JPS6024716B2

JPS6024716B2 - 高活性な固定化酵素の製法

Info

Publication number: JPS6024716B2
Application number: JP57036132A
Authority: JP
Inventors: 国宏市村
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1982-03-08
Filing date: 1982-03-08
Publication date: 1985-06-14
Also published as: JPS58152483A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、光化学的な酵素不溶化方法、さらに詳しくい
えば、ポリピニルアルコール系光架右喬性樹脂にポリエ
チレングリコールを混和することにより、光照射によっ
て包括固定化された酵素の活性が著しく向上される酵素
の不溶化方法に関する。

これまでに知られている酵素の不落化方法は坦体結合法
、架橋法、及び包括法に大別される。

このうち包括性は高分子マトリックス中に酵素を閉じ込
めるものであり、酵素など生体反応活性物質の構造をそ
こなうことなく、したがって活性低下をもたらすことな
く固定化できるので、有利な方法として注目されている
。とくに、微生物菌体、オルガネラなどのミクロンオー
ダーの大きさを持つ酵素を固定化出来るので重要な方法
である。この高分子マトリックス中に酵素を閉じ込める
方法として、水落性高分子化合物を熱的に架橋させる方
法、水瀞性高分子化合物を放射線照射により架橋させる
方法、ピニルモノマー又はオリゴマーをラジカル重合さ
せる方法、光架橋性高分子を照射する方法などが提案さ
れている。このうち、とくに、光照射により酵素を閉じ
込める方法は、固定化に要する反応条件が著しく温和で
あり、活性低下が防止出来るものとして注目されている
。中でも、光二重化反応により光不溶化するポリビニル
アルコール譲導体を用いる方法は、固定化に関する架橋
反応が特定の感光基間でのみ起こるために、固定化の際
に活性低下が起こらないものとして興味深い（特開昭５
５−２３９４１号公報参照）。しかしながら、このよう
な特色を持つ包括法には次のような解決すべき点が残さ
れていた。つまり、高分子マトリックスの中に固定され
た酵素が比較的濃度高密度になると、基質が、マトリッ
クス内部に浸入する速度が有限であるために、マトリッ
クス深部の酵素にまで基質が到達出来ず、結果としてみ
かけの活性が著しく低下してしまう。このため、固定化
される酵素の固定化量に最適値が存在することになり、
固定化においては活性低下が防止される場合でも、実際
に発現する活性は低いものである。このことを解決する
ためには、固定化層を出来るだけ薄くすることが考えら
れるが、機械的強度、製造上での諸問題があり、必ずし
も実用的とは限らない。本発明者は以上の問題を解決す
るには、高分子マトリックス内への基質の拡散速度を向
上させることが本質的に重要と考えた。

マトリックス内で基質が比較的自由に動き回われるため
には、酵素が洩れ出ない程度に架橋密度を低下させる必
要がある。しかしながら、一方では架橋密度の低下は高
分子マトリックスの強度を低下させることにもなる。そ
こで本発明者は、二種の高分子を混合すると、それらの
組合わせによつは微細な相分離現象を起こすことを利用
すれば、機械的強度を低下させることなく多孔性の高分
子マトリックスを形成することが出来、基質の拡散が容
易になるものと着眼した。そこで包括法の中で最も温和
な条件で固定化出来る光架キ瀞性ポリビニルアルコール
誘導体に着目し、光不熔化後のマトリックスが多孔性に
なる添加物を得る目的で鋭意研究を重ねた続；果がなさ
れたものである。．すなわち、本発明は光架橋性ポリビ
ニルァルコール議導体、さらに詳しく述べるならば、一
般式（１）（式中のＲ，は水素原子、アルキル基、ァラルキル基、
Ｒ２は水素原子又はアルコキシ基、×‐は強酸の陰イオ
ン、Ｚは芳香族性含窒素複素環を形成する原子団を示し
、ｍは１から６までの整数、ｎは０又は１の数、ａは０
．５〜１０モル％、ｂは９９．７〜７０モル％、ｃは０
〜３０モル％である）で表わされる光不溶化能を持つポ
リビニルアルコール誘導体にポリエチレングリコールを
添加し、これに酵素を混和したのち光照射することを特
徴とする高活性な固定化酵素を提供するものである。

一般式（１）で表わされるポリビニルアルコール誘導体
は、光照射することにより、一般式（０）で表わされる
環化付加反応物が生成することにより架橋不落化される
（特開昭５５一２３１６３号公認、特関昭５５一６２９
０５公報及び特開昭５６−１１９０６号公報参照）。

しかも、この反応は高度に特異的に起こるので、酵素な
どの酵素を何ら化学的に損傷することなく包括固定化出
来るものとして注目されている。したがって、固定化に
よる酵素反応活性の低下は禾然に防止されることになる
。しかしながら、実際には、固定化によりその活性は低
下する場合が生ずる。本発明者は、この活性低下の原因
を究明すべく研究を重ねた結果、一般式（１）で表わさ
れる光架橋性ポリビニルアルコール誘導体に対する酵素
の混合比が増大するにつれて、みかけの酵素活性発現値
が指数開数的に減少することを見し・出した。

さらに、ミカェリス・メンテン式から固定化酵素を詳細
に検討した結果、基質が高分子マトリックス内に拡散す
る速度が著しく低下することが明らかになった。以上の
知見は、固定化後の酵素反応活性が酵素の固定化量の最
大にもかかわらず低下することのないようにするために
は、基質が固定化マトリックス内に拡散する効率を出来
るだけ低下させないことが本質的に重要なことを確認す
るものである。

そこで、固定化マトリックスおよび酵素にも不活性な第
三の物質を添加し、光架橋後にこの物質を取除けば基質
の拡散が容易になるものと考えた。この第三の物質が持
つべき性能として、上述のように固定化マトリックスお
よび酵素に対して不活性であることは勿論であるが、い
たずらに固定化マトリックスの強度を低下させても良く
ないし、また、高価なものも適当ではない。

さらに光架橋速度を低下させるものであってはならない
。たとえば、グリセリンは不活性物質であるが、これを
共存させて一般式（１）で表わされるポリビニルアルコ
ール誘導体を光架橋化させたものは、膨潤度が高く、基
質の拡散向上に都合の良い性質が付与されるが、機械的
強度が低下するし、また、一般式（１）で表わされるボ
リビニルアルコール誘導体１部に対し、０．５部以上で
光架橋能が低下してしまう。グリセリンをはじめ、比較
的低分子量の水溶性化合物はいずれもこのような好まし
からざる結果を与えたのに対し、ポリエチレングリコー
ルは本課題を一挙に解決する第三の物質であることが明
らかになり、本発明をなすに至ったのである。

つまり、一般式（１）で表わされるポリビニルアルコー
ル誘導体は水溶液としてポリエチレングリコールと良好
に混合出来、また、この混合液から得られる膜が示す光
架橋速度は、ポリエチレングリコール不存在下の場合と
全く変化がない。それのみか、光架橋生成物は湿潤状態
でも良好な機械的強度を保っている。これは、水溶液中
では均質であっても、固体状態ではポリビニルアルコー
ル誘導体とポリエチレングリコールが相分離現象を起こ
し、実質的にポリエチレングリコールの強度が何ら影響
を受けないためである。本発明に用いられる一般式（１
）で表わされる光架橋性ポリビニルァルコール譲導体は
、椿開昭５５−２３９４１号に記載の方法に準じて製造
される。

この樹脂の水溶液にポリエチレングリコールを溶解させ
、これに酵素を溶解または懸濁させたのちに、支持物に
流延塗布または付着させて風乾させ光照射させる。ここ
で用いられるポリエチレングリコールの分子量は３００
〜４０００の範囲にあるのが望ましく、とくに、５００
〜２０００の範囲にあるのが都合が良い。

また、その添加量は、一般式（１）で表わされるポリビ
ニルアルコール誘導体１部に対して０．２〜２部にある
ことが望ましい。これ以下では添加による活性向上が十
分ではないし、また、これ以上では得られる不溶化膜の
強度が劣ってしまう。固定化される酵素としては、たと
えば、インベルターゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、、ア
ス／ぐルターゼ、アスパラギナーゼ、などをあげること
が出来る。この酵素は必らずしも単離されたものである
必要はなく、これらを含む物質、たとえばミトコンドリ
ア、ミクロボデイ、クロロプラストのような細胞断片、
さらには、酵母、ロドトルーラグルチンスなどの微生物
菌体、あるいはこれらの混合物の形で用いることも出来
る。本発明の固定化酵素はそのままで十分に実用に供し
うるが、さらに酵素の安定性及び耐久性を高めるために
、グルタルアルデヒド処理、グルタルアルデヒドジアミ
ン処理などを施してもよい。本発明方法によれば、容易
な操作で効率よく酵素反応活性物質を固定化し、その活
性を著しく向上させることが出釆る。

得られた固定化物は膜状、粒状、繊維状などの様々な形
態に成型することが出来るので、回分式で用いることも
出来るし、カラム状に充填したり、膜状反応器として利
用することも出来る。次に実施例により本発明をさらに
詳細に説明する。

実施例１１ーメチルスチルバゾＩＪウム基をアセタール結合によ
り１．１８モル％結合したポリビニルアルコール（重合
度１７０ｕけん化度約８７％）の８重量％の水溶液にポ
リエチレングリコールを溶解させたのち、ィンベルター
ゼの水溶液を添加してゆるやかに鷹拝して、均一な溶液
とした。

このとき、ポリビニルアルコールに対してポリエチレン
グリコ−ルの混合重量比が等量以下であれば透明な溶液
である。これらの溶液をアクリル樹脂板上に流して風乾
し約２５ムの膜とした。ポリエチレングリコール無添加
の場合は透明な膜となるのに対し、こうして得られる膜
はいずれも失透したものとなった。顕微鏡観察により、
表面に微細な凹凸が生じていることが認められた。こう
して得た膜を蛍光灯を用いて露光してから水洗し、この
酵素活性を基質として３％庶糖を用い、ＦＨ５．００で
測定した。分子量４０００のポリエチレングリコールを
光不溶性ポリビニルアルコール１部に対し、０．４部用
いたときの固定化ィンベルターゼの活性発現率を表１に
示す。これから明らかなように、ポリエチレングリコー
ル添加により、著しい活性向上が見られた。表１ポ
リエチレングリコ−ル共存下で光固定化されたィンベル
ターゼの活性さらに、ポリエチレングリコ−ル共存下で
製造される光不溶化ポリビニルアルコール膜中での、基
質拡散の影響を知るために、ミカェリスーメンテン式の
Ｋｍ値およびＶｍａｘ値を求めた。

結果を表２にまとめた。表２ポリエチレングリコー
ル共存下で光固定化されたィンベルターゼのｋｍおよび
ｖｍａ× これからわかるように、ポリエチレングリコールの分子
量にかかわらず、いずれの場合もその添加によりＫｍ値
が減少しており、基質が光不落化ポリビニルアルコール
のマトリックスへ拡散しやすくなっていることを示唆し
ている。

こうして活性が向上したィンベルターゼ固定化膿の操作
安定性を知るために、基質として３％庶糖を用い、ｐＨ
５．００で３０分間反応させることを繰返し、活性保持
率を測定した。

表３には、０．４部のポリエチレングリコール共存下で
光固定化したィンベルターゼの結果をまとめた。測定方
法による誤差の範囲内で、１００回以上くり返し使用し
ても活性低下は全く見られないことが明らかである。表
３ポリエチレングリコール共存下で光固定化された
ィンベルタ−ゼの反復使用性実施例２実施例１において用いた光不溶性ポリビニルアルコール
の３重量％水溶液２．５のこィンベルターゼ９．４の夕
を溶解し、これに分子量４０００のポリエチレングリコ
ールを添加して均一の溶液を得た。

Claims

【特許請求の範囲】１酵素を含有する光架橋性ポリビニルアルコール誘導
体にポリエチレングリコールを添加してから光を照射す
ることを特徴とする高活性な固定化酵素の製法。２光架橋性ポリビニルアルコール誘導体が、一般式▲
数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ＿１は水素原子、アルキル基、アラルキル
基、Ｒ＿２は水素原子又はアルコキシ基、Ｘ＾−は強酸
の陰イオン、Ｚは芳香族性含窒素複素環を形成する原子
団を示し、ｍは１から６までの整数、ｎは０又は１の数
、ａは０．５〜１０モル％、ｂは９９．５〜７０モル％
、ｃは０〜３０モル％である）で表わされる特許請求の
範囲第１項記載の製法。