JPS60237025A - Ｂ細胞分化因子レセプタ−ｔｒｆ１蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、Ｂ細胞分化因子レセプターＴＲＦＩ蛋白質
に関する。Ｂ細胞分化因子レセプターＴＲＦ　１蛋白質
（以下「レセプター」と記す）は、Ｂ細胞表面上に存在
し、Ｂ細胞に作用してプラズマ細胞を分化誘導する。Ｂ
細胞分化因子ＴＲＦＩと特異的に反応し、ＴＲＦ　１と
の反応によシプラズマ細胞への分化を誘発するものであ
る。従って、この様なレセプターは、ＴＲＦＩの過剰に
よる疾病等の治療薬あるいはＴＲＦＩを分離精製する際
の試薬として用いることができる。しかるに、従来レセ
プターは、Ｂ細胞よシ単離することができず、上記の目
的に使用することができなかった。

これに対し、本発明者らは、レセプターに対するモノク
ローナル抗体を調製することにより、レセプターを単離
精製することに成功した。即ちこの発明は、ＴＲＦルセ
プターとしての機能を有し、実質的に純化された蛋白質
でおる。レセプターは以下のように製造された。

先づ、Ｂ細胞を用いて免疫された動物より得た抗体産生
細胞とミエローマ細胞との融合株を得、これよりＴＲＦ
Ｉレセプター抗体を特異的に産生ずる細胞株を得た。一
方、適当力抗原により感作されたＢ細胞あるいはＢ細胞
腫を破砕し破砕物と上記ＴＲＦルセプターモノクローナ
ル抗体と混合し、モノクローナル抗体に結合した蛋白質
を得た。このタンノやり質は、レセプターであることが
確認された。

ＴＲＦＩレセプター抗体を産生ずる細胞株を得るための
抗原となるＢ細胞としては、牌臓細胞、リンパ節細胞、
末梢血細胞等のリン・ぞ球のいずれからも得ることがで
きる。例えば、これらのリンノや球を抗Ｔ細胞抗体と補
体で処理し、Ｔ細胞をできるだけ除いてＢ細胞画分とす
る。

Ｂ細胞としては、正常Ｂ細胞が用いられるととはもちろ
ん、悪性化細胞をも用いることができる。

悪性化細胞の例としては、ＢＣＬＩ　［ビテッタ（ｖｌ
ｔｅｔｔａ）　等（ジャーナル・オブ・イムノロジーｒ
Ｊ、ＩｍｍｕｎｎｌＪ　１２３巻１９２８（１９７９）
Ｊ　、ＬＩＯＡｃ本発明者ら　日本免疫学会総会記録　
１２巻５８０−　１９８２年］　、　Ｋ４６　、ＢＡＬ
　１７．７．２　Ｃ本発明者ら　日本免疫学会総会記録
　１２巻　５８０−１９８２年〕などがある。正常細胞
については、これを適当な抗原で感作させれば、ＴＲＦ
　ルセプターを保有するＢ細胞数が増加し、従って効率
良い抗原となる。

これらのＢ細胞を用いてマウス１ウサギ等の適当な哺乳
動物に免疫する免疫方法は、通常の方法で良い。感作動
物の肺臓細胞、リンパ節細胞、赤血球を除いた末梢血細
胞等をそのｉｔ抗体産生細胞画分（ＴＲＦＩレセプター
抗体産生細胞を含んでいる）として用いることができる
。

得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とから細胞融合
株を得る方法は、特定の方法を用いる必要なく、従来知
られている方法コーラ−（Ｉｌｏｈｌｅｒ）等［Ｎａｔ
ｕｒｅ　２５６巻、４９５．（１９７５）］が使用でき
る。

ＴＲＦＩレセプター抗体を産生ずる細胞株は、ＴＲＦＩ
レセゾターがＴＲＦＩレセプター抗体およびＴＲＦＩの
両方と反応することを利用して効率よく上記融合株よシ
分離することができる。例えば、本発明者ら［Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ　１２４巻２４１４（１９８０）］に示すア
ッセイ方法を利用できる。細胞株の培養法は、通常の培
地を使用して通常の方法で培養すれば良い。即ち、培地
としては、ローズウェルパーク・メモリアル・インステ
ィテー−）　、　１６４０培地（ＲｏＮｚｅｌｌ　Ｐａ
ｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　１６４
０以下ｒｕｐＭ１１６４０Ｊ　と略記する）が好適であ
るが、他にダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕ　ｌ　ｂ
ｅ　ｅ　ｃ　ｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍ
ｅｄｉｕｍ以下ｒＤＭＥＭＪと記す）、イーグル基礎培
地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｌｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌＭｅｄｌｕｍ）　＊クリック（Ｃ１ｉｃｋ）培地、
　ＲＩＴＣ培地など既知の細胞増殖用培地をあげること
ができる。

１０チ胎児ウシ血清（以下「ＩＣ」と略記する）や新生
児ウシ血清、ウマ血清、あるいはアルブミンを添加して
用いる、培養は、１〜５Ｘ１０’個／ｒｎｌの細胞密度
で３５−３８℃にて４−６係炭酸ガス気流中で行なう。

かくして３−４日間も培養すれば、培地中に著量のモノ
クー−ナル抗体ができる。あるいは、組織適合性動物も
しくは胸腺欠損ヌードマウス等を用いてその腹腔内にて
細胞株を培養することができる。

望ましくは、抗体をよく知られた方法で精製して用いる
。例えば、５０係硫酸アンモニウムで培養上清等を塩析
し、イオン交換クロマトグラフィー、アフィンティーカ
ラム（例えばプロティンＡ−セファロース）ヲ用い、適
当々バッファー、例えば、１Ｍ酢酸によって溶出したも
のを用いる。

レセプター源であるＢ細胞としては、過免疫されたもの
あるいは常にＴＲＦＩレセプターを保有しているＢ細胞
腫株が最も望ましい。これを機械的または界面活性剤、
トルエン等の薬剤と接触せしめることにより破壊する。

界面活性剤としてはＮＰ−４０、ＴｒＩｔｏｎ　Ｘ−１
００は好適ではなかったが、ラブ（５） ロルビーエックス（ムｕｂｒｏｌ−ＰＸ）が最も良い結
Ｊｌ示した。

一方、ＴＲＦＩレセプターモノクローナル抗体を適当な
担体、例えばブロムシアン活性化セファロース＋　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、Ｃｏ、Ｌｔｄ）　＊アフィゲル（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）などに良く知られた方法で固定化し、こ
の固定化モノクローナル抗体のカラムに上記破壊物を通
すことによシレセゾターはモノクローナル抗体に結合す
る。モノクローナル抗体に結合したレセプターを溶離す
るには、０．１ＭグリシンＨＣ２（ｐＨ２，０）等の適
当なバッファーで、リン酸バッファー生理食塩水などで
カラムを洗浄後、流出させることによシ行える。溶離さ
れた蛋白質は、本発明者らが報告した（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ　１２４巻、　２４１４（１９８０））方法により
測定されるＴＲＦＩ活性測定法において、溶離蛋白質と
ＴＲＦＩとを混合するとＴＲＦＩ活性が溶離蛋白質濃度
が高くなる程低くなること、ヨウ素ラベルしたＴＲＦＩ
レセゾター抗体に電気泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ）　した
蛋白質が反応することからＴＲＦＩレセプター蛋白を含
むものである。

（６） 上記電気泳動により精製された分画はＴＲＦ　１活性を
阻止しＴＲＦＩレセプター抗体と特異的に反応する。電
気泳動度より計算された分子量は、非還元で１２万、還
元で６万であシ、又、ＨＰＬＣで精製されたヨウ素化Ｔ
ＲＦＩが５ＰＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分子量１２万分子
と反応することから、得られた蛋白質が分子量１２万（
分子量６万のホモダイマー）のＴＲＦＩレセプターであ
ることが示された。

ＴＲＦＩは、そのレセプターと特異的に結合するＮ−ア
セチルがラクトサミンがあるがここで精製された蛋白も
Ｎ−アセチルがラクトサミン−セファロースデルと特異
的に結合する。このことは、Ｎ−アセチルグルコサミン
がＴＲＦＩ活性を特異的に阻害することとよく一致して
いる。このことがらも精製された蛋白がＴＲＦＩレセプ
ター蛋白であることがわかる。

ＴＲＦＩレセゾターはＴＲＦＩと特異的に反応すること
からＴＲＦ　１の定性定量分析に用いることができる。

またＴＲＦＩと結合して生体内におけるＴＲＦ　１活性
を低減せしめることができることからＴＲＦＩに起因す
る自己免疫疾患、免疫不全症の治療薬として使用できる
。更にまたこのレセプターを例えば適当な担体に固定化
することによりＴ細胞培養物よりＴＲＦＩのみを簡便な
操作によシ分離精製することができる。あるいは、ＴＲ
ＦＩレセプターの欠損細胞への精製レセプターの移植、
Ｂｍ＠特異的マーカーであるこのレセプターに対する特
異抗体作成のための抗原として使用できる。

以下、実施例を示すが本発明を限定するものではない。

実施例 特異性 ４ｒｎ９アラム（Ａｌｕｍ）で包含したＤＮＰ−ＫＬ）
（１００μｇを１０９個百８咳菌死菌とともに６−８週
令のＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内、皮下投与し、８−１
２週後生理食塩水（以下ｒｓａｌｉｎｅＪと記す）中に
溶解したＤＮＰ−ＫＬＨ２０μｇを腹腔内ちるいは皮下
投与した。　（４日後牌臓細胞を摘出し、単細胞化した
後、その１０７個／　ｍｌをウサギ抗脳関連Ｔ細胞抗原
抗血清（１／３０希釈）と２０分４℃更に２０分３７℃
に保ち１０倍に希釈したウサギ補体をこの細胞けん濁し 液に入れ、これを４５分３７℃保った。これよりＢ細胞
をとり、ＤＢＡ／２ＨＩＬ　（♀）とＢＡＬＢ／ｃ　（
♂）を親とするＭ種第１　代（ＤＣＦＩ）　ｉ（♂）マ
ウス６−８週令ニ２×１０７個のＢ細胞を４ｍ９アラム
と１０９個の百日咳菌死菌とともに腹腔接種した。１選
抜以降、２×１０７個のＢ細胞を週１回宛６週間腹腔内
へ追加免疫した。

最終免疫後７日目血清を採取し同時に肺臓細胞を得た。

牌細胞はＤＭＥＭ培地中にて細胞浮遊液を作成し１０　
個を１０　ｍｌ　ＤＭＥＭ中に浮遊させた。他方２　Ｘ
　１０’個のＰ　３−Ｘ６３−Ａｇ　８−Ｕｌミエロー
マ細胞を同様にＤＭＥＭで２回洗浄後１０　ｍｌ　ＤＭ
ＥＭ中に浮遊させた。両細胞浮遊液を混合し８００．９
で５分間遠心し、上清を除いた後、容器を振とうさせ５
０％のポリエチレングリ：ｆｆ−ル１０００　（ＰＥＧ
　１０００）（Ｗａｋｏ、　Ｊｕｎｙａｋｕ　Ｃｏ、Ｌ
ｔｄ）　ＤＭＥＭ液２５０　ｐＬを添加しマイルドに撹
はんした。次いで０．５　ｍｌのＤＭＥＭを１分毎に加
え最終的に２．２５ｍ１ｉで撹はんしながら加えた。更
に１分間静置後ＤＭＥＭ　１０−を加（９） ２００μを宛マイクロカルチャープレートウェル（Ｃａ
ｓｔｅｒ、　Ｃｏ　Ｌｔｄ　）に分配した、培養は３７
℃５％ＣＯ２存在下で行い１００μｔの上清を１．２，
３．７日後にＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ　１６４０　、１０
％　Ｆｅ２，４Ｘ１０−７１１．１３．１４日１に１０
０μｔの上清をＨＴ培地（ＲＰＭＩ　１６４０．１０チ
ＦＣ８，１，６Ｘ　１０−５Ｍチミジン　。

１ｘｌＯＭヒ４キサンチン）に交換した。約２週後れた
上清あるいはその５０％硫安塩析物の抗ＴＲＦ受容体抗
体活性を測定した。

（１）　ＢＣＬＩ　／ｆ　インディング　アッセイ凍結
保存１０８個ＢＣＬＩ細胞を、３７℃水浴をもって融解
せしめ、これを、４　Ｘ　１０　／ｗｅｌｌ宛マイクロ
カルチャーシレー）　（ＦａＩｃｏｎ　＋３９１１）に
分配した。

ついで０．５チウシ血清アルブミン（以下ｒＢｓＡＪと
（１０） 記す）加えたリン酸バッファー生理食塩水（以下ｒＰＢ
ｓＪと配す）でプラスチックス壁を被覆した後、ハイブ
リドーマ上清の５０係硫酸アンモニウム塩析物溶液をビ
オチン化したすｙ７°ルを２０μｇ添加し、１時間室温
に保った。ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄後、ヨウ素化アビジン
を１５分間反応させ、ＰＢＳで洗浄後ノ１／−ト底を切
り取り各ウェルをｒカウンター（Ａｌｏｋａ　ＪＤＣ７
５２）にて放射活性を測定した。

第１表に示すようにＢＣＬＩ細胞上に抗体が反応してい
ることが理解される。反応性の強いクローンｌ−３５−
１をＢＡＲ−１とする。

第　１　表 （１２） この抗体産生クローンは、ＲＰＭＩ　１６４０に１０係
ＦＣ８を加えた培地にＩ　Ｘ　１０６個／ｄの細胞密度
で３〜４日間大旨培養した。抗体は、この上清を５０係
硫安塩析後アフイニテイカラム（ＰｒｏｔｅｉｎＡＳｐ
ｐｈａｒｏｓｅ）により１Ｍ酢酸で溶出させた画分を中
和して用いた。

実施例１によシ作成された抗体をブロムシアン活性化上
ファロースに通常知られた方法（Ａｆｆｉｎｉｔｙ’Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｌｙ　：　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓ　＆　ｍｅｔｈｏｄ８．１５ベージ　Ｐｈａｓａａｃ
ｌａ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ）により結合させた。

１０１０個のＥＣＬＩ　＃Ｉ胞破壊物を２　％　Ｌｕｂ
ｒｏｌ−ＰＸ加Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐａ＋　７．６　）
で融解せしめ８０チ硫酸アンモニウム塩析を２回行った
後４℃−夜ＰＢＳで透析した。透析後５Ｍ−２ビーズに
て濃縮しサンプルをカラムに添加したＰＢＳで洗浄後０
．１Ｍグリシン塩酸バッファー（ｐ［（２，７）で溶出
した。その結果を第２表に示す。各フラクションは、Ｐ
ＢＳで透析してＴＲＦＩレセゾター蛋白質として用いた
。

（１３） 第　２　表 （１４） この溶出された両分ｉ　ＢＣＬＩ細胞を用いたＴＲＦＩ
活性抑制法にて測定した。即ち、ｌＸｌ０”個のＢＣＬ
Ｉ細胞にあらかじめＢ１５１−に１２　ＴＲＦと反応さ
せておいた画分上清を加え３日後のブラックフォーシン
グユニット（以下ｒＰＦＣＪと略記）数を測定すること
によりＴＲＦＩ活性の抑制を測定した。

第３表に示すように、コントロールとしてマウス■ｇＧ
２ａ−セファロースから溶出されたＢＣＬＩ蛋白では何
ら抑制を示さなかったが、本分画が高くなる程抑制を示
し、このことから、ＴＲＦルセゾ（１６） ＴＲＦＩレセプター蛋白質の分子量 −一一一■ｌ鵬得られたレセプター蛋白質フラクション
を常法によｐ　１２５ｒでヨウ素化した（Ｐｉｅｒｃｅ
　Ｂｌｏ−Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｔｅ
ｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ）。作成されたヨウ素
化ＴＲＦ　ルセプターをＢＡＲ−１モノクローナル抗体
と２日間３７℃で反応させ、次いで黄色ブドウ球菌々体
（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎｌ　０　％　５ｕｓｐｅｎｓｉｏ
ｎ）と１時間反応後３回１優ＢＳＡ−ＰＢＳにて洗浄し
たバッファーを加えて５分煮沸後、上清を５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけオートラジオグラフィを行い、上清中に遊離
した１２５エラペルＴＲＦＩレセプター蛋白の分子量を
測定した。その結果非還元１２０にダルトンのバンドが
認められ１．４−ジチオスレイトールによる還元処理で
６０キロダルトンの分子量と決定された。

またＴＲＦＩレセプター抗体による還元・非還元条件下
でのＢＣＬＩの可溶化膜成分電気泳動・々ンドの検出を
試みると、１２０にダルトンにのみ反応しレセゾター分
子は１２０にであることが示された。更にはヨウ素化精
ＩＩＴＲＦＩを電気泳動後ウニ（］７） スタンプロ・ソーイングしたＢＣＬＩ可溶化膜成分と反
応させたところ非還元条件の１２０にダルトンバンドの
みに反応し、還元条件は出現しなかったことから、ＴＲ
ＦＩレセプター蛋白質は、分子量１２万のタンパクで活
性を示し分子量６万の蛋白質のホモダイマーであること
が示される。

ＴＲＦＩレセプターの糖反応性 ＴＲＦＩレセプターとＴＲＦＩの間に糖の関与がある可
能性があることからヨウ素うベルＴＲＦＩレセプター画
分を各レクチン、糖ゲルに反応させた。

即ちリン酸・々ッファーで洗浄したダル３０μｌとヨウ
素化画分１００μｇ　（４１，５６０ｃｐｍ）を混合し
室温で１時間１５分反応させた。その後洗浄バッファー
で３回洗い２０００ｒｐｍ６分の遠心後沈殿物をγカウ
ントした。

（１８） 第　４　表 糖・レクチン−ダル　ＴＲＦＩレセゾター結合ｃｐｍ　
結合度ＧａｌＮａｃ−ｇｅ１　１７４２　８．３Ｇｌ　
ｃＮａｃ−ｇｏ　１　２０９　１．０ＬＢＡ　−ｇｅｌ
　３１８　１．５ ＬＰＡ　−ｇｅｌ　３０４　１．５ ＶＥＡ　−ｇｅｌ　３０６　１．５ ＷＧＡ　−ｇｅｌ　４１３　２．０ Ｎｏｎｅ　−７５０，４ 第４表に示すように、Ｎ−アセチルがラクトサミン（Ｇ
ａ　１−Ｎａ　ｃ　、と略記）に特異的に反応し他には
あま）反応しないことから、ＴＲＦＩレセプターはＧａ
ｌ　Ｎａｃを認識しＴＲＦＩにＧａｌ　Ｎａｅを保有す
る活性基のあることが強く示された。

特許出願人　浜　岡　利　之 味の素株式会社 （１９） 手続補正用 ！ 昭和５９年す月１１日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第　４３し７３号 ２、発明の名称 Ｂ細胞分化因子レセプター蛋白質 （旧名称二Ｂ細胞分化因子しセプターＴＲＦ１蛋白質）
３、補正をする者 事ｆ１との関係　特許出願人 住所　奈良県奈良市学園大和町５−７３０４、補正命令
の日付　自発 ５、補正により増加する発明の数　なし６、補正の対象
　願書の発明の名称の欄、並びに明細書の発明の明　細
　書 １、発明の名称 Ｂ細胞分化因子レセプター蛋白質 特許請求の範囲 Ｂ細胞分化因子のレセプターとしての機能を有し実質的
に純化された蛋白質 ３、発明の詳細な説明 この発明は、Ｂａ胞分化因子レしノター蛋白質に関する
。Ｂ細胞分化因子レセプター蛋白質（以下「レセプター
」と記す）は、Ｂ細胞表面上に存在し、Ｂ細胞分化因子
ＴＲＦＩと特異的に反応し、ＴＲＦＩとの反応によりｆ
ラズマ細胞への分化を誘発するものである。従って、こ
の様なレセプターは、ＴＲＦＩの過剰による疾病等の治
療薬あるいはＴＲＦＩを分離精製する際の試薬として用
いることができる。しかるに、従来からレセプターと呼
称されているものは、Ｂ細胞より単離することができず
、上記の目的に使用することができなかった。

これに対し、本発明者らは、レセプターに対するモノク
ローナル抗体を調製することにより、しく１） セゾターを単離精製することに成功した。即ちこの発明
は、ＴＲＦＩレセプターとしての機能を有し、実質的に
純化された蛋白質である。レセプターは以下のように製
造された。

先づ、Ｂ細胞を用いて免疫された動物より得た抗体産生
細胞とミニ四−マ細胞との融合株を得、これより抗ＴＲ
ＦＩレセプター抗体を特異的に産生ずる細胞株を得た。

一方、適当な抗原によυ感作されたＢ細胞あるいはＢ細
胞腫を破砕し可溶性膜蛋白画分を取得し、これと上記抗
ＴＲＦＩレセゾターモノクローナル抗体と混合し、モノ
クローナル抗体に結合した蛋白質を得だ。このタンパク
質は、レスツタ−であることが確認された。

抗ＴＲＦＩレセゾター抗体を産生ずる細胞株を得るため
の抗原となるＢ細胞としては、膵臓細胞、リンフ４節細
胞、末梢血細胞等のＢ　ＩＪン・９球のいずれからも得
ることができる。例えば、これらの細胞を抗Ｔ細胞抗体
と補体で処理し、Ｔａ胞をできるだけ除いてＢ細胞画分
とする。

Ｂ細胞としては、正常Ｂ細胞が用いられること（２） はもちろん、悪性化Ｂａ胞をも用いることができる。悪
性化Ｂａ胞の例としては、ＢＣＬｌ〔ビテッタ（ｖｉｔ
ｅｔｔａ　）等（ジャーナルオツ・イムノロノーｒ　Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｊ　１２３巻１９２８（１９７９
）　〕。

ＬＩＯＡ　（本発明者ら　日本免疫学会総会記録１２巻
　５８０−１９８２年）　、　Ｋ４６　、　ＢＡＬ　１
７．７．２　Ｃ本発明者ら　日本免疫学会総会記録　１
２巻　５８０−１９８２年〕などがある。正常細胞につ
いては、これを適当な抗原で感作させれば、ＴＲＦＩレ
セノターを保有するＢ細胞数が増加し、従って効率良い
抗原となる。

これらのＢ細胞を用いてマウス、ウサギ等の適当な哺乳
動物に免疫する免疫方法は、通常の方法で良い。感作動
物の肺臓細胞、９７７４節細胞、赤血球を除いた末梢血
細胞等をそのまま抗体産生細胞画分（抗ＴＲＦＩレセゾ
ター抗体産生細胞を含んでいる）として用いることがで
きる。

得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とから細胞融合
株を得る方法は、特定の方法を用いる必要はなく、従来
知られているコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ　）等［Ｎａｔｕ
ｒｅ　２５６巻、４９５．（１９７５））の方法が使用
できる。

抗ＴＲＦＩレセゾター抗体を産生ずる細胞株は、ＴＲＦ
Ｉレセプターが抗ＴＲＦＩレセプター抗体および’ｌ’
ＲＦ１の両方と反応することを利用して効率よ〈上記融
合株より分離することができる。例えば、本発明者ら［
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１２４巻２４１４（１９８０）
）に示すアッセイ方法を利用できる。細胞株の培養法は
、通常の培地を使用して通常の方法で培養すれば良い。

即ち、培地としては、ローズウェル・母−り・メモリア
ル・インスティテユー）　、　１６４０培地（ＲＯＩＩ
ＩＷ（Ｉｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ　１６４０以下ｒ　ＲＰＭＩ　１６４０　Ｊ
と略記する）が好適であるが、他にダルベツコ変法イー
グル培地（Ｄｕｌｂｅｅｃｏ’ａＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅ
ａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ以下「ＤＭＥＭ　Ｊと記す）、
イーグル基礎培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｌｎｉｍｕｍ　
ＥｓｓｅｎｔｉｍｌＭｅｄｌｕｍ　）　ｗクリック（Ｃ
１１ｃｋ　）培地、　ＲＩＴＣ培地など既知の細胞増殖
用培地をあげることができる。　（１０係胎児ウシ血清
（以下ｒＩＣＪと略記する）や新生児ウシ血清、ウマ血
清、あるいはアルブミンを添加して用いる、培養は、１
〜５×１０個／ｍＡ　の細胞密度で３５−３８℃にて４
−６％炭酸ガス気流中で行なう。かくして３−４日間も
培養すれば、培地中に著量のモノクローナル抗体ができ
る。あるいは、組織適合性動物もしくは胸腺欠損ヌード
マウス等を用いてその腹腔内にて細胞株を培養すること
ができる。

望ましくは、抗体をよく知られた方法で精製して用いる
。例えば、５０％硫酸アンモニウムで培養上清等を塩析
し、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーカ
ラム（例えばプロティンＡ−セファロース）を用い、適
当なバッファー、例えば、１Ｍ酢酸によって溶出したも
のを用いる。

レセプター源であるＢ細胞としては、過免疫されたもの
あるいは常にＴＲＦＩレセノターを保有しているＢ細胞
腫味が最も望ましい。これを機械的または界面活性剤、
トルエン等の薬剤と接触せしめることにより破壊する。

界面活性剤としてはＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００は好適ではなかったが、ルプロルピーエックス（Ｌ
ｕｂｒｏｌ　−ＰＸ　）が最も良い（５） 結果を示した。

一方、抗ＴＲＦＩレセゾターモノクローナル抗体を適当
な担体、例えばブロムシアン活性化セファロース、（Ｐ
ｈａｒｍａｅｌａ　＊　Ｃｏ、　Ｌｔｄ　）　ｅアク４
　）ｆ　ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）などに良く知られた方
法で固定化し、この固定化モノクローナル抗体のカラム
に上記破壊物を通すことによりレセプターはモノクロー
ナル抗体に結合する。モノクローナル抗体に結合したレ
セプターを溶離するには、０．１ＭグリシンＨＣ１（ｐ
Ｈ２，０）等の適当なバッファーで、リン酸バッファー
生理食塩水などでカラムを洗浄後、流出させることによ
り行える。溶離された蛋白質は、本発明者らが報告した
（　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１２４巻、　２４１４（１
９８０））　方法によシ測定されるＴＲＦＩ活性測定法
において、溶離蛋白質とＴＲＦＩとを混合するとＴＲＦ
Ｉ活性が溶離蛋白質濃度が高くなる程低くなること、ヨ
ウ素ラベルした抗ＴＲＦＩレセグター抗体に電気泳動（
５Ｏ８−ＰＡＧＥ　）　ｌ、た蛋白質が反応することが
らＴＲＦＩレセノター蛋白を含むものである。

（６） 上記電気泳動により精製された分画はＴＲＦ１活性を阻
止し抗ＴＲＦＩレセプター抗体と特異的に反応する。電
気泳動度より計算された分子量は、非還元条件下で１２
万、還元条件下で６万であり、又、Ｉ（ＰＬＣで精製さ
れた放射性ヨウ素装置ＦＩが５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
で分子量１２万分子と反応することから、得られた蛋白
質が分子量１２万（分子量６万のホモダイマー）のＴＲ
ＦＩレセプターであることが示された。

ＴＲＦＩ　ハ、そのレセプターと特異的に結合するＮ−
アセチルガラクトサミンがあるがここで精製された蛋白
もＮ−アセチルガラクトサミン−セファロースダルと特
異的に結合する。このことは、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンがＴＲＦＩ活性を特異的に阻害することとよく一致し
ている。このことからも精製された蛋白質がＴＲＦＩレ
セプター蛋白質であることがわかる。

ＴＲＦＩレセグターはＴＲＦＩと特異的に反応すること
からＴＲＦＩの定性定量分析に用いることができる。ま
たＴＲＦＩと結合して生体内におけるＴＲＦＩ活性を低
減せしめることができることがらＴＲＦ　１に起因する
自己免疫疾患、免疫不全症の治療薬として使用できる。

更にまたこのレセプターを例えば適当な担体に固定化す
ることによりＴ細胞培養物よりＴＲＦＩのみを簡便な操
作により分離精製することができる。あるいは、ＴＲＦ
Ｉレセゾターの欠損細胞への精製レセプターの移植、Ｂ
細胞特異的マーカーであるこのレセプターに対する特異
抗体作成のだめの抗原として使用できる。

以下、実施例を示すが本発明を限定するものではない。

実施例 抗ＴＲＦルセプターモノクローナル抗体の作成と特異性 ４■アラム（Ａｌｕｍ　）で包含したＤＮＰ−ＫＬＩ（
１００μｇを１０９個百日咳菌死菌とともに６−８週令
の　、Ｂ入ＬＢ／Ｃマウスに腹腔内、皮下投与し、８−
１２週後生理食塩水（以下［５ａｔｉｎｓ　Ｊと記す）
中に溶解したＤＮＰ−ＫＬＩ（２０μｇを腹腔内あるい
は皮下投与した。４日後肺臓細胞を摘出し、単細胞化浮
遊液を作成した後、その１０個／ゴをウサギ抗層関連Ｔ
細胞抗原抗血清（１／３０希釈）と２０分４℃更に２０
分３７℃に保ち１０倍に希釈したウサギ補体をこの細胞
けん濁液に入れ、これを４５分３７℃に保った。これよ
りＢ細胞をとり、６−８週令のＤＢＡ／２Ｈａ　（♀）
とＢＡＬＢ／Ｃ（♂）を親とする雑種第１代（ＤＣＦ’
ｌ　）雄（８）　−ｒ　ウｘに２Ｘ１０’個のＢ細胞を
４１ｖアラムと１０個の百日咳菌死菌とともに腹腔接種
した。１後生以降、２Ｘ１０個のＢ細胞を週１回宛６週
間腹腔内へ追加免疫した。最終免疫後７日目血清を採取
し同時に肺臓細胞を得た。肺細胞はＤＭＥＭ培地中にて
細胞浮遊液を作成し１０個を１０ｍ１　、ＤＭＥＭ中に
浮遊させた。他方２×１０　個のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８
−Ｕｌミエローマ細胞を同様にＤＭＥＭで２回洗浄後１
０　ｍｌ　ＤＭＥＭ中に浮遊させた。両細胞浮遊液を混
合し５ｏｏＩＩで５分間遠心し、上清を除いた後、容器
を振とうさせ５０％のポリエチレングリコール１０００
　（ＰＥＧ　１０００　）　（Ｗａｋｏ、　Ｊｕｎｙａ
ｋｕＣｏ、　Ｌｔｄ　）　ＤＭＥＭ液２５０　ｔｔｌを
添加しマイルドに攪はんした。次いでＱ、　５　ｍｌの
ＤＭＥＭを１分毎に加え最（９） 終的に２．２５Ｍまで攪はんしながら加えた。更に１分
間靜置後ＤＭＥＭ１０ｒｆＬｌを加え５００１１５分間
遠心した。上清を除去後、細胞を１０　％　Ｆｅ２を加
えたＲＰＭ１１６４０培地にて浮遊化せしめ２００μｌ
宛マイクロカルチヤープレートウエル（Ｃｏａｔｅｒ、
　Ｃ。

Ｌｔｄ　）に分配した、培養は３７℃５１　ＣＯ２存在
下で行い１００μｌの上清を１．２，３．７日後にＨＡ
Ｔ培地（ＲＰＭＩ　１６４０　、１０％ＦＣ８、４Ｘ１
０−　Ｍアシノゾチリン、１．６Ｘ１０　Ｍチミジン、
ｌＸ１０’ＭヒＩキサンチンを加えた培地）と交換した
。その後１１．１３．１４日目に１００μｌ０上清をＨ
Ｔ培地（ＲＰＭＩ　１６４０　、１０チＦＣＳ　、　１
．６Ｘ１０　Ｍチミジン、ｌＸ１０’Ｍｔ：ホキサンチ
ン）に交換した。

約２週後に発育が認められたウェルの上清を得、またＲ
ＰＭＩ　１６４０１０％ＦＣ８を加えた培地に交換した
。発育の認められた上清あるいはその５０％硫安塩析物
の抗ＴＲＦ受容体抗体活性を測定した。

（１）　ＢＣＬＩ結合試験 凍結保存１０８個ＢＣＬＩ細胞を、３７℃水浴をもって
融解せしめ、これを、４Ｘ１０５／ｗａｌｌ宛マイ（１
０） クロカルチャーグレート（Ｆ’ａｌｅｏｎす３９１１　
）に分配した。ついで０．５係ウシ血清アルゾミン（以
下、狙− 「ＢＳＡ　」と記す）を加えたリン酸バッファー−埋置
塩水（以下ｒ　ＰＢＳ　Ｊ　、！：記す）でプラスチッ
クス壁を被覆した後、ハイプリドーマ上清の５０％硫酸
アンモニウム塩析物溶Ｋｌを２０μを細胞けん濁液に添
加し、１時間室温に保った。ついでＢＳＡ−ＰＢＳで洗
浄後、放射性ヨウ素化Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａのｖｙ′ｅに
９ （５ｔａｐｈｙｌｏｅｏｃｃｕｓ−一−）を加え１５分
間反応させ、ＰＢＳで洗浄後プレート底を切り取り各ウ
ェルｉｒカウンター（Ａｌｏｋａ　ＪＤＣ−７５２）に
て放射活性をｉｌ’ｉｌＪ定した。

第１表に示すようにＢＣＬＩ　Ａ、ＦＩＪ胞上に抗体が
反応していることが理解される。反応性の強いクロー第
　１　表 この抗体産生クローンは、ＲＰＭＩ　１６４０に１０％
ＦＣ８を加えた培地に１×１０６個／ａｔの細胞密度で
３〜４日間大量培養した。抗体は、この上清を５０チ硫
安塩析後アフイニテイ力ラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＳｅ
ｐｈａｒｏｓａ　）により１Ｍ酢酸で溶出させた画分を
中和して用いた。

実施例１により作成された抗体をブロムシアン活性化セ
ファロースに通常知られた方法（Ａｆｆｉｎ口ｙ孔 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐχｙ　：　ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ　＆　ｍａｔｈｏｄａ、　１５ページ　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｃｏ、　＋　Ｌｔｄ　）により結合させた。

１０１０個のＢＣＬＩ細胞破壊物を２　％　Ｌｕｂｒｏ
ｌ−ＰＸ加Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，６）で融解せし
め８０饅硫酸アンモニウム塩析を２回行った後、水で溶
解後５ＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２（ＳＰＥＣＴＲＵＭ　ＭＥ
ＤＩＣＡＬ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ　）に入れ、室温４
時間その後４℃で３昼夜ＰＢＳ　’ｉ頻回に交換して透
析を行った。なおその際にはＬｕｂｒｏｌ　ＰＸを可及
的に除去する目的でＰＢＳ中にＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ　５
Ｍ−２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅａ　
）を共（１３） 存させた。そして得られたサンプルを抗ＴＲＦＩレセゾ
ター抗体固定化カラムに添加した。ＰＢＳでカラムを洗
浄後０．１Ｍグリシン塩酸バッファー（ＰＨ２６７）で
溶出した。その結果を第２表に示す。ここで得られたフ
ラクション９及び１０を、ＰＢＳで透析してＴＲＦＩレ
セゾター蛋白質画分として用いた。

（１４） 第　２　表 この溶出された画分をＢＣＬＩ細胞を用いたＴＲＦＩ活
性抑制法にて測定した。即ち、１×１０５個のＢＣＬＩ
細胞にあらじめＢ１５１−に１２　ＴＲＦと反応させて
おいた画分上清を加え３日後のブラック７オーシングユ
ニツト（以下ｒ　ＰＦＣＪと略記）数を測定することに
よりＴＲＦＩ活性の抑制を測定した。

第３表に示すように、コントロールとしてマウスＩ　ｇ
Ｇ２ａ−セファロースから溶出されたＢＣＬＩ蛋白では
何ら抑制を示さなかったが、本分画が高くなる程抑制を
示し、このことから、ＴＲＦＩレセグターであることが
わかる。

またこのようにして得られたＢＣＬＩ膜蛋白画分をＳｎ
２　存在下で８％のポリアクリルアミドダル電気泳動（
８０Ｓ−ＰＡＧＥ）にかけ、この蛋白を更にニトロセル
ローズ膜に移行後、放射性ヨウ素化精製ＴＲＦ　１と３
日間３７℃で反応させ、ニトロセルローズ膜を乾燥後、
Ｘ線フィルムにてＴＲＦ　１の結合蛋白を検出すると１
２０キロダルトンのバンドにＴＲＦＩが特異的に結合性
を示した。このことから、ＴＲＦルセプターは１２０キ
ロダルトンの分子量をもつ事が明らかになった。なおこ
のようなモノクローナル抗体カラムの溶出をする以前の
可溶性ＢＣＬＩ膜蛋白の粗画分を上記の方法でＴＲＦＩ
との結合性をしらべても、やけ、９１２０キロダルトン
のバンドにのみ、その結合性が証明された。

（１６’） （１７） ＴＲＦＩレセゾター蛋白質の分子量 抗ＢＡＲ−１抗体カラム溶出法で得られたレセプター蛋
白質フラクションをＩＯＤＯ−ＢｇＡＤＳを用いて１２
５Ｉでヨウ素化した（　Ｐｌｅｒｅｅ　Ｂｌｏ−Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　ｐｒｏｄｕｃｔｓｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂ
ｕｌｌｅｔｉｎ　）　。作成されたヨウ素化ＴＲＦＩレ
セノターを抗ＢＡＲ−１モノクローナル抗体と更に２日
間３７℃で反応させ、次いで黄色ブドウ球菌菌体（Ｐａ
ｎ５ｏｒｂｉｎ　１０　％　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　）
と１時間反応後３回１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて洗浄した。

１０俤ＳＤＳ及び５　％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｆ含む０
．０５　Ｍ　Ｔｒｉａ−ＨＣｔバッファー（ｐＨ８，６
）を加えて５分煮沸後、上清を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
オートラジオグラフィを行い、上清中に遊離した１２５
■ラベルＴＲＦＩレセゾター蛋白の分子量を測定した。

その結果非還元条件下では１２０キロダルトンのバンド
が認められ２０　ｍＭｌ、４−ジチオスレイトールによ
る還元処理で６０キロダルト／の分子量になることが明
らかになった。

また抗ＢＡＲ−１モノクロナール抗体による還元・非還
元条件下でのＢＣＬＩの可溶化膜成分の電気泳動上での
バンドの変化の検出を試みると、非還元条件下では抗体
Ｉ／１１２０キロダルトンにのみ反応しレセプター分子
Ｆｉ１２０キロダルトンであることが示されたが、２０
ｍ〜１１．４−ジチオスレイトール還元条件下では６０
キロダルトンのバンドＫ（−の反応性が検出される事が
明らかとなった。従ってこのことから、ＴＲＦＩレセノ
ター蛋白質は、分子量１２万のタン・ぐりで活性を示し
、その分子構造は分子量６万の蛋白質のホモダイマーよ
少構成されることが示された。

ＴＲＦＩレセゾターの糖反応性 ＴＲＦＩレセプターとＴＲＦＩの間に糖の関与がある可
能性があることから放射性ヨウ素うベルＴＲＦＩレセプ
ター画分を表４に示した各レクチンや糖結合性グルに反
応させた。即ちリン酸バッファーで洗浄したグル３０μ
ｌと放射性ヨウ素化画分１００ｆｉｌ　（４１，５６０
ｃｐｍ　）を混合し室温で１時間１５分反応させた。そ
の後洗浄バッファーで３回洗い　（２０００ｒｐｍ６分
の遠心後沈殿物の放射活性をカウントした。

第４表 ＧａｌＮａｃ−ｇｅｌ　１７４２　８．３Ｇｌ　ｅＮａ
ｃ−ｇｅｌ　２０９　１．０ＬＢＡ　−ｇｅｌ　３１８
　１．５ ＬＰＡ　−ｇｅｌ　３０４　１．５ ＶＥＡ　−ｇｅｌ　３０６　１．５ ＷＧＡ　−ｇｅｌ　４１３　２．０ Ｎｏｎｅ　−７５０，４ 第４表に示すように、ＴＲＦＩレセプターはＮ−アセチ
ルガラクトサミン（Ｇａ１−Ｎａｅ　ｒと略記）に特異
的に結合し他には有意に結合しないことから、ＴＲＦＩ
レセグターはＴＲＦＩ分子上のＧａｌ　Ｎａｅを含む特
異的な構造を認識することが示された。

特許出願人　濱　岡　利　之 味の素株式会社 （２０）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ・　Ｂ細胞分化因子のレセプターＴＲＦＩとしての機能
   を有し実質的に純化された蛋白質