JPS6024196A - 抗ｍ−ＧＯＴモノクロ−ナル抗体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体及びその製
造方法に関する′ものであり、さらに詳細には。

ＧＯＴの分別定量など、アイソザイムの区別に極めて有
効な抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体及びその製造方法
に関するものである。

アスパラギン酸アミントランスフェラーゼ（ＧＯＴ　）
は９種々の動物及び微生物に広（存在し、アミノ基の転
移をあずか、る重要な酵素であるが、特に血清中のＧＯ
Ｔ含量は心筋梗塞、筋疾患、肝疾患等により増大するこ
とが知られており、臨床検査の中でも重要な測定項目と
なっている。ＧＯＴには、細胞質両分に存在する５−Ｇ
ＯＴとミトコンドリア画分に存在するｍ−ＧＯＴの二つ
のアイソザイムがあり。

従来は特殊な目的以外区別しては測定されていなかった
。ところが、最近そのアイソザイムを別個におのおの測
定する意義が研究面、臨床検査の面からいわれ、特にｍ
−ＧＯＴはその血中濃度が肝疾患の程度や９手術の予後
経過とよく相関することから、　ｍ−ＧＯＴの分別定量
が望まれている。

現在、　ＧＯＴの測定はカルメンらに報告〔ジャーナル
　オブ　クリニカル　インベスティゲーション（Ｊ、　
Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　３４巻、１３１頁（１
９５５）　）されている方法がよく用いられる。すなわ
ち、　ＧＯＴ反応により生成したオキザロ酢酸をリンゴ
酸脱水素酵素によりリンゴ酸に変換する際に酸化される
補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの量を紫
外部の吸光度により測定するという方法である。この方
法に代表される酵素活性で測定する方法では、二つのア
イソザイムとも反応し１分別して測定することは不可能
である。そのために。

これらの方法を用いる時は事前に、ジエチルアミノエチ
ルイオン交換体又は電気泳動装置を用いて分別する必要
があった。これらの分別装置は、装置が高価で５分離に
時間を要し、比較的多量の試料を要する等の欠点があっ
た。さらに二つのアイソザイムが免疫学的に交差しない
ことを利用して。

５−ＧＯＴの抗血清をもちいて５−ＧＯＴを沈降せしめ
。

上清のｍ−ＧＯＴを上記の方法等で測定するという方法
〔特開昭５０−１９９１８号公報参照。〕もあるが。

やはり分離する手段が遠心分離を含む、抗体と羊赤血球
の結合物をつくるのが煩雑等の欠点がある。

さらに、酵素活性で測定する方法は補酵素（ピリドキサ
ールホスフェート）のはずれたアポ酵素は。

その補酵素を添加しないと測定不可能であり、操作をよ
り煩雑、高価なものにしている。

また、直接免疫学的測定法（イムノアッセイ）でｍ−Ｇ
ＯＴを測定する方法〔例えばロハート（Ｒｏｂｅｒｔ）
　＋クリニカル　バイオケミストリー（Ｃ１ｉｎ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ）１２巻、２５０頁（１９７９年）〕も知ら
れている。これは、抗体が互いに交差しないことを利用
するため。

上記に示した酵素活性を測定する方法にみられる欠点は
ほぼ克服できるが、これらのイムノアッセイに使用する
抗体が従来の方法、すなわちウサギ等の動物に精製した
抗原で免疫して、血清から分離する方法で得られたもの
であるため、抗血清を採取するたびに大量のしかも精製
された抗原が必要であり、また抗体の最も少量しか得ら
れず、その抗体も単一、均質なものでなく、その品質も
主に動物の個体差に由来するバラツキがあるという欠点
を有していたため、イムノアッセイに使用することが困
難であった。

それゆえ、イムノアッセイの利点を最大限に発揮するう
えで、安価で、かつ大量にしかも品質の安定した抗体の
出現が熱望されていた。

一方、　１９７５年にケーラー（Ｋ２ｈｌｅｒ）とミル
シュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）は、免疫されたマウス
の肺細胞のリンパ球と骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合
させることによって得られる融合細胞（ハイブリドーマ
）を用いて、単一、均質な抗体くモノクローナル抗体）
を製造しうろことを示した〔ネイチ＋−（Ｎａ　ｔｕｒ
ｅ）２５６巻４９５頁（１９７５）　）　、この報告以
来１種々のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体につ
いて報告がされてきた〔例えば、コブロースキー（Ｋｏ
ｐｒｏｗｓｋｉ　）　＋プロシーディングオブ　ナショ
ナル　アカデミツク　サイエンスニーニスニー（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　
７５巻、　３９３Ｂ頁（、１９７８年）；ガルフル（Ｇ
ａｌｆｒｅ）らネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２６６
巻、５５０頁（１９７７年）；ケーラー（Ｋ；ｈｌｅｒ
）らヨーロピアン　ジャーナルォブ　イムノロジー（Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　＋　６巻５１１頁
（１９７６年）〕が、〕抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗
については、全く何も記載されていないし。

またその創製に成功したとの報告もなされていない。

そこで１本発明者らはｍ−ＧＯＴを簡便で感度よく測定
することができるイムノアッセイに適用しうる抗体とそ
の抗体を効率良く生産しうろことのできる製造方法を提
供することを目的として、鋭意検討した結果、抗ｍ−Ｇ
ＯＴ抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを融合させて
得たパイブリドーマ細胞株が、大量の抗ｍ−ＧＯＴモノ
クローナル抗体を生産すること及びその抗体が前記の目
的を達成されることを見い出し９本発明を完成した。

すなわち１本発明はｍ−ＧＯＴと反応し、　５−ＧＯＴ
とは反応しない抗原抗体反応特異性を有するモノクロー
ナル抗体（抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体。）及び抗
ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体産生能を有するハイブリ
ドーマ細胞株を培養し、培養物から抗ｍ−ＧＯＴモノク
ローナル抗体を採取することを特徴とする抗ｍ−ＧＯＴ
Ｏモノクローナル抗体の製造方法である。

次に２本発明に用いられる細胞株としては１例えば次の
細胞学的性質を示す細胞株があげられる。

（１）由来・・・抗ｍ’−ＧＯＴ抗体産生リンパ球とエ
ミローマ細胞との融合により創製した融合細胞である。

（２）形態・・・ミエローマ細胞とほぼ同様の形態を示
す。例えば、大きさは１０〜２０μｍである。

（３）機能・・・単一の抗原決定基を認識する抗ｍ−Ｇ
ＯＴモノクローナル抗体を定常的に生産する。

（４）増殖性・・・ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性
を示す。すなわち、７２時間で約１０倍に増殖する。

（５）保存性・・・−７０°Ｃ以下で極めて容易に長期
間保存可能である。

（６）最適増殖条件・・・温度３７℃、　ｐＨ７，２゜
（７）増殖範囲・・・温度３２℃〜４２℃、　ｐＨ６，
５〜７．８で増殖可能である。

本発明に用いられる細胞株を得るには５例えば次のごと
き方法を採用すればよい。すなわち、まず哺乳動物好ま
しくはマウス又はラットにｍ−ＧＯＴで免疫する。抗原
としては、全てのｍ−ＧＯＴを使用することができるが
、臨床化学的には従来の抗面清がヒトのｍ−ＧＯＴと交
差する哺乳動物１例えばヒト、ブタ、ウシ、ウサギ等の
由来で、かつ被免疫動物とは異なる動物由来が好ましい
。このｍ−ＧＯＴを採取するには２例えばザジャーナル
　オブ　バイオロジカル　ケミストリー　２５３巻８８
４２頁、ジャーナル　オブ　バイオケミストリー８２巻
８４７頁の記載の方法に従って採取すればよい。抗原の
使用量、投与部位、アジュバントの使用等、免疫の方法
は従来の抗血清を得る方法に準ずればよい。例えば、マ
ウスを用いる場合、マウス−匹あたり一回につき０．０
０１〜１０ｎ＋ｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇのｍ−
ＧＯＴを初回はアジュバント（例えば、フロイントの完
全アジュバント）とよく混合して、皮下。

腹腔内等に投与し、３週間以上経過後再びアジュバント
（例えば、フロイントの不完全アジュバント）をよく混
合して、皮下腹腔内等に投与する。

さらに、３週間以上経過後ｍ−ＧＯＴのみを静脈内。

腹腔内、皮下環に投与して、十分免疫する。このように
して免疫された動物を、好ましくは最終免疫から２〜４
日後に殺し、リンパ球を採取する。

リンパ球調製には肺臓、リンパ節、未稍血等が用・いら
れる。このリンパ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく
。

一方、骨髄腫細胞（ミエローマ）を用意する。

このミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のものを使
用することが好ましい。さらに、そのミエローマは薬剤
抵抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミエロ
ーマがハイブリドーマ選択培地で生育しないものが好ま
しい。最も、一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞ラ
インが用いられる。これは、ヒボキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎ
ｔｉｎ　ｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ
　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が欠損しており。

選択培地の一種ヒボキサンチンーアミノブテリンーチミ
ジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また。

使用するミエローマ自身が抗体を分泌しないものが望ま
しい。以上の点から２例えば市販のマウスミエローマＰ
３・Ｘ６３・八ｇ８・６・５・３（Ｘ６３・６・５・３
）、Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・Ｕｌ　（Ｐ２Ｏ３）　、ラ
ットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３等を
用いるのが好ましい。

このミエローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含有す
るイーグル最少培地（ＭＥＭ　）　、　ＲＰＭ１１６４
０培地（ＲＰ旧１６４０）等の培地中で培養する。

次にＭＥＭ　、　ＲＰ旧１６４０等の培地に、上記で得
たリンパ球及びミエローマをおのおの懸濁し、混合する
。このときの混合比は、任意に選択できるが。

好ましくはリンパ球対ミエローマが細胞数で１対１から
２０対１．好ましくは５対１から１０対１の比率を用い
ればよい。混合した細胞は、融合促進剤を用いて融合を
行う。融合方法としては１例えばイムノロシカルメソッ
ズ２巻２８５頁（Ｉｍｍｕｎｏｌｏ−ｇｉｃａｌ　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　、ＶｏｌＩ［１９８１＋　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ）に従って行えばよい。融合促進剤とし
ては１種々の高分子物質やウィルス等を用いることがで
きるが。

好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）　’＋
センダイウィルスを用いればよい。　ＰＥＧは、平均分
子量４００〜２０　、０００のものが使用できるが、好
まし（は１，０００〜７，５００のものを用いればよい
。その使用濃度は４０〜６０ｖｏ１９％が好ましい。

融合させた細胞は、洗浄で融合促進剤を除去し。

５〜１５ｖｏ１０％の血清を含むＭＥＭ又はＲＰＭ１１
６４０培地に懸濁し、９６穴培養皿等に０．５〜５ＸＩ
ＯＧ／穴の割合で分注する。さらに、各穴に選択培地（
例えばＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交換すれば
。

１０〜１４日後には、未融合のミエローマは死滅し。

ハイブリドーマのみ生育する。ちなみに、リンパ球は長
時間生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では生育できず。

やはり１０〜１４日後には死滅する。

目的の抗体を産生じているハイブリドーマの検索として
は、培養上澄液の抗体価を知ることによって行うごきが
できる。例えば、目的とするｍ−ＧＯＴを９６穴マイク
ロタイタープレイド等の担体に吸着させ、非吸着面はウ
シ血清アルブミンで保護し。

上澄液を採取して加える。１〜２４時間の抗原抗体反応
終了後、洗浄し標識された第二抗体（例えばリンパ球が
マウス由来ならウサギ製抗マウスイムノグロブリン等）
を加え、同様に反応せしめる。

標識としては、ラジオアイソトープ、酵素、螢光物質等
を用いることができる。同様に洗浄後、標識方法に応じ
て検出方法で検出する。例えばアイソトープの場合、そ
の放射能活性を、酵素の場合は、基質を加えて酵素活性
を、また螢光物質の場合は、螢光光度計によりその螢光
強度を測定し。

対象実験より強く検出された培養皿の穴を選択する。こ
の方法で選択された穴には、２種類以上のハイブリドー
マのクローンが存在する可能性があるので、クローニン
グによって一つずつのクローン（モノクローン）にする
。このクローニング方法としては１例えば限界希釈法で
行うことができる。すなわち、各穴あたり１個になるよ
うに希釈し、９６穴培養皿に分注し培養する。５〜１０
日後にコロニーが出現したら、穴あたり１個のコロニー
のみと思われる穴のハイブリドーマにつき、上記と同様
の操作で検索し、抗体産生株を再び上記と同様に希釈し
、上記と同様の操作を繰り返し、モノクローンを得れば
よい。

以上の方法により、抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマ細胞株を創製することができる
。

この方法に従って、あらかじめｍ−ＧＯＴで免疫したマ
ウスの肺臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞を融合し
て創製したハイブリドーマ細胞株の一種をバイプリドー
マＭＡＴＨ−１と命名し、この株を昭和５８年３月１５
日′に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の
手続きを行ったが、この株は受託されなかった。このＭ
ＡＴＨ−１は−８０”Ｃ以下でほぼ永久的に凍結保存可
能であって、たえず頒布可能な状態におかれている。

本発明の抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体は１例えば、
上記で得たハイブリドーマ細胞株を培養することにより
、大量に採取することができる。このモノクローナル抗
体の採取方法には２例えば、大きく分けて二通りの方法
がある。一つは培地を用い２フラスコ等の培養容器で培
養し、その上澄液から抗体を採取する方法である。例え
ば、５〜１゜ｖｏｌ、％の血清を含ｔｉ′ＭＥＭ又はＲ
ＰＭ１１６４０培地に、０．５〜５　Ｘ　１０５　＋Ｉ
ｌのハイブリドーマ細胞株を植えると２〜４日で１０〜
２０倍に生育し、その培養後の上澄液から抗体を採取す
る方法である。もう一つの方法はこのようにして培養容
器で培養したハイブリドーマ細胞株を同系の動物に接種
する方法である。

すなわち、ハイブリドーマ細胞株を１０５〜１０７個を
同系の動物の腹腟内又は皮下等に投与し、７〜２０日後
ハイブリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍が大きくなった時
に血清及び腹水を採取する方法である。腹腟内に投与す
る場合には、事前（３〜７日前）に２．　６．　１０．
１４−テトラメチルペンタデカン等の鉱物油を投与する
と、より多量の腹水が得られる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じて精製して
使用することができる。すなわち、硫安分画、イオン交
換体、　ｍ−ＧＯＴを固定化したアフィニティクロマト
グラフィ等の通富タンパク質に適用されうる手段を用い
て精製することができる。

このようにして得られた本発明の抗ｍ−ＧＯＴモノクロ
ーナル抗体の理化学的性質を示すが、この理化学的性質
は、ハイブリドーマＭＡＴ１１−１から得た抗体のもの
である。

（１）作用・・・ｍ−ＧＯＴに作用して抗原抗体反応が
生じる。

（２）抗原抗体反応特異性・・・５−ＧＯＴとは反応せ
ず。

ｍ−ＧＯＴと反応する。

（３）至適ｐＨ・・・６〜９ （４）安定ｐＨ範囲・・・３〜１１ （５）力価の測定法・・・イムノアッセイによって検出
されうる希釈倍率により測定する。

（６）作用適温の範囲・・・２０〜４０℃（７）失活の
条件・・・１００℃１０分の加熱で失活する。

（８）分子量・・・１５０，０００ 本発明の抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体は、大量に、
しかも容易に、かつ安価に得ることができるので、イム
ノアッセイでｍ−ＧＯＴを簡便で感度よく測定すること
ができる。

次に２本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ ジャーナル　オブ　バイオケミストリー８２巻８４７頁
記載の方法に従って、まずブタの心臓をミンチにし、凍
結融解、ホモゲナイズ、６５℃の熱処理の後＋　６００
Ｏｒｐｍの遠心分離により粗抽出液を得た。

次に、その粗抽出液より８０％飽和の硫安分画により得
たＧＯＴ画分を透析脱塩後、ハイドロキシアパタイトカ
ラムにより５−ＧＯＴ　（！：ｍ−ＧＯＴとを分離した
。さらに、そのｍ−ＧＱＴ画分をＤＥＡＥセルロースカ
ラム（ｐＨ７，３）を素通りさせ、その両分をＣＭナセ
ルースカラム（ｐＨ６，３）に吸着させ、塩濃度を上げ
ることにより溶出させ、精製して抗原のｍ−ＧＯＴを得
た。

参考例２ ウシの心臓を用いる以外は参考例１と全く同様にして抗
原のｍ−ＧＯＴを得た。

参考例３ ８週令のマウスＢＡＬＢ／Ｃ（静岡実験動物協同組合よ
り入手。）に参考例１で得た５０．１７　ｇのブタ製ｍ
−ＧＯＴを完全フロントアジュバント（牛丼化学より入
手。）と１＝１に混合乳化し、腹腔内に投与し、４週間
後に同様に５０μｇを不完全フロインドアジュバント（
牛丼化学より入手。）と混合し投与した。さらに、４週
間後５０μｇのブタｍ−ＧＯＴを静注して追加免疫し、
２日後に肺臓をとりだし。

ＮＡＮＫＳ培地（阪大微研より入手。）にほぐして懸濁
、洗浄した。一方、マウスのミエローマ、Ｘ６３６・５
・３　（フロー・ラボラトリ−社より入手。）を２日前
から培養し、対数増殖期にある細胞を遠心分離で集めた
。牌細胞　１０８個をミエローマＸ６３・６・５・３１
０７個とを混合し、遠心によりペレットとした後、３７
℃の水浴中で５０ｖｏ１．％のＰＥＧ４０００−ＲＰＭ
Ｉ１１６４０　（キブコ社より入手。）を１ｍｌを徐々
に１分間で加え、さらに１分間ゆるやかに攪拌後、６分
間で９ｍｌのＲＰＭ１１６４０培地を徐々に加えてＰＥ
Ｇ４０００　（シグマ社より入手。）を希釈した。

遠心分離によりＰＥＧ溶液を除去し、ペレットに１゜ｖ
ｏｌ、％牛胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地１０ｍ
１を加えて９６穴培養皿（ヌンク社より入手。）に各穴
に０．１ｍｌずつ分注した。翌日、　ＨＡＴ培地を０．
１　ｍｌずつ添加し、２，３，５，８．１１日口の計５
回にわたり半分量（０，１ｍｌ）の培養液を捨て、新し
いＨＡＴ培地を加えた。１４日後には９６大中７８穴で
ハイブリドーマの生育がみられたので、その上澄液を抗
原のブタｍ−ＧＯＴを９６穴マイクロタイタープレート
に吸着させ、ペルオキシダーゼを標識した第二抗体（ベ
クター社より入手。）により検出する方法により検索し
たところ、１０数個はど発色するものが認められたが、
そのうち、特に発色度の大きい３株を選択し、９６穴培
養皿に１個／穴の密度に細胞を希釈して培養する限界希
釈法によりクローニングをし、ハイブリドーマＭＡＴＨ
−１を得た。

実施例１ 参考例３で得たハイブリドーマＭＡＴＩ（−１を１０ｖ
ｏｌ。

％の牛胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地で培養
し。

細胞濃度１０６個／ｍｌとなった上澄液を採取して抗ｍ
−ＧＯＴモノクローナル抗体を得た。この抗体を実施例
１で検索に用いた方法でアッセイしたところ。

２５６倍希釈で十分測定可能な程に発色した。

次に、ハイブリドーマＭＡＴＩ（−１５ｘ　１０６（固
を６日前に２．　６．　ｉｏ、　１４テトラメチルペン
タデカン０．５ｍｌを投与されたＢＡＬＢ／　Ｃマウス
の腹腔内に投与し、腫瘍を形成せしめ、１２日後に血清
０．７ｍｌ／匹及び腹水２．０ｍｌ／匹を採取し、抗ｍ
−ＧＯＴモノクローナル抗体を得た。この抗体を培養上
澄液同様にアッセイしたところ、約５０万倍でも測定可
能であった。

また、この上記二つの抗体は、ヒトのｍ−ＧＯＴと反応
し、かついずれの５−ＧＯＴとも反応しなかったので、
十分臨床検査のＧＯＴの分別定量に適用可能であった。

参考例４ 参考例２で得たウシのｍ−ＧＯＴをもちいて、実施例１
と同様に免疫し、実施例１と同様に融合し。

ウシｍ−ＧＯＴを吸着した９６穴マイクロタイタープレ
ートを用い、参考例３と同様に検索したところ。

１０株のウシｍ−ＧＯＴ抗体産生株が得られたので、そ
のうちの１株を参考例３と同様にクローニングしてハイ
ブリドーマ細胞株を得た。

実施例２ 参考例４で得た細胞株を、実施例１と全く同様に培養し
、その上澄液から抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体を得
た。

この抗体を参考例３と同様にアッセイしたところ、５１
２倍まで測定可能なほどに発色した。

この抗体はヒトのｍ−ＧＯＴと反応したが、いずれの５
−ＧＯＴとも反応しなかった。

特許出願人　ユニ子力株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ミトコンドリアアスパラギン酸アミノトランスフ
   ェラーゼ（Ｍｉｔｏｃｏｎｄｒｉａｌ　ａｓｐａｒｔａ
   ｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、別名Ｍｉｔｃ
   ｏｎｄｒｉａｌ　ｇｌｕｔａｍｉｃｏｘａｌｏａｃｅｔ
   ｉｃ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；以下略称してｍ−Ｇ
   ＯＴという。）と反応し、細胞質アスパラギン酸アミノ
   トランスフェラーゼ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　ＧＯＴ又は
   ５ｏｌｕｂｌｅ　ＧＯＴ　；以下５−ＧＯＴという。）
   とは反応しない抗原抗体反応特異性を有するモノクロー
   ナル抗体（以下抗ｍ−にＯＴモノクローナル抗体という
   。）。
2. （２）抗ｍ−ＧＯＴモノクローナル抗体産生能を有する
   ハイブリドーマ細胞株を培養し、培養物から抗ｍ−ＧＯ
   Ｔモノクローナル抗体を採取することを特徴とする抗ｍ
   −ＧＯＴモノクローナル抗体の製造方法。