JPS60227699A - エステル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用試薬 - Google Patents

エステル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用試薬

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JPS60227699A
JPS60227699A JP60070163A JP7016385A JPS60227699A JP S60227699 A JPS60227699 A JP S60227699A JP 60070163 A JP60070163 A JP 60070163A JP 7016385 A JP7016385 A JP 7016385A JP S60227699 A JPS60227699 A JP S60227699A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエステル類が特に試験片中の試験試薬中に適当
な方法で含有されている、例えば体液中のエステル分解
及び／又は蛋白質分解酵素の分析検出のための試薬に関
する。発色性酵素基質（適当なフェノール類のアミノ酸
エステル類或いはペプチドエステル類）及び適当な場合
にはこれらのフェノール類とカップリングして色を形成
するジアゾニウム塩類の他に、本発明の試薬は又これら
のアミノ酸エステル類或いはペプチドエステル類の酵素
的切断の促進剤としてのポリアミノ酸も又含有するもの
である。これらの試薬は特に尿中の白血球の検出に使用
するのが好ましい。
体液、特に尿中の白血球の検出は腎臓及び尿生殖系路の
病気の診断において極めて重要である。
この検出は元々遠心分離にかけられ々い尿或いは尿沈澱
物において白血球の数を数えることにより行われていた
。これらの両方法においては完全々白血球を記録し得る
にすぎない。しかし々から、白血球−リーシスの速度は
尿媒体に応じて広間に変化し、例えば強アルカリ性尿内
においては白血球の半減期は僅かに６０分に過ぎない。
これは、測定される白血球の計測数が余りにも低いとい
うことを意味する。このリーシスの誤差を別にすれば白
血球の非−遠心分離均質化尿中の白血球の測定は計測室
において極めて正確な値を与えるものである。にも拘ら
ず、この方法は余り実際には利用されていないのは、手
間及び時間がかかり熟練者を必要とするからである。
医学的実践における、尿中における白血球の測定のため
の好ましい方法は従って尿沈澱物における所謂視野法で
あった。このためには試料（沈澱）を先ず遠心分離によ
り得なければならなかった。
しかしながら、その除銀の他の構成々分も濃縮され、こ
れらＫは例えば塩類及び表皮細胞類が含まれ、白血球の
顕微鏡による計数を相当により困難なものにする。変化
する沈澱の含量、沈澱の不均質性及び顕微鏡の異った光
学的設計が白血球計数を述べる際に比較的大きな誤差（
数百チまで）に導いた。
これらの困難を回避するために、白血球は広範囲に広が
った酵素スペクトルを有するので各種体液□における白
血球に対する検出原理として酵素反応を使用する試みが
既になされている。
即ち、例えば体液中における白血球の検出試薬は西独公
開公報２，８２６，９６５号、２，８３６，６４４号明
細書より公知であり、これらの明細書中においては白血
球内に存在するエステル分解及び／又は蛋白質分解酵素
が分析目的のために利用されている。スルホンフタレン
エステル類或いはアゾ色素エステル類が白血球エステラ
ーゼ及び／又はプロテアーゼの基質として使用されてい
る。酵素反応において放出された色累は次いで公知の方
法により測定される。しかしながら、これらの公報に記
載された試薬はそれらの反応時間が低い白血球の濃度に
対しては余シに長いのでなお実用目的のためには感度が
余りにも低いものである。
プロテアーゼ類及びエステラーゼ類の各種検出方法が又
組織化学及び植物化学的酵素学から公知である（例えば
、Ａ、Ｇ、Ｅ、ピアス、ヒストケミストリ、セオレテイ
カル・アンドｅアプライド、第３版、チャーチルφリヒ
ングストン、ニシンバラ・ロンドン・ニューヨーク（ｐ
ｅａｒｓｅＪ（ｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｅｏ
ｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　ＡＰｐ−１ｉｅｄ、３ｒｄ　
ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓ
ｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂ−ｕｒｇｈ−Ｌｏｎｄｏｎ　−Ｎ
ｅｗ　ｙｏｒｋ）　１９６８参照）。一般的に、検出の
ためには無色或いは僅かに着色したエステル類が用いら
れ、これらは酵素により無色の酸及び無色のアルコール
（フェノール）成分に分解される。このフェノール成分
を次いで例えばジアゾニウム塩とのカップリング或いは
酸化による引き続く反応において着色生成物に転換する
。例えばシュマルツル（’　Ｆ、　５ｃｈｒｎａｌｚｌ
　）　及びブラウンスタイナー（Ｈ，Ｂｒａｕｎｓｔｅ
ｉｎｅｒ　）はりＩＪ　＞　＊　ウシ：ｘ、　ル（Ｋｌ
ｉｎ、Ｗｓｃｈｅｒ、　）　４６．６４２　（１９６８
）において基質トシテナフトールーＡｓ−Ｄ−クロロア
セテート及び放出されたナフトールと着色アゾ化合物を
形成するジアゾニウム塩を用いた特異的な植物化学的な
白血球エステラーゼの検出を記載している。
しかしながら、このタイプの二成分系は体液、例えば、
尿における白血球の迅速且つ簡易な検出のためには不適
当であることが判明している。何故ならば、それらは余
りにも感度が低く　５，０００白血球数／μ２　を含有
する試料もなお反応を与えない程度であるからである。
英国特許Ａ　−１，１２８，３７１号及びヨーロッパ特
許Ａ〜１２，９５７号は体液内の加水分解酵素の検出の
ために発色性基質としてのインドキシル及びチオインド
キシルエステル類の使用を記載している。
この基質の酵素的切断に際して遊離のインドキシルが形
成され、それは引続いて酸化されて容易に検出できる青
色色素インジゴになる。ヨーロッパ特許Ａ−１２，９５
７号に基づく市販の試験具はＮ−トシル−Ｌ−アラニン
し一インドキシルエステルで含浸された濾紙片よりなる
ものである。との試験片を白血球を含む尿試料中に浸け
るとそれは青色に変色する。しかし寿から、最終着色に
到達し、試験を評価する迄にかかる長い待ち時間（約１
５分）はこの製品の相当な欠点である。
ヨーロッパ特許Ａ−１４，９２９号は酵素的切断反応の
ための各種促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾール誘導
体、アルカリ土類金属錯体）を記載している。［７かし
ながら、インドキシルの完全々酸化までの比較的長い時
間及びこの試験の低い感度（検出限度：数千白血球数／
μＱ）は依然欠点として残る。同様なことは、ヨーロッ
パ特許Ａ−３４、３２３号に従った白血球酵素の基質と
してロイコ−インドアニリン類のエステル類を使用する
場合にも当てはまる。
ヨーロッハ％許ｈ　−３９，８８０号はヨーロッパ特許
１２．．９５７号及び１４，９２９号による基質と上記
のジアゾニウム塩とのカップリングの検出原理との組み
合わせな与えるものである。この様にして白血球の検出
限界を相当に減少させることが可能であるが、実用に際
して望まれる１５−２０白血球数／μαの検出感度はな
お達成されていない。
本発明の目的はこの様に白血球酵素による基質の酵素的
切断の促進の結果、尿中の白血球のより高感度及びより
迅速な検出を可能にするエステル−切断酵素のための新
規促進剤を発見することであった。この目的は試薬系に
ポリアミノ酸を使用することにより達成される。驚くべ
きことに、ポリアミノ酸類はヨーロッパ特許Ａ−’１４
，９２９号に記載される促進剤（ピリジン誘導体、イミ
ダゾール誘導体、金属錯体及びアルコール類）よりも優
れた白血球酵素に対する促進作用を有する。加うるに、
それらは又洗剤としても使用することが出来るので、そ
の結果、実施に対して試薬系に対する洗剤の同時添加（
例えば試験片の被栓のための反応溶液或いは配合物）は
不要となる。
本発明は（ａ）発色性酵素基質としてフェノールのアミ
ノ酸エステル或いはペプチドエステル、（ｂ）成分（ａ
ｌのアミノ酸エステル結合或いはペプチドエステル結合
の酵素的切断を促進する物質、適当な場合には（Ｃ）ジ
アゾニウム塩、適当な場合には（ａｉ　ｇ衝液、及び適
当な場合には（ｅ）担体及び／又は通常の添加剤を含ん
でなるエステル分解及び／又は蛋白質分解＃素の検出の
だめの試薬において成分子ｂ）が好ましくは塩基性基を
含有し、１０００〜２，０００，０００の分子量（数平
均）を有するポリアミノ酸であることを特徴とするもの
に関する。
最後に、本発明は又、液体試料特に体液におけるエステ
ル分解及び／又は蛋白質分解酵素の検出方法において試
料を本発明に従った試薬と接触させ生ずる色反応−を測
定することを特徴とする方法にも関する。
ｚ−０）アミノ酸から構成されたポリアミノ酸（ホモポ
リアミノ酸類）及び構成アミノ酸のランダム化された配
列な有するコポリアミノ酸の形態或いは配列重合体の形
態の２綽以上のアミノ酸の重縮合体のいずれも本発明に
従って使用すべき適当な促進剤である。配列重合体はペ
プチド類或いはそれらの誘導体の重縮合において得られ
、ある一定の繰返しアミノ酸配列を有する。ポリアミノ
酸の促進作用のためには重合或いは共１合に使用される
少なくとも１種のアミノ酸が塩基性基例えばアミノ基或
いはグアニド基を有するのが特に有利である。
好ましくは、本発明に従って使用されるポリアミノ酸類
は下記一般式を有する同種又は異種の単量体から構成さ
れるのがよい： Ｈ２Ｎ　−ＣＨＣ０ＯＨ（Ｉ） ■ （式中、Ｒは水紫或いは１〜１５の炭素数、好ましくは
１〜９の炭素数であり、場合により１個或イは２個の、
特に１個のヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシ
ル基、アミノ基或いはグアニ　ドにより置換されていて
もよい、場合により分岐したアルキル基、シクロアルキ
ル基或いはアラルキル基を表わす）。
本発明に従って促進剤として使用されるポリアミノ酸は
５〜１００モルチ特に１０〜１００モル係の、塩基性基
を有する単量体単位な含むのが好ましい、っ特に好まし
いこのタイプの単量体単位はＲ基においてアミノ基或い
はグアニド基を含有する一般式（Ｉ）で表わされるアミ
ノ酸類である。その様な塩基性アミノ酸の具体例は特に
アルギニン、リジン及びオルニチンでありそれらはラセ
ミ体或いはＬ−或いはＤ一体のいずれであってもよい。
ポリアミノ酸類及び配列重合体は更に天然の蛋白質には
存在しない塩基性アミノ酸を単位として含有することが
できる。ここで挙げることのできる具体例としては、α
、γ−ジアミノ酪酸、α、β−ジアミノプロピオン酸及
びジアミノピメリン酸などである。
酵素的切断の促進剤として、本発明に従って使用される
ポリアミノ酸は文献よシ公知であり、且つ市販されてお
り或いは又それらはそれ自体公知の方法に従って調製す
ることができる（例えば（カチャルフキ−（Ｅ、Ｋａｔ
ｃｈａｌｓｋｉ　）及びセラ（Ｍ。
３ｅｌａ）　、蛋白化学の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｏ
ｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ（：ｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１３　、
２４３−４９２　８１９５８３　；及びアンフインゼン
（Ｃ，Ｌ、　Ａｎｆｉｎｓｅｎ　）、アンソン（Ｍ。
Ｌ、Ａｎｓｏｎ　）　、ニドソール（Ｊ、Ｔ、　Ｅｄｓ
ａｌｌ）及びベイリ（Ｋ、１３ａｉｌｅｙ　）　（編者
）アカテミツク・プレス・インコーホレーテッド、パブ
リツシャー、ニューヨーク（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　Ｉｎｃ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　ＮｅｗＹｏ
ｒｋ））参照。
ポリアミノ酸の平均分子量（数平均）は１，０００〜２
，０００，０００の間にあるべきであり、５　、０００
〜ｓｏｏ、ｏｏｏの平均分子量のポリアミノ酸が好まし
くは使用され、１０　、０００〜３００，０００　の平
均分子量のものが特に好ましい。
ポリアミノ酸類は均質な液体試験においてはＱ、０００
１重量％〜１重量％の濃度で使用するのが好ましく、特
に０００１〜０．０１重量％の範囲の濃度が好ましい。
以下に示す試験装置の調製において、それらは含浸溶液
に基づいて０．０５重量％〜１０重量％、好ましくは１
〜５重量重量源度で使用される。本発明に従って使用さ
れるポリアミノ酸類は白血球酵素によるヨーロッパ特許
Ａ−７．４０７号、８．４２８号、１２，９５７号、１
４　、９２９号、３４　、３２３号及び３９，８８０号
に記載される基質の酵素的切断並びに既に先に述べた基
質の切断を促進する【ゴモリ（Ｑ、　Ｑｏｍｏｒｉ　）
　、ジエー・ヒストケム・サイトケＡ　（Ｊ、Ｈｉｓｔ
ｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）　６４６９　（１
９５３）　；リュフラー（Ｈ，Ｌ′６ｆｆｌｅｒ　）　
、クリン、ウォッチエンシャー（ＫＬｉｎ、Ｗｏｃｈｅ
ｎｓｃｈｅｒ、　）　３９　、１１２０　（１９６１）
　；グイツサ（Ｌ、Ｖｉｓｓｅｒ　）及びブラウト（Ｅ
、　ＢＬｏｕｔ）フェト−ブロック（Ｆｅａ　−Ｐｒｏ
ｃ、　）　２８　、４０７　（１９６９）バイオケム・
パイオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　）　２６８　、２５７　
（１９７２）、及びスウィートマン（Ｆ、　Ｓｗｅｅｔ
ｍａｎ　）及びオルンスタイン（Ｌ。
Ｑｒｎｓｔｅｉｎ　）　、ヒストケム・サイトケム（Ｊ
、Ｈｉｓｔｏ−ｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）　
２３．３２７　（１９７４）　）。
本発明による試薬中の好ましい発色性基質は又下記一般
式（ＩＩ）で表わされる同時係属中の出願に記載される
化合物も又含むことができる：〔式中、Ｘｌ及びＸ２は
同種又は異種であり、窒素又はイオウな示しく但し、Ｘ
ｌ及びＸ２は同時にはイオウを表わさガい）　、Ｒ１は
水素或いは１〜６の炭素数の場合によりノ・ロゲン或い
はヒドロキシルで置換されてもよい、場合により分岐し
たアルキル基を表わし、Ｒ２及びＲ３は同種又は異種で
あり、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、Ｃｔ　Ｃ６−ア
ルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６−アシル基、ハロゲン、トリフ
ルオロメチル基、ニトロ基、５Ｏ３Ｈ基、シアノ基、Ｃ
□−Ｃ８−アシルアミノ基、Ｃ４Ｃ６−ジアルキルアミ
ノ基、或いはＣ６Ｃｌ０−アリール基（これらは又更に
ＣｌＣｓ−アルキル基、ＣｌＣｏ−アルコキシ基、ハロ
ゲン、シアン基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、５
Ｏ３Ｈ基ｓ　ＣＩ　Ｃａ−アシル基或いはＣｌＣ６ジア
ルキルアミノ基により置換されていてもよい）、或いは
Ｒ２及びＲ３は共に縮合芳香族環好ましくはベンゼン環
（これは更に１個又は２個のＲ２基で置換されてもよい
）を形成し、Ａはアミノ酸基或いはペプチド基を示し、
及びＧは水素或いは好ましくはペプチド化学において通
常用いられる窒素保護基或いはその様な基から誘導され
た基を表わす〕。
一般式（ＩＩ）で表わされる好ましい化合物はＸｔがイ
オウな表わし、及びＸ２が窒素を表わすものである。Ｒ
１が水素を表わす一般式（ＩＩ）の化合物及びＲ２及び
Ｒ３が同種又は異種であり、水素、ＣＩ　−Ｃ２−アル
キルｓ　ＣＩ　Ｃ２−アルコキシ基、ハロゲン、Ｃｌ−
Ｃ４−ジアルキルアミノ基或いはベンゼン基を表わすも
のは更に好ましい。
一般式（ＩＴ）の化合物におけるエステル基は５−位に
あるのが特に好ましい。
その他の本発明に従って好ましい発色性基質は同様に同
時係属中の出願に記載されている下記一般式皿）で表わ
される化合物である： 〔式中、Ｘ３及びＸ４はＮ又はＣＨを表わしく但しいず
れの場合にもＸ３或いはＸ４のいずれかはＮを表わす）
、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は同種又は異種であり水素、Ｃｌ
−Ｃ６−アルキル基、Ｃ１−Ｃａ−アルコキシ基、Ｃ１
−Ｃ６−アシル基、ハロゲン、トリフルオロメチル基、
ニトロ基、５ＯｓＨ基、シアノ基、Ｃ１−Ｃｇ−アシル
アミノ基、ＣＩ　Ｃ６−ジアルキルアミン基、或いはＣ
５−Ｃｔｏ−アリール基（それらは更にＣＩ　Ｃ６−ア
ルキル基、Ｃｔ−Ｃ６−アルコキン基、ハロゲン、シア
ノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、５Ｏ３Ｈ基、
ＣｌＣａ−アシル基或いはＣｌＣａ−ジアルキルアミノ
基により置換されていてもよい）、或いはＲｓ、Ｒ６は
共に縮合芳香族環好ましくはベンゼン環（それは更に１
個又は２個のＲ４基によシ置換されていてもよい）を形
成１−１及びＡ及びＧは上記一般式（ＩＩ）の場合に与
えられたと同一の意義を有する〕。
上記一般式側に従った化合物においてＸ３は好ましくは
ＣＨを表わし、Ｘ４は好ましくは窒素を表わす。同種或
いは異種であってもよいＲ４、Ｒ５及びＲ６は好ましく
は水素、Ｃｌ−Ｃ４−アルキル基、Ｃｔ−Ｃ４−アルコ
キシ基、アシルアミノ基（酸基は１〜６個の炭票数の脂
肪族或いは芳香族基である）、Ｃｌ−０４−ジアルキル
アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、或いはアリ
ール基（場合によりＣ１−Ｃ４アルキル基ｓ　Ｃｓ　Ｃ
４−アルコキシ基、或いはハロゲンで置換されていても
よい）を表わす。
特に好ましくは、Ｒ４、Ｒｓ及びＲ６は水素、Ｃｌ−Ｃ
４−アルキル基、フェニル基、或いはハロゲン、或いは
Ｒ５及びＲ６は共に縮合したベンゼン環を形成する。
本発明に従った試薬として適当な発色性基質は又、次の
一般式で表わされる化合物である：〔式中、Ｒ４１，Ｒ
ｓ、Ｒ６、Ａ及びＧは上記一般式（ＩＩＩ）の場合と同
一の意味を有する）。
一般式（ｎ）、（Ｒ１）及ヒ（Ｉｖ）ニオイテ、Ｇ−Ａ
は好ましくは次の一般式を表わす： Ｒ８−ＨＮ−ＣＨ−Ｃ− ７ 〔式中、Ｒ７は水素或いは１〜１５の炭素原子、好まし
くは１〜９個の炭素原子を有し、場合によりヒドロキシ
ル基、メルカプト基或いはカルボキシル基により置換さ
れている）場合により分岐されたアルキル基、シクロア
ルキル基或いはアリール基な表わし、及びＲ８は水素、
或いは好ましくは−ＣＯ−Ｃルール、−ＣＯ−アラルキ
ル基、−ＣＯ−アリール基、−８ｏ２−アルキル基或い
は−８０２−アリール基を表わし、アルキル基は１〜９
個の炭素数好ましくは１〜６個の炭素数を有する直鎖或
いは分岐鎖のものであり、及びアリール基は好ま［７く
は場合によりＣＩ　Ｃ４−アルキル基、ＣＩＣ４−アル
コキシ基或いはハロゲンにより置換されているベンゼン
環を表わす〕。
Ｇ−Ａ−は好ましくは、天然に存在するアミノ酸或いは
２〜８個のその様なアミノ酸のペプチドの通常の窒紫保
簡基を有する基を表わす。
アミノ酸基はそれらのＬ−或いはＤ一体或いはそれらの
ラセミ体であ、り得る。特に好ましい基は、グリシン、
アラニン、バリン、ロイシン、インロイシン、フェニル
アラニン及びチロシンのものであり、いずれの場合にお
いてもし一体が特に好ましい。存在する任意の遊離ヒド
ロキシ基はアシル化好ましくはアセチル化することがで
きる。
Ａの定義におけるペプチド基は、例えば、ジー、トリー
、テトラ−及びペンタ−ペプチド類、好ましくはジー及
びトリーペプチド類を意味するものと理解されるべきで
あり、好ましい使用可能々アミノ酸成分は上記アミノ酸
である〇 −一般式ｎ）、（ＩＩＩ）　、及び（［Ｖ）の基質は対
応するフェノール類と下記一般式： ％式％ （式中、Ｇ及びＡは上記意義を有する）或いはその適当
な反応性誘導体とペプチド化学における常法に従って反
応させることにより得られるＯ 適当な反応性誘導体の具体例は、通常ペプチド合成にお
いて使用きれる酸クロリド類及び混合無水物類、例えば
エチルクロロホルメート或いは活性エステル類例えばペ
ンタクロロフェニルエステル類或いはＮ−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールエステル類である。
本発明による試薬は、フェノール類と反応する色形成剤
（酵素的切断時に放出）として下記一般式で表わされる
ジアゾニウム塩を含有するのが好〔式中、旨は低級アル
キル基、低級アルコキシ基、低級アルキルメルカプト基
、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアン基、トリフルオロメ
チル基、Ｃｓ　Ｃｓ−アルキルスルホンアミド基、アリ
ールスルホンアミ）”ｍ、Ｃｓ　Ｃｓ−アルキルスルホ
ン基、アリールスルホン基、スルホン酸基或いはカルボ
ン酸基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオモルホリノ基、Ｎ
−ピロリジノ基、場合によりＲ−アルキル化されたＮ−
ピペラジノ基或いはＮ−ピペリジノ基、ハロゲン或いは
水素を示し、飾は低級アルキル基、低級アルコキシ基、
アリールオキシ基、低級アルキルメルカプト基、アルキ
ルアミノ基或いはジアルキルアミン基、ヒドロキシル基
、ニトロ基、゛シアノ基、ＣｌＣｓ−アルキルスルホン
アミド基、アリールスルホンアミド基、ＣｌＣｍ−アル
キルスルホン基、了り−ルスルホン基、スルホン酸基或
いはカルボン酸基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオモルホ
リノ基、或いはＮ−ピロリジノ基、場合によシマーアル
キル化されたＮ−ピペラジノ基或いはＮ−ピペリジノ或
いはフェニルアミノ基、場合により低級アルキルもしく
は低級アルコキシ基により置換されてもよいフェニル基
、ハロゲン或いは水素を示し、Ｒ’、　、　Ｒ’４及び
Ｒ′５は同種又は異種であってもよく各々低級アルキル
基、低級アルコキシ基、二）　ｏ基、　Ｃ１−Ｃｓ−ア
ルキルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基％
Ｃ１−ＣＢ−フルキルスルホン基、了り−ルスルホン基
、スルホン酸基、或いはカルボン酸基或いは低級アルキ
ルメルカプト基、ハロゲン或いは水素す表わし、及びＸ
は安定化アニオンを示し、いずれの場合においても２個
の隣接基Ｒ／、〜Ｒ’５が環化して場合によりハロゲン
、ＣＩＣ６−アルキル基、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基或
いはニトロ基、スルホン酸基或いはカルボン酸基により
置換されてもよいベンゼン環を形成し、ナフタレン系列
のジアゾニウム塩を形成することが可能である。
好ましくは一般弐■）において、Ｒ′ｌはＣＩＣ４−ア
ルキル基、Ｃ，−Ｃ４−アルコキシ基、ヒドロキシル基
、ニトロ基、ハロゲン或いは水素を表わし、Ｒ′３はＣ
ｌ＝Ｃ４−アルキル基、Ｃｌ−Ｃ４−アルコキシ基、了
り−ルオキシ基、ＣＩ　Ｃ４−アルキルアミノ基、ｃｌ
−Ｃ４−ジアルキルアミノ基、ニトロ基、Ｃｔ　Ｃ４−
アルキルスルホンアミド基、了り−ルスルホンアミド基
、ＣｌＯ４−アルキルスルホン基、アリールスルホン基
、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、フェニルアミ
ノ基、或いはスルホン酸基或いは水素な表わし、及びＲ
’２、Ｒ／４及びＲ’５は同種又は異種であってもよく
、Ｃ１−〜Ｃ４−アルキル基、Ｃ１−〜Ｃ４−アルコキ
シ基、Ｃ１−〜Ｃ４−アルキルアミノ基、Ｃ１−〜Ｃ４
−ジアルキルアミノ基、ニトロ基、ＣＩ−〜Ｃ４−アル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基或い
はスルホン酸基、ハロゲン或いは水素を表わす。
いずれの場合においても、Ｒ’ｌ−Ｒ’ｓの２つの隣接
基は環化して場合によりハロゲン或いはＣ１−〜Ｃ４−
アルキル或いはＣ１−〜Ｃ４−アルコキシ基或いはニト
ロ基或いはスルホン酸基で置換されているベンゼン環を
場合により形成することができる。
一般式（Ｖ）において、各場合におけるアリール基は６
〜１２個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子を有し
、場合によりハロゲン或いはＣＩ　Ｃ４アルキル基或い
はＣＩ　Ｃ４−アルコキシ基で置換されている芳香族基
を表わす。
一般式（Ｖ）のジアゾニウム塩はそれ自体公知であり、
或いはそれらはそれ自体公知である方法により合成する
ことができる（ツーベン−ウニイル（Ｈｏｕｂｅｎ　−
Ｗｅｙｌ　）　＋　有機化学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ
Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、　Ｘ／３
巻）。
本発明による蛋白質分解酵素特に白血球酵素検出用の試
薬は、適当な緩衝系を含有するのが好ましい。この目的
のための可能性のある系としては例えばリン酸塩、ホウ
酸塩、炭酸塩／重炭酸塩、炭酸塩、バルビッール酸塩、
トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（＝トリ
ス）、２−アミノ−２−メチル−プロパン−１，３−ジ
オール（＝アメジオール）或いはアミノ酸緩衝液が挙げ
られ、ｐＨ値及び能力は原則として６〜１０、好ましく
は７〜９のｐＨ値が測定溶液或いは試験片において確立
されるように選ばれる〇 場合により促進ポリアミノ酸に加えて、本発明に従った
試薬において一緒に洗剤を使用することが有利な場合が
ある。
これらの洗剤は、一方において、試験溶液に存在する蛋
白質の崩壊を起こし、従って酵素を放出すると共に、他
方においては、基質及び切断時に形成される物質に対す
る可溶化剤として作用し、関連する場合には色を強める
。使用可能な洗剤としてはカチオン性及びアニオン性洗
剤並びに両性及び非イオン性洗剤が挙げられる。
これらの洗剤の具体例としては、ベンジル−ジメチル−
テトラデシル−アンモニウムクロリド、Ｎａドデシルサ
ルフェート、　ゼフイロール、ポリビニルピロリドン、
及びヘパリノイド、及び適当であるガらば上記洗剤の２
種以上のものの混合物も使用することが出来る。本発明
に従って活性化剤として使用されるポリアミノ酸も又洗
剤の作用を有するのでその他の洗剤の添加は原則として
行う必要がない。
上記洗剤の使用はより均質な色分布及びより強力な着色
が達成されるので同相（例えば試験片）に固定された試
薬を用いる白血球の測定において特に有利である。
本発明の試薬において、上記試薬はそれ自体公知のタイ
プの不活性担体に含有されるのが好ましく、特に好まし
い担体マ）　＋）ツクスは多孔性物質例えば特に濾紙及
びプラスチック、ガラス繊維マットで作られた膜（米国
特許３，８４６，２４７号明細書）、多孔性セラミック
片、合成不織布繊維、スポンジ材料（米国特許３，５５
２，９２８号明細書）、フェルト、織物、木材、セルロ
ース或いはシリカゲルなどである。
この目的のために、上記担体を、容易に除去することの
できる溶媒例えば水、メタノール、エタノール、アセト
ン、ジメチルホルムアミド或いはジメチルスルホキシド
などの適当な溶媒中の上記試薬溶液で含浸する。これは
、次の２つの工程により行うのが好まｌ〜い。この材料
な先ず緩衝液及びその他の水溶性添加剤を含有する水溶
液で含浸させる。それを次いで一般式（Ｖ）の発色性酵
素基質及び活性化剤の溶液で含浸する。しか【、ながら
、この含浸は別の順序で行うこともでき、或いは２つの
含浸溶液の異った組成を用いて行うこともで（２７） きる。好ましくは、含浸溶液或いは検査されるべき流体
は各場合において発色性基質及びジアゾニウム塩を１０
−’　〜１０−’　％　ル／　Ｑ特許　１０−３〜１０
−２モル／Ｑで含有し、ポリアミノ酸を０．０５重量係
〜ｌＯ重量％特に１重量％〜５重量係で含有するのがよ
い。
濾紙がマトリックスとして使用される場合には仕上げら
れた試験紙はそのま〜使用することが可能であり、或い
はそれらを公知の方法で把手に固着させることができ、
或いは例えば西独公開公報２．１１８，４５５号明細豊
に従ってプラスチック及び微細メツシュ網目構造の間に
密封して使用することが可能である。
膜で被覆された試験片を製造するためには、好ましくは
、全ての試薬をフィルム形成性物質、例えば、ポリビニ
ルエステル或いはポリアミドなどの溶液或いは分散液中
に導入し、均一に混合する。
この混合物の薄層をプラスチック製の担体上にへヶ塗り
し、乾燥する。乾燥後、この様にして製造された膜被覆
試験片を切断し、そのま−或いは公（２８） 知の方法で把手に固着し、或いは例えば西独特許公開公
＠　２，１１８，４５５号明細書に従ったプラスチック
及び微細網目構造に密封されて使用することができる。
エステル分解及び蛋白質分解酵素特に白血球酵素の検出
のための本発明に従った診断剤は、上記試験試薬成分に
通常の薬学的添加剤を添加し、混合物を顆粒化すること
により粉末混合物或いは試薬錠剤の形態で形成すること
ができる。この種類の添加剤の具体例としては、炭水化
物例えばモノ−、オリゴ−或いはポリ−サツカライド類
、或いは糖−アルコール類例えばマンニトール、ソルビ
トール、もしくはキシリトール、或いはその他の可溶性
不活性化合物例えばポリエチレングリコール類もしくは
ポリビニルピロリドンなどがある。
粉末混合物又は試薬錠剤は例えば約５０〜２００■好ま
しくは５０〜８０ｍ９の最終重量を有する。
各場合において約５〜２０ｍｇ、好ましくは約１０ｍ９
の全重量の凍結乾燥体を調製するために、試験に必要な
全試薬に加えて通常の構造形成物質例えばポリビニルピ
ロリドン及び適当であるならばそノ他の充填剤例えばマ
ンニトール、ソルビトール或いはキシＩＪ　）−ルなど
を含有する溶液が凍結乾燥される。
本発明による溶液の形態の診断試薬は、試験に必要な全
ての試薬を含有するのが好ましい。使用可能な溶媒は、
水及び水と水溶性の有機溶媒、例えば、メタノール、エ
タノール、アセトン、或いはジメチルホルムアルデヒド
との混合物である。
貯蔵上の理由から、試験に必要とされる試薬を実際の検
査時にのみ一緒に合一される２以上の溶液　□に試験に
必要な試薬を分割するのが有利である。
この様に調製された診断試薬は、検査されるべき体液に
浸漬後或いは問題となる体液に添加後に視覚的に或いは
光度測定例えば反射光度測定或いは細胞内における光度
測定により測定することのできる色形成を介しての迅速
且つ簡易なエステル分解及び／又は蛋白質分解酵素特に
白血球酵素の存在の検出を可能にする。細胞当りの白血
球酵素の活性は実質的に一定のパラメーターとしてみな
　□すことが出来るので、検査される体液の白血球濃度
は色形成の強度からめることができる。白血球酵素の活
性は白血球の溶解後においても十分に保持されるので非
溶解白血球及び溶解白血球の両者が本発明の診断試薬な
用いて記録される。それにより溶解による誤差は生じな
い。
以下の具体例は本発明を例示するものである。
特に断りのない限り与えられた量は重量部或いは重量％
であると理解されるべきである。
一般的方法 基質に応じて５０〜２５０μαのＮ−メチルピロリドン
を可溶化剤として２２５−の使用緩衝液に添加し、溶液
の容量を緩衝液な用いて２．５ｍｌにした。
１　ｍ、ｌの水或いはＮ−メチルピロリ　トン中の５〜
１００　Ｔｎ９のポリアミノ酸の溶液５μＵ及び１ｍｌ
の水或いはＮ−メチルピロリドン中の２■のドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）或いは４１のその他の洗剤の溶
液５μ０を次いで添加した。十分に攪拌後、Ｎ−メチル
ピロリドン或いは述べられた溶媒中の１０−１モル濃度
の基質溶液５μαを添加し、白血球懸濁液の添加後述べ
られた波長における消失の増大な連続的に追跡した。並
行して行われた白血球の添加のない実験において自然加
水分解により引起こされる消失の増大をめた。
反応速度をめるために、酵素反応において得られた消失
の増大は自然加水分解についてめられた値だけ差引いた
。基質の切断に対する絶対値（モル数７分）はモル消失
係数の助けをかりて消失差から計算することかできる。
実施例１ ０、１　Ｍ　）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン緩衝液、ｐＨ８，８中における白血球によるトシル
−し−アラニンインドキシルエステルの切断の速度に及
ぼすポリアミノ酸の添加の影響（試験バッチ当り５０μ
悲のＮ−メチルピロリドンの添加）。
切断速度は３６０ｎｍにおける消失の増大の連続的測定
によりめられた。
第１表 活　性　化　剤　μ９／試験　切断の相対速度デカノー
ル　１２５１ Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ａｒｇ　（４０，０００）　ｚ、、　１
．７５Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ　（１００，０００）　／
／　２．０５Ｐｏｌｙ−ＤＬ−レｓ　（３７，０００）
　／／　３．１０ｐｏｔｙ−Ｌ−ＩＬｙｓ　（１４，０
００）　ＩＩ　１．８２／／　（２２，０００）　ＩＩ
　１．９４ｎ　（５５，０００）　／／　２．３７ｔｔ
　（１００，０００）　５０　２．１０ｔｔ　（１００
，０００）　１２５　２．３５ｔｔ　（１００，０００
）　２５’０　２．５０ポリアミノ酸の平均分子量（数
平均）は括弧内に与えられている。
試験バツチ当りの１０μりのＳＤＳも又各場合において
洗剤として使用された。
実施例２ 各試験バッチ当＃）１００μＱのＮ−メチルピロリドン
の存在下における０、　１　Ｍ　ｌ−リス−（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン緩衝液ｐＨ８，４中のポリア
ミノ酸の添加時の白血球による５−（Ｎ−）シルーＬ−
アラニルオキシ）−１，２−ベンズイソチアゾールの切
断の促進。切断の速度は３２５ｎｍにおける消失の増大
の連続的測定によりめられた。
第２表 ポリマーの平均分子量（数平均）は括弧内に与えられて
いる。
ＳＤＳ或いは第２表の最後の３つの実験においては、ゼ
フイロール（約５０チ強度の水溶液として）を各場合に
おいて各試験バッチ当り１０μりの量、洗剤として添加
された。
実施例３ 各試験バッチ当り２５０μＵのＮ−メチルピロリドンの
存在下における０、ＩＭ）リス−（ヒドロキシメチル）
−アミノメタン緩衝液ｐＨ８，８中のポリアミノ酸の添
加時の白血球によるトシル−し−アラニン−３−４）”
ワキシー５−フェニルビロールエステルの切断の促進。
切断の速度は３３０ｎｍ　における消失の増大の連続的
測定によりめた。
１第３表 ポリアミノ酸の平均分子量（数平均）は括弧内に与えら
れている。
各場合において試験バッチ当り１０μりのＳＤＳを洗剤
として添加した。
実施例４ 実験バッチ轟り２５０μαのＮ−メチルビ１０　リドン
の存在下における０、　１　Ｍ　）リス−（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン緩衝液ｐＨ８，４中のポリアミ
ノ酸の添加時の白血球によるトシル−し−アラニン３−
ヒドロキシ−５−フェノールピロールエステルの酵素的
切断の促進。切断（１”）速度は３２５ｎｍにおける消
失の増大の連続的測定によりめられた。
第４表 ５ＤＳ−ナトリウムドデシルサルフェートＢＤＴＡ−ペ
ンジル−ジメチル−テトラデシル−アンモニウムクロリ
ド ゼフイロールは約５０％強度の溶液として使用された。
ポリマーの平均分子量（数平均）は括弧内に与えられて
いる。
エステル類は各場合において粉末化された炭酸カリウム
の存在下において無水メチルエチルケトン或いは無水ト
ルエン中においてＮ−）シルーＬ−アラニルクロリドと
フェノール類な反応することにより調製された。約５５
Ｃにおいて６〜１２時間攪件した後４０〜７０％のフェ
ノールが反応した。フェノール対に２Ｃ０３対酸クロリ
ドのモル比は通常１　：　１．５　：　１．５であった
。ｐＨ値は、全反応時間な通して約７であった。仕上げ
を行うに際し、炭酸カリウムを５０ｉＣで炉別し、次い
で溶媒を真空蒸留により除去した。生成物をシリカゲル
−溶出液（石油エーテル：アセトン＝約９：１）による
カラムクロマトグラフィー及び引続いて再結晶により精
製した。
文献：フィッシャー（Ｅ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ　）及びリ
ブシツツ（Ｗ、Ｌｉｐｓｃｈｉｔｚ　）、　Ｂ、　４８
，３６２（１９１５）。
８３．７２（０，９３モル）のＬ−アラニンを４６５Ｔ
Ｌｌの約２Ｎの水酸化ナトリウム溶液に溶解する。１８
６り（０，９７６モル）　ノｐ　−）ルエンスルホニル
クロリドをこの溶液に少しずつ７０〜７２Ｕにおいて２
０分間に亘って添加する。スルホニルクロリドの添加の
最中に反応液は自動滴定器な用いて約２Ｎの水酸化ナト
リウム溶液でｐＩ（１０に保たれる。
ここにおいて５６０−の２Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消
費される◎反応液の…が最早変化しない時点において、
反応液を１５〜５Ｃに冷却し、３７％強度の塩酸を用い
てｐＨ３にする。分離した生成物を吸引により炉別し、
湿潤した濾過ケーキ＆　２３５０ｄの水から再結晶する
。収率：融点１３２〜１３５Ｃの１８５．５ｇ（理論値
の８２％）のし−ｐ−）ジルアラニン。
ｐ−）シル−し一アラニルクロリド １５８．１９　（０，６５モル）の１）−トシル−Ｌ−
アラニンを３５０　ｍｌのチオニＡ・クロリ　ド中にお
いて、４０Ｃで透明な溶液が形成されるまで攪拌するＯ
過剰のチオニルクロリドを次いで水ポンプ真空下に留去
する。フラスコ中の残渣な３００−の蒸留トルエン中に
入れる。透明なやや黄色を帯びた溶液が得られ、これを
攪拌した９００１１Ｌｌのりクロイン中に注入する。酸
クロリドが析出する。次σ）日、それを吸引濾過し、軽
ガソリンで洗浄し、真空乾燥器内において塩化カルシウ
ム／水酸化カリウム上で乾燥する。
収率：　１５５９　（理論値の９１％）の殆んど無色の
結晶。融点８１〜８３Ｃ。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、、（２Ｌ）発色性酵素基質としてのフェノールのア
    ミノ酸エステル或いはペプチドエステル及び（ｂ）成分
    （ａ）のアミノ酸エステル或いはペプチドエステル結合
    の酵素的切断（開裂）を促進する物質を含んでなるエス
    テル分解及び／又は蛋白質分解酵素の検出のための試薬
    であって促進物質として１０００〜２　、０００　、０
    ００　の分子量を有するポリアミノ酸を含有することを
    特徴とする試薬。 ２、　ポリアミノ酸の分子量が５，０００〜５００，０
    ００である特許請求の範囲第１項記載の試薬０３、　ポ
    リアミノ酸が１種類のみのアミノ酸から、　構成されて
    いる特許請求の範囲第１項又は第２項記載の試薬。 ４、　ポリアミノ酸が２種以上の異ったアミノ酸からラ
    ンダム配列において構成されている特許請求の範囲第１
    項又は第２項記載の試薬。 ５、　ポリアミノ酸が２種以上の異ったアミノ酸から繰
    返しアミノ酸配列で構成されている特許請求の範囲第１
    項又は第２項記載の試薬。 ６、　ポリアミノ酸が下記一般式のアミノ酸から構成さ
    れている特許請求の範囲第１項記載の試薬：　・ Ｈ２Ｎ　ＣＨＣ０ＯＨ （式中、Ｒは水素或いは１〜１５の炭素数、好ましくは
    １〜９の炭素数であり、場合により１個或いは２個のヒ
    ドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、アミノ
    基或いはグアニ　ドによ多置換されていてもよい場合に
    より分岐したアルキル基、シクロアルキル基或いはアラ
    ルキル基を表わす）。 ７、　ポリアミノ酸のアミノ酸単位の５〜１００モルチ
    、好ましくは１０〜１００モルチが塩基性基を有する特
    許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の試薬。 ８　塩基性基がナミノ基及び／又はグアニ　ド基である
    特許請求の範囲第７項記載の試薬。 ９、　試薬が不活性な担体に好ましくは試験片の形態で
    含有されている特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれ
    かに記載の試薬。 １０　液体試料、特に体液におけるエステル分解及び／
    又は蛋白質分解酵素の検出方法において試料を特許請求
    の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の試薬と接触さ
    せ、生ずる発色反応を測定することを特徴とする方法。
JP60070163A 1984-04-06 1985-04-04 エステル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用試薬 Granted JPS60227699A (ja)

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