JPS6149957B2

JPS6149957B2 -

Info

Publication number: JPS6149957B2
Application number: JP57011241A
Authority: JP
Inventors: Kunihiro Ichimura
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1982-01-27
Filing date: 1982-01-27
Publication date: 1986-10-31
Also published as: JPS58129976A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は高感度の光架橋性樹脂を用いる微生物
菌体の固定化方法に関する。更に詳細には、本発明は、固定化したまま増殖
を可能とし、かつ生産物の透過を自由とした微生
物菌体の固定化方法に関する。微生物菌体を固定化するためには、とくにその
増殖を阻害することなく高い活性を保持すること
が必要である。このためには、微生物菌体を高分
子鎖が形成する微細な格子の中に包括し、菌体が
逸脱することなく、しかも或る程度の自由度を有
する状態で強固に固定化することが不可欠とな
る。このような目的に対しては、高分子のゲルが用
いられることになるが、すでに多様なゲルを用い
る微生物菌体の固定方法が提案されている。その
中では、親水性ビニルモノマー、たとえばアクリ
ルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒド
ロキシエチルメタクリレートなどを微生物菌体の
水懸濁液と混じ、これを重合させて微生物菌体を
包括固定化する方法がある。また、重合には光照射することによる方法も提
案されている。この方法は比較的低温度でゲルが
生ずるので、微生物菌体の活性が固定化処理段階
で損失しにくくなるという改良が見られる。しか
しながら、従来の方法では原料である低分子ビニ
ルモノマーまたはオリゴマーを完全に反応させて
消失させることは不可能であり、したがつて食品
や医薬品を製造するためにはこの方法を用いるこ
とは出来ない。しかも、この方法で製造される包
括固定物を任意の形状に成形することも困難であ
つた。一方、これらの欠点を改良するためにさらに次
のような２つの方法が提案されている。その第一
の方法は、特開昭52―66681号公報や特開昭52―
66682号公報に記載されているように、光重合可
能なエチレン性不飽和基を有する光硬化性樹脂を
用いるものである。この方法の特徴は、光重合性
物質が比較的高分子量であるために低分子量ビニ
ルモノマーに比べて毒性が低減され、かつ、固定
化物が成形性に富んでいるところにあるとされて
いる。しかしながら、この方法にも解決されねば
ならない次の二点がある。つまり、光架橋と云え
どもその橋かけ反応はラジカル連鎖反応であり、
この活性は反応性物質のために微生物菌体が化学
的に損傷され得ること、および、光架橋を促進さ
せるために増感剤が必要であり微生物菌体への汚
染や食品もしくは医薬品製造には、この分子量の
低い増感剤の混入のために問題があること、であ
る。また、第二の方法として、天然高分子に何ら
かの架橋反応を施して微生物菌体を包括するもの
がある。（特開昭53―6483号公報）この方法の特色は、天然高分子を用いているた
めに食品や医薬品を製造する上で包括固定化剤の
持つ毒性が解消されることにある。しかしなが
ら、実際に利用される架橋反応はグルタルアルデ
ヒドのように固定化される微生物菌体をも化学的
に損傷するものを用いている。また、アルギン酸（Biotech.and Bioeng.19
巻、387ページ（1977年）参照）やカラギーナン
のような多糖類にカルシウムなどのイオンを架橋
反応に用いるものは、とくに、固定化条件が温和
で注目すべきものであるが、次のような欠点を解
決している訳ではない。すなわち天然物であるた
めに、組成が必らずしもつねに同一のものでない
こと、イオン結合による架橋であるために、脱架
橋しやすく再生が可能である反面、架橋が比較的
容易に切断されて微生物菌体の漏出を完全に阻止
出来ないこと、という問題点を包含しているもの
である。本発明者は、先に光二量化型感光基を側鎖に有
する水溶性光架橋樹脂が酵素や葉緑体の固定化に
極めて有利であることを見い出しているが、酵素
を包括固定化する場合と異なり、微生物菌体を固
定化する場合には、菌体の増殖に伴なう固定化材
料の劣化があつてはならないし、なおかつ、増殖
に付随する基質の自由な透過と代謝生産物の速や
かな系外からの洩出が実現されねばならない。本発明者は、このような従来の微生物菌体の固
定化方法がもつ欠点を克服し、微生物菌体をなん
ら損傷することなく固定化でき、しかも固定化し
たまま増殖を可能とし、かつ生産物の透過を自由
に行いうる固定化物を形成する方法を開発するた
めに、鋭意研究を重ねた結果、本発明者が先に開
発した高感度の光架橋性樹脂（例えば特開昭56―
11906号公報参照）を用い、これに微生物菌体を
加え特定条件下で光架橋処理させることにより、
その目的を達成しうることを見出し、この知見に
基づいて本発明をなすに至つた。すなわち、本発明は、一般式（式中のR₁は水素原子、低級アルキル基、低
級アルコキシ基、R₂は芳香族性複素環残基、ｍ
は１〜６の整数、ｎは０又は１である）で表わされる光架橋性基含有単位を少なくとも
0.3モル％含有するポリビニルアルコール又はそ
の水溶性誘導体を水に溶解して、濃度１〜20重量
％の水溶液を調製し、次いでこれに微生物菌体を
加え、波長320nm以上の光を照射して光架橋させ
て、微生物菌体を固定化させたのち、得られた固
定化物の表面を、さらに上記のポリビニルアルコ
ール又はその水溶性誘導体で被覆し、光照射する
ことを特徴とする微生物菌体の固定化方法を提供
するものである。上記の一般式(A)で表わされる光架橋性基含有単
位を少なくとも0.3モル％含有するポリビニルア
ルコール又はその水溶性誘導体は公知であつて、
例えば特開昭55―23163号公報、特開昭55―62905
号公報又は特開昭56―11906号公報に記載された
方法に従つて製造することができる。本発明に適
した光架橋性樹脂の感光性基含有単位としては、
次のようなものをあげることが出来るが、その限
りでないことは勿論である。これらの感光性基含有単位を有する高分子化合
物は、対応するビニルアルコールのビニル重合体
であるが、その例としては、ポリビニルアルコー
ルや部分けん化ポリビニルアルコール、10モル％
以下のブチラール化されたポリビニルアルコー
ル、ポリビニルアルコールとアクリルアミドの共
重合体、ビニルアルコールとイソプロペニルアル
コールとの共重合体などをあげることが出来る。本発明に適した光架橋性樹脂の重合度は数百か
ら数千の範囲にあることが望ましい。これ以下で
あると固定化に要する光照射時間が著しく長いば
かりでなく、得られた固定化物の強度が劣つてし
まう。また、これ以上の重合度であれば、水溶液
としての粘度は著しく増大し、微生物菌体との均
質な混和を実現するために障害となつてしまう。
さらには、この範囲の重合度は分子量に換算する
と10000〜100000に相当するので、微生物菌体が
産生する低分子量の目的物を純粋に単離する必要
があれば、限外過法などにより容易に分離出来
る。本発明に用いられる一般式(A)で表わされる感光
性基含有単位を持つ光架橋性樹脂は、露光により
次式の反応が起こつて架橋不溶化が達成される。この反応は非常に高い効率で起こり、他の光架
橋樹脂に比べて数倍から数十倍もの高い感光度を
示す。しかしながら、微生物菌体は溶媒に溶解せ
ず、不均一な状態で光架橋性樹脂に分散すること
になる。したがつて、酵素を固定化する場合と異
なり、露光の際、微生物菌体自身の光散乱効果の
ために、樹脂の深部まで光が十分に到達出来ない
ので、架橋が十分に起こらず微生物菌体の固定化
物を調製するためには甚だ不利と推測されたので
ある。しかしながら、前記した光架橋性樹脂を濃
度１〜20重量％の水溶液とし、これに微生物菌体
を加えて波長320nm以上の光を照射して固定化し
たものは、十分な強度をもつだけでなく、高い活
性を示し、しかも微生物菌体の漏出は非常に少な
いものであつた。この好ましい結果をもたらす要
因は必らずしも明白ではないが、一般式(A)で示さ
れた感光性基の吸光係数が数万程度と比較的大き
いため、露光面で緊密な架橋が起こり、微生物菌
体の洩出が十分に阻止され、なおかつ、固定化物
の強度が良好になるものと思われる。しかしながら、増殖するにつれて微生物菌体の
占める容積は増加するので、酵素もしくは休止細
胞を固定化する場合よりもはるかに大きな固定化
マトリツクスの強度が要求される。このために
は、上述のようにして製造される固定化物の表面
に、さらに一般式(A) （式中、R₁、R₂m、ｎは前記と同じ意味を持
つ）で表わされる光架橋性基含有単位を少なくと
も0.3モル％含有するポリビニルアルコールもし
くは水溶性ポリビニルアルコール誘導体を被覆
し、これに光照射することにより、生育する微生
物菌体の漏出を完全に阻止し、なおかつ、実用上
好ましい強度を持つた固定化物とすることが出来
る。上記に示した架橋反応は、活性化エネルギーが
極めて小さい光励起状態から起こるので、低温で
も容易に進行し、しかも反応熱の発生もほとんど
ない。したがつて、微生物菌体の活性を低下させ
ないために必要な低温での固定化が可能となる
し、光固定化の際の局所的な反応熱発生に起因す
る活性損失が全く生じないという特徴がもたらさ
れる。本発明に用いる一般式(A)で表わされる感光性基
含有単位を持つ光架橋性樹脂は、通常の光架橋性
樹脂、たとえば、前記のエチレン性不飽和基を含
む光重合型樹脂の数十倍以上の感光速度を示すの
で、光照射による微生物菌体の活性損失が防止さ
れるばかりでなく、固定化に要する時間が著しく
短縮されて経済性に優れたものである。また、本発明に用いる一般式(A)で表わされる感
光性基含有単位を持つ光架橋性樹脂は、全く増感
剤を必要としないので、固定化物が不要の物質で
汚染されることが全くなく、本発明により製造さ
れる微生物菌体の反応生成物を食品や医薬品に利
用することが出来る。さらには、本発明に用いられる光架橋性樹脂
は、大量安価に入手出来る基幹高分子を原料とす
るために品質が安定し、かつ、大量に生産され得
るものであり、固定化の再現性は極めて良好であ
る。しかも熱安定性に優れているので、滅菌処理
が容易である。今一つの特長をあげると、上記の式で示された
光架橋部位は、生成したシクロブタン環に結合し
た芳香族性残基または一般式R₂で示された芳香
族性複素環残基が吸収する波長の光で照射するこ
とにより、再び開裂し、もとの一般式(A)で示され
る感光性残基に戻る。このより短かい特定の光を
照射することにより、可逆的に固定化された微生
物菌体を回収することが可能である。次に、この光架橋性樹脂を使用して微生物菌体
を固定化する方法について説明する。まず、光架橋性樹脂を水に溶解して濃度１〜20
重量％の水溶液を調製する。この濃度が１重量％
よりも低いと微生物菌体の固定が十分に行われ
ず、使用中に微生物菌体が漏出するし、また20重
量％よりも高くなると、微生物菌体の増殖や生産
物の自由な透過が阻害される。次いでこれに所定
の微生物菌体を、好ましくは懸濁水として加え均
一に混合する。次にこの懸濁液を光照射して架橋
を起こさせ、ゼラチン状の非水溶性物を得る。こ
のゼラチン状物の内部に微生物菌体が固定化され
る。また、この微生物菌体を懸濁した光架橋性樹
脂の溶液を平滑面上に流展又は塗布した溶液を風
乾したのち、照射する方法でも良い。あるいは、
溶液の流展又は塗布を、補強材又は支持物として
３次元的な担体、例えば、紗、ろ紙、糸、管状
物、粒状物などを用いて行つてもよい。塗布後た
だちに光照射すれば補強材又は支持物に付着した
ゼラチン状物を得、また、風乾したのちに照射す
れば、より機械的強度に優れた固定化物を得るこ
とが出来る。この際に照射する光としては、波長
320nm以上のものを用いることが必要である。こ
れよりも短波長のものは、微生物菌体に悪影響を
与えるので不適当である。さらに完全に微生物菌体の漏出を防止するため
に、これらの固定化物を一般式(A)で表わされる感
光性基含有の樹脂溶液に含浸させ、好ましくは風
乾後に光照射すれば良い。このようにして固定化物を製造するに当つて必
要な光源としては、水銀灯、キセノン灯、けい光
灯、太陽光などを利用することができる。一般式
(A)で示される感光性基は吸収極大波長が約330〜
430nmにあり、通常の光源からの光を効率よく吸
収して架橋が起こることになる。照射時間は、含
水率や光架橋性樹脂の性質によつて異なるが、風
乾された状態では数秒〜数十分、水溶液状ではこ
れより長い照射時間を必要とし、約５〜30分程度
で行われる。このように、光を散乱する不透明な
微生物菌体が存在していても、固定化が効率良く
起こることは意外なことであつた。微生物にとつ
て有害な紫外線を除いた約320nm以上の光により
短時間の照射時間で固定化が達成されるので、固
定化による微生物菌体の活性損失が防止出来る。
さらには共有結合による架橋であるために、固定
化物の機械的強度に優れ、二次的な硬化処理、た
とえば、二官能性架橋剤による架橋処理が不要で
あるので、製造工程が簡素化されるばかりか、架
橋剤という汚染物の混入が全くないので都合が良
い。本発明方法を適用する微生物菌体としては酵
母、細菌、かび、放線菌、担子菌などすべての微
生物があげられる。特に、酵母において、パン酵
母、ワイン酵母、清酒酵母、シゾサツカロミセ
ス・ポンベ、ロドトルラ・グルチニスなどが具体
的にあげられる。本発明方法により製造される固定化物は、水を
加えると膨潤し、基質の透過が促進され、反応が
順調に進行する。しかも、光架橋性樹脂の母体が
ポリビニルアルコールまたはその誘導体であるた
めに、微生物菌体を取り巻くマトリツクスは生体
活性物質の安定化に寄与する水酸基を豊富に含む
ものである。このため、固定化物の示す保存安定
性、操作安定性は優れたものである。本発明方法により製造される固定化物は、回分
式で繰り返し使用しても良いし、あるいはまた、
カラムに充填して基質溶液を通しても良い。した
がつて、通常の発酵反応の装置用に利用出来る
し、さらには微生物電極のような特殊な用途にも
好適である。このように、本発明方法によれば、微生物菌体
の活性を損なうことなく、簡便に、かつ、大量
に、上記のような各種用途に適した微生物菌体固
定化物を製造することが出来る。次に本発明を実施例に基づき、さらに詳細に説
明する。実施例１重合度2000の完全けん化ポリビニルアルコール
26.09ｇを100cm³の水に懸濁し、これに１―メチル
―４｛２―（ｐ―ホルミルフエニル）エテニル｝
ピリジニウムメト硫酸塩2.77ｇを加えて溶解さ
せ、さらに85％リン酸10ｇを添加して２日間室温
でゆるやかに撹拌した。膨潤したポリビニルアル
コール粒子を330メツシユのポリエステル紗を用
いて過して集め、洗液が中性になるまで充分に
水洗した。これを熱水に溶解して400ｇの淡黄色
の感光性樹脂溶液とし、180メツシユのポリエス
テル紗で過して均一な溶液を得た、この感光性
樹脂水溶液25ｇに、湿重量18.23ｇのパン酵母生
菌体を加えてゆるやかに撹拌して均一の菌体懸濁
液とした。この懸濁液の一部を透明なアクリル樹
脂板上に拡げ、上下両面から20W螢光灯８本を並
列させた光源より20cmの位置で10分間照射した。
こうして得た固定化物を10％ブドウ糖液に懸濁さ
せて370℃で振とうしたところ、、エチルアルコー
ルの生成が認められた。また、菌体を懸濁した樹脂溶液をアクリル樹脂
板上に均一の厚みになるように拡げ、これを室温
で風乾して強靭なフイルム（厚み約60μ）を得
た。この膜を上記と同じ光源を用い、上下両面を
同時に２分間照射した。こうして得た固定化物
0.4ｇを10％ブドウ糖水溶液50cm³に懸濁し、30℃
で２日間振とうし、生成したエチルアルコール量
を測定した。反応に用いた固定化物を水洗してか
ら、再びブドウ糖溶液に浸漬してアルコール発酵
をくり返し行なつた。その結果を表１にまとめて
示す。

【表】実施例２重合度1800の完全けん化ポリビニルアルコール
10ｇを蒸留水120cm³に熱時溶解し、これに１―メ
チル―４―（２，２―ジメトキシエトキシ）キノ
リニウムメト硫酸塩1.00ｇを加えて溶かし、さら
に85％リン酸2.5ｇを添加して85〜90℃で15時間
撹拌した。放冷後強塩基性イオン交換樹脂で酸を
除去した。こうして得た感光性樹脂水溶液５ｇ
に、湿潤重量1.0ｇのワイン酵母を添加してゆる
やかに撹拌して均一の粘ちような懸濁液とし、こ
れをアクリル樹脂版に均一に塗布して風乾した。
得られた膜両面を実施例１と同様に光照射した。膜を３倍に希釈した感光性樹脂水溶液中に含浸
させて風乾し、再び露光した。こうして得た不溶
化膜を実施例１と同様にして醗酵させたところ、
酵母の漏出なくアルコール生成率90％程度でくり
返し使用することが出来た。表１において、くり返し反応回数が５回未満で
は菌体の水溶液への洩出は認められなかつたが、
６回目以降から発酵溶液に白濁が生じた。そこ
で、実施例１で得た酵母固定化フイルムを、実施
例１で得た感光性樹脂溶液を倍量に希釈した溶液
に浸漬し、これを風乾したのち実施例１と同じ光
源により両面を２分間露光した。こうして得た固
定化膜を実施例１と同様にしてくり返しアルコー
ル発酵を行なつたところ、くり返し回数12回まで
菌体の洩出を認めなかつた。また、このときアル
コール生成率は実施例１とほぼ同程度のものであ
つた。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中のR₁は水素原子、低級アルキル基、低
級アルコキシ基、R₂は芳香族性複素環残基、ｍ
は１〜６の整数、ｎは０又は１である）で表わされる光架橋性基含有単位を少なくとも
0.3モル％含有するポリビニルアルコール又はそ
の水溶性誘導体を水に溶解して、濃度１〜20重量
％の水溶液を調整し、次いでこれに微生物菌体を
加え、波長320mm以上の光を照射して光架橋させ
て、微生物菌体を固定化させたのち、得られた固
定化物の表面を、さらに上記のポリビニルアルコ
ール又はその水溶性誘導体で被覆し、光照射する
ことを特徴とする微生物菌体の固定化方法。