JPH01196293A - Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法Info
- Publication number
- JPH01196293A JPH01196293A JP63017422A JP1742288A JPH01196293A JP H01196293 A JPH01196293 A JP H01196293A JP 63017422 A JP63017422 A JP 63017422A JP 1742288 A JP1742288 A JP 1742288A JP H01196293 A JPH01196293 A JP H01196293A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbsag
- polyethylene oxide
- hepatitis
- oxide condensate
- sorbitan ester
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は遺伝子操作により得られるＢ型肝炎ウィルス表
面抗原（以下、ＨＢＳＡｇという。）の抽出方法に関す
る。
面抗原（以下、ＨＢＳＡｇという。）の抽出方法に関す
る。
ＨＢｓＡｇはＢ型肝炎ワクチンの主成分である。
Ｂ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ陽性のキャリアー血液
からＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ホルマリン処理など
の不活化操作を行った後、ＨＢｓＡｇの免疫原性を高め
るために、アジュバントとしてアラム・ゲルを加えたも
のとして開発、実用化された。
からＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ホルマリン処理など
の不活化操作を行った後、ＨＢｓＡｇの免疫原性を高め
るために、アジュバントとしてアラム・ゲルを加えたも
のとして開発、実用化された。
このようにして作られたＢ型肝炎ワクチンは感染発症の
予防だけでなく、感染源となるキャリアーの発生阻止に
も有効であることから、Ｂ型肝炎の絶滅も可能である。
予防だけでなく、感染源となるキャリアーの発生阻止に
も有効であることから、Ｂ型肝炎の絶滅も可能である。
しかし、Ｂ型肝炎ワクチンの生産についてはいくつかの
問題点がある。第１は、ＨＢｓＡｇの原材料をキャリア
ーの血液に依存していることから、ワクチンの供給が制
約されるということである。
問題点がある。第１は、ＨＢｓＡｇの原材料をキャリア
ーの血液に依存していることから、ワクチンの供給が制
約されるということである。
第２は、キャリアーの血液中には少量ながら感染性のＢ
型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）が含まれることから、唯一の
感染しえる動物であるチンパンジーを用いての安全試験
が必要になるということである。
型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）が含まれることから、唯一の
感染しえる動物であるチンパンジーを用いての安全試験
が必要になるということである。
このようなワクチンの生産上の難点を克服する方法とし
て遺伝子操作の技術が導入された。
て遺伝子操作の技術が導入された。
組換えＤＮＡ技術は異種のＤＮＡをファージ又はプラス
ミドＤＮＡにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で開始
された。そして、ＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決定、
ワクチンとして使われるべきＨＢｓＡｇ遺伝子の同定、
大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産生へ
と発展していった。
ミドＤＮＡにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で開始
された。そして、ＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決定、
ワクチンとして使われるべきＨＢｓＡｇ遺伝子の同定、
大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産生へ
と発展していった。
たとえば、酵母由来ＨＢｓＡｇ （ｙ−ＨＢｓＡｇ）は
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると、
分子量２３． ＣＯＯ〜２５．０００のポリペプチドの
みからなり、これはヒト由来ＨＢｓＡｇ （ｈ−ＨＢｓ
Ａｇ）のグリコジル化されていないポリペプチドと一致
するものである。また、ｈ−ＨＢｓＡｇと同じ２２ｎｍ
の直径をもち、塩化セシウム溶液中での浮上密度は、ｈ
−ＨＢｓＡｇと同じである。
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると、
分子量２３． ＣＯＯ〜２５．０００のポリペプチドの
みからなり、これはヒト由来ＨＢｓＡｇ （ｈ−ＨＢｓ
Ａｇ）のグリコジル化されていないポリペプチドと一致
するものである。また、ｈ−ＨＢｓＡｇと同じ２２ｎｍ
の直径をもち、塩化セシウム溶液中での浮上密度は、ｈ
−ＨＢｓＡｇと同じである。
前述したＢ型肝炎ワクチンの生産上の難点を克服するた
めに、遺伝子操作の技術によりＨＢＳＡｇを大量に得、
それを高度精製することによりワクチンとする方法が確
立されつつある。
めに、遺伝子操作の技術によりＨＢＳＡｇを大量に得、
それを高度精製することによりワクチンとする方法が確
立されつつある。
遺伝子操作により微生物菌体から産生されたＨＢｓＡｇ
を回収するには、菌体を適当な溶媒に懸濁後、菌体を粉
砕することによって、ＨＢｓＡｇを菌体内外から抽出す
る方法が用いられる。
を回収するには、菌体を適当な溶媒に懸濁後、菌体を粉
砕することによって、ＨＢｓＡｇを菌体内外から抽出す
る方法が用いられる。
しかし、遺伝子操作により得られたＨＢｓＡｇは水溶性
に乏しいため、抽出操作が極めて困難であった。ＨＢｓ
Ａｇを可溶化するために抽出操作の時に界面活性剤を添
加するのが常法であるが、界面活性剤の種類においては
ＨＢｓＡｇを失活させるものもあることが判明した。
に乏しいため、抽出操作が極めて困難であった。ＨＢｓ
Ａｇを可溶化するために抽出操作の時に界面活性剤を添
加するのが常法であるが、界面活性剤の種類においては
ＨＢｓＡｇを失活させるものもあることが判明した。
そこで、本発明者らはこれらの事情に鑑み鋭意研究を重
ねた結果、遺伝子操作を経た菌体内または菌体外に産生
されたＨＢｓＡｇを効率よく抽出し、しかも抗原性を低
下させない方法を見出し、本発明を完成した。
ねた結果、遺伝子操作を経た菌体内または菌体外に産生
されたＨＢｓＡｇを効率よく抽出し、しかも抗原性を低
下させない方法を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の目的は、遺伝子操作により得られる
ＨＢｓＡｇを高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチ
レンオキサイド縮合物の存在下に抽出する方法を提供す
ることにある。
ＨＢｓＡｇを高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチ
レンオキサイド縮合物の存在下に抽出する方法を提供す
ることにある。
〔課題を解決するための手段及び作用〕■ 出発原料
本発明において用いられるＨＢｓＡｇは遺伝子操作に由
来して調製されたものであれば、特に限定されない。従
って遺伝子操作を経てＨＢｓＡｇを発現する菌体（例え
ば、大腸菌、酵母、枯草菌など）を用いる。
来して調製されたものであれば、特に限定されない。従
って遺伝子操作を経てＨＢｓＡｇを発現する菌体（例え
ば、大腸菌、酵母、枯草菌など）を用いる。
遺伝子操作によりＨＢｓＡｇを発現させる方法は公知の
手段に基づく。すなわち、ＨＢｓＡｇ遺伝子（ＨＢｓＡ
ｇをコードするｃＤＮＡ）を調製して適当なベクターに
組込んで組換えベクターを調製し、これを微生物菌体に
導入して形質転換させた後、この形質転換株を培養して
菌体にＨＢｓＡｇを発現・産生せしめる。
手段に基づく。すなわち、ＨＢｓＡｇ遺伝子（ＨＢｓＡ
ｇをコードするｃＤＮＡ）を調製して適当なベクターに
組込んで組換えベクターを調製し、これを微生物菌体に
導入して形質転換させた後、この形質転換株を培養して
菌体にＨＢｓＡｇを発現・産生せしめる。
具体的には、例えば、大腸菌を用いる方法として特開昭
５５−１０４８８７など、酵母を用いる方法として特開
昭５９−４８０８２などが例示される。
５５−１０４８８７など、酵母を用いる方法として特開
昭５９−４８０８２などが例示される。
■ 抽出
菌体を高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオ
キサイド縮合物の存在下に、ｐＨ７〜９の緩衝液（例え
ば、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸＋１ｍＭフッ化フェニルメチルスル
ホニル含有１０ｍＭ ） ’Ｊス緩Ｉ液（ｐＨ７，５）
など）に懸濁後、菌体を粉砕することによって、ＨＢｓ
Ａｇを菌体内外から抽出する。
キサイド縮合物の存在下に、ｐＨ７〜９の緩衝液（例え
ば、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸＋１ｍＭフッ化フェニルメチルスル
ホニル含有１０ｍＭ ） ’Ｊス緩Ｉ液（ｐＨ７，５）
など）に懸濁後、菌体を粉砕することによって、ＨＢｓ
Ａｇを菌体内外から抽出する。
高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキサイ
ド縮合物における高級脂肪酸としてはラウリン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる
。
ド縮合物における高級脂肪酸としてはラウリン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる
。
具体的には、
モノラウリン酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキ
サイド縮合物（Ｔｗｅｅｎ−２０、同一２１）、モノパ
ルミチン酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキサイ
ド縮合物（Ｔｗｅｅｎ−４０）、モノステアリン酸ソル
ビタンエステルーポＪＪエチレンオキサイド縮合物（Ｔ
ｗｅｅｎ−６０、同一６１）、トリステアリン酸ソルビ
タンエステル−ポリエチレンオキサイド縮合物（Ｔｗｅ
ｅｎ−６５）、モノオレイン酸ソルビタンエステル−ポ
リエチレンオキサイト縮合物（Ｔｗｅｅｎ−８０、同８
１）、トリオレイン酸ソルビタンエステル−ポリエチレ
ンオキサイト縮合物（Ｔｗｅｅｎ −８５）などが例示
される。
サイド縮合物（Ｔｗｅｅｎ−２０、同一２１）、モノパ
ルミチン酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキサイ
ド縮合物（Ｔｗｅｅｎ−４０）、モノステアリン酸ソル
ビタンエステルーポＪＪエチレンオキサイド縮合物（Ｔ
ｗｅｅｎ−６０、同一６１）、トリステアリン酸ソルビ
タンエステル−ポリエチレンオキサイド縮合物（Ｔｗｅ
ｅｎ−６５）、モノオレイン酸ソルビタンエステル−ポ
リエチレンオキサイト縮合物（Ｔｗｅｅｎ−８０、同８
１）、トリオレイン酸ソルビタンエステル−ポリエチレ
ンオキサイト縮合物（Ｔｗｅｅｎ −８５）などが例示
される。
高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキサイ
ド縮合物の添加濃度としては０．１〜２．０ｗ／ｖ％程
度であり、好ましくは、０．１〜０．５１１１／ｖ％程
度である。
ド縮合物の添加濃度としては０．１〜２．０ｗ／ｖ％程
度であり、好ましくは、０．１〜０．５１１１／ｖ％程
度である。
なお、菌体の粉砕に際しては、既知の方法、例えば、凍
結融解法、ガラスピーズ法、高圧法、超音波処理法、酵
素処理法などが用いられる。
結融解法、ガラスピーズ法、高圧法、超音波処理法、酵
素処理法などが用いられる。
■ 精製・製剤化
得られたＨＢｓＡｇ抽出画分は、公知の方法、例えば溶
解度差に基づく分画（硫安、ＰＥＧ、アクリノールなど
）、コロイド珪酸塩による吸着クロマト、疎水性基を有
する担体による吸着クロマト、ＨＢｓ抗体を用いたアフ
ィニティクロマト、ゲル濾過、超遠心分離、透析、限外
濾過、不活化処理（加熱、ホルマリン処理）、などによ
り精製される。
解度差に基づく分画（硫安、ＰＥＧ、アクリノールなど
）、コロイド珪酸塩による吸着クロマト、疎水性基を有
する担体による吸着クロマト、ＨＢｓ抗体を用いたアフ
ィニティクロマト、ゲル濾過、超遠心分離、透析、限外
濾過、不活化処理（加熱、ホルマリン処理）、などによ
り精製される。
さらに、ＨＢｓＡｇ精製画分は既知の方法、例えば、免
疫補助剤、賦形剤、安定化剤、防腐剤の添加、小分は分
注、除菌濾過、凍結乾燥により製剤化される。
疫補助剤、賦形剤、安定化剤、防腐剤の添加、小分は分
注、除菌濾過、凍結乾燥により製剤化される。
具体的には、特開昭５９−１０１４２６ 、同５９−１
１５１８９、同６０−２５８１２７ 、同６１−１０３
８９５ 、同６２−２２７２８に記載された方法に準じ
ればよい。
１５１８９、同６０−２５８１２７ 、同６１−１０３
８９５ 、同６２−２２７２８に記載された方法に準じ
ればよい。
本発明の方法により、ＨＢｓＡｇを効率的に抽出でき、
しかも、ＨＢｓＡｇを失活させないという特徴を有する
。
しかも、ＨＢｓＡｇを失活させないという特徴を有する
。
従って、本発明の方法は遺伝子操作により得られたＨＢ
ｓＡｇを抽出する方法として極め、て有用である。
ｓＡｇを抽出する方法として極め、て有用である。
この結果は、最酩精製品の回収率の向上、比活性の向上
をもたらしうる。従って、ＨＢｓＡｇの製造全体にとっ
ても有用である。
をもたらしうる。従って、ＨＢｓＡｇの製造全体にとっ
ても有用である。
実施例Ｉ
ＨＢｓＡｇを発現した酵母〔サツ力ロマイセスセレビジ
ｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） Ｇ ＲＦＩＩＩ ｒＩｈ ｏ９０株） ｔ−集
菌し、この５ｋｇを５βの１ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ） 、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホ
ニノヘ０．１％（Ｗ／Ｖ）モノラウリン酸ソルビタンエ
ステル−ポリエチレンオキサイド縮合物（Ｔｗｅｅｎ
２０）を含む１０ｍＭ ）リス緩衝液、ｐＨ７，５に懸
濁し、グラスビーズ法（Ｄｙｎ。
ｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） Ｇ ＲＦＩＩＩ ｒＩｈ ｏ９０株） ｔ−集
菌し、この５ｋｇを５βの１ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ） 、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホ
ニノヘ０．１％（Ｗ／Ｖ）モノラウリン酸ソルビタンエ
ステル−ポリエチレンオキサイド縮合物（Ｔｗｅｅｎ
２０）を含む１０ｍＭ ）リス緩衝液、ｐＨ７，５に懸
濁し、グラスビーズ法（Ｄｙｎ。
−Ｍｉｌｌ使用）により酵母からＨＢｓＡｇを抽出した
。抽出液にアクリノールを終濃度で０．３％（Ｗ／Ｖ’
）加え、室温で３０分撹拌後、生成した沈澱を遠心分離
（４０（ｆｏｒ、 ｐ、 ｍ、 、 ３０分間）により
除去し上清を得た。
。抽出液にアクリノールを終濃度で０．３％（Ｗ／Ｖ’
）加え、室温で３０分撹拌後、生成した沈澱を遠心分離
（４０（ｆｏｒ、 ｐ、 ｍ、 、 ３０分間）により
除去し上清を得た。
この上清にベントナイトを０．５％（Ｗ／Ｖ）加え、室
温で３０分撹拌後、遠心分離（４０００ｒ、 ｐ、 ｍ
、 、 ３０分間）し、得られた上清にケイ酸アルミン
酸マグネシウム〔エアロジルＲ３８０、Ｄｅｇｕｓａ社
製〕を２．５％（ｗ／ｖ）になるように添加し、３７℃
で３時間撹拌した。撹拌後、ｙ−ＨＢｓＡｇを吸着した
ケイ酸アルミン酸マグネシネウムを遠心分ｍ （３００
０ｒ、ｐｏｍ、。
温で３０分撹拌後、遠心分離（４０００ｒ、 ｐ、 ｍ
、 、 ３０分間）し、得られた上清にケイ酸アルミン
酸マグネシウム〔エアロジルＲ３８０、Ｄｅｇｕｓａ社
製〕を２．５％（ｗ／ｖ）になるように添加し、３７℃
で３時間撹拌した。撹拌後、ｙ−ＨＢｓＡｇを吸着した
ケイ酸アルミン酸マグネシネウムを遠心分ｍ （３００
０ｒ、ｐｏｍ、。
１５分間）により回収し、回収したｙ−ＨＢｓＡｇ吸着
ケイ酸アルミン酸マグネシウム３．１５Ｍ ＥＤＴＡと
０．１５Ｍ塩化ナトリウムより成るｐＨ７，５の緩衝液
で洗浄した。洗浄後、０．５％（Ｗ／Ｖ）デオキシコー
ル酸ナトリウムを含有するｐＨ９，０の緩衝液で吸着さ
れたｙ−ＨＢｓＡｇを溶出した。遠心分離（３０００ｒ
、ｐ、ｍ、、 １５分間）により回収した溶出液はｐＨ
を７．２に調整したのち、抽出液１！当り硫安を７０ｇ
添加し、別途調製されたフェニルアラニン−セファロー
ス４Ｂのカラムへ注入ＬＨＢｓ抗原を吸着させた。上記
と同じ濃度の硫安液で十分に洗浄し、不純物質を除去し
た後、ＩＯＶ／Ｖ％エタノール含有０．１ＭＩＪン酸緩
衝波緩衝液７．２）を用いてＨＢｓ抗原を溶出した。尚
フェニルアラニン−セファローズ４Ｂの調製法は臭化シ
アンで活性化したセファローズ４Ｂにフェニルアラニン
溶液を加え、室温で１６時間反応させることにより行っ
た。
ケイ酸アルミン酸マグネシウム３．１５Ｍ ＥＤＴＡと
０．１５Ｍ塩化ナトリウムより成るｐＨ７，５の緩衝液
で洗浄した。洗浄後、０．５％（Ｗ／Ｖ）デオキシコー
ル酸ナトリウムを含有するｐＨ９，０の緩衝液で吸着さ
れたｙ−ＨＢｓＡｇを溶出した。遠心分離（３０００ｒ
、ｐ、ｍ、、 １５分間）により回収した溶出液はｐＨ
を７．２に調整したのち、抽出液１！当り硫安を７０ｇ
添加し、別途調製されたフェニルアラニン−セファロー
ス４Ｂのカラムへ注入ＬＨＢｓ抗原を吸着させた。上記
と同じ濃度の硫安液で十分に洗浄し、不純物質を除去し
た後、ＩＯＶ／Ｖ％エタノール含有０．１ＭＩＪン酸緩
衝波緩衝液７．２）を用いてＨＢｓ抗原を溶出した。尚
フェニルアラニン−セファローズ４Ｂの調製法は臭化シ
アンで活性化したセファローズ４Ｂにフェニルアラニン
溶液を加え、室温で１６時間反応させることにより行っ
た。
得られたＨＢｓＡｇ画分はショ糖直線密度勾配（２０〜
５５％）ゾーナル超遠心分離（４３，００Ｏｒ、 ｐ９
ｍ、。
５５％）ゾーナル超遠心分離（４３，００Ｏｒ、 ｐ９
ｍ、。
４８時間）により、単一ピークとして回収され、このピ
ークと吸光度のピークは一致した。
ークと吸光度のピークは一致した。
回収したｙ−ＨＢｓＡｇ画分は、ｐＨ７のリン酸緩衝液
で透析した後、アジュバントとして水酸化アルミニウム
を加えてワクチンを得た。
で透析した後、アジュバントとして水酸化アルミニウム
を加えてワクチンを得た。
次に精製ｙ−ＨＢｓＡｇの性状分析を行った。
精製Ｖ−ＨＢｓＡｇ中の酵母成分の有無を、酵母成分に
対する抗体とＨＢｓＡｇを含まない酵母成分の感作ヒツ
ジ赤血球による血球凝集阻止法（ＨＡｌ法）、および精
製ｙ−ＨＢｓＡｇと酵母成分に対する抗体を用いてモル
モット皮膚被動性アナフィラキ−（ＰＣＡ）反応で検討
した結果、いずれの方法でも酵母成分は検出されなかっ
た。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の分析に
よれば、精製ｙ−ＨＢｓＡｇはｈ−ＨＢｓＡｇの分子量
２５０００に相当するペプチドのみから成るものであっ
た。電子顕微鏡観察では、精製ｙ−ＨＢｓＡｇはｈ−Ｈ
ＢｓＡｇとほぼ同じ直径、形状を持った均一な球形粒子
として認められた。
対する抗体とＨＢｓＡｇを含まない酵母成分の感作ヒツ
ジ赤血球による血球凝集阻止法（ＨＡｌ法）、および精
製ｙ−ＨＢｓＡｇと酵母成分に対する抗体を用いてモル
モット皮膚被動性アナフィラキ−（ＰＣＡ）反応で検討
した結果、いずれの方法でも酵母成分は検出されなかっ
た。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の分析に
よれば、精製ｙ−ＨＢｓＡｇはｈ−ＨＢｓＡｇの分子量
２５０００に相当するペプチドのみから成るものであっ
た。電子顕微鏡観察では、精製ｙ−ＨＢｓＡｇはｈ−Ｈ
ＢｓＡｇとほぼ同じ直径、形状を持った均一な球形粒子
として認められた。
実施例２
抽出における各種添加剤の有効性を調べた。添加剤とし
て アルキルフェノール−ポリエチレンオキサイド縮合物（
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００） モノラウリン酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキ
サイド縮合物（Ｔｗｅｅｎ ２０）モノオレイン酸ソル
ビタンエステル−ポリエチレンオキサイド縮合物（Ｔｗ
ｅｅｎ ８０）を選んだ。
て アルキルフェノール−ポリエチレンオキサイド縮合物（
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００） モノラウリン酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオキ
サイド縮合物（Ｔｗｅｅｎ ２０）モノオレイン酸ソル
ビタンエステル−ポリエチレンオキサイド縮合物（Ｔｗ
ｅｅｎ ８０）を選んだ。
実施例１に準じて抽出を行い、抽出液中のＨＢｓＡｇ活
性をＲＰＨＡ法により測定した（第１表）。
性をＲＰＨＡ法により測定した（第１表）。
実施例３
精製ＨＢＳＡｇに対する添加剤の影響を調べた。
用いた添加剤は実施例２と同じである。
一定力価の精製ＨＢｓＡｇ溶液（２０ｐｇ／ｍｌ）に各
種濃度の添加剤を等量混合し２５℃で１・時間静置した
のちＲＰＨＡ法で抗原価を測定し抗原の失活の程度を測
定したく第２表）。
種濃度の添加剤を等量混合し２５℃で１・時間静置した
のちＲＰＨＡ法で抗原価を測定し抗原の失活の程度を測
定したく第２表）。
１、抽出における界面活性剤の有効性（第１表）２、精
製ＨＢｓ抗原に対する界面活性剤の影響（第２表）以上
の結果より酵母からＨＢｓ抗原を抽出する場合界面活性
剤を入れることによって効果的に抽出できる力や１表）
、界面活性剤の種類によっては、ＨＢｓ抗原を失活させ
る場合もある＠２林しかし’ｉ’ｗｅｅｎ ２０の場合
、抽出効率はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と変わらず、し
かもかなり高濃度までＨＢｓ抗原を失活させないという
特徴を持つ。
製ＨＢｓ抗原に対する界面活性剤の影響（第２表）以上
の結果より酵母からＨＢｓ抗原を抽出する場合界面活性
剤を入れることによって効果的に抽出できる力や１表）
、界面活性剤の種類によっては、ＨＢｓ抗原を失活させ
る場合もある＠２林しかし’ｉ’ｗｅｅｎ ２０の場合
、抽出効率はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と変わらず、し
かもかなり高濃度までＨＢｓ抗原を失活させないという
特徴を持つ。
（ほか３名）
手続補正占
昭和６３年３り／６日
Claims (4)
- （１）遺伝子操作によりＢ型肝炎ウィルス表面抗原遺伝
子を組込んだ組換えベクターを用いて形質転換した微生
物菌体から産生されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原を抗原
性を低下させずに抽出する方法において、高級脂肪酸ソ
ルビタンエステル−ポリエチレンオキサイド縮合物の存
在下に行うことを特徴とするＢ型肝炎ウィルス表面抗原
の抽出方法。 - （２）高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオ
キサイド縮合物の添加量が０．１〜２．０ｗ／ｖ％であ
る請求項１記載の抽出方法。 - （３）高級脂肪酸ソルビタンエステル−ポリエチレンオ
キサイド縮合物がモノラウリン酸ソルビタンエステル−
ポリエチレンオキサイド縮合物である請求項１記載の抽
出方法。 - （４）微生物が酵母である請求項１記載の抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63017422A JPH01196293A (ja) | 1988-01-29 | 1988-01-29 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63017422A JPH01196293A (ja) | 1988-01-29 | 1988-01-29 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01196293A true JPH01196293A (ja) | 1989-08-08 |
Family
ID=11943578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63017422A Pending JPH01196293A (ja) | 1988-01-29 | 1988-01-29 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01196293A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05252976A (ja) * | 1991-03-15 | 1993-10-05 | Merck & Co Inc | 組換え宿主細胞から得られる組換えｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の安定化方法 |
-
1988
- 1988-01-29 JP JP63017422A patent/JPH01196293A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05252976A (ja) * | 1991-03-15 | 1993-10-05 | Merck & Co Inc | 組換え宿主細胞から得られる組換えｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の安定化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0162639B1 (en) | Antigenic preparations and isolation of such preparations | |
| US4649192A (en) | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate | |
| EP0522291B1 (en) | Process for purifying hepatitis a virus (HAV), virus thus purified and vaccine compositions containing it | |
| CN1122531C (zh) | 抗日本脑炎疫苗的工业生产方法和所获得的疫苗 | |
| US20100055134A1 (en) | Method of separating protective components of bordetella pertussis | |
| JP2950970B2 (ja) | 百日咳菌からの６９０００ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法 | |
| US4902783A (en) | Method for purifying a gene-expression product produced by recombinant DNA technique | |
| WO1987006939A1 (en) | Process for isolating and purifying p. falciparum cs protein vaccine expressed in recombinant e. coli | |
| US4612283A (en) | Method for purification of HBs antigen | |
| JPS6089431A (ja) | 形質転換酵母から誘導される免疫原性ＨＢｓＡｇ | |
| CA2347084C (en) | Hepatitis a vaccines | |
| CA2164672C (en) | Process for purifying hepatitis b viral surface antigen comprising pres2 peptide | |
| JPH01196293A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法 | |
| KR20060033870A (ko) | Ｈｅｒ-2 변이체의 정제 | |
| EP0179485B1 (en) | A process for the purification of hbsag | |
| JPS62187495A (ja) | 新規ｄｎａおよびポリペプチド | |
| JPS60258127A (ja) | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 | |
| JP3747077B2 (ja) | 百日咳菌由来感染防御成分の分離取得方法 | |
| JPS62142122A (ja) | ＨＢｓＡｇ複合体、その製造法およびＨＢワクチン | |
| JPS60226822A (ja) | 線維状赤血球凝集素の精製方法 | |
| JPH0780785B2 (ja) | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 | |
| JPS6069030A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス感染に対するワクチン及び組成物 | |
| CN1008145B (zh) | 冻干的b型肝炎疫苗 | |
| HK1012404B (en) | Extraction of cell-bound protein from bordetella |