JPS60227677A - 固定化微生物を用いるプロテア−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固定化微生物音用いるプロテアーゼの製造方法
、さらに詳しくいえば、グロテアーゼ生産能？有する固
定化微生物と限外ろ過膜とを組み合わせることにより、
菌体濃度全署しく高く維持し々がら連続培養を行い、効
率よくプロテアーゼ全製造する方法に関するものである
。

プロテアーゼは食品・水産加工工業において、大豆タン
パクや魚肉の加水分解などに用いられており、また皮革
工業、醸造工業あるいは洗剤工業々どの分野において広
く用いられている。特に近年、衣料用洗剤においては、
環境汚染の面からリン酸塩の使用が規制されるに伴い、
洗浄力を高めるためにアルカリプロテアーゼが配合され
るようになり、今後、その需要は大きく拡大することが
予想されている。

（従来の技術） 従来、プロテアーゼは培養液を満たしたタンク内に微生
物菌体を浮遊させ々から培養する方法によって製造され
ている。しかし々から、このような方法においては、効
率が悪く、シかも該微生物菌体を使い捨てにするという
問題がある。

ところで、近年、微生物や酵素全高分子ゲル中に閉じ込
めたり、あるいは高分子ゲルに化学的に結合させて固定
化し、種々の有用物質全産生式せる方法が開発され、実
用化の可能性が高まってきた。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、微生物？用いて効率よくプロテアーゼ全
製造する方法について研究７重ね、末端イソシアネート
型ウレタンプレポリマーを用いた固定化微生物が効率よ
くプロテアーゼを生産すること？見出したが、さらに鋭
意研究？進めた結果、該固定化微生物と限外ろ過膜と？
組み合わせることにより、菌体濃度を著しく高く維持し
彦がら連続培養を行うことが可能と々って、プロテアー
ゼの生産効率が飛躍的に増大すること？見出し、この知
見に基づいて本発明？完成するに至った。

（問題点全解決するための手段） すなわち、プロテアーゼ生産能？有する微生物？含む水
性媒体中に末端イソシアネート型つレタンプレポリマー
？加えて反応させ、次いで得られた固定化微生換金栄養
培地中で培養してプロテアーゼを製造するに当り、培養
液中のプロテアーゼ？限外ろ過膜を用いて培養液から分
離し、ろ過残留液全培養液に戻して培養？継続すること
を特徴とする固定化微生物？用いるプロテアーゼの製造
方法全提供するものである。

本発明方法において用いる微生物は、プロテアーゼ生産
能？有する微生物（以下プロテアーゼ生産微生物と略称
する）であれば特に制限は々く、任意に選択することが
できる。このような微生物としては、例えばバチルス・
ズブチリス、バチルス・サーモプロティオリティクス、
バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・ポリミ
キサ、バチルス・リケニホルミス、バチルス・アミロリ
フファシェンス、クロストリジウム・ヒストリティクム
、ストレプトマイセス・コリ、ストレプトマイセス・フ
シティ、シュードモナス・フルオレセンス、サーマス・
サーモフィラス、セラチア属々どの細菌類、及びアスパ
ルギルス・ニカー、アスパルギルス・オリザエ、ペニシ
リウム・クルクロピリラム々どのカビ類が適当である。

特にアルカリプロテアーゼ孕生産する微生物としてはバ
チルス・ズブチリス及びバチルス・リケニホルミス、３
− 中性プロテアーゼ全生産する微生物としてはクロストリ
ジウム・ヒストリティクム及びンユードモナス・フルオ
レセンスが好ましい。さらに、これらの中でバチルス・
リケニホルミスＡＴＯＯ−１４５８０、バチルス・ズブ
チリスＩＦＯ−３０１３、バチルス・アミロリフファシ
ェンスＡＴＯＣ！−２３８４２，バチルス・ステアロサ
ーモフィラスＡＴＯＯ−８００５及びサーマス・サーモ
フィラスＡＴＯＯ−２７６３４が特に適している。これ
らの微生物は一般によく知られた微生物であり、所望に
より公的機関又は各種研究機関よシ容易に入手可能であ
る。

本発明に用いる微生物の固定化材料としては、水性媒体
中で樹脂化又はゲル化するに際し、微生物の通り抜は全
妨げ、かつプロテアーゼ？自由に通過させるのに十分な
太きての孔径を有する包括ゲル全形成し、かつ該ゲルの
機械的強度が良好であり、その上微生物の増殖に悪影響
を与えないという要件金満たすものが要求でれ、このよ
うがものとして、末端イソシアネート型ウレタンプレポ
リマーが適している。この末端イソシアネート型４− ウレタンプレポリマーとは、例えばポリエチレングリコ
ール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレンポリ
オールなどのポリオキシアルキレンポリオールと化学量
論的に過剰量のポリイソシアネートとの反応生成物が挙
げられる。

前記ポリオキシアルキレンポリオールとしては、ｆｙＬ
ｔハ：ｒ−ｙ−レンクリコール、フロピレンゲリコール
、グリセリン、ペンタエリスリトールなどの多価アルコ
ール又はエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、ピ
ペラジン、アルキルアミンなどのアミン類に、エチレン
オキシド、プロピレンオキシドなど全付加して得られる
分子量約２００〜２０．０００．好ましくは約５００〜
５，０００のエチレンオキシド含有割合が約５０重量％
以上、好ましくは約７０重量多以上のものが挙げられる
。また、ポリイソシアネートの例としては、トリレンジ
イソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネート、
ヘキサメチレンジイソシアネート、デスモジ：Ｌ　／Ｌ
／　Ｌ　（バイエル社製）のようなジイソシアネートな
どが挙げられる。

本発明に用いるウレタンプレポリマーハ、末端イソシア
ネート基の量が２〜１０重量係、好ましくは３〜７重量
重量範囲になるように調製される。

このイソシアネート基の量が２重量係未満では形成され
るゲルの強度が小さく、また１０重量％？超えるとゲル
化（ポリマー化）反応が激しいため、微生物が死滅しや
すいので不適当である。

これらのウレタンプレポリマーを用いて微生物？固定化
する場合、該微生物ケ含む水性懸濁液にウレタンプレポ
リマー？混合し、０．０１〜ｉｏｍｍ程度の厚さに１０
分〜２時間放置することにより、反応してゲル化する。

このゲル化温度は６０℃以下、好ましくは０〜４０℃の
範囲である。得られた固定化微生物は含水状態のゲルの
５０重量％以下、好ましくは２０重量％以下であること
が望ましいが、微生物が増殖するので、これ以上の含有
割合でも差し支えない。

本発明方法においては、前記のようにして得られた固定
化プロテアーゼ生産微生物を栄養培地中で培養してプロ
テアーゼ？製造する。この培地に添加する栄養源として
は、例えば炭素源としてブドウ糖、果糖、乳糖、ソルビ
トールなどの糖類、デンプン、セルロース、ペクチンな
どの多糖類、クエン酸、コ・・り酸のような有機酸類な
どが、窒素源としては尿素、アミノ酸、ペプトン、コー
ンステープリカー、酵母エキスなどが、また無機塩類と
してはリン酸モノカリウム、リン酸ジカリウム、硫酸マ
グネシウムなどのリン、カリウム及びイオウの供給物質
がそれぞれ適宜使用される。これらの栄養源は前記の例
示に限定されるものではなく、これら以外のものも任意
に使用することができる。また培養液中におけるこれら
の栄養源の濃度は微生物の種類、固定化に用いたプレポ
リマーの種類、微生物の培養条件により異なるので、プ
ロテアーゼ孕製造する際に、最適条件金遣ぶことが望ま
しい。

本発明方法の特徴は、菌体全培養し々から、培養系から
培養液の一部全リサイクルし、そのリサイクルの途中で
限外ろ過膜音用いて培養液全ろ過し、菌体濃度が高くな
った培養液を培養系に戻し、ろ液からプロテアーゼ４分
離する点にある。この際、培養系にろ液に見合う量の培
養液全追加すれば、培養系の容積を一定に保つことがで
きるので、長時間の連続培養が可能となる。

本発明において用いる限外ろ過膜としては、通常プロテ
アーゼの分子量は１万〜５万であシ、また菌体は１μ程
度であるので、分子量５万以上、１μ以下の分離可能な
漢音使用するのがよい。これ以上の平均孔後金もった漢
音使用すると、微生物菌体全通過きせる可能性があるの
で好ましく彦い。また、通常の限外ろ過膜以外のもの、
例えばダイヤフローメンプランやホローファイバー彦ど
も、前記性能ケ有するものであれば使用することができ
る。

本発明？実施するに当り、培養条件としてはｐＨは４〜
８、好ましくは５〜７、温度は１０〜６０℃、好１しく
け２５〜５０℃の範囲が適当である。

また、固定化微生物のプロテアーゼ産生量はその培養条
件によって異なるが、通常３０〜２００　時間で最大と
なる。一般に連続培養を行う場合、連続培養全開始する
時期と平均滞留時間が重要であシ、通常、活性が最大と
々る時期の±２０時間より連続培養を開始するのがよい
。捷た、平均滞留時間は、プロテアーゼ生産が最大とな
るまでの培養時間、す々わち３０〜２００時間に調節す
ることが望ましい。培養装置としては、例えば従来のか
くはん種型培養槽、振とり培養機、流動層型培養装置々
どのほか、充てんカラムなども使用しうる。

本発明により製造されたプロテアーゼは、ろ液中から、
例えば塩析、ｐＨ調節、あるいは樹脂による吸着分離な
どの方法によって、単離、精製することができる。

（発明の効果） 本発明のプロテアーゼ製造方法においては、ウレタンプ
レポリマー固定化菌体と限外ろ過膜との組合せにより、
菌体濃度全署しく高めた状態全維持して、連続培養全行
うことが可能であり、したがって、菌体の代謝生産物で
あるプロテアーゼの生産？著しく高めることが長期間に
おいて可能となる。また、包括固定化材料は極めて多く
のものが公知であるが、本発明のように末端イソシアネ
ート型ウレタンプレポリマーを用いてプロテアーゼ生産
菌全固定した場合、その菌体の増殖が他の固定化材料に
比べて著しく良好である。その理由については、必ずし
も明確では々いが、おそらく、ウレタンプレポリマー包
括ゲルの内部構造がプロテアーゼ生産菌の生育環境に適
しているためと考えられる。さらに、限外ろ過膜？用い
て培養する場合、固定化しない菌体音用いるよりも、固
定化した菌体２用いるほうが、プロテアーゼ生産量が多
いという効果を有する。

（実施例） 次に実施例によって本発明？さらに詳細に説明する。

なお、試薬は滅菌処理したのち使用し、操作は無菌室で
行った。

また、培養液はラクトース６０ｆ、コーンステープリカ
ー１０　？、ペプトン１７ｆ？、リン酸ジカリウム１４
１、リン酸モノカリウム６１、クエン酸ナトリウム３７
、硫酸アンモニウム６１、炭酸カルシウム０．５９及び
硫酸マグネシウムｌｉｉ”ｉ水に溶解し、全量がＩＡ［
々るように水分量全調節して製造した。

微生物については、微生物全４８時間スラント培養し、
次いでスラント培地から１白金耳の菌体全敗り出し、９
６時間前培養して得た前培養液１０ｍ１！’ｉ遠心分離
し、次いで生理食塩水１０ｍ１に分散させて菌体希釈液
とし、これを実験に用いた。

実施例１、比較例１ 分子量２，０００のポリエチレングリコール１モルとト
リレンジイソシアネート２モルと全反応させて得られた
イソシアネート含有率３．５係の末端イソシアネート型
ウレタンプレポリマー１００２に、バチルスｅリケニホ
ルミスＡＴＣＣ−１４５８０の菌体希釈液２００−を２
５℃で加えて混合したのち、１時間放置して固定化微生
物全製造した。この固定化微生物’ｚ　１　ｃｔｄの立
方体に切断し、その体積４００７！をあらかじめ調製し
た培養液１ｔに加え、３７℃にて、２１容量のミニジャ
ーファーメンタ−（いわしや生物科学社製）を用い、１
１０００ｒｐ１１− にてかきまぜ、通気下培養を行った。

培養開始後、経時的にプロテアーゼ活性を測定し、５５
時間経過した時点でプロテアーゼ活性が１５．０００　
ｕ／ｒｎ１．（地人書館発行「酵素利用・・ンドブツク
」２０７ページ記載の方法）の最大値？示したので、６
０時間後よシ、培養液全ミリポア社製ペリコンカセリト
ンステム（限外ろ過膜：ＰＴＨＫ分子量１０万全使用）
を用いて、１８ｒｎｌ／ｈｒ　（平均滞留時間５５ｈｒ
）の流速でプロテアーゼ含有液が排出されるように調節
して、限外ろ過？行い、同時に１’８ｍｌ／ｈｒの流速
で、前記の培養液組成と全く同一の培養液金新たに供給
して連続培養？開始し、経時的にプロテアーゼ活性と全
菌数（培養液の１００倍希釈の６６０ｍμでの吸光度）
を測定した。また、比較のために、ベリコンカセリトン
ステムを用い彦いて同様に培養を行い、プロテアーゼ活
性と全菌数全測定した。これらの結果全第１表に示す。

なお、全菌数は連続培養７行っているときの培養液の平
均全菌数であり、総プロテアーゼは連続培養中の総取出
量全示す。連続培養時間１２− は２４０時間である。

第　１　表 実施例２、比較例２ 分子量１５００のポリエチレングリコール１モル、プロ
ピレングリコール全開始剤とするポリオキシプロピレン
−ポリオキシエチレンクリコール（エチレンオキシド含
量７０重量％、分子量３０００）１モル及びトリレンジ
イランアネート４モル全反応させて得られた末端イソシ
アネート型ウレタンプレポリマー（イソシアネート含有
率４．７　％　）　Ｔｈ用いて、実施例１と同様な方法
により培養したところ、培養開始後６０時間後に、プロ
テアーゼ活性が１４，５００ｕ／ｍｅの最大値を示した
ので、６５時間後より培養液を実施例１と同様々方法で
限外ろ過？行い、１７ｍｇ／ｈｒ　（平均滞留時間６０
ｈｒ）の流速でプロテアーゼ含有ろ液が排出されるよう
に調節した。同時に１７ｍ１／ｈｒの流速で、前記の培
養液組成と全く同一の培養液を新たに供給して２３５時
間連続培養培養−、プロテアーゼ活性と全菌数全測定し
た。また、比較のために、ペリコンカセリトンステム？
用いかいで、同様に連続培養全行い、プロテアーゼ活性
と全菌数全測定した。

これらの結果全第２表に示す。

第　２　表 実施例３ 実施例１と全く同様の操作を行った。ただし、新たに培
養液？添加することなく、３８時間、限外ろ過膜によシ
ブロチアーゼ含有ろ液を排出すると同時に、菌体はリサ
イクルする操作？くり返した。この際のプロテアーゼ含
有ろ液と培養槽中に残存する培養液中の総プロテアーゼ
量は１，８５０Ｘ１０’ｕであった。

実施例４．５ 実施例１と全く同様の操作７行った。ただし、限外ろ過
膜として、ＰＳｖＰ分子量１００万（実施例４）、及び
ＧＶＷＰ　Ｏ，２２１！　（実施例５）（いずレモミリ
ポア社製）？用いて２４０時間連続培養孕行つ′ｆｃ。

その結果？第３表に示す。

第　３　表 特許出願人　ライオン株式会社 （ほか１名） 代理人阿　形　明

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　プロテアーゼ生産能を有する微生物を含む水性媒体
   中に末端イソシアネート型つレタンプレポリマー全加え
   て反応させ、次いで得られた固定化微生物を栄養培地中
   で培養してプロテアーゼを製造するに当り、培養液中の
   プロテアーゼを限外ろ過膜？用いて培養液から分離回収
   し、ろ過残留液全培養液に戻して培養を継続することを
   特徴とする固定化微生物を用いるプロテアーゼの製造方
   法。