JPS6024710B2 - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担子菌によるセルラーゼの製造法に関する。

従来よりセルラーゼは、繊維質を分解する酵素として食
品工業、飼料、下水処理及び医薬等の分野に於いて広く
利用されている。

そこで本発明者等は、植物繊維質に対し強い酵素活性を
示すセルラーゼを生産する微生物を見し、出すべく、広
く自然界よりセルラーゼ生産菌の検索を管つた結果、農
家の稲わら堆肥中より分離したコプリナス（Ｃｏｐｒｉ
ｎ船）属に属する担子菌が極めて強い酵素活性を示すセ
ルラーゼを生産することを知り、本発明を完成した。

即ち本発明は、コプリナス属に属し、セルラーゼ生産能
を有する菌株をセルロース含有培地に接種、培養し、培
養物よりセルラーゼを採取することを特徴とするセルラ
ーゼの製造法である。

以下本発明を詳述する。先ず本発明に使用される菌とし
てはコプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属しセルラー
ゼ生産館を有する菌であれば如何なる菌でも良く、また
これをの菌の変種もしくは変異株でも良い。

そしてコプリナス属に属しセルラ−ゼ生産能を有する菌
の具体例としては、例えばコプリナス・シネレウス（Ｃ
ｏｐｒｉｎ雌・ｃｍｅｒｅｕｓ）ＫＫ−３７Ｍ等が挙げ
られる。

上記コブリナス・シネレウス３７Ｍの菌学的性質は以下
に示す通りであ。

なお菌学的性質は概ね「ＴｈｅＦ皿ｇ Ｎ Ｂ（Ｃｈａ
ｐｔｅｒ２３）」Ａｌｅ滋ｎｄｅｒＨ．Ｓｍｉｔｈ（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ．１９７３）および「標準原
色図鑑全集１４菌類」今関六也、本郷次雄、椿啓介共著
（保有社出版、１９７７）に記載の方法に準拠した。コ
プリナス・シネレウスＫＫ−３７Ｍの菌学的性質ｍ 各
塔地における生育状態（何れも２５℃で培養）■ 麦芽
エキス寒天塔地 ７日目で旺盛な生育を示し、集落の直径は６５×６５側
で、白く柔かし、ふわふわした綿毛状を呈する。

１４日目ではシャーレ（８５×８５側）全面に生育し、
中心部は直経５仇吻程度の円形で綿毛状の菌糸が盛り上
り、その周辺は極めて短い菌糸を培地上を覆う。

■ バレイショ・ブドウ糖寒天塔地 ７日目で旺盛な生育を示し、集落は８３×８３燭（直径
）程度で、白く柔かい極めて密に集合した綿毛状を呈す
る。

１４日目では直径８５×８５脚で、厚さが２〜３側、白
色洋毛状の菌糸が密生し、集落の周縁部に褐色の０．１
側程度の菌核を形成する。

■ ッアベック寒天培地 ７日目の生育は不良で、希薄な菌糸が８３×８３側程度
まで広がっているが、集落の形成は認められない。

１４日目では菌糸の生育にはほとんど変化は見られない
がシャレーの全面に褐色で０．１肋程度の菌核をまばら
に形成する。

■ サブロー寒天塔地 ７日目では小程度の生育を示し、集落は４５×４５側程
度で、白く柔かし、長毛の菌糸がやや粗く集合した集落
を形成する。

１４日目では中程度の生育（７５×７５肋）を示し、菌
糸は白色でやや長く、中央部が盛り上り、全体として花
びらを重ねた状態となり、裏面は黄色を呈する。

■ ＹｐＳｓ寒天塔地 ７日目で極めて旺盛な生育を示し、集落は８３×８３側
程度で白く柔かし、綿毛状を呈し、培地中に褐色の０．
１肋程度の菌核を多数を多数形成する。

１４日目ではシャーレの全面（８５×８５肌）に生育し
、菌糸は灰白色綿毛状を呈し、菌核は全面に形成し、裏
面は褐色を呈し、集落の表面に子実体形成の為の白色の
原基を１の固程度形成する。

‘２） 生理的性質 ■ 最適生育条件 ＰＨ；６．０〜９．０ 温度：２５〜４０ｑ０ ■ 生育の範囲 ＰＨ；４．５〜１０．５ 温度；２０〜４５℃ 次に上記した菌学的性質を有するコプリナス・シネレウ
スＫＫ−３７Ｍの分類学上の位置について「ＴｈｅＦｕ
ｎｇｉ Ｗ Ｂ（Ｃｈａｐｔｅｒ２３）」Ａｌｅ滋ｎｄ
ｅｒＨ．Ｓｍｉｔｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ．１
９７３）および「標準原色図鑑全集１４菌類」今関六也
、本郷次雄、椿啓介共著（保有社出版、１９７７）の分
類と対比検討した結果、本菌株は菌糸の隔膜部にカスガ
イ状突起を有し、ＹｐＳｅ培地上に形成された子実体は
、幼時には長９８形で、極めて脱落し易い白色の毛で被
われ、ヒダは茎に酸生し刃状を呈すること、胞子は成熟
すると傘が一夜のうちに液化した線条に沿い裂片状とな
ること、更に胞子紋は黒紫褐色で傘には大形の側シスチ
ジアを有することより、コプリナス属に属する菌株であ
ると判明される。

更に本菌株の子実体の茎は、絹糸状の細鱗片に被われ、
茎の根本はや）ふくれ、上方に向ってやや紬まっている
こと、更に一つの担子器に４個のの胞子を付け、該胞子
は楕円形（６〜７×９〜１１仏）で発芽孔を有すること
からコプリナス・シネレウスと判定される。そして上記
傘は幼時に於いてクリーム色から徐々に濃い紫色になり
、成熟すると黒紫色になること、更に生育最適温度は３
７〜４０ｏｏで、特に３７０付近で子実体の形成が旺盛
となることより、本菌株はコブリナス・シネレウスの新
菌株であると同定し、本菌株をコプリナス・シネレウス
ＫＫ−３７Ｍと命名した。

なお上記コプリナス・シネレウスＫＫ−３７Ｍは工業技
術院微生物工業技術研究所に徴工研菌寄第６０７２号（
ＦＥＲＭＰ−６０７２）として寄託されている。

次に、本発明に於けるセルラーゼ生産に使用される堵地
としては、例えば櫨紙、アビセル、脱脂綿、オガクズ、
おから、稲わら、醤油柏、コーヒー粕、落下生殻等のセ
ルロースを含有させることが必須で、これに必要により
殿粉等の多糖類、単糖類および少糖類、窒素源としてべ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、酵母、ア
ンモニム塩類、尿素等の有機もしくは無機の窒素化合物
、その他リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩等の無機塩類
、ビタミン類、生長促進物質を適宜添加した培地が用い
られる。

また培養培地としては、液体培地固体培地の何れでも良
く、培養ｐＨ‘ま通常５．５以上、好ましくは６〜９の
範囲である。そして培養温度は２５〜４０ｑｏ、好まし
くは３０〜３〆０付近であり、また培養期間としては通
常２〜１０日間程度であった。培養終了後、固体培養の
場合は該培養物を常法により水もしくは緩衝液等で抽出
し、液体培養の場合は該培養を常法により櫨過もしくは
遠心分離し粗酵素液を得る。

上述の操作により得られる本酵素（粗酵素液）の理化学
的性質を示すと、以下の通りである。

‘１１ 作用および基質特異性櫨紙、アビセルＣＭＣ−
Ｎａ、脱脂綿、オガクズ、おから、稲わら、醤油粕、も
み殻、ピーナツ殻、コーヒー粕等に作用し、還元糖を生
成させる。

‘２１ 至適ｐＨおよび安定ｐＨ 本酵素の至薄ｐＨは第１図に示す如く、ＰＨ６．０（５
０００）であり、安定ｐＨの範囲は第２図の如くｐＨ４
〜９（３０ｏｏ、２独特間処理）である。

なおｐＨ５〜８の範囲では、５０ｑｏで４時間加熱処理
を行っても５０％以上の活性が残存した。脚 力価の測
定法セルラーゼ活性の測定は、櫨紙を基質として生成す
る還元糖の増加量を測定する方法を用いた（Ｍ．Ｍａｎ
ｄｅｌｅ ＆ Ｄ．Ｓにて肋ｅｒｇ，Ｊ，Ｆｅｒｍ
ｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ・，５４，２６７．１９７６）
。

即ち猿紙（ワットマンＭ．１）５０雌を基質として、こ
れに酵素液０．５泌とクエン酸緩衝液（餌６．０，０．
１Ｍ）１の‘を加え５０００で６０分間酵素反応を行な
った後、ジニトロサルチル酸試薬３の‘を加え、沸騰裕
中で５分間加熱た発色させる。これに水１６のとを加え
５５瓜ｍに於ける吸光度を測定し、グルコース量として
表わした。酵素単位は、５０ｏ０１時間の反応で１山夕
のグルコースに相当する還元力を生成する酵素活性を１
単位とした。

【４）作用適温の範囲 本酵素の作用適温の範囲は、第３図の如く４５〜５５ｏ
０（ｐＨ６．０）である。

‘５｝ ｐＨ、温度などによる失活の条件第４図の如く
、ｐＨ６．０の条件下でほぼ５０ｑＣまで安定である。

【６｝ 阻害および活性化 本酵素は水銀、銀等の重金属により阻害を受け、マンガ
ン、コバルト、バリウム等により活性化される。

‘７｝ 精製方法 本酵素の精製方法は、本菌の培養液を遠心分離して得ら
れた櫨液（粗酵素液）を、０．０９ＭＮａ２ＨＰ０４（
クエン酸でｐＨ８．０に調整）溶液で充分に平衡化した
ＤＥＡＥーセフアデツクス（スェーデン、ファルマシア
社製）に吸着させる。

次いで前記緩衝液で充分に洗った後、０．９Ｍ食塩を含
む前記緩衝液で溶出する。溶出液を限外猿過膜ＵＭ−１
０（米国、アミコン社製）を用いて脱塩、濃縮し、この
濃縮液を前記緩衝液で平衡化したセフアデツクスＧ−１
５０（スェーデン、ファルマシア社）でゲル櫨週を行い
精製する。【８１ 分子量本酵素はＣ，一酵素、Ｃｘ−
酵素、８−グルコシダーゼ等の酵素群よりなり、分子量
は平均１０，０００〜１００，０００である。

本発明により得られるセルラーゼは、その安定ｐＨ範囲
が４〜９と極めて広く、殊ににｐＨ８付近に於いても強
い酵素活性を有する為、例えば消化薬等の医薬品工業、
その他食品工業等に広く使用され、本発明は工業的に極
めて有意義である。

以下実施例により本発明を具体的に示す。実施例 アビセン；１％（Ｗ／Ｖ）、（ＮＨ４）２Ｓ０４；０．
１４％（Ｗ／Ｖ）、Ｋ比Ｐ０４；０．２０％（Ｗ／Ｖ）
、尿素；０．０３％（Ｗ／Ｖ）、ＣａＣ１２；０．０３
％（Ｗ／Ｖ）、ＭｇＳ０４・７日２０；０．０３％（Ｗ
／Ｖ）、ベプトン：０．１０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス
；０１０％（Ｗ／Ｖ）、ツイーン８０；０．１のＺ、Ｆ
ｅＳ０４・７日２８０；０．００００５％（Ｗ／Ｖ）、
ＭｎＳ０４・日２０；０．０００１６％（Ｗ／Ｖ）、Ｚ
ｎＳ０４・７日２０：０．００００１４％（Ｗ／Ｖ）及
びＣｏＣ１２：０．００００２％（Ｗ／Ｖ）を含有する
液体培地５０の上を５００Ｍ客ヒダ付きフラスコに投入
し、常法により加熱殺菌後、これに５％Ｎａ２Ｃ０３溶
液２０泌を加え培地のｐＨを８．５に調整したものに、
コプリナス・シネレウスＫＫ−３７Ｍ（徴工研菌寄第６
０７２号、ＦＥＲＭＰ−６０７２）の菌糸を接種し、３
０ｑｏで３日間ロータリシェーカーで種培養して得られ
る培養液の全量（４０の‘）を、上記組成の液体培地１
〆と共に５〆客三角フラスコに投入し、次いで該培地の
ｐＨを５％Ｎａ２Ｃ０３溶液でｐＨ８．５に調整した後
、３０午０で７日間ロータリーシェーカーで培養を行な
った。

培養終了液を常法により遠心分離して得られた櫨液８０
０の‘に冷アルコールを２４００泌を加えて１昼夜放置
後、沈澱する区分を補集し、次いで常法により減圧下で
乾燥し本粗酵素粉末５９を得た。

該粗酵素の酵素活性は１．４×１ぴｈ．／夕であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至通ｐＨ、第２図は安定−範囲、第３
図は作用適温の範囲、第４図は温度による失活の条件（
ｐＨ６．０）を夫々示す。 オー図 オ２図 ズ５図 力４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コプリナス属に属し、セルラーゼ生産能を有する菌
   株をセルロース含有培地に接種、培養し、培養よりセル
   ラーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製造法
   。