JPS6024718B2 - 高純度かつ低着色度リボ核酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリボ核酸（以下ＲＮＡと記す）の製法に関する
。

ＲＮＡは調味料、化粧品、医薬品等の原料として有用な
物質であり、このような用途に使用されるＲＮＡは高純
度かつ低着色度の製品が要求される。本発明はＲＮＡ含
有液に蛋白分解酵素を作用させ、不純物として存在する
蛋白質を分解し、次いで脱色するＲＮＡの製造において
、蛋白分解酵素を作用させる段階から予め着色防止剤を
加え、蛋白分解反応後脱色剤により着色成分を除去する
事を特徴とする、高純度かつ低着色度のＲＮＡを工業的
に容易かつ安価に製造する方法に関するものである。微
生物菌体からのＲＮＡの抽出は、熱食塩水抽出、または
弱アルカリ加熱抽出、あるいは微生物細胞を機械的に破
砕もしくは酵素的に溶解した後抽出する等、多くの抽出
法があるが、これらの抽出方法によって得られるＲＮＡ
抽出液中には、通常不純物として、蛋白質，糖類，塩類
等が多量に存在する。このＲＮＡ抽出液からＲＮＡを工
業的規模で回収する方法としては、一般に酸性下でＲＮ
Ａを不溶化し分離回収する方法が用いられている。しか
しながら不純物として存在する蛋白質のうち、酸不溶性
蛋白質あるいは核酸と結合している蛋白質はＲＮＡと同
じ挙動を示し、上記のような方法ではＲＮＡから分離除
去する事は困難である。従って、このようなＲＮＡの分
離回収方法によって得られるＲＮＡ製品は、純度の比較
的低いものである。このような蛋白質を分離除去する事
により高純度ＲＮＡの工業的製法を提供するのが本発明
の目的である。ところで、蛋白質を分離除去し高純度の
ＲＮＡを得る方法としては、フェノール処理により蛋白
質を部分的に変性させ、フェノール層へ抽出する方法や
、クロロホルムにより蛋白質を変性除去する方法等が知
られている。

しかしながら、これらの方法は多量の有機溶媒を用い、
しかも操作が繁雑である事などから、工業生産には適し
たものとは言い難い。本発明において、まず蛋白質を効
率よく除去するための方法としては、蛋白分解酵素を用
いる法が、コスト的にも操作の容易さから見ても最適で
あるのでこの方法を採用した。

すなわち、ＲＮＡ含有液に蛋白分解酵素を作用させる事
により、酸不落性蛋白質に対してはこれを分解してその
性質を酸可溶性とし、またＲＮＡと結合している蛋白質
に対してはこれを分解する事によりその結合を解き、そ
の後の酸沈澱によるＲＮＡの分離回収において容易に蛋
白質を分離除去できる事を見し、出した。蛋白分解酵素
による蛋白質の除去効果を表一１に示す。表一１ ところが、この方法では除蛋白質という目的は達せられ
るが、得られるＲＮＡの着色度は高く、低着色度のＲＮ
Ａを得るためには、脱色操作が必要であることがわかっ
た。

さらに、表−２に示すように、蛋白分解酵素処理を行う
と、その反応中に副反応としてアミノーカルボニル反応
によると思われる液の褐変現象が見られ、しかもこの着
色成分は活性炭や脱色剤等ではきわめて除去し‘こくい
ものである。すなわち、蛋白質分解酵素を用いて高純度
化したＲＮＡ溶液をそのまま活性炭等の脱色剤で脱色し
ても、目的の低着色度のＲＮＡは得られない事がわかつ
た。そこでＲＮＡの高純度表−２注 着色度とは、５％
ＲＮＡ溶液を１００００ｍ血で１０分間遠心分離して得
られた上燈液の波長４５０ｍ〃における吸光度を測定し
、着色度＝吸光度×１０００ によつて表わした値である。

化として最も効率的である蛋白分解酵素を用いた方法が
採用でき、しかも後の脱色剤による脱色操作で容易に脱
色できる、高純度かつ低着色度のＲＮＡを効率良く得る
方法を鋭意検討した結果、蛋白分解酵素を作用させる段
階から予め着色防止剤として、亜硫酸または重亜硫酸あ
るいはその塩の一種あるいは二種以上を添加する事によ
り、この目的を達成できる事を見し、出し、本発明に至
ったものである。

着色防止剤として、亜硫酸水素ナトリウムを用いた場合
の例を、表−３に示す。表−３ところで、ＲＮＡ含有液
の脱色において、種々の脱色剤の中で最も脱色効果の大
きな活性炭を使用するとき、コロイド溶液の特徴である
活性炭の解豚現象のため、添加した活性炭を完全に除去
する事ができず、一部がＲＮＡに持ち込まれるため、満
足のいく低着色度のＲＮＡを得る事は困難である。

しかしながら、本発明の脱色剤を蛋白分解の段階から用
いる方法によれば、ＲＮＡ含有液はきわめて脱色され易
い状態となっているため、一般に脱色性能が低いといわ
れている粒状活性炭や脱色樹脂、イオン交換樹脂等によ
っても容易に脱色可能であり、また粉末活性炭を使用す
る場合も、その必要量が比較的少量で済むため、解豚現
象による活性炭のもれも最小限に押える事が可能であり
、低着色度のＲＮＡをきわめて容易に得る事が可能とな
った。以上述べたように、本発明の特徴は、高純度かつ
低着色度ＲＮＡの工業的生可能な製造方法を鋭意検討し
た結果、ＲＮＡ含有液に蛋白分解酵素を作用させ、不純
物として存在する蛋白質を分解し、次いで脱色するＲＮ
Ａの製造において、蛋白分解酵素を作用させる段階から
予め着色防止剤を加え、蛋白分解反応後脱色剤により着
色成分を除去することである。

本発明において、各操作は単なる効果の積み重ねではな
く、互いに有機的に結びついており、表−４に示したよ
うに、各操作のどれが欠けても目的とする品質のＲＮＡ
製品を得る事はできない。

すなわち本発明は従来有機溶媒を多量に用い、繁雑な操
作のくり返しでのみ得られていた高品位のＲＮＡと同等
あるいはそれ以上の品質を有するＲＮＡのきわめて効率
的かつ経済的な工業生産方式を確立したところにその特
徴を有するものである。表−４ なお、ＲＮＡ含有液としては、微生物菌体あるいは植物
細胞から抽出した抽出液でも、それらから−旦分離した
ＲＮＡを再び水に溶解したものでも使用可能である。

また、蛋白分解酵素としては、その起源，精製度にかか
わらず使用する事ができる。

脱色剤として用いる活性炭、イオン交換樹脂は、その種
類によって脱色効果の大小はあるが、その種類を間ずに
使用可能である。

実施例 １ 亜硫酸パルプ廃液を糖源として培養して得られた酵母菌
体（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）１０ｋ９を５％食塩
溶液１００夕に懸濁し、９５ｑｏで４時間、加熱蝿梓抽
出した後、遠心分離により菌体を除去し、ＲＮＡ含有液
１００夕を得た。

この液に亜硫酸水素ナトリウムを１０夕加え、さらに蛋
白分解酵素としてブロナーゼ（科研化学ＫＫ製）２．５
夕を加え、５０℃で１時間反応した後、液を５００に冷
却し、塩酸を用いてｐＨ１．５に調整し、ＲＮＡを不溶
化した。不溶化したＲＮＡは遠心分離により分離回収し
た後、再び水に懸濁し、水酸化ナトリウムで中和し、Ｒ
ＮＡ含有液２０〆を得た。次にこの液を、粒状活性炭（
粒状白サギ：武田薬品工業ＫＫ製）１夕を詰めたカラム
にＳＶ＝２で通液し得られた脱色液を曙霧乾燥して、Ｒ
ＮＡ純度９６．５％、着色度３８の高純度かつ低着色度
ＲＮＡ１【９を得た。実施例 ２ モラセスを糖源として培養して得られた酵母菌体（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｌｋ９
を４％食塩溶液１０のこ懸濁し、９８ｏｏで２時間加熱
燈梓抽出した後、遠心分離により菌体を除去し、ＲＮＡ
含有液１０夕を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ リボ核酸含有液に蛋白分解酵素を作用させ、不純物
   として存在する蛋白質を分解し、次いで脱色するリボ核
   酸の製造において、蛋白分解酵素を作用させる段階から
   予め着色防止剤として、亜硫酸または重亜硫酸あるいは
   それらのナトリウム塩又はカリウム塩から成る群から選
   ばれた一種又は二種以上を加え、蛋白分解反応後脱色剤
   により、着色成分を除去することを特徴とする、高純度
   かつ低着色度リボ核酸の製造方法。