JPS6024181A - ハイブリド−マ細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマ細胞株に関するものであり。

さらに詳細には、　ＧＯＴの分別定量など、アイソザイ
ムの区別に極めて有効な抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマ細胞株に関するものである
。

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴは２
種々の動物及び微生物に広く存在し、アミノ基の転移を
あずかる重要な酵素であるが、特に血清中のＧＯＴ含量
は心筋梗塞、筋疾患、肝疾患等により増大することが知
られており、臨床検査の中でも重要な測定項目となって
いる。ＧＯＴには、細胞質両分に存在する５−ＧＯＴと
ミトコンドリア画分に存在するｍ−ＧＯＴの二つのアイ
ソザイムがあり。

従来は特殊な目的以外区別しては測定されていなかった
。ところが、最近そのアイソザイムを別個におのおの測
定する意義が研究面、臨床検査の面からいわれ、特にｍ
、ＧＯＴはその血中濃度が肝疾患の程度や２手術の予後
経過とよく相関することから、　ｍ−ＧＯＴの分別定量
が望まれている。

現在、　ＧＯＴの測定はカルメンらに報告（ジャーナル
　オブ　クリニカル　インベスティゲーション（Ｊ、　
Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）　３４巻、１３１頁（１９
５５）　）されている方法がよく用いられる。ずなわぢ
、　ＧＯＴ反応により生成したオキザロ酢酸をリンゴ酸
脱水素酵素によりリンゴ酸に変換する際に酸化される補
酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの量を紫外
部の吸光度により測定するという方法である。この方法
に代表される酵素活性で測定する方法では、二つのアイ
ソザイムとも反応し１分別して測定することは不可能で
ある。そのために。

これらの方法を用いる時は事前に、ジエチルアミンエチ
ルイオン交換体又は電気泳動装置を用いて分別する必要
があった。これらの分別装置は、装置が高価で１分離に
時間を要し、比較的多量の試料を要する等の欠点があっ
た。さらに二つのアイソザイムが免疫学的に交差しない
ことを利用して。

５−ＧＯＴの抗血清をもちいて５−ＧＯＴを沈降せしめ
。

上清のｍ−ＧＯＴを上記の方法等で測定するという方法
〔特開昭５０−１９９１８号公報参照。〕もあるが。

やはり分離する手段が遠心分離を含む、抗体と羊赤血球
の結合物をつくるのが煩雑等の欠点がある。

さらに、酵素活性で測定する方法は補酵素（ピリドキサ
ールホスフェート）のはずれたアポ酵素は。

その補酵素を添加しないと測定不可能であり、操作をよ
り煩雑、高価なものにしている。

また、直接免疫学的測定法（イムノアッセイ）でｍ−Ｇ
ＯＴを測定する方法〔例えばロバート（Ｒｏｂｅｒ　ｔ
）クリニカル　ハ゛イオケミストリー（Ｃ１ｉｎ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ）１２巻、２５０頁、（１９７９年）〕も知
られている。これは、抗体が互いに交差しないことを利
用するため。

上記に示した酵素活性を測定する方法にみられる欠点は
ほぼ克服できるが、これらのイムノアッセイに使用する
抗体が従来の方法、すなわちウサギ等の動物に精製した
抗原で免疫して、血清から分離する方法で得られたもの
であるため、抗血清を採取するたびに大量のしかも精製
された抗原が必要であり、また抗体の最も少量しか得ら
れず、その品質も主に動物の個体差に由来するバラツキ
があるという欠点を有していたため、イムノアッセイに
使用することが困難であった。

それゆえ、イムノアッセイの利点を最大限に発揮するう
えで、安価で、かつ大量にしかも品質の安定した抗体の
出現が熱望されていた。

一方、　１９７５年にケーラー（Ｋ；ｈｌｅｒ）とミル
シュフィン（Ｍｉｌｓｔｅｔｎ）は、免疫されたマウス
の肺細胞のリンパ球と骨’ｔＡＢＭ細胞（ミエローマ）
と融合させることによって得られる融合細胞（ハイブリ
ドーマ）を用いて、単一、均質な抗体くモノクローナル
抗体）を製造しうることを示した〔ネイチ＋　−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２５６巻４９５頁（１９７５）　）　、こ
の報告以来１種々のハイブリドーマ及びモノクローナル
抗体について報告がされてきた〔例えば、コブロースキ
ー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　）　＋プロシーディングオブ
　ナショナル　アカデミツク　サイエンスニーニスニー
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ）　７５巻、　３９３８頁（１９７８年）；ガルフル
（Ｇａｌｆｒｅ）らネイチ＋　（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　２
６６巻、５５０頁（１９７７年）；ケーラー（Ｋ６ｈｌ
ｅｒ）らヨーロピアン　ジャーナルオブ　イムノロジー
（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　＋　６巻５１
１頁（１９７６年）〕が、〕抗ｍ−ＧＯＴモノクローナ
ル抗体産生を有するハイブリドーマ細胞株については、
全く何も記載されていないし、またその創製に成功した
との報告もなされていない。

そこで２本発明者らはｍ−ＧＯＴを簡便で感度よく測定
することができるイムノアッセイに適用しうる抗体を効
率良く生産しうろことのできるハイブリドーマ細胞株を
めて、鋭意検討した結果、抗ｍ−ＧＯＴ抗体産生リンパ
球とミエローマ細胞とを融合させて得たパイブリドーマ
細胞株が、大量の抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を生
産することを見い出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明は抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体産
生能を有するハイブリドーマ細胞株である。

次に２本発明の細胞株の細胞学的性質を示す。

（１１由来・・・抗ｍ−ＧＯＴ抗体産生リンパ球とミエ
ローマ細胞との融合により創製した融合細胞である。

（２）形態・・ベニローマ細胞とほぼ同様の形態を示す
。例えば、大きさは１０〜２０μｍである。

（３１１Ｍ能・・・単一の抗原決定基を認識する抗ｍ−
ＧＯＴモノクローナル抗体を定當的に生産する。

（４）増殖性・・・ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性
を示す。すなわち、７２時間で約１０倍に増殖する。

（５）保存性・・・−７０℃以下で極めて容易に長期間
保存可能である。

（６）最適増殖条件・・・温度３７℃、　ｐＨ７，２゜
（７）増殖範囲・・・温度３２°Ｃ〜４２℃、　ｐｌ＋
　６．５〜７．８で増殖可能である。

本発明の細胞株を得るには１例えば次のごとき方法を採
用すればよい。すなわち、まず哺乳動物好ましくはマウ
ス又はラットにｍ−ＧＯＴで免疫する。

抗原としては、全てのｍ−ＧＯＴを使用することができ
るが、臨床化学的には従来の抗血清がヒトのｍ−ＧＯＴ
と交差する哺乳動物９例えばヒト、ブタ、ウシ、ウサギ
等の由来で１かつ被免疫動物とは異なる動物由来が好ま
しい。このｍ−ＧＯＴを採取するには９例えばザジャー
ナル　オブ　バイオロジカルケミストリー２５３巻８８
４２頁、ジャーナル　オブバイオケミストリ−８２Ｓ　
８４７頁の記載の方法に従っ”ζ採取すればよい。抗原
の使用量、投与部位。

アジュバントの使用環、免疫の方法は従来の抗血清を得
る方法に準ずればよい。例えば、マウスを用いる場合、
マウス−匹あたり一回につき０．００１〜１０ｍｇ、好
ましくは０．０１〜１　ｍｇのｍ−ＧＯＴを初回はアジ
ュバント（例えば、フロイントの完全アジュバント）と
よく混合して、皮下、腹腔内等に投与し、３週間以上経
過後再びアジュバント（例えば。

フロイントの不完全アジュバント）をよく混合して、皮
下腹腔内等に投与する。さらに、３週間以上経過後ｍ−
ＧＯＴのみを静脈内、腹腔内、皮下環に投与して、十分
免疫する。このようにして免疫された動物を、好ましく
は最終免疫から２〜４日後に殺し、リンパ球を採取する
。リンパ球調製には肺臓、リンパ節、未稍血等が用いら
れる。このリンパ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく
。

一方、骨髄腫細胞（ミエローマ）を用意する。

このミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のものを使
用することが好ましい。さらに、そのミエローマは薬剤
抵抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミエロ
ーマがハイブリドーマ選択培地で生育しないものが好ま
しい。最も、一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞ラ
インが用いられる。これは、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｌ１ｙｐｏｘａ
ｎｔｉｎ　ｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙ
ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が欠損しており。

選択培地の一種ヒポキサンチンーアミノブテリンーチミ
ジン（ＩＩＡＴ）培地に生育できない。また。

使用するミエローマ自身が抗体を分泌しないものが望ま
しい、Ｊ）、上の点から５例えば市販のマウスミエロー
マＰ３・Ｘ６３・Ａｇ８・６・５・３（Ｘ６３・６・５
・３）、Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・υ１　（Ｐ３１１１’
）　、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ’ｌ・
２・３等を用いるのが好ましい。

このミエローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含有す
るイーグル最少培地（ＭＥＭ　）　、　ＲＰ旧１６４０
培地（ＲＰＭ１１６４０）等の培地中で培養する。

次にＭＥＭ　、　ＲＰＭ１１６４０等の培地に、上記で
得たリンパ球及びミエローマをおのおの懸濁し、混合す
る。このときの混合比は、任意に選択できるが。

好ましくはリンパ球対ミエローマが細胞数で１対１から
２０対１．好ましくは５対１から１０対１の比率を用い
ればよい。混合した細胞は、融合促進剤を用いて融合を
行う。融合方法としては９例えばイムノロジカル　メソ
７１２巻２８５頁（Ｉｍｍｕｎｏｌｏ−ｇｉｃａｌ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　Ｖｏｌｌｌ　１９８１＋　八ｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　に従って行えばよい。融合促進剤
としては１種々の高分子物質やウィルス等を用いること
ができるが。

好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダ
イウィルスを用いればよい。　ＰＥＧは、平均分子量４
００〜２０，０００のものが使用できるが、好ましくは
１．、０００〜７，５００のものを用いればよい。その
使用濃度は４０〜６０ｖｏ１．％が好ましい。

融合させた細胞は、洗浄で融合促進剤を除去し。

５〜１５ｖｏｌ　、％の血清を含むＭＥＭ又はＲＰＭ１
１６４０培地に懸濁し、９６穴培養皿等に０．５〜５Ｘ
１０Ｇ／穴の割合で分注する。さらに、各穴に選択培地
（例えばＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交換すれ
ば。

１０〜１４日後には、未融合のミエローマは死滅し。

ハイブリドーマのみ生育する。ちなみに、リンパ球は長
時間生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では生育できず。

やはり１０〜１４日後には死滅する。

目的の抗体を産生じているハイブリドーマの検索として
は、培養上澄液の抗体価を知ることによって行うごきが
できる。例えば、目的とするｍ−ＧＯＴを９６穴マイク
ロタイタープレイド等の担体に吸着させ、非吸着面はウ
シ血清アルブミンで保護し。

上澄液を採取して加える。１〜２４時間の抗原抗体反応
終了後、洗浄し標識された第二抗体（例えばリンパ球が
マウス由来ならウサギ製抗マウスイムノグロブリン等）
を加え、同様に反応せしめる。

標識としては、ラジオアイソトープ、酵素、螢光物質等
を用いることができる。同様に洗浄後、標識方法に応じ
て検出方法で検出する。例えばアイソトープの場合、そ
の放射能活性を、酵素の場合は、基質を加えて酵素活性
を、また螢光物質の場合は、螢光光度計によりその螢光
強度を測定し。

対象実験より強く検出された培養皿の穴を選択する。こ
の方法で選択された穴には、２種類以上のハイブリドー
マのクローンが存在する可能性があるので、クローニン
グによって一つずつのクローン（モノクローン）にする
。このクローニング方法としては１例えば限界希釈法で
行うことができる。すなわち、各穴あたり１個になるよ
うに希釈し、９６穴培養皿に分注し培養する。５〜１０
日後にコロニーが出現したら、穴あたり１個のコロニー
のみと思われる穴のハイブリドーマにつき、上記と同様
の操作で検索し、抗体産生株を再び上記と同様に希釈し
、上記と同様の操作を繰り返し、モノクローンを得れば
よい。

以上の方法により、抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマ細胞株を創製することができる
。

この方法に従って、あらかじめｍ−ＧＯＴで免疫したマ
ウスの肺臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞を融合し
て創製したハイブリドーマ細胞株の一種をハイブリドー
マＭＡＴ１１−１と命名し、この株を昭和５８年３月１
５日に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の
手続きを行ったが、この株は受託されなかった。このＭ
ＡＴｌｌ−１は一８０℃以下でほぼ永久的に凍結保存可
能であって、たえず頒布可能な状態におかれている。

このハイブリドーマＭＡＹ１１−１は１通常用いられる
培地で増殖可能である。例えば、牛胎児血清を５〜２０
ｖｏ１．％含有するＲＰＭＩ又はＭＥＭを培地として用
い、３７℃、炭酸ガス濃度５　ｖｏｌ、％含有空気下で
よく増殖する。また、ミエローマの造腫瘍性をも有して
いるので、生体内での増殖２例えば同系の動物、ヌード
マウス等で増殖し、抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を
産生ずることができる。

このハイブリドーマ細胞株を培養することにより、抗ｍ
−ＧＯＴモノクローナル抗体を大量に採取することがで
きる。このモノクローナル抗体の採取方法には、大きく
分けて二通りの方法がある。一つは培地を用い、フラス
コ等の培養容器で培養し。

その上澄液から抗体を採取する方法である。例えば、５
〜１０νｏｆ、％の血清を含むＭＥＭ又はＲＰＭ１１６
４０培地に、０．５〜５Ｘ１０Ｓ個のハイブリドーマ細
胞株を植えると２〜４日で１０〜２０倍に生育し、その
培養後の上澄液から抗体を採取する方法である。

もう一つの方法はこのようにし、て培養容器で培養した
ハイブリドーマ細胞株を同系の動物に接種する方法であ
る。すなわぢ、ハイブリドーマ細胞株を１０５〜１０７
個を同系の動物の腹腟内又は皮下等に投与し、７〜２０
日後ハイブリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍が大きくなっ
た時に血清及び腹水を採取する方法である。腹腟内に投
与する場合には。

事前（３〜７日前）に２．　６．１０．１４−テトラメ
チルペンタデカン等の鉱物油を投与すると、より多量の
腹水が得られる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じて精製して
使用することができる。すなわち、硫安分画、イオン交
換体、’　ｍ−ＧＯＴを固定化したアフイニティクロマ
トグラフイ等の通審タンパク質に適用されうる手段を用
いて精製することができる。

このようにして得られた抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗
体の理化学的性質を示す。

（１１作用・・・ｍ−ＧＯＴに作用して抗原抗体反応が
生じる。

（２）抗原抗体反応特異性・・・５−ＧＯＴとは反応せ
ず。

ｍ−ＧＯＴと反応する。

（３）至３ｆｉｉｐＨ・・・６〜９ （４）安定ｐＨ範囲・・・３〜１１ （５１力１面の測定法・・・イムノアッセイによって１
されうる希釈倍率により測定する。

（６）作用適温の範囲・・・２０〜４０℃（７）失活の
条件・・・１００°ＣＩＯ分の加熱で失活する。

（８）分子量・・・１５０．０００ 本発明のハイブリドーマ細胞株は、抗ｍ−ＧＯＴモノク
ローナル抗体を大量に、しかも容易に、かつ安価に得る
ことができるので、イムノアッセイでｍ−ＧＯＴを簡便
で感度よく測定することができる。

次に２本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ ジャーナル　オブ　バイオケミストリー８２巻８４７頁
記載の方法に従って、まずブタの心臓をミンチにし、凍
結融解、ホモゲナイズ、６５℃の熱処理の後＋　６００
Ｏｒｐｍの遠心分離により粗抽出液を得た。

次に、その粗抽出液より８０％飽和の硫安分画により得
たＧＯＴ画分を透析脱塩後、ハイドロキシアパタイトカ
ラムにより５−ＧＯＴとｍ−ＧＯＴとを分離した。さら
に、そのｍ−ＧＯＴ画分をＤＥＡＥセルロースカラム（
ｐＨ７，３）を素通りさせ、その両分をＣＭナセルース
カラム（ｐＨ６，３）に吸着させ、塩濃度を上げること
により溶出させ、精製して抗原のｍ−ＧＯＴを得た。

参考例２ ウシの心臓を用いる以外は参考例１と全く同様にして抗
原のｍ−［ｉｏＴを得た。

実施例１ ８週令のマウスＢＡＬＢ／Ｃ（静岡実験動物協同組合よ
り入手。）に参考例１で得た５０μｇのブタ製ｍ−ＧＯ
Ｔを完全フロントアジュバント（牛丼化学より入手。）
と１：１に混合乳化し、腹腔内に投与し、４週間後に同
様に５０μｇを不完全フロインドアジュバント（牛丼化
学より人手。）と混合し投与した。さらに、４週間後５
０μｇのブタｍ−’ＧＯＴを静注して追加免疫し、２日
後に肺臓をとりだし。

ＮＡＮＭＳ培地（阪大微研より人手。）にほぐして懸濁
、洗浄した。一方、マウスのミエローマ、Ｘ６３６・５
・３゛（フロー・ラボラトリ−社より人手。）を２日前
から培養し、対数増殖期にある細胞を遠心分離で集めた
。肺細胞　１０８個をミエローマＸ６３・６・５・３１
０７個とを混合し、遠心によりペレットとした後、３７
℃の水浴中で５０ｖｏ１．％のＰＥＧ４０００−ＲＰＭ
Ｉ１１６４０　（キブコ社より人手。）を１ｍｌを徐々
に１分間で加え、さらに１分間ゆるやかに攪拌後、６分
間で９ｍｌのＲＰＭ１１６４０培地を徐々に加えてＰＥ
Ｇ４０００　（シグマ社より入手。）を希釈した。

遠心分離によりＰＥＧ溶液を除去し、ペレ・ノドに１０
ｖｏ１．％牛胎児血清を含むＲＰｌ’１ｌ１６４０培地
１０ｍ１を加えて９６穴培養皿（ヌンク社より入手。）
に各穴に０．１ｍｌずつ分注した。翌日、　ＨＡＴ培地
を０．１　ｍｌずつ添加し、２，３，５，８．１１日口
の計５回にわたり半分量（０，１ｍｌ）の培養液を捨て
、新しいＩＩＡＴ培地を加えた。１４日後には９６大中
７８穴でハイブリドーマの生育がみられたので、その上
澄液を抗原のブタｍ−ＧＯＴを９６穴マイクロタイター
プレートに吸着させ、ペルオキシダーゼを標識した第二
抗体（ベクター社より入手。）により検出する方法によ
り検索したところ、１０数個はど発色するものが認めら
れたが、そのうち、特に発色度の大きい３株を選択し、
９６穴培養皿に１個／穴の密度に細胞を希釈して培養す
る限界希釈法によりクローニングをし、ハイブリドーマ
ＭＡＴＩＩ−１を得た。

参考例３ 実施例１で得たハイブリドーマＭＡＴＩＩ−１を１０ｖ
ｏｌ。

％の牛胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地で培養
し。

細胞濃度１０６個／ｍｌとなった上澄液を採取して抗ｍ
−ＧＯＴモノクローナル抗体を得た。この抗体を実施例
１で検索に用いた方法でアッセイしたところ。

２５６倍希釈で十分測定可能な程に発色した。

次ニ、ハイブリＦ−７ＭＡＴＩＩ−１５ｘ　ｒｏ’　１
ｌｌｄを６日前に２．　６．　１０．１４テトラメチル
ペンタデカン０．５ｍｌを投与されたＢＵ、Ｂ／　Ｃマ
ウスの腹腔内に投与し、！！瘍を形成せしめ、１２日後
に血清０．７ｍｌ／匹及び腹水２．０ｍｌ／匹を採取し
、抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を得た。この抗体を
培養上澄液同様にアッセイしたところ、約５０万倍でも
々り定可能であった。

また、この上記二つの抗体は、ヒトのｍ−ＧＯＴと反応
し、かついずれの５−ＧＯＴとも反応しなかったので、
十分臨床検査のＧＯＴの分別定量に適用可能であった。

実施例２ 参考例２で得たウシのｍ−ＧＯＴをもぢいて、実施例１
と同様に免疫し、実施例１と同様に融合し。

ウシｍ−ＧＯＴを吸着した９６穴マイクロタイタープレ
ートを用い　実施例１と同様に検索したところ。

１０株のウシｍ−ＧＯＴ抗体産生株が得られたので、そ
のうちの１株を実施例１と同様にクローニングしてハイ
ブリドーマ細胞株を得た。

参考例４ 実施例２で得た細胞株を、参考例３と全く同様に培養し
、その上′／Ｍ、液から抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗
体を得た。

この抗体を参考例３と同様にアッセイしたところ、５１
２倍まで測定可能なほどに発色した。

この抗体はヒトのｍ−ＧＯＴと反応したが、いずれの５
−ＧＯＴとも反応しなかった。

特許出願人　ユニチカ株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ミトコンドリアアスパラギン酸アミノトランス
   フェラーゼ（Ｍｆｔｏｃｏｎｄｒｉａｌ　ａｓｐａｒｔ
   ａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、別名Ｍｉｔ
   ｃｏｎｄｒｉａｌ　ｇｌｕｔａｍｉｃｏｘａｌｏａｃｅ
   ｔｉｃ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｉ以下略称してｍ−
   ＧＯＴという。）モノクローナル抗体産生能を有するハ
   イブリドーマ細胞株。