JPS60239662A - 免疫センサー及びその作成方法 - Google Patents
免疫センサー及びその作成方法Info
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- JPS60239662A JPS60239662A JP59095500A JP9550084A JPS60239662A JP S60239662 A JPS60239662 A JP S60239662A JP 59095500 A JP59095500 A JP 59095500A JP 9550084 A JP9550084 A JP 9550084A JP S60239662 A JPS60239662 A JP S60239662A
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- electrode
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗体又は抗原となる蛋白質を電極面に固定させ
た免疫センサーの作成方法に関する。
た免疫センサーの作成方法に関する。
最近、抗原−抗体反応を利用して生体内の微量の抗原又
は抗体を測定するための免疫センサーが種々開発され、
生体内の各種ホルモンや蛋白質の定量に応用せんとする
試みがなされている。
は抗体を測定するための免疫センサーが種々開発され、
生体内の各種ホルモンや蛋白質の定量に応用せんとする
試みがなされている。
しかし現在のところ実用化までに至っている免疫センサ
ーは殆どなく、例えば特開昭５３−１４９３９４号公報
には電界効果トランジスタのゲート絶縁股上に抗体又は
抗原を固定化した有機膜又は無機膜を被覆した免疫セン
サーが、又、特開昭５４−１６１９９２号公報には電解
効果トランジスタの半導体表面に被覆されたボυマーマ
トリックスに抗原又は抗体を共有結合的に固定化させた
免疫センサーが開示されているが、前者にあっては抗体
が不純で生成する電位に特異性がなく免疫センサーとし
て実用に供しうるか否か疑問であり、又、後者にあって
はスペーサを介して抗原又は抗体を固定する方法の開示
があるのみで、反応の特異性の高い免疫センサーが完成
されたものとは判断し難い。
ーは殆どなく、例えば特開昭５３−１４９３９４号公報
には電界効果トランジスタのゲート絶縁股上に抗体又は
抗原を固定化した有機膜又は無機膜を被覆した免疫セン
サーが、又、特開昭５４−１６１９９２号公報には電解
効果トランジスタの半導体表面に被覆されたボυマーマ
トリックスに抗原又は抗体を共有結合的に固定化させた
免疫センサーが開示されているが、前者にあっては抗体
が不純で生成する電位に特異性がなく免疫センサーとし
て実用に供しうるか否か疑問であり、又、後者にあって
はスペーサを介して抗原又は抗体を固定する方法の開示
があるのみで、反応の特異性の高い免疫センサーが完成
されたものとは判断し難い。
又、スペーサを介して抗体又は抗原を固定する方法は免
疫センサーの作成工程が複雑となるという欠点を有する
。
疫センサーの作成工程が複雑となるという欠点を有する
。
本発明者等はかかる従来の免疫センサー作成に伴なう問
題点に鑑がみ、特異性の高い免疫センサーを簡単な方法
で作成することを目的として鋭意研究を行なった結果、
抗体又は抗原となる蛋白質を架橋剤を使用して緩和な条
件下で架橋させることにより、従来のようにスペーサを
予め付加する複雑な反応を行なわせることなく、しかも
蛋白質の生理的に重要な機能を失なわせることなく、電
極面に蛋白質を固定化しうろことを見出し本発明に至っ
た。
題点に鑑がみ、特異性の高い免疫センサーを簡単な方法
で作成することを目的として鋭意研究を行なった結果、
抗体又は抗原となる蛋白質を架橋剤を使用して緩和な条
件下で架橋させることにより、従来のようにスペーサを
予め付加する複雑な反応を行なわせることなく、しかも
蛋白質の生理的に重要な機能を失なわせることなく、電
極面に蛋白質を固定化しうろことを見出し本発明に至っ
た。
この場合、固定化すべき抗体は通常の場合不均一である
ため、細胞融合法により調製された純粋なモノクローナ
ル抗体を使用することにより固定化される抗体の密度を
高めて電位変化をより大きくさせうろことを見出した。
ため、細胞融合法により調製された純粋なモノクローナ
ル抗体を使用することにより固定化される抗体の密度を
高めて電位変化をより大きくさせうろことを見出した。
又、本発明においてはモノクローナル抗体の例として医
学的な診断に重要なパラメータとなるヒト血清アルブミ
ン（以下Ｈ３Ａという）およびハブテンであるアデノシ
ン−３’、５’ −環状リン酸（以下ｃＡＭＰという）
のモノクローナル抗体を使用して本発明の方法により免
疫センサーを作成した。
学的な診断に重要なパラメータとなるヒト血清アルブミ
ン（以下Ｈ３Ａという）およびハブテンであるアデノシ
ン−３’、５’ −環状リン酸（以下ｃＡＭＰという）
のモノクローナル抗体を使用して本発明の方法により免
疫センサーを作成した。
又、本発明によって作成された免疫センサーを使用して
種々の抗原に対する電位を測定したところ、ＩＳＡ及び
ｃ Ａ Ｍ”￥のいずれに対しても特異的な電位を発生
することが確認された。
種々の抗原に対する電位を測定したところ、ＩＳＡ及び
ｃ Ａ Ｍ”￥のいずれに対しても特異的な電位を発生
することが確認された。
このように高分子蛋白質としてのＨＳ Ａと、低分子蛋
白質としてのｃＡＭＰを代表例として、これらに対する
モノクローナル抗体を固定した免疫センサーが特異的な
電位を発生することば、他の無数に考えられる有用な抗
体に対しても同様に適用可能であり、又、逆に電極面に
抗原を固定して抗体を測定することも、抗原となる蛋白
質を純粋に取出すことが容易であることから極めて容易
である。
白質としてのｃＡＭＰを代表例として、これらに対する
モノクローナル抗体を固定した免疫センサーが特異的な
電位を発生することば、他の無数に考えられる有用な抗
体に対しても同様に適用可能であり、又、逆に電極面に
抗原を固定して抗体を測定することも、抗原となる蛋白
質を純粋に取出すことが容易であることから極めて容易
である。
以下に、本発明の免疫センサーの作成方法をＩＳＡ及び
ｃＡＭＰに対する抗体を電極面に固定する場合を例とし
て説明する。
ｃＡＭＰに対する抗体を電極面に固定する場合を例とし
て説明する。
先ず、ＩＳＡに対するモノクローナル抗体（以下ｍＡｎ
ｔｉ ）ＩＳＡという）を電極面に固定させる方法につ
いて説明する。
ｔｉ ）ＩＳＡという）を電極面に固定させる方法につ
いて説明する。
はじめに電極面に固定すべきＩＳＡに対するモノクロー
ナル抗体ｍ７１１ｎｔｉ ＩＳＡを公知の方法により以
下のようにして調製する。
ナル抗体ｍ７１１ｎｔｉ ＩＳＡを公知の方法により以
下のようにして調製する。
すなわち、まずＩＳＡをフロイント（Ｆ ｒ ｅ ｕｎ
ｄ）の完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖ
ａｎｔ）と共に１３ａｌｂ／Ｃマウス腹腔内に投与して
免疫反応を起させる。その後２週間間隔で数回同様にし
てフロイントの不完全アジュバントと共に投与して追加
免疫をする。
ｄ）の完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖ
ａｎｔ）と共に１３ａｌｂ／Ｃマウス腹腔内に投与して
免疫反応を起させる。その後２週間間隔で数回同様にし
てフロイントの不完全アジュバントと共に投与して追加
免疫をする。
次に後述する酵素免疫測定法により血中抗体価の上昇し
たマウスを選び、肺臓を摘出し、この肺臓を分けて細胞
サスペンションを′ｒｌＩｌ！１する。これに別に培養
したミエローマ細胞Ｎ５−１を加え、ポリエチレングリ
コールにより細胞融合を行ない融合体を得る。得られた
融合体をＨＡＴ培地で２週間培養後、ＨＴ培地およびＲ
ＰＭＩ−１６４０培地でさらに培養を続は細胞群を得る
。この細胞群を希釈し、１個ずつに分けてさらに培養し
、培養上清に産生されている抗体を酵素免疫測定法によ
り測定し、特異的な抗体を産生じている細胞を選択する
。選択した細胞をさらに培養増加さゼ、これをマウス腹
腔内に注射し増殖させる。１ケ月後、腹水を取り遠心分
離してｍＡｎｔｉ −ＩＳＡを含有している上清を得、
これを−８０℃で保存する。
たマウスを選び、肺臓を摘出し、この肺臓を分けて細胞
サスペンションを′ｒｌＩｌ！１する。これに別に培養
したミエローマ細胞Ｎ５−１を加え、ポリエチレングリ
コールにより細胞融合を行ない融合体を得る。得られた
融合体をＨＡＴ培地で２週間培養後、ＨＴ培地およびＲ
ＰＭＩ−１６４０培地でさらに培養を続は細胞群を得る
。この細胞群を希釈し、１個ずつに分けてさらに培養し
、培養上清に産生されている抗体を酵素免疫測定法によ
り測定し、特異的な抗体を産生じている細胞を選択する
。選択した細胞をさらに培養増加さゼ、これをマウス腹
腔内に注射し増殖させる。１ケ月後、腹水を取り遠心分
離してｍＡｎｔｉ −ＩＳＡを含有している上清を得、
これを−８０℃で保存する。
次にｍＡｎｔｉ −Ｈ３Δを含有する腹水から以下のよ
うにしてｍＡｎｔｉ−ＩＳＡを精製する。
うにしてｍＡｎｔｉ−ＩＳＡを精製する。
上記の腹水の上清をリン酸緩衝液中で透析し、ＤＥＡＥ
−セルロースカラムに通し、γ−グロブリン画分を得、
この両分を蒸留水で透析し凍結乾燥して白色の精製ｍＡ
ｎ ｔ １−ＩＳＡを得る。得られた精製ｍＡｎｔｉ
−ＩＳＡ、の純度はセルロースアセテート膜電気泳動法
により測定し、腹水中の他の成分がカラムクロマトグラ
フィーにより除かれたことを確認する。
−セルロースカラムに通し、γ−グロブリン画分を得、
この両分を蒸留水で透析し凍結乾燥して白色の精製ｍＡ
ｎ ｔ １−ＩＳＡを得る。得られた精製ｍＡｎｔｉ
−ＩＳＡ、の純度はセルロースアセテート膜電気泳動法
により測定し、腹水中の他の成分がカラムクロマトグラ
フィーにより除かれたことを確認する。
ｍＡｎ ｔ １−ＩＳＡの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は
以下のとおりである。
以下のとおりである。
一定量のＩ Ｓ Ａを含む溶液を、塩化ビニル製マイク
ロプレー１・の穴に注入し、ＩＳＡを吸着させる。次い
でこのプレートを洗浄後、検体となるｍＡｎ ｔ １−
ＩＳＡを含む溶液を加え、３７°Ｃで１時間放置し、吸
着Ｈ３ＡとｍＡｎｔｉ−ＩＳＡを結合させる。これを洗
浄後、アルカリホスファターゼを結合した抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を加え、３７℃で１時間放置する。洗浄後、基質
となるｐ−ニートロフェニルボスフェートを反応させ、
生成したｐ−二トロフェノールをアルカリ性で吸光度（
ＯＤ）を測定しｍＡｎｔｉ −ＩＳＡを定量する。
ロプレー１・の穴に注入し、ＩＳＡを吸着させる。次い
でこのプレートを洗浄後、検体となるｍＡｎ ｔ １−
ＩＳＡを含む溶液を加え、３７°Ｃで１時間放置し、吸
着Ｈ３ＡとｍＡｎｔｉ−ＩＳＡを結合させる。これを洗
浄後、アルカリホスファターゼを結合した抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を加え、３７℃で１時間放置する。洗浄後、基質
となるｐ−ニートロフェニルボスフェートを反応させ、
生成したｐ−二トロフェノールをアルカリ性で吸光度（
ＯＤ）を測定しｍＡｎｔｉ −ＩＳＡを定量する。
一方、ｃ Ａ Ｍ Ｐに対するモノクローナル抗体（ｍ
Ａｎ ｔ ｉ−ｃＡＭＰ）も同様の方法で調製されたも
のを使用した。
Ａｎ ｔ ｉ−ｃＡＭＰ）も同様の方法で調製されたも
のを使用した。
次に以上のようにして調製した精製モノクローナル抗体
を以下の方法でｐＨ電極に固定する。
を以下の方法でｐＨ電極に固定する。
この場合、ｍＡｎｔｉ−ＩＳＡとｒｒ＋Ａｎｔｉ−ｃＡ
ＭＰの固定は全く同様にして行なうことができるのでｍ
Ａｎｔｉ −ＩＳＡを例として説明する。
ＭＰの固定は全く同様にして行なうことができるのでｍ
Ａｎｔｉ −ＩＳＡを例として説明する。
すなわち、まずｐ Ｈ５〜９に調整した０、０１Ｍリン
酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）と０８１５４Ｍ塩化
カリウム（Ｋ（１りの混合緩衝液（以下Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ
４＋ Ｋ Ｃｎ 緩ｊｈ液という）に精製ｍΔｎｔｉ
−ＩＳＡを濃度１０−６〜１０−２ｇ／／！に溶解した
溶液を調製し、一方、上記の緩衝液に架橋剤を濃度］、
Ｘ １０−７〜１ｘｌＯ”ｇ／ｍβに溶解した溶液を
調製する。使用し得る架橋剤としてはグルタルアルデヒ
ド、ビスジアゾヘンチジン、−＼キサメチレンジイソシ
アナート、トルシコニンジイソシアナート、Ｎ 、 Ｎ
’ −エチレンビスマレインイミドおよびＮ、Ｎ’ −
ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを挙げること
ができる。
酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）と０８１５４Ｍ塩化
カリウム（Ｋ（１りの混合緩衝液（以下Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ
４＋ Ｋ Ｃｎ 緩ｊｈ液という）に精製ｍΔｎｔｉ
−ＩＳＡを濃度１０−６〜１０−２ｇ／／！に溶解した
溶液を調製し、一方、上記の緩衝液に架橋剤を濃度］、
Ｘ １０−７〜１ｘｌＯ”ｇ／ｍβに溶解した溶液を
調製する。使用し得る架橋剤としてはグルタルアルデヒ
ド、ビスジアゾヘンチジン、−＼キサメチレンジイソシ
アナート、トルシコニンジイソシアナート、Ｎ 、 Ｎ
’ −エチレンビスマレインイミドおよびＮ、Ｎ’ −
ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを挙げること
ができる。
次にｐＨ渕定用その他適宜の電極表面に上記のｍ、Ａｎ
ｔ ｉ −ＩＳＡ溶液及び架橋剤溶液を順次浸漬塗布
する。この場合使用される電極材料とじてはガラスのみ
ならず、カーボンペースト、半導体、グラジ−カーボン
、金属例えば白金、銀等であってもよい。
ｔ ｉ −ＩＳＡ溶液及び架橋剤溶液を順次浸漬塗布
する。この場合使用される電極材料とじてはガラスのみ
ならず、カーボンペースト、半導体、グラジ−カーボン
、金属例えば白金、銀等であってもよい。
ｍＡｎｔｉ −Ｈ３Ａ１１８液の電極面への塗布は電極
の液絡部などの対象表面以外をバラフィルム等で絶縁被
覆したのち、単に溶液に室温で１〜５時間浸漬放置する
のみでよい。
の液絡部などの対象表面以外をバラフィルム等で絶縁被
覆したのち、単に溶液に室温で１〜５時間浸漬放置する
のみでよい。
この浸漬放置の間にｍＡｎｔｉ−ＩＳＡは電極面に吸着
される。
される。
次いでｍＡｎｔｉ −１（ＳＡを吸着させた電極を架橋
剤溶液に室温で１〜数時間浸漬放置する。この操作によ
って電極面に吸着されたｍＡｎｔｉ−ＩＳＡは架橋され
て容易に剥離することなく安定に固定化される。
剤溶液に室温で１〜数時間浸漬放置する。この操作によ
って電極面に吸着されたｍＡｎｔｉ−ＩＳＡは架橋され
て容易に剥離することなく安定に固定化される。
架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用した場合は、次
いでこの電極をｐ Ｈ８，５〜９．５の０．０５Ｍ硼酸
（Ｈ３ＢＯ３）緩衝液を用いて調製した濃度１０−１〜
１０’Ｍの水素化ホウ素すトリウム溶液に数分以上浸漬
して還元反応を行なわセたのぢ、前記Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ４
＋ Ｋ Ｃ１２緩衝液で洗浄することによりｍＡｎｔｉ
−ＩＳＡの電極面への架橋固定が完了する。
いでこの電極をｐ Ｈ８，５〜９．５の０．０５Ｍ硼酸
（Ｈ３ＢＯ３）緩衝液を用いて調製した濃度１０−１〜
１０’Ｍの水素化ホウ素すトリウム溶液に数分以上浸漬
して還元反応を行なわセたのぢ、前記Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ４
＋ Ｋ Ｃ１２緩衝液で洗浄することによりｍＡｎｔｉ
−ＩＳＡの電極面への架橋固定が完了する。
本発明による抗体又は抗原となる蛋白質の電極面への固
定は第１図に模式的に示したような機構で行なわれるも
のと推察される。
定は第１図に模式的に示したような機構で行なわれるも
のと推察される。
すなわち、先ず第１図＋８１に示すように電極面２に上
記蛋白質１を物理的に充分吸着させたのち、第１図（ｂ
ｌに示すように架橋剤３を用いて蛋白質の機能的な構造
の変化を起さないような緩和な条件下で吸着された蛋白
質１相互を架橋させることにより、蛋白質１自体はその
生理的に重要な機能が殆ど破壊されないまま、相互に橋
絡されて電極面に強固に固定される。
記蛋白質１を物理的に充分吸着させたのち、第１図（ｂ
ｌに示すように架橋剤３を用いて蛋白質の機能的な構造
の変化を起さないような緩和な条件下で吸着された蛋白
質１相互を架橋させることにより、蛋白質１自体はその
生理的に重要な機能が殆ど破壊されないまま、相互に橋
絡されて電極面に強固に固定される。
以下に実施例に基づいて本発明をさらに説明する。
［実施例〕
実施例１
−まず、前記の方法で調製した精製ｍＡｎｔｉ−ＩＳＡ
を０．０１ＭＫＨ２ＰＯ−＋ ＋０．１５４ＭＫＣｅ緩
衝液（ｐＨ７，６）にｉ解して濃度１．６８ ｘ １０
’ Ｈ／ ｍ １のｍＡｎ ｔ １−Ｈ３Ａ溶液を調
製し、一方、架橋剤溶液として同様の緩衝液を用いて濃
度１．０５ ｘ １０−５ｇ／ｍβのグルタルアルデヒ
ド溶液を調製した。次にｐＨ測定用ガラス電極（東亜電
波工業製、Ｇ５ｌ−１５５Ｃ）を用意し、この液絡部を
パラフィルムで覆って比較電極との短絡を防止し、上記
のｍＡｎｔｉ−Ｈ３Ａ溶液４゜μｌを塗布して室温で５
時間放置し電極面に吸着させた。次いで上記のグルタル
アルデヒド溶液４０μｌを塗布して室温で３時間放置し
、ｍＡｎｔｉ−ＩＳＡを架橋させた。
を０．０１ＭＫＨ２ＰＯ−＋ ＋０．１５４ＭＫＣｅ緩
衝液（ｐＨ７，６）にｉ解して濃度１．６８ ｘ １０
’ Ｈ／ ｍ １のｍＡｎ ｔ １−Ｈ３Ａ溶液を調
製し、一方、架橋剤溶液として同様の緩衝液を用いて濃
度１．０５ ｘ １０−５ｇ／ｍβのグルタルアルデヒ
ド溶液を調製した。次にｐＨ測定用ガラス電極（東亜電
波工業製、Ｇ５ｌ−１５５Ｃ）を用意し、この液絡部を
パラフィルムで覆って比較電極との短絡を防止し、上記
のｍＡｎｔｉ−Ｈ３Ａ溶液４゜μｌを塗布して室温で５
時間放置し電極面に吸着させた。次いで上記のグルタル
アルデヒド溶液４０μｌを塗布して室温で３時間放置し
、ｍＡｎｔｉ−ＩＳＡを架橋させた。
次に：０．０５ＭＨ３ＢＯ３ｔ＝ｆＪｆｆｊ液（ｐＨ９
，０）を用いて調製した濃度２．ｌＸ１０−４Ｍの水素
化ホウ素ナトリウム溶液１００ｍ７！に室温で３０分間
浸漬して還元反応を行なわせ架橋を完了させた。次いで
前記ＫＨ２ＰＯ４＋ＫＣＩ！緩衝液で洗浄し、ｍＡｎｔ
ｉ −Ｈ３Ａ固定化電極を作成した。
，０）を用いて調製した濃度２．ｌＸ１０−４Ｍの水素
化ホウ素ナトリウム溶液１００ｍ７！に室温で３０分間
浸漬して還元反応を行なわせ架橋を完了させた。次いで
前記ＫＨ２ＰＯ４＋ＫＣＩ！緩衝液で洗浄し、ｍＡｎｔ
ｉ −Ｈ３Ａ固定化電極を作成した。
ｍＡｎｔｉ −Ｈ３Ａ固定化電極の洗浄液について前述
の酵素免疫測定法によりｍＡｎｔｉ −ＩＳＡ量を測定
したところ、Ｉ Ｘ １０ ’ ｇと極めて微量であり
、電極面へのｍＡｎｔｉ −ＩＳＡの固定はほぼ完全に
行なわれていることが判った。
の酵素免疫測定法によりｍＡｎｔｉ −ＩＳＡ量を測定
したところ、Ｉ Ｘ １０ ’ ｇと極めて微量であり
、電極面へのｍＡｎｔｉ −ＩＳＡの固定はほぼ完全に
行なわれていることが判った。
次に作成したｍＡｎｔｉ −Ｈ３Ａ固定化電極を使用し
て以下の方法により各種の抗原に対する電位変化を測定
した。
て以下の方法により各種の抗原に対する電位変化を測定
した。
まず、０．０１ ＭＫ Ｈ２Ｐ ０４ →−０，１５４
ＭＫＣｌ緩往ｉ液（ｐＨ７，５３）を用いて濃度０．０
３％のγ−クロフリンラビソ１〜・フラクションｒｌ（
Ｒ−ＩｇＧ）ＨＩ［（ｐＨ７，５３）をｆＪｌａ製した
。この緩衝液を用いてＩＳＡの５ ｍ ｇ ／ ｍ Ａ
溶液を調製し、そのｐ）（が上記Ｒ−１ｇ Ｇ緩（’Ａ
液のｐ ］（と同一になるよう力性カリ （ＫＯＨ）溶
液で調製したのち、これをＲ−ＩｇＧ緩ｉＥ液を用いて
稀釈し、各種濃度のＨ５Ａ抗原溶液を作成した。同様に
してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブ
ミン（ＩＳＡ）及び卵白アルブミン（ＯＶＡ）からなる
各種抗原の各種濃度の／８液を作成した。
ＭＫＣｌ緩往ｉ液（ｐＨ７，５３）を用いて濃度０．０
３％のγ−クロフリンラビソ１〜・フラクションｒｌ（
Ｒ−ＩｇＧ）ＨＩ［（ｐＨ７，５３）をｆＪｌａ製した
。この緩衝液を用いてＩＳＡの５ ｍ ｇ ／ ｍ Ａ
溶液を調製し、そのｐ）（が上記Ｒ−１ｇ Ｇ緩（’Ａ
液のｐ ］（と同一になるよう力性カリ （ＫＯＨ）溶
液で調製したのち、これをＲ−ＩｇＧ緩ｉＥ液を用いて
稀釈し、各種濃度のＨ５Ａ抗原溶液を作成した。同様に
してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブ
ミン（ＩＳＡ）及び卵白アルブミン（ＯＶＡ）からなる
各種抗原の各種濃度の／８液を作成した。
次に上記の各種抗原の各種濃度溶液を８ｍ７！ずつ中試
験管に採取し、３７℃の恒温槽中に浸漬した。これにｍ
Ａｎ ｔ ｉ −Ｈ３Ａ固定化電極を濃度の低い溶液か
ら順に浸漬し、各々の電位を測定した。この場合、異な
る種類の抗原溶液の電位測定に先立ち、電極を０．０Ｉ
Ｎ塩酸で洗浄したのち上記Ｒ−ＩｇＧ緩衝液に浸して元
の電位に戻ったことを確認し、次の抗原溶液の電位測定
に移った。
験管に採取し、３７℃の恒温槽中に浸漬した。これにｍ
Ａｎ ｔ ｉ −Ｈ３Ａ固定化電極を濃度の低い溶液か
ら順に浸漬し、各々の電位を測定した。この場合、異な
る種類の抗原溶液の電位測定に先立ち、電極を０．０Ｉ
Ｎ塩酸で洗浄したのち上記Ｒ−ＩｇＧ緩衝液に浸して元
の電位に戻ったことを確認し、次の抗原溶液の電位測定
に移った。
ｍＡｎ ｔ ｉ −Ｈ３Ａ固定化電極による各種抗原に
対する上記の電位測定の結果を第２図に示した。
対する上記の電位測定の結果を第２図に示した。
第１図から明らかなように、この電極ばＩＳＡ、ＲＳ
Ａ、 Ｂ Ｓ Ａ溶液ニ対し、夫々濃度６Ｘ１０−’ｍ
ｇ ／ （１、ｌＸｌ０−２ｍｇ＃、３Ｘ１０−’ｍ
ｇ／βで＋１ｍＶの電位差を生し、ＯＶＡでは電位変化
を生じなかった。
Ａ、 Ｂ Ｓ Ａ溶液ニ対し、夫々濃度６Ｘ１０−’ｍ
ｇ ／ （１、ｌＸｌ０−２ｍｇ＃、３Ｘ１０−’ｍ
ｇ／βで＋１ｍＶの電位差を生し、ＯＶＡでは電位変化
を生じなかった。
一方、前述したｍＡｎｔｉ −ＩＳＡの酵素免疫測定法
によりＩＳＡ、ＩＳＡ、ＢＳＡ及びＯＶＡの各種抗原に
対するｍＡｎ、ｔｉ −ＩＳＡの各種深度における結合
濃度を吸光度定量した結果は第３図に示す通りで、ＩＳ
Ａは他の抗原に対し顕著な特異性がみられたが、上記の
電位測定の結果も第３図の結果とよく一致する結果が得
られ、微量のＩＳＡがｍＡｎｔｉ −Ｈ３Ａ固定化電極
により高精度で定量し得ることが判明した。
によりＩＳＡ、ＩＳＡ、ＢＳＡ及びＯＶＡの各種抗原に
対するｍＡｎ、ｔｉ −ＩＳＡの各種深度における結合
濃度を吸光度定量した結果は第３図に示す通りで、ＩＳ
Ａは他の抗原に対し顕著な特異性がみられたが、上記の
電位測定の結果も第３図の結果とよく一致する結果が得
られ、微量のＩＳＡがｍＡｎｔｉ −Ｈ３Ａ固定化電極
により高精度で定量し得ることが判明した。
実施例？
まず、細胞融合法で産生じた精！Ｉ！ｍＡｎｔｉ−ｃＡ
ＭＰを実施例１に示したｍＡｎｔｉ −ＩＳＡの電極へ
の固定と全く同様の条件でｍＡｎｔｉ−ｃＡＭＰ固定化
電極を作成した。
ＭＰを実施例１に示したｍＡｎｔｉ −ＩＳＡの電極へ
の固定と全く同様の条件でｍＡｎｔｉ−ｃＡＭＰ固定化
電極を作成した。
この電極を使用して以下の方法により各種のハプテンに
対する電位変化を測定した。
対する電位変化を測定した。
まず、０．０１ＭＫＨ２ＰＯ４＋０．１５４ＭＫＣβ緩
衝液（ｐＨ６，５）を用いて濃度０．０３％のγ１’ロ
ブリンラビット・フラクションＩＩ（ＲＩｇＧ）緩衝液
（ｐＨ６，５）を調製した。
衝液（ｐＨ６，５）を用いて濃度０．０３％のγ１’ロ
ブリンラビット・フラクションＩＩ（ＲＩｇＧ）緩衝液
（ｐＨ６，５）を調製した。
この緩衝液を用いてｃ Ａ Ｍ Ｐ 、 ｃ Ｇ Ｍ
Ｐ 、及びアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）からなる
各ハプテンＩ Ｘ １０ ’ ｍ ｏ ７！／ ７！溶
液をＩＩ Ｍ シ、コレらを夫々稀釈して各種濃度のハ
プテン／８液を調シした。
Ｐ 、及びアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）からなる
各ハプテンＩ Ｘ １０ ’ ｍ ｏ ７！／ ７！溶
液をＩＩ Ｍ シ、コレらを夫々稀釈して各種濃度のハ
プテン／８液を調シした。
次にこのハブテン溶液各８ｍ７！ずつを中試験管に採取
し、３７℃の恒温槽中に浸漬した。これにｍＡｎｔｉ−
ｃＡＭＰ固定化電極を濃度の低い溶液から順に浸漬し、
各々の電位を測定した。この場合、異なる種類のハプテ
ン／８液の電位測定に先立ち、電極を蒸留水とＲ−１’
ｇＧ緩衝液（ｐＨ６゜５）で洗浄し、この緩衝液に浸し
て元の電位に戻ったことを確認してから次のハプテン溶
液の電位測定に移った。
し、３７℃の恒温槽中に浸漬した。これにｍＡｎｔｉ−
ｃＡＭＰ固定化電極を濃度の低い溶液から順に浸漬し、
各々の電位を測定した。この場合、異なる種類のハプテ
ン／８液の電位測定に先立ち、電極を蒸留水とＲ−１’
ｇＧ緩衝液（ｐＨ６゜５）で洗浄し、この緩衝液に浸し
て元の電位に戻ったことを確認してから次のハプテン溶
液の電位測定に移った。
ｍＡｎ ｔ ｉ−ｃＡＭＰ固定化電極による各種ハプテ
ンに対する上記の電位測定の結果を第４図に示した。
ンに対する上記の電位測定の結果を第４図に示した。
第４図から明らかなように、ｍＡｎｔｉ−ＣへＭＰ固定
化電極はｃＡＭＰに対しては濃度５×ＩＱ ” ｍ ｏ
１ ／ １で＋１ｍＶの電位差を示したが、他のハプ
テン溶液では電位変化を生しなかった。
化電極はｃＡＭＰに対しては濃度５×ＩＱ ” ｍ ｏ
１ ／ １で＋１ｍＶの電位差を示したが、他のハプ
テン溶液では電位変化を生しなかった。
以上のことからｍＡｎ ｔ ｉ−ｃＡＭＰ固定化電極は
ｃ Ａ Ｍ Ｐに対してのみ特異性を示すことが判明し
、微量のｃ Ａ Ｍ Ｐの定量が可能であることが明ら
かとなった。
ｃ Ａ Ｍ Ｐに対してのみ特異性を示すことが判明し
、微量のｃ Ａ Ｍ Ｐの定量が可能であることが明ら
かとなった。
以上、詳細に説明したように、本発明のＩＳＡ又はｃＡ
ＭＰに対するモノクローナル抗体電極の作成方法は該抗
体溶液を電極面にｌこ漬塗布して吸着させたのち、架橋
剤を用いて固定化させる方法であるから、従来のスペー
サを介し−ζ固定さゼる方法に比し固定手段が極めて簡
便となり、又、固定化された抗体は安定性に優れており
、再現性よく微量のＩＳＡ又はｃＡＭＰを定量しうる利
点を有する。
ＭＰに対するモノクローナル抗体電極の作成方法は該抗
体溶液を電極面にｌこ漬塗布して吸着させたのち、架橋
剤を用いて固定化させる方法であるから、従来のスペー
サを介し−ζ固定さゼる方法に比し固定手段が極めて簡
便となり、又、固定化された抗体は安定性に優れており
、再現性よく微量のＩＳＡ又はｃＡＭＰを定量しうる利
点を有する。
第１図は本発明の機構説明図、第２図は本発明のｍＡｎ
ｔｉ−Ｈ３Ａ固定化電極の各種抗原に対する電位変化を
示すグラフ、第３図は種々の抗原に対するｍＡｎｔｉ−
ＩＳＡの用量作用曲線、第４図は本発明のｍＡｎＬｉ−
ｃＡＭＰ固定化電極の各種ハプテンに対する電位変化を
示すグラフである。 １・・・・・・蛋白質、２・・・・・・電極、３・・・
・・・架橋剤。
ｔｉ−Ｈ３Ａ固定化電極の各種抗原に対する電位変化を
示すグラフ、第３図は種々の抗原に対するｍＡｎｔｉ−
ＩＳＡの用量作用曲線、第４図は本発明のｍＡｎＬｉ−
ｃＡＭＰ固定化電極の各種ハプテンに対する電位変化を
示すグラフである。 １・・・・・・蛋白質、２・・・・・・電極、３・・・
・・・架橋剤。
Claims (3)
- （１）電極面に抗体又は抗原となる蛋白質を吸着させ、
吸着された該蛋白質相互を架橋剤を用いて緩和な条件下
で架橋することを特徴とする免疫センサーの作成方法。 - （２）架橋剤としてグルタルアルデヒド、ビスジアゾヘ
ンチジン、ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエン
ジイソシアナート、Ｎ、Ｎ′ −エチレンビスマレイン
イミド及びＮ 、 Ｎ’ −ポリメチレンビスヨードア
セトアミドから選ばれる化合物を用いることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の免疫センサーの作成方法
。 - （３）抗体として純粋な汚ツクローナル抗俸を使用する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫セン
サーの作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59095500A JPS60239662A (ja) | 1984-05-15 | 1984-05-15 | 免疫センサー及びその作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59095500A JPS60239662A (ja) | 1984-05-15 | 1984-05-15 | 免疫センサー及びその作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60239662A true JPS60239662A (ja) | 1985-11-28 |
| JPH0558134B2 JPH0558134B2 (ja) | 1993-08-25 |
Family
ID=14139315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59095500A Granted JPS60239662A (ja) | 1984-05-15 | 1984-05-15 | 免疫センサー及びその作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60239662A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104407148A (zh) * | 2014-09-04 | 2015-03-11 | 齐智 | 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒 |
-
1984
- 1984-05-15 JP JP59095500A patent/JPS60239662A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.AM.CHEM.SOC=1975 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104407148A (zh) * | 2014-09-04 | 2015-03-11 | 齐智 | 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0558134B2 (ja) | 1993-08-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |