JPS60227670A - フエニルアラニンアンモニアリア−ゼ生成微生物 - Google Patents
フエニルアラニンアンモニアリア−ゼ生成微生物Info
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- JPS60227670A JPS60227670A JP59226951A JP22695184A JPS60227670A JP S60227670 A JPS60227670 A JP S60227670A JP 59226951 A JP59226951 A JP 59226951A JP 22695184 A JP22695184 A JP 22695184A JP S60227670 A JPS60227670 A JP S60227670A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なフェニルアラニンアンモニアリ・アーゼ
生成微生物ならびにそれらの選定、製造および利用方法
に関する。より詳細に本発明は比較的扁レベルの酵素、
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下、時にｒＰ
ＡＬＪと称することがある）であって、ひいてはＬ−フ
ェニルアラニンの製造にとって有用なものを生成する微
生物に関する。
生成微生物ならびにそれらの選定、製造および利用方法
に関する。より詳細に本発明は比較的扁レベルの酵素、
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下、時にｒＰ
ＡＬＪと称することがある）であって、ひいてはＬ−フ
ェニルアラニンの製造にとって有用なものを生成する微
生物に関する。
Ｌ−フェニルアラニンは人間の必須アミノ酸の一種であ
り、従って非経口的ならびに経腸的栄養配合物の重要な
成分である。更に、このアミノ酸は他の製品、たとえば
人工甘味料、アスパルターゼ製造用出発原料として有用
である。フェニルアラニンについて各種微生物法が知ら
れている。たとえば、米国特許第３，６６０，２３５号
にはブレヴイ／＜ りｆ ＩＪ ｒ’ｙ ム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバクテリウムＩ Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） 、アルトロバクタ
ー （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ） 、バｆ Ｊｌ／
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）およびカンジダ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ）についてのフェニルアラニン同族体抵抗菌株
（ａｎａｌｏｇ ｒｅｓｉｓｔａｕｔ ｇｔｒａｉｕｓ
）によるフェニルアラニンの製造が記載されている。
り、従って非経口的ならびに経腸的栄養配合物の重要な
成分である。更に、このアミノ酸は他の製品、たとえば
人工甘味料、アスパルターゼ製造用出発原料として有用
である。フェニルアラニンについて各種微生物法が知ら
れている。たとえば、米国特許第３，６６０，２３５号
にはブレヴイ／＜ りｆ ＩＪ ｒ’ｙ ム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバクテリウムＩ Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） 、アルトロバクタ
ー （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ） 、バｆ Ｊｌ／
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）およびカンジダ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ）についてのフェニルアラニン同族体抵抗菌株
（ａｎａｌｏｇ ｒｅｓｉｓｔａｕｔ ｇｔｒａｉｕｓ
）によるフェニルアラニンの製造が記載されている。
プレヴイバクテリウム、コリネバクテリウム、アルトロ
バクターおよびエシェリヒア（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ）の成る種のチロシン必須ミュータントによるこの
アミノ酸の製造もまた、知られている（米国特許第３，
６５４，０７９号および同第３，９０９，３５３号参照
）。
バクターおよびエシェリヒア（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ）の成る種のチロシン必須ミュータントによるこの
アミノ酸の製造もまた、知られている（米国特許第３，
６５４，０７９号および同第３，９０９，３５３号参照
）。
ＰＡＬはＬ−フェニルアラニン（７） ） ？ンスー桂
皮酸およびアンモニアへの分解を触媒する。この酵素反
応は可逆的であり、そして英国特許第１，４８９，４６
８号はＬ−フェニルアラニンの製造方法を開示しており
、これはアンモニウムイオンヲ伴うトランス−桂皮酸の
ＰＡＬ融媒反応によりＬ−フェニルアラニンを得る方法
を包含している。この反応はＬ−フェニルアラニンの製
造にとって有用であることが知られており、従って高レ
ベルのＰＡＬ活性を生ずる微生物の生産を達成するため
の必要性は依然として続いている。この種の微生物ハ桂
皮酸およびアンモニウムイオンのＬ−フェニルアラニン
への転化に直接用いることができ、あるいは酵素を細胞
から直接単離し、かつバイオリアクターの各種の形態に
おいてＬ−フェニルアラニンを製造するために用いるこ
とができる。
皮酸およびアンモニアへの分解を触媒する。この酵素反
応は可逆的であり、そして英国特許第１，４８９，４６
８号はＬ−フェニルアラニンの製造方法を開示しており
、これはアンモニウムイオンヲ伴うトランス−桂皮酸の
ＰＡＬ融媒反応によりＬ−フェニルアラニンを得る方法
を包含している。この反応はＬ−フェニルアラニンの製
造にとって有用であることが知られており、従って高レ
ベルのＰＡＬ活性を生ずる微生物の生産を達成するため
の必要性は依然として続いている。この種の微生物ハ桂
皮酸およびアンモニウムイオンのＬ−フェニルアラニン
への転化に直接用いることができ、あるいは酵素を細胞
から直接単離し、かつバイオリアクターの各種の形態に
おいてＬ−フェニルアラニンを製造するために用いるこ
とができる。
本発明は大量にＰＡＬ′（ｉｌ−生成する新規な微生物
に関する。これらの微生物は従来の突然変異技法により
得られる。ＰＡＬ−含有細胞はトランス−桂皮酸とアン
モニアへのフェニルアラニンの酵素的転化ならびに引続
くトランス−桂皮酸の代謝からエネルギーを得ることが
できるので、ＰＡＬ−大量生産ミュータントを選定する
ための手段にはこの種の細胞を、実質的に唯一の炭素源
としてＬ−フェニルアラニンを含有する最少栄養培地上
に培養することを包含する。この選定技術はＰＡＬ−生
成ミュータント（突然変異体）を同定するために利用す
ることができるが、Ｌ−フェニルアラニンの分解は引続
く分解性反応よりも遥かに迅速に生ずることが判明して
いるので、この技法は高レベルのＰＡＬ活性を示すこれ
らのミュー、タントを単に名目的に産出力のある菌株か
ら識別するために特に有用なものではない。
に関する。これらの微生物は従来の突然変異技法により
得られる。ＰＡＬ−含有細胞はトランス−桂皮酸とアン
モニアへのフェニルアラニンの酵素的転化ならびに引続
くトランス−桂皮酸の代謝からエネルギーを得ることが
できるので、ＰＡＬ−大量生産ミュータントを選定する
ための手段にはこの種の細胞を、実質的に唯一の炭素源
としてＬ−フェニルアラニンを含有する最少栄養培地上
に培養することを包含する。この選定技術はＰＡＬ−生
成ミュータント（突然変異体）を同定するために利用す
ることができるが、Ｌ−フェニルアラニンの分解は引続
く分解性反応よりも遥かに迅速に生ずることが判明して
いるので、この技法は高レベルのＰＡＬ活性を示すこれ
らのミュー、タントを単に名目的に産出力のある菌株か
ら識別するために特に有用なものではない。
本発明によれば、ＰＡＬ−生成ミュータントはフェニル
アラニン同族体を実質的に唯一の炭素源として含有する
最少栄養培地上に前記ミュータントを培養することによ
り選定される。この種の同族体はＰＡＬ用の基質として
作用するそれらの能力に基づいて選択されるが、この場
合同族体のＰＡＬ−融媒分解は生物学的に有用なエネル
ギーの随伴する放出による単一の代謝産物に対する同族
体の全代謝についての律速段階である。この技法は如何
なるＰＡＬ−生成微生物のＰＡＬ−大量生産菌株をも選
定するために利用することができ、そして特に高レベル
のＰＡＬ活性を示すロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ
ｌａ ）およびロードスボリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏ
ｒｉｄｉｕｍ ） 属の酵母ミュー ｐ ７ ）を得る
のに有用である。これらの細胞は桂皮酸およびアンモニ
ウムイオンの直接転化に用いてもよいし、あるいは引続
いてＬ−フェニルアラニンの製造に用いられる高レベル
のＰＡＬを生成するために成長させることもできる。
アラニン同族体を実質的に唯一の炭素源として含有する
最少栄養培地上に前記ミュータントを培養することによ
り選定される。この種の同族体はＰＡＬ用の基質として
作用するそれらの能力に基づいて選択されるが、この場
合同族体のＰＡＬ−融媒分解は生物学的に有用なエネル
ギーの随伴する放出による単一の代謝産物に対する同族
体の全代謝についての律速段階である。この技法は如何
なるＰＡＬ−生成微生物のＰＡＬ−大量生産菌株をも選
定するために利用することができ、そして特に高レベル
のＰＡＬ活性を示すロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ
ｌａ ）およびロードスボリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏ
ｒｉｄｉｕｍ ） 属の酵母ミュー ｐ ７ ）を得る
のに有用である。これらの細胞は桂皮酸およびアンモニ
ウムイオンの直接転化に用いてもよいし、あるいは引続
いてＬ−フェニルアラニンの製造に用いられる高レベル
のＰＡＬを生成するために成長させることもできる。
本発明の微生物的菌株は従来の突然変異法により得られ
る。この雅の方法は、たとえば、親菌株の培養基を変異
原たとえば、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホ
ネート、５−ブロモウラシル、ビトロキシラミン、窒素
およびサルファーマスタード等を用いて化学的突然変異
に曝す工程を含むものである。細胞を紫外線または電離
線で照射する方法も４７ｃ利用することができる。この
種の技法は周知であり、そして、たとえば［ベーシック
ーバクテリオロジ−（Ｂａ５ｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ ） Ｊう・マンナおよびマレット著、第２版、
ボルチモア市、ザ・ウイリ・アムズ・アンド・ウィリア
ムス・カンパニー、１９５９年、第６４６乃至６４９ペ
ージに記載されている。
る。この雅の方法は、たとえば、親菌株の培養基を変異
原たとえば、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホ
ネート、５−ブロモウラシル、ビトロキシラミン、窒素
およびサルファーマスタード等を用いて化学的突然変異
に曝す工程を含むものである。細胞を紫外線または電離
線で照射する方法も４７ｃ利用することができる。この
種の技法は周知であり、そして、たとえば［ベーシック
ーバクテリオロジ−（Ｂａ５ｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ ） Ｊう・マンナおよびマレット著、第２版、
ボルチモア市、ザ・ウイリ・アムズ・アンド・ウィリア
ムス・カンパニー、１９５９年、第６４６乃至６４９ペ
ージに記載されている。
化学薬品捷たは放射線により誘発さ−ｒＬ、た突然変異
は、典型的には数百から数千のミュータント菌株を生成
する。所望の特性を有する生長し得る菌株の選定は、具
体的な選定方法が工夫できなければ骨の折れる課題であ
る。本発明はＰＡＬ−生成ミュータントの選定方法を包
含するものであるが、この場合ミュータントは実質的に
唯一の炭素源としてＰＡＬ酵素用基質を含有する最少栄
養培地上で培養させるものである。ＰＡＬを含有するこ
れらの菌種は基質を分解することができ、その結果エネ
ルギーおよび栄養を得るものである。上に示したように
、Ｌ−フェニルアラニンはＰＡＬについての基質である
が、Ｌ−フェニルアラニンの桂皮酸およびアンモニアへ
の酵素的分解は非常に迅速に発生し、かつ引続く分解反
応は律速的である。
は、典型的には数百から数千のミュータント菌株を生成
する。所望の特性を有する生長し得る菌株の選定は、具
体的な選定方法が工夫できなければ骨の折れる課題であ
る。本発明はＰＡＬ−生成ミュータントの選定方法を包
含するものであるが、この場合ミュータントは実質的に
唯一の炭素源としてＰＡＬ酵素用基質を含有する最少栄
養培地上で培養させるものである。ＰＡＬを含有するこ
れらの菌種は基質を分解することができ、その結果エネ
ルギーおよび栄養を得るものである。上に示したように
、Ｌ−フェニルアラニンはＰＡＬについての基質である
が、Ｌ−フェニルアラニンの桂皮酸およびアンモニアへ
の酵素的分解は非常に迅速に発生し、かつ引続く分解反
応は律速的である。
従って、フェニルアラニン含有培地はＰＡＬを含有する
ミュータントについて選択的であるが、それらは特にＰ
ＡＬ−大量生産菌種について選択的であると論う訳では
ない。それはミュータントの成長速度が細胞のＰＡＬ含
有量にそれほど左右されルモのではなく、フェニルアラ
ニン代謝産物を利用する細胞の一般的な効率によるもの
だからである。本発明の選定方法には、潜在的なＰＡＬ
−大量生産ミュータントを、実質的に唯一の炭素源とし
てＰＡＬ基質を含有する最少培地上で成長させる工程を
包含するものであるが、前記ＰＡＬ基質は代謝行路にお
ける引続く反応に比べると緩慢に分解するものである。
ミュータントについて選択的であるが、それらは特にＰ
ＡＬ−大量生産菌種について選択的であると論う訳では
ない。それはミュータントの成長速度が細胞のＰＡＬ含
有量にそれほど左右されルモのではなく、フェニルアラ
ニン代謝産物を利用する細胞の一般的な効率によるもの
だからである。本発明の選定方法には、潜在的なＰＡＬ
−大量生産ミュータントを、実質的に唯一の炭素源とし
てＰＡＬ基質を含有する最少培地上で成長させる工程を
包含するものであるが、前記ＰＡＬ基質は代謝行路にお
ける引続く反応に比べると緩慢に分解するものである。
それにより酵素的分解は、栄養およびエネルギー価に関
する細胞による基質の全体的利用に際して律速段階とな
る。この種の培地上で最良に成長する（：′れらの細胞
は最高レベルのＰＡＬ活性を有している。細胞のＰＡＬ
−生成能力の確認は本明細書中に記載される方法によシ
得られる細胞の酵素活性測定により達成することができ
る。
する細胞による基質の全体的利用に際して律速段階とな
る。この種の培地上で最良に成長する（：′れらの細胞
は最高レベルのＰＡＬ活性を有している。細胞のＰＡＬ
−生成能力の確認は本明細書中に記載される方法によシ
得られる細胞の酵素活性測定により達成することができ
る。
これらの方法においては各種の基質が用いられ（１１）
て来たが、一般にＰＡＬ分解に関してフェニルアラニン
よりも低い活性を有する孔ゆる基質を利用することがで
きる。この種の基質の例には、次のようなものがあるが
、これらに限定されるものではない。すなわち、そね、
らはＬ−フェニルアラニンメチルエステル、Ｌ−フェニ
ルアラニンエチルエステル、ｍ−フルオロ−Ｄ、Ｌ−フ
ェニルアラニン、Ｌ−チロシン、β−２−チェニル−Ｄ
、 Ｌ−アラニンおよびＰ−フルオロ−Ｄ、Ｌ−フェニ
ルアラニンである。特に好ましい基質はＬ−チロシンで
ある。Ｌ−チロシンのＰ Ａ、 Ｌ融媒代謝は緩慢ニ進
行し、かつ栄養素としてのＬ−チロシンの総体的利用に
おける律速段階である。従って、Ｌ−チロシンを実質的
な唯一の炭素源として含有する最少本質的培地上で成長
する細胞は比較的高レベルのＰＡＬ活性を示すことが判
明し−ている。
よりも低い活性を有する孔ゆる基質を利用することがで
きる。この種の基質の例には、次のようなものがあるが
、これらに限定されるものではない。すなわち、そね、
らはＬ−フェニルアラニンメチルエステル、Ｌ−フェニ
ルアラニンエチルエステル、ｍ−フルオロ−Ｄ、Ｌ−フ
ェニルアラニン、Ｌ−チロシン、β−２−チェニル−Ｄ
、 Ｌ−アラニンおよびＰ−フルオロ−Ｄ、Ｌ−フェニ
ルアラニンである。特に好ましい基質はＬ−チロシンで
ある。Ｌ−チロシンのＰ Ａ、 Ｌ融媒代謝は緩慢ニ進
行し、かつ栄養素としてのＬ−チロシンの総体的利用に
おける律速段階である。従って、Ｌ−チロシンを実質的
な唯一の炭素源として含有する最少本質的培地上で成長
する細胞は比較的高レベルのＰＡＬ活性を示すことが判
明し−ている。
Ｌ−チロシン培地にＰＡＬ−含有ミュータントの個体群
を接種すると、細胞の成長は通常非常に緩慢に起る。典
型的には数日間全く成長が認められず、その後二、三の
コロニーかｌｔｌ現する。ＰＡ（１２） Ｌ活性に関するこれらコロニーの分析は、それらが高レ
ベルのＰＡＬ活性を有することを示した。
を接種すると、細胞の成長は通常非常に緩慢に起る。典
型的には数日間全く成長が認められず、その後二、三の
コロニーかｌｔｌ現する。ＰＡ（１２） Ｌ活性に関するこれらコロニーの分析は、それらが高レ
ベルのＰＡＬ活性を有することを示した。
これらの方法により得ることができる微生物細胞にはス
トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ） 属
のバクテリアならびにロードトルラ、ロードスボリジウ
ムおよびスポロボロマイセス（５ｐｏｒｏｂｏｌ。
トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ） 属
のバクテリアならびにロードトルラ、ロードスボリジウ
ムおよびスポロボロマイセス（５ｐｏｒｏｂｏｌ。
ｍｙｃｅｓ ）の酵母菌がある。野生タイプまたは知ら
れ７ｃＰＡＬ−生成菌株からミュータントを生成した後
、ミュータント個体群全上記したＰＡＬ基質の成長維持
量を含有する最少本質的培地に接種する。基剤最少培地
は必須のビタミン、ミネラルおよび窒素源を含有してい
るが、微生物的成長を維持する炭素源の十分な量を含有
するものではない。
れ７ｃＰＡＬ−生成菌株からミュータントを生成した後
、ミュータント個体群全上記したＰＡＬ基質の成長維持
量を含有する最少本質的培地に接種する。基剤最少培地
は必須のビタミン、ミネラルおよび窒素源を含有してい
るが、微生物的成長を維持する炭素源の十分な量を含有
するものではない。
この基剤培地はＰＡＬ基質、好ましくはＬ−チロシンを
補給芒し、従ってこれが唯一の炭素源として作用する。
補給芒し、従ってこれが唯一の炭素源として作用する。
通常、ＰＡＬ基質の濃度がリットル当り約１乃至約１０
グラム、好ましくは約３乃至約７ダラムの濃度である培
地を用いる。
グラム、好ましくは約３乃至約７ダラムの濃度である培
地を用いる。
最少本質的培地は周知であり、そしてこれには典型的に
約０．０５乃至約ＬＯｆ／ｌの濃度のカリウム、ナトリ
ウム、鉄、マンガンおよび亜鉛のリン酸塩、硫酸塩、塩
化物、ヨウ化物およびモリブデン酸塩が包含される。更
に、これらの培地はビタミン類および成長要素、たとえ
ばビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、Ｔノシト
ール、ナイアシン、Ｐ−アミノ安息香酸、塩酸、ピリド
キシン、リボフラビン、および塩酸チアミンを含有する
のが有利であシ、その量は約０．１乃至約１．０？／ｌ
の範囲に及んでいる。培地の組成は臨界的なものではな
く、各種の合成、半合成または天然成分から構成されて
いてもよい。
約０．０５乃至約ＬＯｆ／ｌの濃度のカリウム、ナトリ
ウム、鉄、マンガンおよび亜鉛のリン酸塩、硫酸塩、塩
化物、ヨウ化物およびモリブデン酸塩が包含される。更
に、これらの培地はビタミン類および成長要素、たとえ
ばビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、Ｔノシト
ール、ナイアシン、Ｐ−アミノ安息香酸、塩酸、ピリド
キシン、リボフラビン、および塩酸チアミンを含有する
のが有利であシ、その量は約０．１乃至約１．０？／ｌ
の範囲に及んでいる。培地の組成は臨界的なものではな
く、各種の合成、半合成または天然成分から構成されて
いてもよい。
選定培地は好ましくは固体培地（７Ｃとえば、寒天培地
）であって、細胞の取扱員と移動を容易とする。これら
の培地は滅菌され、そして生理的に受容可能なｐＨ％
たとえば約５乃至約８、好ましくは約６乃至約７に緩衝
される。接種された培地は生物学的に受容可能な温度、
たとえば約２０℃乃至約５０℃、好ましくは約３０℃で
培養される。
）であって、細胞の取扱員と移動を容易とする。これら
の培地は滅菌され、そして生理的に受容可能なｐＨ％
たとえば約５乃至約８、好ましくは約６乃至約７に緩衝
される。接種された培地は生物学的に受容可能な温度、
たとえば約２０℃乃至約５０℃、好ましくは約３０℃で
培養される。
ここに記載した方法は赤色酵母菌、ロードトルラ・ルブ
ラ（ｒｕｂｒａ ）およびロードスボリジウム、）−ル
ｏイデス（ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ）のＰＡＬ大量生産
ミュータント菌株を得るために特に有用であることが判
明している。これらのミュータントＩｄＬ−チロシンを
富化した本質的培地上に大きなコロニーを生成し、そし
て酵素活性測定により高レベルのＰＡＬを生成すること
が示されている。
ラ（ｒｕｂｒａ ）およびロードスボリジウム、）−ル
ｏイデス（ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ）のＰＡＬ大量生産
ミュータント菌株を得るために特に有用であることが判
明している。これらのミュータントＩｄＬ−チロシンを
富化した本質的培地上に大きなコロニーを生成し、そし
て酵素活性測定により高レベルのＰＡＬを生成すること
が示されている。
ＰＡＬは殆どの微生物中で誘発可能な酵素なので、ＰＡ
Ｌ生成に関する基質が必要となる。更にこれらの酵素は
しばしば異化代謝産物のりプレッション（ｒｅｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ）を受ける。従って、生産方法はＰＡＬ合成
の誘発を最大とし、かつ異化代謝産物を最小とするよう
に設定するのが有利である。
Ｌ生成に関する基質が必要となる。更にこれらの酵素は
しばしば異化代謝産物のりプレッション（ｒｅｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ）を受ける。従って、生産方法はＰＡＬ合成
の誘発を最大とし、かつ異化代謝産物を最小とするよう
に設定するのが有利である。
通常、ＰＡＬは炭素および窒素の同化可能源ならびに必
須ビタミン、ミネラルおよび七の他の成長要素を含有す
る栄養培地中にＰＡＬ−生成菌株を培養することにより
生成される。適切な炭素源は各種の精製または粗製炭水
化物、たとえばグルコース、スクロース、糖みつ、澱粉
、穀粒等を包含することが可能である。好ましい炭素源
はダル（１５） コースシロップである。
須ビタミン、ミネラルおよび七の他の成長要素を含有す
る栄養培地中にＰＡＬ−生成菌株を培養することにより
生成される。適切な炭素源は各種の精製または粗製炭水
化物、たとえばグルコース、スクロース、糖みつ、澱粉
、穀粒等を包含することが可能である。好ましい炭素源
はダル（１５） コースシロップである。
窒素源には、無機アンモニウム塩、たとえばリン酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等ならびに有機含
窒素物質、たとえば大豆ミール、内冷出液、アミノ酸、
とうもろこし浸出液、タン白質氷解物、ペプトン、酵母
抽出物等がある。
モニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等ならびに有機含
窒素物質、たとえば大豆ミール、内冷出液、アミノ酸、
とうもろこし浸出液、タン白質氷解物、ペプトン、酵母
抽出物等がある。
本発明方法にとって好ましい窒素源は酵母菌抽出物であ
る。
る。
ビタミン、ミネラルおよびその他の成長要素は炭素およ
び窒素源によって供給してもよいし、あるいは別々に供
給してもよい。これらの成分は用いられた特別な微生物
によって変化させることも可能である。典型的には痕跡
のミネラル、たとえば亜鉛、マンガン、鉄、コバルトお
よびカルシウムを無機塩類として成長促進量をもって供
給することができる。これらのミネラルは、たとえば水
道水のような処理水、海水等を用いて供給してもよい。
び窒素源によって供給してもよいし、あるいは別々に供
給してもよい。これらの成分は用いられた特別な微生物
によって変化させることも可能である。典型的には痕跡
のミネラル、たとえば亜鉛、マンガン、鉄、コバルトお
よびカルシウムを無機塩類として成長促進量をもって供
給することができる。これらのミネラルは、たとえば水
道水のような処理水、海水等を用いて供給してもよい。
他の成長要素で代表的に供給されるのはＤＬ−メチオニ
ンである。説明されたタイプの栄養（１６） 培地は周知であり、かつ組成は広く変動させることが可
能である。
ンである。説明されたタイプの栄養（１６） 培地は周知であり、かつ組成は広く変動させることが可
能である。
殆どの微生物におけるＰＡＬ酵素の誘発可能性の故に、
細胞は上記したように慣用の培地において所望の細胞密
度に都合良く培養される。所望の細胞成長が達成された
後、ＰＡＬ誘発物質を促進ＰＡＬ合成に添加することが
できる。Ｌ−フェニルアラニンは良好なＦ Ａ Ｔ、誘
発物質であり、更にＬ−フェニルアラニンの多数の同族
体もまた、この酵素の合成を誘発する。たとえば、Ｌ−
チロシン、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、また
Ｈｍ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンモコの目的の
ために用いることができる。
細胞は上記したように慣用の培地において所望の細胞密
度に都合良く培養される。所望の細胞成長が達成された
後、ＰＡＬ誘発物質を促進ＰＡＬ合成に添加することが
できる。Ｌ−フェニルアラニンは良好なＦ Ａ Ｔ、誘
発物質であり、更にＬ−フェニルアラニンの多数の同族
体もまた、この酵素の合成を誘発する。たとえば、Ｌ−
チロシン、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、また
Ｈｍ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンモコの目的の
ために用いることができる。
細胞に対しＰＡＬ誘発物質はＰＡＬ−誘発量をもって添
加され、こｊ６は通常、細胞（乾燥重量）の約０．１乃
至約１．３ ｆ ／ ｆの範囲に及んでいる。
加され、こｊ６は通常、細胞（乾燥重量）の約０．１乃
至約１．３ ｆ ／ ｆの範囲に及んでいる。
好ましくはＰＡＬ誘発物質は約０．２乃至約０．５の濃
度において用いられる。この工程の間、温度、ｐＨおよ
び通気のＰＡＩ、−誘発条件が維持される。
度において用いられる。この工程の間、温度、ｐＨおよ
び通気のＰＡＩ、−誘発条件が維持される。
これらのパラメータは変動してもよく、そして通常は生
理的に適合した限度内に維持される。
理的に適合した限度内に維持される。
用いられる細胞がＰＡＬ合成の異化代謝りプレッション
に対し敏感であれば、誘発に先立って、異化代謝産物な
らびにそれらの前駆体を培地から減少または除去するた
めの手段を講するべきである。これは培地から細胞を分
離し、それらを洗浄し、かつそれらを異化代謝産物を含
まない培地中に懸濁させることにより達成される。ある
いはＰＡＬ誘発手順が開始される前に、栄養素が実質的
に使い尽くされるまで細胞を成長させることも可能であ
る。
に対し敏感であれば、誘発に先立って、異化代謝産物な
らびにそれらの前駆体を培地から減少または除去するた
めの手段を講するべきである。これは培地から細胞を分
離し、それらを洗浄し、かつそれらを異化代謝産物を含
まない培地中に懸濁させることにより達成される。ある
いはＰＡＬ誘発手順が開始される前に、栄養素が実質的
に使い尽くされるまで細胞を成長させることも可能であ
る。
これらの細胞はＰＡＬ−誘発条件下でＰＡＬ活性が約０
．５〜２，０単位／−１好ましくは約１．５単位／−に
達するまで培養するのが有利である。これらの条件下で
、ＰＡＬ活性は成る点まで増大し、次いで減少し始める
ことが一般に観察される。これらの手順により生成され
るＰＡＬはｔ−桂皮酸およびアンモニアからＬ−フェニ
ルアラニンを生成するために用いることができる。これ
らの反応体は水性培地中のＰＡＬ−含有細胞に直接添加
することもできるし、あるいはそれらから単離ネれた細
胞または酵素は知られた方法によシ固形支持体上に固定
することもでき、これは酵素活性が維持される限り再使
用可能である。
．５〜２，０単位／−１好ましくは約１．５単位／−に
達するまで培養するのが有利である。これらの条件下で
、ＰＡＬ活性は成る点まで増大し、次いで減少し始める
ことが一般に観察される。これらの手順により生成され
るＰＡＬはｔ−桂皮酸およびアンモニアからＬ−フェニ
ルアラニンを生成するために用いることができる。これ
らの反応体は水性培地中のＰＡＬ−含有細胞に直接添加
することもできるし、あるいはそれらから単離ネれた細
胞または酵素は知られた方法によシ固形支持体上に固定
することもでき、これは酵素活性が維持される限り再使
用可能である。
フェニルアラニンはこの方法によりフェニルアラニン−
生成条件下で生成される。これらの条件は全細胞または
細胞を含まない酵素生成物が用いられるか否かならびに
固定された系が用いられるか否かによって、使用特定微
生物菌株に左右される。通常、を−桂皮酸およびアンモ
ニア水（マタは可溶性アンモニウム塩）はアンモニア水
またはアンモニウム塩が過剰となるような量をもって供
給される。アンモニア水およびアンモニア塩類は約３乃
至約８モル／ｌの量をもって用いられる。
生成条件下で生成される。これらの条件は全細胞または
細胞を含まない酵素生成物が用いられるか否かならびに
固定された系が用いられるか否かによって、使用特定微
生物菌株に左右される。通常、を−桂皮酸およびアンモ
ニア水（マタは可溶性アンモニウム塩）はアンモニア水
またはアンモニウム塩が過剰となるような量をもって供
給される。アンモニア水およびアンモニア塩類は約３乃
至約８モル／ｌの量をもって用いられる。
高アンモニア濃度の目゛的はｔ−桂皮酸のフェニルアラ
ニンへの高い転化速度を得ることにある。を−桂皮酸は
約５乃至約３０９／ｌの量をもって用いられる。反応装
置内のｔ−桂皮酸の濃度は、を−桂皮酸の周期的な添加
によりこれらの範囲内に維持される。Ｉ）Ｈは９．５〜
１１、好ましくは１０．４（１９） 〜１０．８の範囲内に維持される。温度は通常１５〜３
５℃の範囲内に維持される。
ニンへの高い転化速度を得ることにある。を−桂皮酸は
約５乃至約３０９／ｌの量をもって用いられる。反応装
置内のｔ−桂皮酸の濃度は、を−桂皮酸の周期的な添加
によりこれらの範囲内に維持される。Ｉ）Ｈは９．５〜
１１、好ましくは１０．４（１９） 〜１０．８の範囲内に維持される。温度は通常１５〜３
５℃の範囲内に維持される。
これらの方法により生成ネれるＬ−フェニルアラニンは
何らかの適切な手段により回収可能である。このアミノ
酸の溶解性は比較的低いので、ｐＨをその等電点１５．
５ ＞に調節すると、生成物はしばしば反応混合物から
沈殿することになり、そ（２てこね、は濾過または遠心
分離により回収することができる。所望によりこの生成
物は更に丙結晶才たはカラムクロマトグラフィーにより
更に精製することが可能である。好ましい回収方法は、
ここに参考として引用する１９３３年１０月３１日出願
の米国出願第 ５４Ｔ７，１４０号中に記載されている
。
何らかの適切な手段により回収可能である。このアミノ
酸の溶解性は比較的低いので、ｐＨをその等電点１５．
５ ＞に調節すると、生成物はしばしば反応混合物から
沈殿することになり、そ（２てこね、は濾過または遠心
分離により回収することができる。所望によりこの生成
物は更に丙結晶才たはカラムクロマトグラフィーにより
更に精製することが可能である。好ましい回収方法は、
ここに参考として引用する１９３３年１０月３１日出願
の米国出願第 ５４Ｔ７，１４０号中に記載されている
。
本発明は更に以下の実施例によって例示されるが、これ
らは限度を意図するものではない。
らは限度を意図するものではない。
本実施例１ｄＰＡＬのオーバープロデューサー（ｏｖｅ
ｒ −ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ） ｆ得るための突然変異
および酵母細胞の選択を説明するものである。
ｒ −ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ） ｆ得るための突然変異
および酵母細胞の選択を説明するものである。
（２０）
菌株
ロードトルラ・ルブラ（ＡＴＣＣ４０５６）およびロー
ドスボリジウム・トルロイデス〔ＡＴＣＣ１０７８８；
メイテイングータイプ（ｍａｔｉｎｇ −ｔｙｐｅ ）
α〕をアメリカン・タイプ・カルチャー・−ｙ ｖ ク
ション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ’ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）、［米国メリーランド州
ロックヴイル〕から入手した。菌株はＹＥ寒天（下記参
照）上に保持した。引続き、５６Ｑｎｍにおいて光学濃
度を監視することにより液体培養物中で成長を行わせた
。光学濃度１．０は乾燥細胞重量約ｏ、３７ｔ／１に対
応する。培養物は３０℃で培養した。
ドスボリジウム・トルロイデス〔ＡＴＣＣ１０７８８；
メイテイングータイプ（ｍａｔｉｎｇ −ｔｙｐｅ ）
α〕をアメリカン・タイプ・カルチャー・−ｙ ｖ ク
ション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ’ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）、［米国メリーランド州
ロックヴイル〕から入手した。菌株はＹＥ寒天（下記参
照）上に保持した。引続き、５６Ｑｎｍにおいて光学濃
度を監視することにより液体培養物中で成長を行わせた
。光学濃度１．０は乾燥細胞重量約ｏ、３７ｔ／１に対
応する。培養物は３０℃で培養した。
培地
ＹＥ培地はリットル当り酵母抽出物１５ｒｉ含有してい
た。最少培地は、全てリットル当りで第１リン酸カリウ
ム１ｆ１硫酸マグネシウム０．５？、塩酸ナトリウム０
．１Ｆ、塩化カルシウム０．１ｔおよび各０．４■のビ
オチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、イノシトール
、ナイアシン、Ｐ−７ミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン
、リボフラビン、塩酸チアミン、はう酸、よう化カリウ
ム、塩化第２鉄、硫酸第１マンガン、モリブデン酸ナト
リウム、および硫酸亜鉛を含有していた。上記の他、Ｇ
Ｐ培地はリットル当りグルコース１０ｔおよびＬ−フェ
ニルアラニン５１？を、ＰＡ培地はリットル当り各５１
のＬ−フェニルアラニンおよび硫酸アンモニウムを、な
らびにＴＡ培地は各５ｔのＬ−チロシンおよび硫酸アン
モニウムを含有していた。固体培地は上記成分の他、リ
ットル当り寒天２０２を含有していた。
た。最少培地は、全てリットル当りで第１リン酸カリウ
ム１ｆ１硫酸マグネシウム０．５？、塩酸ナトリウム０
．１Ｆ、塩化カルシウム０．１ｔおよび各０．４■のビ
オチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、イノシトール
、ナイアシン、Ｐ−７ミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン
、リボフラビン、塩酸チアミン、はう酸、よう化カリウ
ム、塩化第２鉄、硫酸第１マンガン、モリブデン酸ナト
リウム、および硫酸亜鉛を含有していた。上記の他、Ｇ
Ｐ培地はリットル当りグルコース１０ｔおよびＬ−フェ
ニルアラニン５１？を、ＰＡ培地はリットル当り各５１
のＬ−フェニルアラニンおよび硫酸アンモニウムを、な
らびにＴＡ培地は各５ｔのＬ−チロシンおよび硫酸アン
モニウムを含有していた。固体培地は上記成分の他、リ
ットル当り寒天２０２を含有していた。
変種生成
培養物をＹＥ培地で培養して光学濃度１．５以上とした
。次に培養物を遠心分離し、ＰＡ培地中に光学濃度２を
もって再懸濁した。Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二
トロソグアニジン＋ ＮＴＧ）を添加して最終濃度２０
〜１００μｔ／１ｔｔｌとし、そして培養物を３０℃に
おいて３０分間振とうすることにより培養した。細胞は
希釈し、かつプレートにする前に洗浄した。スルホン酸
エチルメタン＋ＥＭＳ）変種生成に関して、細胞は上記
のように処理されるが、ＮＴＧをＥＭＳで置換し、最終
濃度５■／ ｍｌとなるように添加した。ＥＭＳに対す
る曝露は６０分間であった。
。次に培養物を遠心分離し、ＰＡ培地中に光学濃度２を
もって再懸濁した。Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二
トロソグアニジン＋ ＮＴＧ）を添加して最終濃度２０
〜１００μｔ／１ｔｔｌとし、そして培養物を３０℃に
おいて３０分間振とうすることにより培養した。細胞は
希釈し、かつプレートにする前に洗浄した。スルホン酸
エチルメタン＋ＥＭＳ）変種生成に関して、細胞は上記
のように処理されるが、ＮＴＧをＥＭＳで置換し、最終
濃度５■／ ｍｌとなるように添加した。ＥＭＳに対す
る曝露は６０分間であった。
ＰＡＬ検定
細胞の試料（１０〜１００μｔ）をトリス緩衝液（ｐＨ
８，８） ５０ ｍＭ、Ｌ−フェニルアラニン２５ｍＭ
、およヒ塩化セチルピリジウム０．００１％（ωｔ
／ ｖｏ７ ）から成る溶液９００μを添加することに
よりＰＡＬを測定した。この混合物を記録分光光度計内
で培養し、そして桂皮酸の出現を２８０ｎｍ１モル吸光
度−１６，２００）でフォローした。
８，８） ５０ ｍＭ、Ｌ−フェニルアラニン２５ｍＭ
、およヒ塩化セチルピリジウム０．００１％（ωｔ
／ ｖｏ７ ）から成る溶液９００μを添加することに
よりＰＡＬを測定した。この混合物を記録分光光度計内
で培養し、そして桂皮酸の出現を２８０ｎｍ１モル吸光
度−１６，２００）でフォローした。
Ｌ−チロシンを基質として用いたとき、光学濃度は３１
５ｎｍで監視した。クマリン酸にはモル吸光係数１０，
０００を用いた。光学濃度における増加速度は、通常細
胞への添加後１分乃至５分の直線増加期間中に測定した
。ＰＡＬの単位は、２２℃において分当り０．８３μモ
ルまたは３０℃において分当り１μモルの桂皮酸の生成
を融媒する酵素の量である。具体的な活性は乾燥細胞重
量のｆ当りのＰＡＬの単位として表わす（Ｕ／ｌ）。
５ｎｍで監視した。クマリン酸にはモル吸光係数１０，
０００を用いた。光学濃度における増加速度は、通常細
胞への添加後１分乃至５分の直線増加期間中に測定した
。ＰＡＬの単位は、２２℃において分当り０．８３μモ
ルまたは３０℃において分当り１μモルの桂皮酸の生成
を融媒する酵素の量である。具体的な活性は乾燥細胞重
量のｆ当りのＰＡＬの単位として表わす（Ｕ／ｌ）。
ＰＡＬ誘発
ＰＡＬ誘発に関して、菌株を寒天プレートからＹＥ培地
に接種し、そして３０℃で振とりすることにより培養し
た。５６０ｎｍにおける光学濃度が１．５以上に達した
とき、培養物を６０００ｘｆで１０分間遠心分離した。
に接種し、そして３０℃で振とりすることにより培養し
た。５６０ｎｍにおける光学濃度が１．５以上に達した
とき、培養物を６０００ｘｆで１０分間遠心分離した。
細胞ペレットは光学濃度１．０でＰＡ培地内に再懸濁さ
せた。次いで培養物は３０℃において本明細書で示した
時間にわたり振とうすることにより培養した。次にＰＡ
Ｌ活性および光学濃度を測定した。
せた。次いで培養物は３０℃において本明細書で示した
時間にわたり振とうすることにより培養した。次にＰＡ
Ｌ活性および光学濃度を測定した。
基質試験
数多くのフェニルアラニン同族体’ｅＰＡＬ用基質とし
て試験した。ＰＡ’Ｌの基質として各化合物の活性を、
トリス緩衝液（ｒ）Ｈ８，８） ５０ ｍＭ、塩化セチ
ルピリジニウム０．００１’ｌωｔ ／ ｖｏｔ ）お
よび試験すべき化合物２ ｍＭから成る溶液でＰＡＬ−
含有細胞であるＲ・ルブラＡＴＣＣ４０５６を培養する
場合の２８０ ｎｍまたは３１５ ｎｍにおける吸光度
の増加速度を測定することにより決定した。第１表に示
したこの試験の結果は数多くのフェニルアラニン同族体
がＰＡＬ基質としてＬ−フェニルアラニンより低い効率
を有することを示し、その結果ＰＡＬ−大量生産菌株を
本発明に従ってふるい分けするために使用可能であるこ
とを示している。この種の化合物には、Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル、Ｌ−フェニルアラニンエチルエ
ステル、ｍ−フルオロ−Ｄ％Ｌ−７ラニンおヨヒＰ −
フルオロ−ＤＸＬ−フェニルアラニンがある。
て試験した。ＰＡ’Ｌの基質として各化合物の活性を、
トリス緩衝液（ｒ）Ｈ８，８） ５０ ｍＭ、塩化セチ
ルピリジニウム０．００１’ｌωｔ ／ ｖｏｔ ）お
よび試験すべき化合物２ ｍＭから成る溶液でＰＡＬ−
含有細胞であるＲ・ルブラＡＴＣＣ４０５６を培養する
場合の２８０ ｎｍまたは３１５ ｎｍにおける吸光度
の増加速度を測定することにより決定した。第１表に示
したこの試験の結果は数多くのフェニルアラニン同族体
がＰＡＬ基質としてＬ−フェニルアラニンより低い効率
を有することを示し、その結果ＰＡＬ−大量生産菌株を
本発明に従ってふるい分けするために使用可能であるこ
とを示している。この種の化合物には、Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル、Ｌ−フェニルアラニンエチルエ
ステル、ｍ−フルオロ−Ｄ％Ｌ−７ラニンおヨヒＰ −
フルオロ−ＤＸＬ−フェニルアラニンがある。
Ｌ−チロシン培地上のミュータントの培養上記のように
調製されたＲ、ルブラおよびＲ。
調製されたＲ、ルブラおよびＲ。
トルロイデスのミュータントをＬ−チロシン含有培地（
ＴＡプレート）上でプレートとした。これら培地上での
培養５日後、希薄なコロニーが出現した。これらコロニ
ーの寸法はＬ−フェニルアラニンを炭素源とする２乃至
３日後の培養に見られるものと比較可能であった。Ｒ，
ルブラおよびＲ。
ＴＡプレート）上でプレートとした。これら培地上での
培養５日後、希薄なコロニーが出現した。これらコロニ
ーの寸法はＬ−フェニルアラニンを炭素源とする２乃至
３日後の培養に見られるものと比較可能であった。Ｒ，
ルブラおよびＲ。
トルロイデスの数個のコロニーをＴＡプレートから集め
て、セしてＴＡ寒天上に画線した。それらが成長したと
き、単一のコロニーを上記のようにＰＡＬについて誘発
した。ＰＡＬ検定の結果はこれら分離物の多くのものが
高レベルのＰＡＬを生成することを示した。４種類のこ
の種菌株が特に高レベルのＰＡＬ活性を生ずることを示
していた。
て、セしてＴＡ寒天上に画線した。それらが成長したと
き、単一のコロニーを上記のようにＰＡＬについて誘発
した。ＰＡＬ検定の結果はこれら分離物の多くのものが
高レベルのＰＡＬを生成することを示した。４種類のこ
の種菌株が特に高レベルのＰＡＬ活性を生ずることを示
していた。
これらの菌株は米国農務省、アグリカルチュラル、リサ
ーチ、カルチャー、コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ ）、〔米国、イリノイ州、ベコリアのノ
ーザン、リジオナル、゛リサーチ、センター（Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ） ］に寄託された。これらの菌株には以下
に掲げる表示（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ）および受入
れ番号が付与された。
ーチ、カルチャー、コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ ）、〔米国、イリノイ州、ベコリアのノ
ーザン、リジオナル、゛リサーチ、センター（Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ） ］に寄託された。これらの菌株には以下
に掲げる表示（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ）および受入
れ番号が付与された。
Ｒ，ルブラ ＧＸ３２４３ ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９７
Ｒ，ルブラ ＧＸ３２４２ ＮＲＲＬＹ−１５５９６Ｒ
，）ルロイデス ＧＸ３２４９ ＮＲＲＬＹ−１５５９
９Ｒ，）ルロイデス ＧＸ３２４８ ＮＲＲＬＹ−１５
５９８第 Ｉ 表 Ｌ−フェニルアラニン １００ Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル ６０Ｌ−フェニ
ルアラニンエチルエステル ４７ｍ−フルオロ−Ｄ、Ｌ
−フェニルアラニン ４３Ｌ−チロシン ３】 β−２−チェニル−Ｄ、Ｌ−アラニン ２７Ｐ−フルオ
ロ−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン ２０Ｌ−２−アミノ−
３−フェニル−１−プロパツール １５β−フェニル−
Ｄ、Ｌ−セリン １０ ｍ−Ｄ、Ｌ−チロシン ８ β−メチル−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン ５Ｄ−チロシ
ン 〈４ − 薫 Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニン 〈４− 黄兼 Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン 〈４Ｐ−７ミ
／−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン 〈３０−Ｄ、Ｌ−チロ
シン 〈３ ”ＣＢＺ はカルボベンジロキシを示す。
Ｒ，ルブラ ＧＸ３２４２ ＮＲＲＬＹ−１５５９６Ｒ
，）ルロイデス ＧＸ３２４９ ＮＲＲＬＹ−１５５９
９Ｒ，）ルロイデス ＧＸ３２４８ ＮＲＲＬＹ−１５
５９８第 Ｉ 表 Ｌ−フェニルアラニン １００ Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル ６０Ｌ−フェニ
ルアラニンエチルエステル ４７ｍ−フルオロ−Ｄ、Ｌ
−フェニルアラニン ４３Ｌ−チロシン ３】 β−２−チェニル−Ｄ、Ｌ−アラニン ２７Ｐ−フルオ
ロ−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン ２０Ｌ−２−アミノ−
３−フェニル−１−プロパツール １５β−フェニル−
Ｄ、Ｌ−セリン １０ ｍ−Ｄ、Ｌ−チロシン ８ β−メチル−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン ５Ｄ−チロシ
ン 〈４ − 薫 Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニン 〈４− 黄兼 Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン 〈４Ｐ−７ミ
／−Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン 〈３０−Ｄ、Ｌ−チロ
シン 〈３ ”ＣＢＺ はカルボベンジロキシを示す。
”ＢＯＣはＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルｔ 示ｆ
。
。
（２７）
第１頁の続き
■Ｉｎｔ、ＣＩ、４ 識別記号 庁内整理省ワ〇八
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）実質的に唯一の炭素源としてＬ−チロシンを含有
する最少本質的培地上で成長する能力を有するフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ生成微生物。 （２）ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）属のバクテリウムである特許請求の範囲第１項記載
の微生物。 （３） ロードトルラ、ロードスポリジウム、またはス
ホロホロマイ＋ｘ （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ
）属の酵母菌である特許請求の範囲第１項記載の微生物
。 （４）酵母菌ロードトルラ・ルブラ″′ｉ！たはロード
スポリジウム・トルロイデスである特許請求の範囲第３
項記載の微生物。 （５）菌株ＧＸ３２４３、ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９７の
同定特性を有するＲ、ルブラである特許請求の範囲第４
項記載の微生物。 （６） 菌株ＧＸ３２４２、ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９６
の同定特性を有するＲ、ルブラである特許請求の範囲第
４項記載の微生物。 （７）菌株ＧＸ３２４９、ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９９の
同定特性を有するＲ、）ルロイデスである特許請求の範
囲第４項記載の微生物。 （８）菌種ＧＸ３２４８、ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９８の
同定特性を有するＲ、）ルロイデスである！許請求の範
囲第４項記載の微生物。 （９）ＰＡＬ−生成条件下で、同化可能な炭素、窒素お
よび必須ミネラルおよび成長要素を含有する栄養培地中
でＰＡＬ−生成微生物菌株を培養する工程を含んで構成
され、この場合前記ＰＡＬ−生成微生物菌株が実質的に
唯一の炭素源としてＬ−チロシンを含有する最少本質的
培地上で成長する能力を有することを特徴とするフェニ
ルアラニンアンモニアリアーゼを生成する方法。 （１０）更に微生物菌株の細胞の成長が引続き、細胞に
対しＰＡＬ誘発物質を添加する工程を含んで構成される
特許請求の範囲第９項記載の方法。 （１１）更に、ＰＡＬ−誘発物質の添加に先立って栄養
培地中の異化代謝産物またはそれらの前駆体を除去する
か、あるいはそれらの濃度を減少させる工程を含んで構
成さね−る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 ＋１２）ＰＡＬ−生成微生物菌株がストレプトマイセス
属のバクテリウムである特許請求の範囲第９゜１０また
は１１項記載の方法。 ＋１３）ＰＡＬ−生成微生物菌株がロードトルラ、ロー
ドスポリジウム、またはスポロポロマイセス属の酵母菌
である特許請求の範囲第９，１ｏまたは１１項記載の方
法。 ＋１４）ＰＡＬ−生成微生物菌株がロードトルラ・ルブ
ラまたはロードスボリジウム・トルロイデスである特許
請求の範囲第１３項記載の方法。 ＋１５）ＰＡＬ−生成微生物菌株が菌株ＧＸ３２４３、
ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９７の同定特性を有するＲ、ルブ
ラである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ＋１６）ＰＡＬ−生成微生物菌株が菌株ＧＸ３２４２、
ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９６の同定特性を有するＲ、ルブ
ラである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ＋１７）ＰＡＬ−生成微生物菌株が菌株ＧＸ３２４９、
ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９！３の同定特性を有するＲ、）
ルロイデスである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ＋１８）ＰＡＬ−生成微生物菌株が菌株ＧＸ３２４８、
ＮＲＲＬ Ｙ−１５５９８の同定特性を有するＲ、）ル
ロイデスである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ＋１９） （ａ） ＰＡＬ−生成条件下で、同化可能な
炭素、窒素および必須ミネラルおよび成長要素を含有す
る栄養培地中でＰＡＬ−生成微生物菌株を培養し、この
場合前記ＰＡＬ−生成微生物菌株が実質的に唯一の炭素
源としてＬ−チロシンを含有する最少本質的培地上で成
長する能力を有しており、（ｂ） Ｌ−フェニルアラニ
ン生成条件下で、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ
をｔ−桂皮酸およびアンモニアと接触させてＬ−フェニ
ルアラニンを形成し、そして （Ｃ） そのＬ−フェニルアラニンを回収する工程を含
んで構成されることを特徴とするＬ−フェニルアラニン
の生成方法。 （２０）更に、微生物菌株の細胞の成長が引続き、細胞
に対しＰＡＬ誘発物質を添加する工程を含んで構成され
る特許請求の範囲第１９項記載の方法。 （２１）更に、ＰＡＬ−誘発物質の添加に先立って栄養
培地中の異化代謝産物または七ね、らの前駆体金除去す
るか、あるいはそれらの濃度を減少させる工程を含んで
構成される特許請求の範囲第２０項記載の方法。
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