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ANTICORPS MONOCLONAUX CONTRE LES FLAGELLES DE ---PSEUDOMONAS AERUGINOSA.
DOMAINE DE L'INVENTION.
La presente invention concerne l'application de techniques immunologiques aux fins d'obtenir de
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nouvelles nouve e matières utiles pour le---diagnostic et letraitement d'infections bactériennes et, plus particu- librement, la production et l'application d'anticorps monoclonauxhumainsquisontcapablesdereconnaître les flagelles de Pseudomonas aeruginosa.
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION.
Une maladie de type Gram-négatif et ses complications les plus sérieuses, par exemple la bacteriemie et l'endotoxemie, sont la cause d'une morbidité et d'une mortalité significatives chez l'être humain. Ceci est vrai, en particulier, de l'organisme
Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa, qui a été de plus en plus associé ä des maladies bactériennes, spécia- lement avec des infections nosocomiales, durant les cinquante dernières années.
Durant les quelques dernières décénnies, les antiobiotiques ont été la thérapie de choix pour la lutte contre des maladies de type Gram-négatif. La morbidité et la mortalité élevées et continuelles dues à une infection bactérienne de type Gram-négatif sont, cependant, indicatrices des limitations de la thérapie par antibiotiques, particulièrement en ce qui concerne
P. aeruginosa. (Voir, par exemple, Andriole, V. G., "Pseudomonas Bacteremia : Can Antibiotic Therapy
Improve Survival ?", J. Lab. Clin. Med.,/1978/,
94 : 196-199). Ceci a suscite la recherche d'autres procédés de prévention et de traitement.
Un procédé qui a été considéré est le renfor- cement du Systeme immunitaire de l'hôte par immuni-
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sation active ou passive. Par exemple, il a été observé - que l'immunisation active de l'homme ou des animaux expérimentaux avec des vaccins constitués de cellules bactériennes entières ou d'endotoxines bactériennes purifiées provenant de P. aeruginosa conduit au deve- loppement d'anticorps opsoniques spécifiques dirigés
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essentiel1emeuL. contre des determinants des récurrentes d'oligosacchar des molecules de lipopolysaccharides (LPS) situées sur la membrane externe----- --due de-i-aeugino & a- rack, mu bulins--Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B. et Finlayson, J. pages 73-79, U.
Department of Health and Human Services, 1979). De tels anticorps, qu'ils aient été engendrés activement ou transférés passivement, se sont révélés comme étant protecteurs contre les effets létaux de l'infection due à P. aeruginosa chez divers modèles d'animaux (Pollack, supra) et dans quelques recherches préliminaires chez 1'être humain (voir Young, L. S. et Pollack, M., P. aeruginosa, Sabath, L., éd., pages 119-132, Hans Huber, 1980).
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Les travaux ci-dessus suggèrent que les approches immunotherapeutiques pourraient être utilisées pour prévenir et traiter la maladie bactérienne due ä P. aeruginosa, par exemple en administrant des immunoglobulines humaines rassemblées qui contiennent des anticorps contre la ou les souches infectantes. Les immunoglobulines humaines sont définies ici comme étant la fraction du plasma humain qui est enrichie en anticorps, parmi lesquels se trouvent des anticorps spécifiques contre des souches de P. aeruginosa. Du fait de certaines limitations dans l'utilisation des composants des immunoglobulines humaines, cette approche au traitement de la maladie due à P. aeruginosa reste à l'étude (voir, par exemple,
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Collins, M. S. et Roby, R. E., Am. J.
Med., 76 (3A) : 168- Collins, M.S. et Roby, R.E., Am. J. Med., 76 (3A) : 168- 174, [1984]),etjusqu'àprésentiln'yapasde -7y, E pas de
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produits disponibles contenant ces commerciauxcomposants.
Une telle limitation associée aux compositions d'immunoglobulines reside en ce qu'elles consistent en
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des rassemblemenls-dechairtttans-er !-provenance d'un--millier de donneurs ou plus, ces échantillons ayant été présélectionnés d'après la présence d'anticorps parti-
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c-pliers anti-Psei-tomos. ntMement-conduit--a--- faire la moyenne des titres d'anticorps individuels, ce qui, au mieux, résulte en de modestes augmentations du titre resultant des anticorps desires.
Une autre limitation est que le procédé de preselection lui-même requiert un tri continu, coûteux, de la population des donneurs pour assurer l'uniformité du produit. En dépit de ces efforts, les immuno- globulines obtenues peuvent encore avoir une varia- bilité considérable d'un lot ä l'autre et parmi des produits en provenance de différentes régions géographiques.
Une autre limitation inhérente aux compositions d'immunoglobulines réside en ce que leur usage se traduit par l'administration simultanée de grandes quantités de substances protéiniques étrangères (qui peuvent inclure des virus tels que ceux dont on a montre récemment qu'ils étaient associés au Syndrome d'Immuno-Deficitaire Acquis ou SIDA), qui peuvent causer des effets biologiques néfastes. La combinaison de faibles titres des anticorps desires et du haut contenu en substances étrangères peuvent souvent limiter au-dessous de l'optimum la quantité d'immunoglobulines spécifiques et donc bénéfiques administrables au patient.
En 1975, Kohler et Milstein ont expose leur
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découverte fondamentale que certaines lignées de cettules-de-souris ere-fustonnées-avec-des'"'- - dont chacun sécrète des anticorps d'une spécificité pouvaTreittunique, c'est-à-dire des anticorps monoclonaux (Kohler,
G. et Milstein, C., Nature, 256 : 495-497 El975¯7).
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-----Avec . . possible, dans quelques cas, de produire- quantités d'anticorps murins sélectivement-spécifiques ----- un-dterminant-parH & ulier minants sur des antigènes. Ultérieurement, en utilisant des technologies développées plus tard, il est devenu possible de produire des anticorps monoclonaux humains (voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 4 464 465, qui est cité ici en reference).
11 est reconnu que dans quelques situations, les anticorps monoclonaux de souris ou des compositions de ces anticorps peuvent susciter des inconvénients lors de l'utilisation chez l'être humain. Par exemple,
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il a été rapporté anticorps monoclonaux de traitement d'une certaine maladie humaine peuvent provoquer une réponse immunitaire qui les rend inoperants (voir, Levy, R. L. et Miller, R. A., Ann. Rev. Med., 34 : 107-116/'1983. 7). Cependant, avec les récents progrès dans la technologie de l'ADN recombinant, tels que la production d'anticorps monoclonaux chimériques souris/homme, ces difficultés peuvent être diminuées.
Aussi, des procedes pour la production d'anticorps monoclonaux humains sont actuellement disponibles (voir, Human Hybridomas and Monoclonal
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Antibodies, Engleman, E. et al., éd., Plenum Publishing Corp. 19857, qui est ci ici en G.référence).
En utilisant la technologie de l'hybridome
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et/ou de la transformation cellulaire, de nombreux greeperde d'anticorps protecteurs contredesinfec" tions à P. aeruginosa. Des anticorps monoclonaux ont - é 1p1opes P. aeruginosa, incluant des épitopes de surface spécifiques à-sér-otype-unique-et-a-serotypes -teIrS-queceuxtrouvsdans cules charides (LPS) delta-bactérie (voir, par exemple, les -is d'Am6 des n 624 et 807 394 cédées la Demanderesse, qui cherehess o°tr-appo- r-t-é-}a product-ionsont toutes deux citées ici en reference). Des anti- corps monoclonaux protecteurs spécifiques pour l'exotoxine A de P. aeruginosa ont également été produits
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(voir, par exemple, la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique 742 170 cédée à la Demanderesse, qui est citee en référence)..
L'utilisation d'anticorps monoclonaux spéci- fiques pour la région LPS de P. aeruginosa, ou des exotoxines de la bactérie, peut fournir une protection
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suffisante situations, mais il est auffisante dans qqgL dans quelquesgénéralement préférable de disposer d'une capacité de protection plus large. Par exemple, dans les traitements prophylactiques d'infections possibles chez l'homme, il serait préférable d'administrer un ou des anticorps protecteurs contre plusieurs de souches de P. aeruginosa.
De même, dans des applications thérapeu- tiques où le ou 1 les sérotypes de la ou des souches infectantes ne sont pas connus, il serait préférable d'administrer un anticorps ou une combinaison d'anticorps efficace contre la plupart sinon contre tous les sérotypes cliniquement importants de P. aeruginosa, idéalement en apportant des anticorps réactifs dans les Schemas traditionnels de srotypage.
Un aspect de la physiologie de P. aeruginosa
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dont on a montré qu'il contribue & la virulence de -----rorgantsme-et-lar ,-qui-est-one-crpacm ""resultant n (voir, Montie, T. et 7, 38 . aeruginosa fait qu'il a un flagelle unique à structure en bâtonnet--Bes-études F-modèle de souris mtyttlitbrûlée ont montre qu'un plus grand pourcentage de souris survivait lorsque-des souches de P. aeruginosa nondouéesdemouvementétaientinoculéesdansles brûlures expérimentales que si des souches douées de mouvement étaient utilisées. (McManus, A. et al., /'1980. 7. Burns, 6 : 235-239 et Montie, T. et al., 19827, Infect. and Immun., 38 : 1296-1298).
D'autres études sur la pathogenese de P. aeruginosa ont prétendu que les animaux immunises avec des préparations d'anti- gène de flagelle étaient protégés quand ils étaient brûlés et infectés avec des souches douées de mouvement de la bactérie (voir, Holder, I. et al., [1982],
Infect. and Immun., 35 : 276-280).
Chose importante, les flagelles de
P. aeruginosa ont été étudiés par des procédés serolo- giques et décrits comme tombant dans deux groupes antigéniques majeurs désignés par H1 et H2 par B. Lanyi (1970, Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 17 : 35-48) et par type a et type b par Ansorg, R. (1978, Zbl. Bakt.
Hyg., 1. Abt. Orig. A, 242 : 228-238). Le typage sérologique des flagelles par les deux laboratoires a montré que les flagelles Hl (Lanyi, B., supra) ou flagelles de type b (Ansorg, R., supra) étaient sérolo- giquement uniformes, c'est-ä-dire qu'aucun sous-groupe n'a été identifié. Ce type flagellaire sérologiquement uniforme est dit ci-après type b. L'autre antigene majeur, H2 (Lanyi, N., supra) ou type flagellaire a (Ansorg, R., supra) contenait cinq sous-groupes. Cet
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antigène est dit ci-après type flagellaire a, avec cinq -----socf-groopes-ao,-ay,-33 -l "groupes u } variées sur différentes souches de P. aeruginosa portant L'antigène a été trouvé sur tous les flagelles de type-a-ma-Ls-avec-un aaEtM. --- cTg-elessouches.
Un schéma de sérotypage basé sur les antigènes
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es-----stables P. aeruginosa est dit schéma Habs, qui a été récemment incorporé dans l'International Antigenic Typing System.
(Voir, Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33 : 256, '1983 7.) Les souches de référence Habs des types flagellaires de P. aeruginosa ont été caractérisées par immunofluorescence avec des sérums polyclonaux par
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Ailsorg Abt. Orin. A, 242 228-238) ou par coagglutination sur lame (1978, Zbl. Bakt. Hyg., 1.(Ansorg, R et al, 1984, J. Clin. Microbiol., 20 : 84- 88). Les souches Habs 2,3, 4,5, 7,10, 11 et 12 sont des souches-portant des flagelles de type b et les souches Habs 1, 6,8 et 9 portent des flagelles de type a. Un grand nombre de souches de P. aeruginosa pourrait donc probablement etre reconnu par un petit
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nombre d' pour les pe anticorps monoclonaux spécifiquesprotéines flagellaires.
En conséquence, il existe un besoin significatif d'anticorps monoclonaux capables de réagir avec des épitopes sur des protéines flagellaires, et dans quelques cas, de fournir également une protection contre de multiples sérotypes de P. aeruginosa. De plus, certains de ces anticorps pourraient convenir
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pour le traitement prophylactique et thérapeutique d'infections P. aeruginosa, ainsi que pour le diagnostic de telles infections. La présente invention
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respond - RESUME- DEIANV13NT mE . m s RESUME-IE-L-"-INVENIv L'-inventionä e de cellules qui peuvent produire des anticorps monoclonauxcapablesdeselierauxflagellesprésentssur la plupart des souches de la bactérie P. aeruginosa.
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---r & -a pe Les Les gissent avec des epitopes sur les protéines flagellaires de P. aeruginosa- et peuvent une distinction entre les ype s--- anticorpsbactéries. De plus, elle a pour objet une composition pharmaceutique se prêtant au traitement d'un être humain susceptible d'infection ou déjà infecté par P. aeruginosa et contenant une quantité prophylactique ou thérapeutique d'au moins un anticorps monoclonal ou fragment de liaison de celui-ci capable de réagir avec les flagelles de souches de P. aeruginosa, la composition comprenant de préférence aussi un excipient physiologiquement acceptable.
La composition peut egalement contenir l'un quelconque ou plus de ce qui suit : des anticorps -monoclonaux supplémentaires capables de réagir avec l'exotoxine A de P. aeruginosa ; des anticorps monoclonaux capables de réagir avec des serotypes de déterminants sur les LPS de P. aeruginosa ; une fraction de gammaglobuline du plasma de sang humain ; une fraction de gammaglobuline du plasma de sang humain dont le plasma peut provenir d'un être humain ayant des taux eleves d'immunoglobulines reac- tives avec P. aeruginosa ; et un ou plusieurs agents antimicrobiens. De plus, elle a pour objet les usages cliniques des anticorps monoclonaux, y compris la production de trousses de diagnostic.
DESCRIPTION DES FORMESDE REALISATION SPECIFIQUES.
La présente invention procure de nouvelles cellules capables de produire des anticorps monoclonaux
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et des compositions comprenant de tels anticorps, -----lesqueHres-compostoits-sont-epables-de-eeonnte- -- lles -sur souches de P. alors que les anticorps individuelsreconnaissent flagelles de P. aeruginosa. Les cellules en question on-des-chromosomes squeJ--l'ADN de cellule pour un antirorps une protéine flagellaire commune à certaines souches de P. aeruginosa. Pour les protéines flagellaires de type a, des anticorps monoclonaux pan-réactifs peuvent etre produits, et pour les protéines flagellaires de type b, des anticorps qui sont pan-réactifs ou réagissent avec au moins 70% des souches portant des flagellessontinclus.
Cesanticorpsmonoclonaux peuvent être utilisés de façons très diverses, notamment pour le diagnostic et la therapie.
Les anticorps monoclonaux ainsi fournis sont particulièrement utiles dans le traitement ou la prophylaxie d'une maladie grave par P. aeruginosa. Les protéines de surface des flagelles de P. aeruginosa seraient accessibles pour un contact direct avec les molécules d'anticorps, inhibant ainsi vraisemblablement la motilité de l'organisme et/ou facilitant les autres effets favorables pour les hôtes infectes.
La préparation d'anticorps monoclonaux peut être accomplie en immortalisant une lignée de cellules capables d'exprimer des sequences d'acide nucléique codant pour des anticorps spécifiques pour un épitope sur les protéines flagellaires de multiples souches de P. aeruginosa. La lignée de cellules immoralistes peut être une lignée de cellules de mammifère qui a été transformée par oncogénèse, transfection, mutation ou
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äquivalent.
De telles cellules incluent les lignées -----Rtyetotne-tsTrlgneesdlympnonte7 aurEres celltles expressiön et""la secretion de l'immunoglobuline ou d'un fragment de "liaisoh fragment peut entre une immunoglobuline d'origine - nureje-dH-mammdrfere nr-ot itonmte--qui sont les sources préférées, produite par trans mation d'un--lymphocyte, particulier d'un splenocyte, ---au-moyea-dm-vrrus-eu-par-fusion ympheeyte-awec--une cellule néoplasique, par exemple un myélome, pour produire une lignée de cellules hybrides. Typiquement, le splénocyte sera obtenu à partir d'un animal immunisé contre des antigènes flagellaires ou des fragments de ceux-ci contenant un site épitopique. Les protocoles d'immunisation sont bien connus et peuvent varier considérablement tout en restant efficaces. (Voir, Golding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, N.
Y., 1983, qui est cité ici en référence).
Les lignées de cellules hybrides peuvent--être clonées et examinées suivant les techniques classiques, et les anticorps capables de se lier à des déterminants flagellaires de P. aeruginosa peuvent être détectés dans les surnageants cellulaires. Les lignées de cellules hybrides appropriées peuvent alors être cultivées à grande échelle ou injectées dans la cavité péritonéale d'un h6te approprie pour la production d'ascite.
Dans une forme d'exécution de la présente invention, les cellules sont des lymphocytes humains transformés qui produisent des anticorps monoclonaux humains, de préférence protecteurs in vivo contre des épitopes accessibles spécifiques pour au moins une protéine flagellaire. Les lymphocytes peuvent être
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obtenus chez des donneurs humains qui sont ou ont été exposés aux souches appropriées de P. aeruginosa portant des flagelles. Un procédé préféré de transformation cellulaire est décrit en detail dans le brevet
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des Etats-Unis d'Amérique nO 464 465, qui est cit ici par référence.
-faiDu fäftqüT. öntYennentIes anticorps de la D présente invention, qui sont connus pour être spécifiques pour les protéinesTlagellaires, surnageants ------drexpériencessirtvantes
4être examinés par analyse de compétition avec des anticorps monoclonaux en question, comme moyen pour identifier des exemples supplémentaires d'anticorps monoclonaux antiflagellaires. Dès lors, des lignées de cellules hybrides peuvent être aisément produites ä partir d'une variété de sources, sur base de la disponibilité des anticorps spécifiques pour des antigènes flagellaires particuliers presents.
Alternativement, quand des lignées de cellules hybrides, qui produisent des anticorps spécifiques pour les types epitopiques en qestiron, sont disponibles,ces lignées de cellules hybrides peuvent etre fusionnées avec d'autres cellules B néoplasiques, ces autres cellules B pouvant servir de destinataires pour de l'ADN genomique codant pour les récepteurs. Tandis que les cellules B néoplasiques de rongeurs, en particulier murines, sont le plus communément utilisées, d'autres espèces mammifères peuvent servir, comme les espèces lagomorphes, bovines, ovines, équines, porcines, aviaires, etc.
Les anticorps monoclonaux peuvent être de l'une quelconque des classes ou sous-classes d'immunoglobulines telles que les IgM, IgD, IgA, IgE, ou des sous-classes d'IgG connues pour chaque espèce d'animal.
Généralement, les anticorps monoclonaux peuvent etre
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utilisés intacts ou sous forme de fragments de liaison, ------treJrs-jueFvTFtb-F -mais-habdrtrueI. emet-aacs-- - tion peuvent trouver un usage autre que la production directe cellules peuvent etre fusionnées avec d'autres cellules (jteUL & sus-des n'ejiablement des-cellules produire deaT codant pour les anticorps monoclonaux. En variante, les 1ignées de cellules peuvent être utilisées en tant que sources des chromosomes codant pour les immunoglobulines, qui peuvent être isolés et transférés a des cellules par des techniques autres que la fusion.
De plus, les genes codant pour les anticorps monoclonaux peuventêtreisolésetutiliséssuivantlestechniques d'ADN recombinant pour la production d'immunoglobulines
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spécifiques dans une variété En particulier, en preparant des banques de cADN a partir d'ARN d'hôtes.messager, un clone de cADN unique, codant pour l'immu- noglobuline et exempt d'introns, peut être i solé et placé dans des vecteurs d'expression convenables procaryotiques ou eucaryotiques et ensuite transformé dans un hôte pour la production en masse finale. (Voir, généralement, les brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 4 172 124 ; 4 350 683 ; 4 363 799 ; 4 381 292 et 4 423 147.
Voir aussi, Kennett et al., Monoclonal Antibodies, Plenum, N. Y., 1980, et les references y citées, toutes ces sources étant mentionnées ici en reference).
Plus spécifiquement, suivant la technologie de l'ADN hybride, les immunoglobulines ou fragments de la présente invention peuvent être produits dans des bactéries ou une levure. (Voir, Boss et al., Nucl.
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Acid. Res., 12 : 3791 et Wood et al., Nature, ----3t4 446-,-chacnjn-etanL-ct4-ici "exemple, er -partir codant pour les chaînes lourdes et légères des anticorps corps mo o s12a r L-m e 1--9-b de la pressente invention, peut tre isolé par hybrie au moyen- du-cADN-de lymphocytesBALB/cautres que le clone L'ARNm hybride pas sera riche pour sessagQs : désirées. Si nécessaire, ce processus peut etre répété pour s'élever ensuite jusqu'aux taux désirés d'ARNm. La composition d'ARMm recueillie peut alors être soumise à la transcription réverse pour fournir un mélange de cADN enrichi en les séquences désirées.
L'ARN peut être hydrolysé avec une ribonucléase appropriée et l'ADN simple brin peut être rendu double brin avec l'ADN polymerase I et des initiateurs agissant au hasard, par exemple de l'ADN de thymus de veau fragmenté au hasard.
L'ADN double brin résultant peut alors etre clone par insertion dans un vecteur approprie, par exemple dans des vecteurs viraux tels que les vecteurs lambda, ou dans des vecteurs plasmidiens (tels que pBR322, pACYCl84, etc). En développant des sondes basées sur des séquences connues pour les régions constantes des chaines lourdes et légères, les clones de cADN ayant le gène codant pour les chaines désirées légères et lourdes peuvent être identifies par hybridation.
Ensuite, les gènes peuvent être excisés des plasmides, manipulés pour retirer l'ADN surperflu en amont du codon d'initiation ou l'ADN de la région constante, et ensuite introduits dans un vecteur approprie pour la transformation d'un hôte et l'expression finale du gene.
D'une manière appropriée, des hôtes mammifères
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(par utilisés pour traiter la chaine (par exemple unir exemple des cellules de souris) peuvent êtrechaines lourdes et légères ), afin d ' obtenir une immuno- globuline intacte, et pour sécréter l'immunoglobuline exempte de sequence leader, si désiré. En variante, on peut utiliser des micro-organismes unicellulaires pour produire les deux chaînes, auquel cas une manipulation ultérieure peut être requise pour retirer les séquences d'ADN codant pour l-es-signaux -de traitement et leader
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- -- - ----- -de e r s-é-crétion, tm fournissant un co-don l'extrémite 5'de la séquence codant pour la chaine lourde.
De cette maniere, les immunoglobulines peuvent être préparées et apprêtées de manière à être assem- blees et glycosylées dans des cellules autres que des cellules de mammifères. Si cela est désiré, chacune des chaines peut être tronquée de manière à retenir au moins la région variable, lesquelles régions peuvent alors être manipulées pour fournir d'autres immuno- globulines ou fragments spécifiques pour les epitopes flagellaires.
Les anticorps monoclonaux de la présente invention sont particulièrement utiles ä cause de leur spécificité pour des antigènes contre pratiquement tous les variants de P. aeruginosa présentement connus. De plus, quelques-uns des anticorps monoclonaux sont protecteurs in vivo, permettant l'incorporation dans des produits pharmaceutiques tels que des combinaisons d'anticorps contre des infections bactériennes.
Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent aussi trouver une large variété d'utilisations in vitro. Par exemple, les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour le typage des micro-organismes, pour l'isolement de souches spéci- fiques de P. aeruginosa, pour l'élimination selective de cellules de P. aeruginosa dans un mélange hétérogène
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de cellules, etc.
-----------Bans-des-butrS-de-iagno & tic-les monoclonaux " marqués. Typiquement, les tests de diagnostic imposent -----d-ddecier-ta-formatmr'anrmptxe-par-ta-liaisoir-de l'anticorps au flagelle de l'organisme P- ne sont-pas-marqu & -U-anticorps tination. De plus, les anticorps non marques-peuvent- anH. êtreutilisésencombinaisonavecd'autresanticorps marques (seconds anticorps) qui sont réactifs avec l'anticorps monoclonal, comme des anticorps spécifiques pour une immunoglobuline. En variante, les anticorps monoclonaux peuvent être directement marqués. Une large variété de marqueurs peut être utilisée, comme les radionucléides, les agents fluorescents, les enzymes, les substrats d'enzymes, les cofacteurs d'enzymes, les inhibiteurs d'enzymes, les ligands (particulièrement les haptènes), etc.
De nombreux types de tests immunologiques sont disponibles et, par exemple, certains incluent ceux décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique no 3 817 827 : 3 850 752 : 3 901 654 : 3 935 074 : 3 984 533 : 3 996 345 : 4 034 074 et 4 098 876, tous étant cités ici en reference.
Les anticorps monoclonaux de la présente invention sont habituellement utilisés dans des tests immunologiques enzymatiques, où les anticorps en question, ou des seconds anticorps d'une espece différente, sont conjugues à une enzyme. Quand un chantillon contenant P. aeruginosa d'un certain sérotype, tel que du sang humain ou un lysat de celui-ci, est combiné avec les anticorps en question, une liaison se fait entre les anticorps et les molécules présentant l'epitope desire. Ces. cellules peuvent alors être séparées des réactifs non liés, et un second anticorps
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(marqué avec une enzyme) peut être ajouté. Ensuite, la présence d'un produit de conjugaison anticorps-enzyme spécifiquement lié aux cellules est déterminée.
D'autres techniques classiques bien connues de l'homme de métier peuvent également être utilisées.
Des trousses peuvent également être fournies pour l'utilisation avec les anticorps en question pour détecter P. aeruginosa dans des solutions ou la presence d'antignes flagellaires de P. aeruginosa.
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--Aiinsjr,--ta--composition question de la présente invention peut être présentée, habituellement sous une forme lyophilisée, soit seule, soit conjointement avec des anticorps supplémentaires spécifiques contre d'autres bactéries Gram-négatives.
Les anticorps, qui peuvent être conjugués à un marqueur ou non conjugués, sont inclus dans les trousses avec des tampons, comme du Tris, du phosphate, du carbonate, etc., des stabilisateurs, des biocides, des protéines inertes, par exemple de la serum albumine bovine, etc.
Généralement, ces substances seront présentes en des quantités moindres qu'environ 5%, sur base de - la quantité d'anticorps actif, et habituellement présentes en une quantité totale d'au moins environ 0, 001%, sur base de la concentration d'anticorps. Frquemment, il sera désirable d'inclure un diluant ou excipient inerte pour diluer les ingrédients actifs, auquel cas l'excipient peut être présent ä raison d'environ 1% Åa 99% en poids de la composition totale. Quand un second anticorps capable de se lier a l'anticorps monoclonal est utilise, celui-ci sera habituellement present dans une fiole séparée. Le second anticorps est typiquement conjugué à un marqueur et présenté en une formulation analogue aux formulations d'anticorps décrites cidessus.
Les anticorps monoclonaux, en particulier les
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anticorps monoclonaux humains, ¯¯den L'invention, peuvent également être incorporés en tant que composants de compositions pharmaceutiques contenant une quantité thérapeutique ou prophylactique d'au moins un des anticorps monoclonaux de cette invention avec un excipient pharmaceutiquement efficace. Un excipient pharmaceutique devrait etre toute substance compatible
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non toxique convenable pour administrer des anticorps monoclonaux patient. L'eau les graisses, eTTesso. e utilisés en tant qu'excipients. Des adjuvants pharma- ceutiquement acceptables (agents tamponnants, agents dispersants} peuvent également être incorporés dans la composition pharmaceutique.
De telles compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique, de manière a être spécifiques pour des souches d'un type flagellaire de P. aeruginosa. En variante, une compo- sition pharmaceutique peut contenir deux anticorps monoclonaux ou plus pour former un "cocktail". Par exemple, un cocktail contenant des anticorps mono- - clonaux contre les deux types de flage-lles ou contre des groupes des diverses souches de P. aeruginosa (par exemple différents sérotypes) serait un produit uni- versel ayant une activité contre la grande majorité des isolats cliniques de cette bactérie particuliere.
La fraction molaire des différents anticorps monoclonaux constitutifs ne différera habituellement pas de plus d'un facteur de 10, et plus habituellement pas de plus d'un facteur de 5, et sera habituellement dans une proportion molaire d'environ 1 : 1-2 par rapport à chacun des autres composants d'anticorps.
Les anticorps monoclonaux de la presente invention peuvent également etre utilisés en combi- naison avec des produits de plasma sanguin existants, comme des gammaglobulines et immunoglobulines commer-
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cialement disponibles utilisées dans le prophylactique ou thérapeutique de la maladie à traitementP. aeruginosa chez les humains. De préférence, pour les immunoglobulines, le plasma sera obtenu chez des donneurs humains ayant des taux élevés d'immuno- globulines réactives avec P. aeruginosa. (Voir à titre général :"IntravenousImmuneGlobulinandthe Compromised Host", Amer. J. Med., 76 (3a),
30 mars, 1984, pages 1-231, qui est cité ici en reference).
Les anti corps monoclonaux en question peuvent etre utilisés ä l'étant de compositions administrées séparément, donnés conjointement avec des agents antibiotiques ou antimicrobiens. Typiquement, les agents antimicrobiens peuvent inclure une pénicilline antipseudomonale (par exemple la carbenicilline) en association avec un aminoglycoside (par exemple la gentamicine, la tobramycine, etc.), mais de nombreux autres agents (par exemple des cephalosporines) bien connus de l'homme de métier peuvent également être utilisés .
Les anticorps monoclonaux et leurs compo- sitions pharmaceutiques de l'invention sont particu- librement utiles pour l'administration orale ou parenterale. De preference, les compositions pharmaceu- tiques sont administrées par voie. parenterale, c'est-ä- dire sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.
L'invention a done pour objet des compositions pour l'administration parenterale qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal ou un cocktail de celui-ci dissous dans un excipient acceptable, de préférence un excipient aqueux. Une variété d'exci- pients aqueux peut être utilisée, par exemple l'eau, l'eau tamponnée, une solution physiologique salée a
0, 4%, une solution de glycine à 0, 3%, etc. Ces solu-
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tions sont stériles et partYcu resefITsees genéralement exemptes de matierepar des techniques de stérilisation classiques et bien connues.
Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables, requises pour approcher des conditions physiologiques,
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comme des agent 'aroTstemerit-dur-pH des tampons, agents de la toxicité, etc., par exemple l'acetate de sodium, le de sodium, le chlorure-- -----de-potassium-le-ehiorure-de-eTctjrerum,,-le sodium, etc. La concentration en anticorps dans ces formulations peut varier largement, c'est-a-dire de moins d'environ 0,5%, habituellement d'environ 1% ou d'au moins environ 1 % jusqu'à 15 ou 20% en poids au maximum, et sera sélectionnée essentiellement d'après les volumes de fluide, les viscosités, etc., à préférer pour le mode particulier d'administration choisi.
Dès lors, une composition pharmaceutique typique pour l'injection intramusculaire pourrait être préparée de façon à contenir l ml d'eau tamponnée stérile et 50 g d'anticorps monoclonal. Une composition typique pour la perfusion intraveineuse pourrait être préparée de façon à contenir 250 ml de solution de Ringer sterile, et 150 in d'anticorps monoclonal. Les procédés pour préparer des compositions administrables parentéralement sont connus ou évidents pour l'homme de
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m métier et sont décrits avec plus de détails, par e e exemple, dans Remington's Pharmaceutical Science, 15èrne éd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, (1980), qui est cité ici en référence.
Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent tre lyophilisés pour la conservation et reconstitues dans un excipient convenable avant usage. Cette technique s'est révélée efficace avec les immunoglobulines classiques et les techniques de lyophilisation
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et de reconstitution connues dans le metier peuvent
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être de métier etre appliqu & es. 1 est que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire ä des degres divers de perte d' activité de l'anticorps (par exemple, avec les immunoglobulines classiques, les anticorps IgM ont tendance ä avoir une
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plus plusgrande üe-tles TgG) que Les concentrations d'utilisation peuvent devoir être pour la compensation.
Le-s--compositions perte d'activité-monoclonaux de l'invention ou un cocktail de ceux-ci peuvent être administrees pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des infections a P. aeruginosa. Dans une application thérapeutique, les compositions sont administrées à un patient déjà infecté par un ou plusieurs serotypes de P. aeruginosa en une quantité suffisante pour soigner ou au moins partiellement arrêter l'infection et ses complications.
Une quantité adéquate à cet effet est définie comme "dose thérapeutiquement efficace". Les quantités -efficaces à cet effet dépendront de - la sévérité de l'infection et de l'état général du système immunitaire du patient, mais seront généralement comprises dans tme gamme d'environ l jusqu'a environ 200 mg d'anticorps par kg de poids du corps, mais des doses de 5 jus-
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qu'à 25 mg par kg sont plus habituelles. 11 faut garder à l'esprit que les produits de l'invention peuvent, de façon générale, être utilisés dans des etats pathologiques graves, c'est-a-dire des situations menaçant la vie, ou menaçant potentiellement la vie,
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spécialement et l'endotoxemie dues a pecialement la ein s la bactériémieP. aeruginosa.
Dans des applications prophylactiques, les compositions contenant l'anticorps de l'invention ou un cocktail de celui-ci, sont administrées à un patient
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non encore infecte par P. aeruginosa pour augmenter la
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---6- ssib e. resistance Sune Une telle quantité est definite comme etant une "dose prophylactiquement efficace". Dans cet usage, les quantités précises dépendent à nouveau de l'état de santé du patient et du niveau général d'immunité, mais
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se s1tuent spécialement de 0, 5 ä 2, 5 mg par kg.
Des uniques ou multiples - Tis-pBrorvent-eure-efectuees, ss-et-Ire-programme d'administration étant sélectionnés par le médecin traitant. Dans tous les cas, les formulations m e : --gén. éralement âe 0, 1 jusqu'à 25-mg par kg- ;pharmaceutiques doivent apporter une quantité du ou des anticorps de l'invention suffisante pour le traitement curatif ou prophylactique efficace du patient.
EXPERIENCES.
EXEMPLE 1.-
L'exemple illustre le procédé appliqué pour préparer un anticorps monoclonal murin qui se lie spécifiquement aux flagelles de P. aeruginosa.
Des souris BALB/c âgées de trois mois ontzeg immunisées par voie intraperitoneale huit fois avec des bactéries viables P. aeruginosa, immunotype Fisher 1 et immunotype Fisher 2 (A. T. C. C. n* 27312 et nO 27313), toutes les une à deux semaines, pour un total de neuf semaines. Les doses initiales de bactéries étaient
8 x 106 et 1 x 107 organismes par souris pour l'immu- notype Fisher 1 et l'immunotype Fisher 2 de
P. aeruginosa, respectivement, et la dose était augmen- tée de 30 ä 60 fois au cours des immunisations.
Trois jours après la dernière injection, la rate d'une souris a été prélevée aseptiquement et une suspension cellulaire unique a été préparée par rota- tion douce de l'organe entre les extrémités givrées de deux lames de verre steriles. Les cellules mononu-
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claires de rate ont dans une proportion 47lavecdes myelomedesounsenhase logarithmique Molecular Research Council, Cambridge, England) et fusionnées pour créer des hybridomes suivant le procédé décrit par Tarn et al., ---36 lspenisn="cetluaire finale a été diluée à concentration de 1, x 106 cellules par ml dans un mili-eu-hybride (RPMI ---Ir640 Gibco,-Gramd-fTslarld, enant été combinéessérum foetal de veau inactivé par la chaleur, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 g/ml de pénicilline et de streptomycine,
de l'hypoxanthine 1, 0 x 10-4 M, de l'aminoptérine 4, 0 x 10-7 M et de la thymidine 1, 6 x 10-5 M), additionné de 2, 0 x 106 cellules de thymus BALB/c fraîchement préparées par ml, comme cellules nourricières.
Le melange a été mis sur plaques (200 litres par puits) dans des plaques à 96 puits (n* 3596, Costar, Cambridge, MA). Les cultures ont été nourries par retrait et remplacement de 50% du volume de chaque puits avec du milieu hybride HAT-RPMI frais, tous les deux ou trois jours. Les surnageants des cultures ont été testés pour la presence d'anticorps antiP. aeruginosa par dosage d'immunosorption avec enzyme fixee (ELISA) lorsque la croissance cellulaire atteignait approximativement 40% de confluence dans les puits, habituellement dans les 7 à 10 jours.
Les surnageants des cultures des cellules hybrides ont été testés simultanément sur des preprations de membranes externes provenant de chacune des deux bactéries immunisantes. Les préparations de membranes externes ont été isolées par une modification de la technique de Tarn et al. {1982, Infect. Immun., 36 : 1042-1053), qui est citée ici en référence. Des
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bactéries (immunotype Fisher 1 et immunotype Fisher 2 ---d P. aTerugnQfsa. oTrt-temoculee triptycase-soya (TSB) et cultivées de 16 "ISheures T 34"C avec aération dans un bain remué par un agitateur giratoire. par centrifugation et lavées deux fois avec de la solution saline --tramp & tmee-au-Phosphate (PBS, NaG- Na2HP04-7HO8iM PO mM, 2) contenant 150 unités inhibitrices de trypsine (U.
I. ) apro-tinTnearLJLLJigma, MCL)-.'H
Le culot de la centrifugation finale a été remis en suspension dans de la triéthanolamine 0, 17 M et de l'acide édétique (EDTA) disodique 20 mM, et ensuite homogénéisé sur glace pendant dix minutes. Les débris ont été centrifugés hors de l'homogenat a
14. 900 g et rejetés, et le surnageant a été centrifugé ànouveaucommeci-dessus. Leculotaétérejetéà nouveau et les membranes ont été centrifugées hors du surnageant à 141. 000 g pendant une heure. Le surnageant a été rejeté et les culots membraneux ont été conservés durant la nuit à 40C dans 10 ml de PBS contenant
75 U. 1. T. d'aprotinine par ml.
Le jour suivant, les culots ont été remis en suspension par agitation et ensuite divises en aliquotes et stockés à -70oC. La teneur en protéine de chacune des aliquotes a été déterminée par le procédé de Lowry et al. (1951, J.
Biol. Chem., 193 : 265-275).
Les plaques d'antigène pour les tests ELISA ont été préparées comme suit. Les préparations de membranes externes ont été diluées jusqu'à 5 g de proteine par ml dans du PBS et 50 litres de la solution ont été mis sur plaque, dans chaque puits de plaques à 96 puits (Linbro nO 76-031-05, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA), couvertes et incubées durant la nuit à 37*C. L'antigène non lié a été élimine des
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plaques et 100 iitres de sérum albumine --bov-krre-- (DSAY-da-" a --ä--ä--incub*eä---üendärit puits, s nt heure a 37OC.
Apresl'eliminationduBSAnonabsorbé, surnageants des cultures (50itres) provenant de d'une solutionchaque- pu-i-ts-d & s-plaques=de-f-usion ont été répliqués sur plaque dans les puits correspondants des plaques d'antigene et incubes 30 minutes a 37 C. L'anticorps
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non-Li-a-eL- & LuML-its-et-les ves-- trois fois avec 100. litres par puits d'une solution BSA-PBS à 1% (p/v). Ensuite, 50 litres par puits d'IgG de chèvre antisouris biotinylée diluée d'une manière appropriée (Tago, Inc., Burlingame, CA) ont été ajoutes à chaque puits et incubés pendant 30 minutes à 37OC.
Les plaques ont été lavées trois fois, comme décrit cidessus, et ensuite 50 litres d'un complexe préformé avidine : peroxydase de raifort biotinylée (Vectastain ABC Kit, Bector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), préparé suivant les indications du fabricant, ont été ajoutés aux puits ApKLejs 30 minutes ä température ambiante, le réactif Vectastain a été éliminé des puits, les puits ont été lavés comme ci-dessus et ensuite 100 litres par puits de substrat 0phénylènediamine [0, 8 mg/ml dans du tampon au citrate
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0, M à pH 5, 0, en mé1ange avec un volume de H202 1à 0,03% (v/v)] ont été ajoutés.
Le substrat a été incubé pendant 30 minutes a la température ordinaire à l'obscurité et les réactions ont été alors arrêtées par l'addition de H2S04 3N ä raison de 50 rires par puits.
Les hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux qui se liaient à l'une ou l'autre des deux préparations d'antigène ont été localisés en mesurant l'absorbance a 490 nm des réactions colorimétriques
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dans puits, sur un lecteur Dynatech Model 580 ---HicroELISA- rexandria, Ces "un-puits, appellatiohPa3 saient un anticorps qui se liait uniquement à la plaque chaqued'antigène immunotype Fisher 2. Ce puits a été étudié plus en détail comme décrit ci-dessous. L'anticorps
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--monocrlonal et la lignée-detirtlaira ce puits sont tous deux identifiés par la désignation Pa3 IVC2 - le texte ci-après. Les cellules Pa3- puits orLgnal-ont-t eOttees-et-cottes-pa. niques de dilution limitantes, comme décrit par Tarn et al., (1982, Infect. Immun., 36 : 1042-1053).
Une ascite contenant un anticorps monoclonal de haut titre a été préparée dans des souris CB6 Fl (generation Fi d'une femelle BALB/c x un male C57BL/6) suivant les procédés décrits par Tam et al. (1982,
Infect. Immun., 36 : 1042-1053). Des mâles de souris
CB6 Fi ages de 2 à 3 mois ont été injectEs par voie intraperitoneale avec 0, 5 ml de Pristane (2, 6, 10, 14-té- traméthylpentadécane, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, - MI) 10 à 21 jours avant une injection intrapéritonéale de cellules Pa3 IVC2 en phase logarithmique dans du
RPMI. Chaque souris a été injectée avec 0, 5-1 x 107 cellules dans 0, 5 ml. Après approximativement deux semaines, le liquide accumulé a été prélevé sur les souris tous les deux ou trois jours.
La concentration d'anticorps dans l'ascite a été déterminée par électro- phorèse sur gel d'agarose (Paragon, Bookman Instru- ments, Inc., Brea, CA) et toutes les ascites qui contenaient 5 mg/ml ou plus d'anticorps ont été rassem- blées, fractionnées en aliquotes et surgelées à -70 C.
Caractérisation de la cible moléculaire liée par l'anticorps monoclonal.
Le surnageant de la culture de la lignée cellulaire clonée Pa3 IVC2 a été testé par ELISA, comme
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décrit ci-dessus, sur des préparations de membranes externes notypesFfsher ."aeruginosa A. de P. aureofaciens (A. 13985) et de Klebsiella provenant decnaccunedesseptsouchesimmu-pheumoniae (A.T.C.C. 8047), toutes préparées comme décrit ci-dessus. L'anticorps Pa3 IVC2 se liait aux
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- Knrier-2 Knnona-ae" membranes externes de P. aeruginosa et pas aux autres immunotypes---Fisher, ni a P. aureofaciens"ou --K-pneMtSuMte- L'antigene par l'anti- corps Pa3 IVC2 a été identifie par precipitation radioimmune.
En resume, cette analyse comporte l'incubation d'antigènes radiomarqués avec l'anticorps Pa3 IVC2 et une source particulaire de protéines A qui conduit à la formation de complexes insolubles anticorps : antigène.
Ces complexes sont lavés pour éliminer tout antigène lie non spécifiquement et ensuite les complexes sont dissociés et séparés sur gel de polyacrylamide. Les espèces radioactives prédominantes trouvées dans le gel sont identifiées-de cette manibre comme étant le ou lesantigènes correspondants auxquels l'anticorps Pa3 IVC2 se lie.
Des aliquotes ze de préparations solubles de membranes externes des immunotypes Fisher 2,3, 4 et 5 de P. aeruginosa ont été radiomarquees en phase solide avec 125I en utilisant de l'Iodo-gen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker et Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun., 80 : 849-857 ; Markwell et Fox, 1978, Biochemistry, 17 : 4807-4817). Cette technique provoque l'iodation des résidus de tyrosine exposes de la plupart, sinon de toutes les protéines contenues dans les preparations de membranes externes.
Pour diminuer la liaison non spécifique des antigènes de la membrane externe & l'anticorps
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Pa3 les preparations radiom rquées (5 x 106 coups par"ml testontd"abord Tncubeespendant une
IVC2,(dilution finale 1 : 40). Le surnageant de la culture Pa3 IVC2 (0, 5 ml) contenant l'anticorps Pa3 IVC2 a alors été ajouté ä chaque échantillon de membrane externe. Après incubation de l'antigène et de l'anti-
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corps pendant une heure à 4OC, la source de protéine A, IgGSORB (0, Center, Inc., -MB-a-t-amte-et-ineubee encore 30 minutes (Kessler, S. 1975, J.
095 ml par echäntillon) (The EnzymeImmunol., 115 : 1617-1622).
IgGSORB a été préparé selon les indications du fabricant et, juste avant l'utili- sation, les réactions non spécifiques ont été empêchées en bloquant des sites potentiellement réactifs avec du milieu de culture, en lavant l'IgGSORB deux fois avec du RPMI hybride (milieu hybride RPMI-HAT sans HAT).
Les complexes antigène-anticorps IgGSORB ont été centrifugés à 1.500 g pendant 10 minutes ä 4 C, lavés deux fois avec du tampon RIPA phosphat (phos- phate 10 mM, pH 7, 2, NaCl 0,15 M, Triton X 100 1,0% (v/v), désoxycholate de sodium 1, 0% (p/v), dodecylsulfate de sodium (SDS) 0, 1% (p/v) et aprotinine 1, 0% (v/v) ; deux fois avec du tampon hautement salin (TrisHC1 0, 1 M, pH 8, 0, LiCl 0,5 M, beta-mercaptoethanol 1% (v/v) ; et une fois avec du tampon de lyse (Tris-HCl 0,02 M, pH 7,5, NaC1 0,05 M et Nonidet P-40 0, 05% (v/v) (Rohrschneider et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 76 : 4479-4483).
L'antigène lié au complexe a été dégagé par incubation avec du tampon d'un chantillon [Tris-HCl 0, 125 M, pH 6,8, SDS 2% (p/v) 7, beta-mercaptoethanol 2% (v/v) et glycérol 20% (v/v) ä 950C pendant dix minutes et collecté dans le surnageant après centrifugation a 1. 500 g pendant 10 minutes.
Les échantillons de surnageants ont alors été
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appliqués sur-des gels de polyacrylamide ä 14% contenant du SDS préparés suivant le procédé due B. Lugtenberg et al. (1978, FEBS Lett., 58 : 254-258), tel que modifie par Hancock et Carey (1979,J
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Bacteriol., 140 : 902-910, qui est cité ici en référence), et les antigènes ont été séparés dans le gel '"par'*e La constante de 50 V. Après la fixation du gel dans du ''methanol (v/v), de l'acide actique"10% et du glycerol papier Whatman 3 MM à l'aide d'un sécheur de gel Biorad (Richmond, CA). Le gel séché a été couvert avec une enveloppe plastique et exposé à un film Kodak X-AR pendant 18 heures a la température ambiante.
Les résultats de cette expérience ont illustre que le Pa3 IVC2 se liait & un seul antigene de la préparation de membrane externe de l'immunotype Fisher 2 de P. aeruginosa, mais à aucun antigene présent dans les autres préparations de membranes externes. Le poids moléculaire (PM) de l'antigene dans le-gel était d'environ 53.000 daltons, comme déterminé en comparant sa mobilité à celle de protéines de référence marquées au 14C (phosphorylase B, PM 92. 500 ;
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BSA, PM 69. anhydrase carbonique, PM 30. cytochrome C, PM 12.
England Nuclear, Boston, MA) qui étaient séparées dans le même gel. Le poids moleculaire de cet antigène est en corrélation avec le poids moléculaire de la flagelline, la protéine comprise dans les flagelles de P. aeruginosa, comme rapporte par Montie et al. (1982, Infect. Immun., 35 : 281-288), qui est cité ici en reference.
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De plus, Pa3 IVC2 a par ELISA en utilisant les souches Habs 1 à 12 de P. aeruginosa (A. 33348-33359) qui étaient fixe avec de
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été examinél'ethanol sur des plaques de microtitration à 96 puits.
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. t. -p-ä-r-gds--c6m-me sult-.
Lespiaques preparees d'antigehe etäientDes bouillons de culture d'une nuit de chaque organisme ont été centrifugés, le culot a été lavé deux fois avec du PBS et ensuite remis en suspension dans du PBS jusqu'a une densite optique de 0,2 unité pour
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l'absorbancrrOnmr es--ont-été mises sur plaque dans des puits (50 litres par puits) et ensuite centrifugées à 1. pendant 15 --L-MMMM BS -et-etTSTtttre-- de l'ethanol (95%) a été ajoute aux puits pendant 15 minutes à la température ambiante. Après l'elimi- nation de l'ethanol des puits, les plaques ont été séchées à 1'air et ensuite couvertes et stockées à 40C jusqu'à usage.
Les résultats des tests ELISA, enregistrés comme décrit ci-dessus, ont montré que Pa3 IVC2 se liait aux souches Habs 2,3, 4, 5, 7,10, 11 et 12 fixées par l'ethanol. Ce modèle de spécificité indiquait que Pa3 IVC2 se liait aux flagelles de type b de P. aeruginosa- (Ansorg, R., 1978, Zbl. Bakt. Hyg., I., Abt. Orig. A, 242 : 228-238 ; Ansorg, R. et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20 : 84-88, tous deux cités ici en référence). Si on attribue cette spécificité au Pa3 IVC2 monoclonal, les souches de référence de P. aeruginosa, immunotype Fisher 2, immunotype Fisher 6, et immunotype Fisher 7 portent des flagelles de type b.
Des données expérimentales précédentes, il a été conclu que Pa3 IVC2 se lie spécifiquement à la flagelline de type b de P. aeruginosa.
Activité protectrice de Pa3 IVC2 in vivo.
Des expériences sur des animaux ont été menées pour déterminer si 1'anti corps monoclonal Pa3 IVC2 protégerait une souris injectée avec de multiples doses létales 50 (DLgo) de bactéries de P. aeruginosa
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vivantes. Le choisi était le modèle de la souris ---biubee Colin-M & .-et-Roby,-RrE,-18,-J.-Trauma-- - est cité icirern-réference). a fait A des groupes de souris une brûlure grave, suivant le protoeoledesäuteurs, tement injectées avec de 5 z 10 DLo de Fisher 7. L'anticorps-monocJLona. je-administré 'voier sousforme (0, 2 ml par voie intraperitoneale) avant la brûlure et l'injection. duinombre vants n'a été observée chez les animaux traités avec vants n'a'etb obaerv6e chez les animaux trait'es avec modèle Pa3 IVC2 par comparaison avec ceux qui n'avaient pas reçu d'anticorps.
EXEMPLE 2.-
L'exemple 2 illustre le procédé pour la préparation d'une lignée de cellules hybrides murines produisantunanticorpsmonoclonalmurincontrela flagelline de type b de P. aeruginosa, qui est protecteur in vivo.
Des souris femelles adultes BALB/c ont d'abord été injectées par voie intrapéritonéale avec l'immunotype Fisher 6 viable de P. aeruginosa (A. T. C. C. 27317) (8 x 106 organismes), et deux semaines plus tard, elles ont reçu une injection de l'immunotype Fisher 5 viable de P. aeruginosa (A. T. C. C. 27316) (4 x 106 organismes). Durant la période suivante de deux semaines, les immunotypes Fisher 5 et Fisher 6 viables de P. aeruginosa ont été administrés simulta- nement en deux injections hebdomadaires. La dose de chaque organisme a été augmentée de manière que la dose finale s'élève à 10 fois la dose initiale.
Une injection finale de préparations (50 g de protéine) de membranes externes de l'immunotype Fisher 6 de P. aeruginosa preparees suivant le procédé de R. E. W. Hancock et H. Nikaido (1978, J. Bacteriol.,
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:381-390)atedonnee e-ladernière viables. Trois jours
136après la dernière immunisation, la rate a été prélevée sur une souris et les cellules de rate ont été préparées pour l'hybridation comme décrit dans l'exemple 1.
Les surnageants des cultures des hybridomes
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ont-"ete la prsence n-ficcir7ps arif-i--P. aeruginosa par test ELISA au jour 10 après la fusion suivant dans l'exemple que 9ène, des bactéries viables immobilisées dans les puits des plaques de microtitration à 96 puits. Les plaques ont été préparées comme suit.
50 nitres de poly-L-lysine (PLL) /mol dans du PBS) (Sigma n P-1524, St. Louis, MO) ont été
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a w¯ ajoutés à et incubes pendant 30 minutes à la temperature ambiante. La PLL non adsorbée a été éliminée et les puits ont été lavés trois fois avec du PBS. Les cultures bactériennes cultivées pendant la nuit dans du TSB ont été lavées une fois avec du PBS et ensuiteremises en suspension dans du PBS jusque A660 nm 0, 2 D.O. 50 litres des suspensions bactériennes ont été ajoutes à chaque puits de la plaque et admis à se lier à 37"C pendant une heure. Les bactéries non liées ont été éliminées des plaques, avec trois lavages des puits au moyen de Tween salin [NaCl 0,9% (p/v), Tween-20 0, 05% (v/v) 7.
La liaison non spécifique des anticorps a été bloquée par l'addition aux puits de 200 l itres par puits de tampon bloquant [PBS contenant du lait maigre séché 5% (p/v), de l'antimousse A 0, 01% (v/v) (Sigma, St. Louis, MO) et du thimerosal 0, 01% (v/v) ] et par incubation pendant une heure à la temperature ambiante.
Le tampon bloquant en excès a été expulsé et les puits
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ont été lavés trois fois avec du Tween salin, comme
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- tt recedeaunentr.------------------------c-u ur Les ageants lJ. ) été répliqués dans les puits correspondants des plaques - 30 minutes. Les surnageants de cultures ont été éliminés des plaques, avec lavage des puits uinq-fois--= au moyen de Tween salin.
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Un anticorps enzyme- -G---àe peroxydase de raifort + IgM) (Tago, Inc., Burlingame, CA), a été dilué dans du PBS contenant du Tween-20 0, 1% de seconde étape, conjugué une(v/v) et du BSA 0,2% (p/v), suivant des titrations effectuées précédemment, et ensuite vitres du réactif ont été ajoutés à chaque puits et incubés 30 minutes à la température ambiante. Le réactif en excès a été expulsé les puits laves cinq fois dans du Tween salin : et 100 ritres par puits du substrat o- phénylenediamine ont été ajoutés et incubés pendant 30 minutes, comme décrit dans l'exemple 1. Les réac-
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tions ont ete rretes dans l'exemple et ensuite lues pour l'absorbance à 490 nm sur un lecteur de plaque Bio-Tek EL-310 Automated EIA.
Suivant les procédés décrits ci-dessus, les surnageants de cultures de la fusion ont été testés pour la présence d'anticorps qui se lient aux immuno- types Fisher 1, 2, 3 ou 4 de P. aeruginosa, mais non aux plaques de contrôle préparées par la même technique PLL et de blocage, mais sans bacteries. Les surnageants contenant l'anticorps qui se liait à l'un quelconque de ces quatre immunotypes Fisher ont été testés une seconde fois en utilisant chacun des sept immunotypes Fisher de la bactérie séparément. L'anti corps présent dans le surnageant d1 un puits, PaF4 IVE8, se liait seulement aux immunotypes Fisher 2,6 et 7 de
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P. aeruginosa.
Les cellules du puits PaF4 IVE8 ont été clonées par des procédés de dilution limitante, comme décrit dans l'exemple 1. L'anticorps monoclonal et la lignée cellulaire clonale de ce puits sont tous deux identifiés par la désignation PaF4 IVE8 dans le texte ci-après. Une ascite contenant de l'anticorps monoclonal à haut titre a été produite comme d'écrit dans l'exemple 1, excepté que des souris BALB/c ont été utilisées au lieu de CB6F1.
Spécificité de PaF4 IVE8.
Un test réalisé pour identifier l'antigène lié par l'anticorps monoclonal PaF4 IVE8 a été l'immunofluorescence indirecte sur des organismes bactériens.
Chacun des sept immunotypes Fisher de référence de P. aeruginosa plus une souche non flagellée de P. aeruginosa (PA103, A.T.C.C. n 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62 : 377-389) et Escherichia coli (G.S.C. A25) ont été cultivés pendant la nuit à 37 C dans du TSB. Les bactéries ont été centrifugées et ensuite lavées deux fois avec du PBS. Chaque souche a décrit dans l'exemple l. L'anticorps monoclonal et la lignée cellulaire clonale de ce puits sont tous deux identifiés par la désignation PaF4 IVE8 dans le texte
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ci-après.
Une ascite contenant de l'anticorps monoclonal h haut r'eteproduite crit crit dans l'exemple 1, excepte des souris BALB/c ont été utilisées au lieu de CB6F Spé-c--i-f-i Un test réalisé pour identifier l'antigene par l'anticorps monoclonal PaF4 IVES a été l'immuno- fluorescence indirecte sur des organismes bactériens.
Chacun des sept immunotypes Fisher de référence de
P. aeruginosa plus une souche non flagelles de
P. aeruginosa (PA103, A.T.C.C. n 29260, Leifson, 1951,
J. Bacteriol., 62 : 377-389) et Escherichia coli (G.S.C. A25) ont été cultives pendant la nuit à 37 C dans du TSB. Les bactéries ont été centrifugées et ensuite lavées deux fois avec du PBS. Chaque souche a été remise en suspension dans -du PBS- jusqu'a une
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densité optique de 2, 2 z 660 nm.
Les suspensions bactériennes ont alors été une fois de plus diluées dans une proportion 1 : 150 et des échantillons de 20 litres ont été placés dans des cellules individuelles sur des lames de Carlson (Carlson Scientific Inc., Peotone, IL) et seches sur la lame à 40 C. Les surnageants de cultures (25 litres) de PaF4 IVE8 ont été incubés sur les échantillons bactériens séchés sur les lames en chambre humidifiée à la température ambiante pendant 30 minutes. L'anticorps non lié a été éliminé des lames en immergeant les lames dans l'eau distillée.
Après séchage des lames, une IgG de chèvre antisouris conjuguée avec de l'isothiocyanate de
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fluorescéine (ITCF) plus une IgM (25 litres par puits d'une dilution 1:40 dans du PBS) (Tago, Burlingame, CA) ont été incubées sur les lames pendant 30 minutes à 1a température ambiante en chambre humidifiée dans l'obscurité. Les lames ont été lavées à nouveau dans l'eau distillée, séchées et ensuite couvertes avec une lamelle couvre-objet montée avec du glycerol lans du PBS (9 : 1). Les lames ont été observées avec un microscope ä fluorescence.
La coloration fluorescente a été observée uniquement sur les immunotypes Fisher 2,6 et 7 de P. aeruginosa et a été observée comme étant une sinusolde (ligne) émanant uniquement d'une extrémité des organismes. Ceci est conforme avec la morphologie et la localisation du flagelle polaire unique de ces bactériens.
La réaction de PaF4 IVE8 avec les flagelles a été confirmée par analyse d'immunoblotting, Les antigènes de la membrane externe de l'immunotype Fisher 6 de P. aeruginosa (voir exemple 1) ont été séparés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide à 14% contenant du SDS comme décrit dans l'exemple 1, excepté que 1'électrophorèse a été menée pendant cinq heures & un amperage constant de 80 mA. Des marqueurs de poids moléculaire précolorés (lysozyme PM 14. 300 : beta- lactoglobuline PM 18.400; alpha-chymotrypsinogène PM 25. 700 ; ovalbumine PM 43. 000 : sérum albumine bovine PM 68. 000 ; phosphorylsase B PM 97. 400 et myosine PM 200.000) (BRL, Gaithersburg, MD) ont été inclus dans le même gel de polyacrylamide.
Les antigènes ont été transferee du gel de polyacrylamide sur une membrane de nitrocellulose (MNC), (0, 45/4ion, Schleicher and Schuell, Inc., Keen, NH) dans un tampon Tris-glycine-méthanol (Towbin et al., [1979], Proc. Natl, Acad. Sei., USA, 76 : 4350-
<Desc/Clms Page number 35>
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4354) contenant du SDS 0, 05% (p/v) durant la nuit à 40C - -prèsrans--fM-t MNC Teeh-200705% PBS (PBS-Tween) (Batteiger, B. et al., 1982, J.
Immunol.
=- -- -un-- ampérage-cunsta : nt dtempérature ambiante. Pour cette étape et toutes les suivantes, leplateaucontenantlaMNCaétéplacésur une plate-forme secoueuse pour assurer la distribution de la solution sur toute la--MNC.
EMI35.2
- -Aprèune heure, la solut ion PBS-Tweenaété - - -décantée et de l'ascite PaF4 IVE8 (diluée 1 : 1000 dans du PSB-Tween) a été ajoutée et incubée avec la MNC pendant une heure ä la temperature ambiante. La MNC a alors été lavée cinq fois, chaque fois 5 minutes, avec du PBS-Tween pour éliminer l'anticorps non lié. De 1'IgG de chèvre antisouris conjuguée avec de la phosphatase alcaline plus IgM (Tago, Inc.) a etc dilues suivant les indications du fabricant et incubée avec la MNC pendant une heure à 1a température ambiante. La MNC a été lavée cinq fois comme décrit ci-dessus, puis le substrat contenant du phosphate-de bromochloroindolyle et du bleu de p-nitrotetrazolium (Sigma, St. Louis, MO), préparé comme décrit par Leary et al. (1983, Proc.
Natl. Acad. Sei., USA, 80 : 4045-4049), a été ajouté et incube 10 à 20 minutes à la température ambiante. La réaction a été arrêtée en lavant le substrat avec de l'eau distillée.
Les résultats de cette expérience ont montré que PaF4 IVE8 se liait spécifiquement à un antigène unique d'un poids moleculaire de 53. 000 daltons dans la preparation de membranes externes. Les résultats du test d'immunofluorescence indirecte et de l'immuno- blotting démontrent que PaF4 IVE8 se lie aux flagelles de P. aeruginosa.
Le type de flagelle que PaF4 IVE8 reconnaît a
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été déterminé par ELISA. Les souches Habs 1-12 3-43--j3 --- 33 5) orrtrtettes puits de micrötitrationTe ults avec de la PLL, et l'ELISA a été plus t & t dans cet exemple. La source de l'anticorps PaF4 IVE8 était le surnageant de la culture. Des
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rêdctions- ont été -notée6- contenant les souches Habs 2, 3, 4,5, 7, 10,11 et 12, indiquant donc que PaF4 IVE8 se lie--aux-fl-agelles de typeb. Lesdonnéesdelaprotectioninvivosont présentées ci-dessous dans l'exemple 4.
EXEMPLE 3.-
L'exemple 3 illustre le procédé pour la preparation d'une lignée de cellules hybrides murines produisant un anticorps monoclonal antiflagelle de type a de P. aeruginosa, qui est protecteur in vivo.
La source de cellules lympholdes pour la fusion était une rate d'une souris BALC/c immunisée, qui avait été injectée quatre fois par voie itnrapéri- toneale pendant 6 semaines avec des flagelles purifies de -type a (10 ag de proteine) provenant-de souches
Habs 6. et 8 (A. T. C. C. nO 33353 et 33355). Les flagelles ont été purifiés suivant le procédé de T. C. Montie et al. (1982, Infect. Immun., 35 : 281-288, qui est cité ici en référence) sauf que la centrifugation finale des flagelles a été menée à 100. 000 9 pendant une heure plutôt qu'à 40. 000 9 pendant trois heures.
Une seconde modification adoptée pour quelques opérations a été de détacher les flagelles des bactéries pendant
30 secondes dans un mélangeur plutôt que pendant
3 minutes. (Allison et al., 1985, Infect. Immun.,
49 : 770-774).
Les concentrations en protéines de chaque préparation ont été déterminées avec le test de protéine Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA) et la présence
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de lipopolysaccharide (LPS) en Y. O., et "1978, Biochetn., LespoJLds laires de protéines de flagelles ont été déterminés en comparant leur migration dans un gel de polyacrylamide avec SDS à la migration de protéines marquées dde
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referencetSRl- exempl Le poids de la flagelline de la souche Habs 6 était de 51. de la flagelline de --Habs-8-etait-de-4. raltons. urµ-sorTE-en-- accord avec celles obtenues par J. S. Allison et al. (1985, Infect. Immun. ; 49 : 770-774, qui est cite ici en référence).
La fusion de splenocytes provenant de souris immunisées contre la flagelline avec des cellules de
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myélome NS-1 a été réalisée trois jours après la m ye dernière immunisation, comme décrit dans les exemples 1 et 2. Quand les cellules hybrides ont crû jusqu'à environ 40% de confluence (jour 7), les surnageants des
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cultures dans des puits correspondants de trois ont été répliquésl* immunotype Fisher 1 de P. aeruginosa lié & de la PLL (voir exemple 2 pour la préparation) et les souches Habs 6 et Habs 9 fixées à la formaline.
Les bactéries pour les plaques d'antigènes fixes ä la formaline ont été cultivées, lavées et diluées comme décrit pour les plaques d'antigènes liées a la PLL. Des bactéries diluees (0, 2 unité de densité optique pour l'absorbance ä 660 nm) ont été ajoutées aux puits individuels litres par puits) de plaques de microtitration à 96 puits Linbro, et les plaques ont
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alors été 200 g pendant 20 minutes & centrifugées à 1.température ambiante. Les surnageants ont été éliminés des puits et 75 litres d'une solution de formaline 0, 2% (v/v) dans du PBS ont été ajoutés à chaque puits
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et incubés pendant 15 minutes a température ambiante.
Après élimination de la formaline des puits, les plaques ont été séchées à l'air et stockées à 40C jusqu'a usage. La formaline n'altère par l'antigenicite des flagelles, comme l'indique la capacité des antisérums antiflagelles d'agglutiner des organismes traités par la formaline (Lanyi, B., 1970, Acta
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Microbiol. Acad. Sci., Hung., 17 35-48). La souche immunotype Fisher l de aeruinosa comme-témoin, e-que comme l'indique la coloration une teinture mordante (Manual of Clin. Microbiol., Lennette, éd. p. 1099). Les cellules hybrides dans le puits FA6 IIG5 produisaient un anticorps qui se liait à Habs 6 et Habs 9 (deux souches portant des flagelles de type a), mais pas à 1'immunotype Fisher 1.
Les cellules provenant du puits FA6 IIG5 ont été sous-cultivées et clonées, comme décrit dans les exemples précédents. L'anticorps monoclonal et la lignée cellulaire clonale provenant de ce puits sont tous deux identifiés par la designation FA6 IIG5 dans le texte ci-après. De l'ascite a été produite dans des souris BALB/c comme décrit dans l'exemple 2.
Spécificité de FA6 IIG5.
La spécificité de l'anticorps FA6 IIG5 a été déterminée par immunofluorescence indirecte et immunoblotting. L'immunofluorescence indirecte a été réalisée essentiellement comme décrit dans l'exemple 2, avec les modifications suivantes.
Des cultures de bactéries ayant cru durant la nuit sur de l'agar au trypticase-soya à 30 oe ont été prélevées sur les plaques avec des écouvillons de coton et remises en suspension dans du PBS jusqu'a une valeur de l'absorbance à 660 nm de 0,2 unité D. O. De la
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formaline une concentration finale de 0, 37% (v/v) ---dans-du-PBS-a- outee--la-Suspension-sous-- "agttation.-Apres a--ambiante pendant 15 minutes, les bactéries ont été dilueesdansduPBSdans litres de cette suspension ont été placés dans des ---ptts-Hidviduels de lames de les e parees bbservation décr-it dans l'exemple 2. La source iormSLLMeAntsde & -de-La cellulaire FA6 IIG5.
La coloration fluorescente par l'anticorps
1 : àFA6 IIG5 a été observée sur les seules souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type a, mais sur aucune de celles portant le type b. L'image fluorescente observée étai une ligne sinusoldale indiquant
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que TTG imxEl cent était augmenté par traitement des bactéries avec de la formaline, mais ce traitement n'était pas requis pour visualiser la coloration flagellaire avec l'anticorps.
L'immunoblotting a été réalisé comme décrit dans l'exemple 2. Les sources d'antigènes de flagelles de type a étaient les préparations flagellaires purifiées (voir le présent exemple). Les antigènes ont été séparés dans des gels à 10% de polyacrylamide contenant du SDS CLaemmli, U. K., 1970, Nature (London), 227 : 680-685] et transférées sur une MNC. Les préparations de FA6 IIG5, soit le surnageant de culture, soit l'ascite diluée 1 : 1. 000 ont été mis à réagir avec la MNC, et la réaction détectée avec un réactif approprié conjugué à une enzyme et un substrat d'enzyme, comme décrit dans l'exemple 2. L'immunoblotting a illustre que FA6 IIG5 se lie spécifiquement ä la flagelline de P.
M. 51. 700 de Habs 6 et à la flagelline de P. M. 47. 200
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de Habs 8.
-- ------ccmffrmat. seulement a et de type b," a obtenue par ELISA, auxquelles fins les souches e a "Habs teHeesindividuelYementavecPLLaux puits de plaques de microtitration à 96 puits Linbro. L'antigene-se-liait-eulrement-aux souches Habs et a, sont les seules souches portant des flagelles de type a parmi-les R. et a1., 1984, --Clin , L < ii-eti-I reference). Les études de protection in vivo sont re on-du--fatt-que-FA & -YI & 5--réagit--présentées dans l'exemple 4 suivant.
EXEMPLE 4.-
L'exemple 4 illustre la protection de souris passivement immunisées avec les anticorps PaF4 IVE8 et FA6 IIG5 contre une infection par P. aeruginosa sur modele de souris brûlée.
Les anticorps monoclonaux antiflagelles ont été testés sur modèle de souris brûlée suivant le procédé de M. S. Collins et R. E. Roby (1983, J. Trauma, 23 : 530-534, qui est cité ici en reference). Pour les etudes de protection, tous les anticorps ont été purifies par chromatographie protéine A-Sépharose (Ey, P. L. et al., 1978, Immunochemistr , 15 : 429-436, qui est cite ici en reference) et dialysés contre du tampon PBS. La souche portant des flagelles de type a utilisée dans les essais sur animaux était P. aeruginosa PA220 (acquise chez le Dr. James Pennington, Boston, MA) et la souche a flagelles de type b était l'immunotype Fisher 2 de p. aeruginosa (A.T.C.C. n 27313) de reference.
40 g d'anticorps monoclonal purifié ont été donnés, par voie intraveineuse par souris, une z deux heures avant la brûlure et l'injection infectante. Immédiatement après la brûlure, les animaux ont reçu
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sous escarre 0, 5 ml de PBS froid contenant les
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Bact ceesLaTdoseinjectµeStaltaenviron 10 DLgo pour chaque organisme. Les résultats des essais sur animaux sont présentés dans les tableaux I et II.
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TABLEAU 1 Etude de la protection par un anticorps monocional anti-flagelles type a sur modèle de souris brûlée1.
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<tb>
<tb>
Pourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> FA6 <SEP> IIG5,
<tb> antiflagelles <SEP> a <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 80
<tb> PaF4 <SEP> IVE8, <SEP>
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Anticorps
<tb> monoclonal
<tb> non <SEP> spécifique
<tb> anti-LPS <SEP> 100 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> PBS, <SEP> sans
<tb> bactéries <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80
<tb>
EMI42.2
1. Les souris ont été infect6es sous escarre par environ 10 DLgo de P. aeruginosa PA220.
2. Le pourcentage est basé sur la survie de-souri-sdans des groupes de dix animaux, ä l'exception du groupe de contrôle recevant du PBS seulement, qui consistait en cinq souris. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
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TABLEAU II
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Etude de la protection par un anticorps monoclonal---Etüde e. antiflageiles type b sur modèle de souris brûlée .
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<tb>
<tb> de <SEP> la <SEP> protection <SEP> par <SEP> un <SEP> anticprps <SEP> monocionalPourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour <SEP>
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> PaF4 <SEP> IVE8,
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90
<tb> PA6 <SEP> IIG5 < ---- <SEP>
<tb> antiflagelles <SEP> a <SEP> 1DO-20 <SEP> r0'10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10-- <SEP>
<tb> Anticorps
<tb> monoclonal
<tb> non <SEP> spécifique
<tb> anti-LPS <SEP> 100 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> PBS,
<SEP> sans
<tb> bactéries <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb>
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- 1. Les souris ont été infectées sous escarre par environ 10 DL50 de l'immunotype Fisher 2 de
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P. aeruginosa. 2. Le pourcentage de survie est base sur le nombre de souris survivantes par- groupe de dix, ä l'exception du groupe de contrôle recevant du PBS seulement, qui consistait en cinq souris. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
<Desc/Clms Page number 44>
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Une survie très significative a ---ctrezT-les-sourts-trsttes-avec-rairticorps-anH.-a lanticorpsanti-bet TnjectIOn de l'antigene correspondant. Réciproquement, 80-90% des souris traités avec un anticorps monoclonal antiflagellaire -ti f --==Ht & tiatif un anticorps-nen- & peejyEtteaatri-LPS, mourraient. : - type a de protéger les souris contre-une letal e asa--po-rt-ante--di-imm des flagelles de type b, et l'incapacité été observéeantiflagelles de type b de protéger les souris contre une injection létale de P. aeruginosa PA220 du type a, corroboraient in vivo la spécificité des anticorps observée in vitro. La survie des souris brûlées, mais non infectées, indiquait que la brûlure elle-même n'était pas létale.
EXEMPLE 5.-
L'exemple 5 démontre la réactivité croisée considérable de PaF4 IVE8 et FA6 IIG5 avec des isolats acliniques de P. aeruginosa, ce qui prouv & l'utilite clinique de ces anticorps dans l'immunothérapie des infections a P. aeruginosa.
Des isolats cliniques ont été obtenus dans des hôpitaux et cliniques. Les isolats provenaient de divers sites de prélevement, notamment le sang, des plaies, l'appareil respiratoire, l'urine et les oreilles. Un total de 157 isolats a été examiné.
PaF4 IVE8 s'est lie spécifiquement a
34 isolats cliniques (22%), tandis que l'anticorps pour les flagelles de type a ou FA6 IIG5, s'est lie a
102 isolats cliniques (65%), soit un total de 136 des
157 isolats (87%). Parmi les 21 souches qui notaient reconnues par aucun des deux anticorps, 19 étaient non flagellées, comme l'indique la coloration avec une
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teinture mordante. deux anticorps en combmaisoh desT38 isolats cliniques (voir, Ansorg, R., 1978, Zbl. Bakt, Hyg. I Abt.
A, 242 228-238, qui est cité ici en référence).
EXEMPLE 6.L'exelllple le procede ) ur-laproduction d'anticorps monoclonaux humains qui se lient aux-flagelles de type b de P. aeruginosa ---------UH-hantiJrton--de-sng chez un individu immunisé avec une préparation de polysaccharide de haut poids moléculaire (Pier et al., 1984, Infect. Immun., 45 : 309) a servi de source de cellules B. Les cellules mononucléaires ont été séparées du sang par des techniques courantes de centrifugation sur Ficoll-Paque [Boyum (1968) Scand. J.
Clin. Lab. Invest., 21 : 77] et lavées deux fois dans un tampon phosphaté salin exempt de calcium et de magnésium (PBS).
Les cellules mononucléaires ont été débarrassees des cellules T suivant un mode opératoire modifié pour former des rosettes E. En bref, les cellules ont d'abord été remises en suspension jusqu'a une concentration de 1 x 107 cellules par ml dans du PBS contenant 20% de sérum foetal de veau (SFV) a 4 C. 1 ml de cette suspension a ensuite été place dans un tube à fond rond en polystyrène de 17 x 100 mm et on y a ajoute 1 x 109 globules rouges de mouton traités avec du bromure de 2-amino-isothiouronium (AET) provenant d'une solution à 10% (v/v) dans du milieu de Dulbecco modifié suivant Iscove (milieu d'Iscove) Madsen et Johnson (1979), J. Immun. Methods, 27 : 61 : 7.
La suspension a été mélangée doucement pendant 5- 10 minutes à 40C et les cellules en rosette E ont été ensuite séparées par centrifugation sur Ficoll-Paque
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durant 8 minutes à cellules mononu- 1-6-aire-g- ----cteaire- u-s. E-négatives" (CMSPE*) ont été recueillies et lavées une fois dans du milieu d'lscove et remises en suspension dans le même milieu contenant du SFV 15% (v/v), de la L-glutamine (2 mmoles par
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litre), de la p-én-ici-rtlne par de la streptomycine (lO /ml), de l'hypoxanthine (1 x 10-4 M), de l'aminoptérine (4 x 10-7 M) et ----de- ne- 6--x-705-M.-ee-miet-eat - (100 Uni-e-és- I ternationales--apres milieu HAT.
La transformation avec entraînement cellulaire des CMSPE- a Eto accomplie en cocultivant ces cellules avec une 1ignée de cellules transformantes. La lignée de cellules transformantes était une lignée de cellules lymphoblastoldes humaines positives pour l'antigene nucléaire d'Epstein-Barr (EBNA) dérivée par mutagenese au méthanesulfonate d'éthyle (EMS) de la lignée de cellules lymphoblastoldes GM 1500, suivie d'une sélection en présence de 30 g/ml de 6-thioguanine pour rendre les cellules déficientes-en hypoxanthine-gua- nine-phosphoribosyltransférase (HGPRT) et donc sensibles au HAT. Cette lignée cellulaire est dénommée lignée cellulaire 1A2 et a été déposée à l'American Type Culture Collection (A. T. C. C.) le 29 mars 1982 sous le nO A. T. C. C. CRL 8119.
Des cellules 1A2 en phase de croissance logarithmique ont été remises en suspension dans du milieu HAT et ensuite combinées avec les CMSPEavec une proportion de 15 cellules 1A2 par CMSP. Le mélange de cellules a été mis sur plaque dans 30 plaques de microtitration de 96 puits à fond rond (Costar 3799) une concentration de 32. 000 cellules par puits dans un volume de vitres par puits, et incube à 370C dans une atmosphère humidifiée contenant
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2. Les cultures ont e 6% de C02'Les jours 5 et
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cultures ont été nourries aux8 après la mise sur plaque par remplacement de la moitié du surnageant par du milieu HAT frais.
Seize jours après la mise sur plaque, 100% des puits contenaient des cellules proliférantes et, dans la plupart des puits, les cellules étaient d'une densit süffi- sante pour la collecte et l'examen des surnageants pour
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----des "-'"-" Les surnageants ont été pour la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa tliant technique-EtrISA crrj. avec les modifications suivantes. Un rassemblement des sept souches imununotypes Fisher de reference (A. T. C. C n 27312-27318) (A660 = 0, 2 unité D. O.) a eté lie des plaques de microtitration à 96 puits à fond plat (Immulon II, Dynatech), prétraité avec de la poly-L- lysine, incubé et lavé, comme décrit dans l'exemple 2.
Aprbs le blocage des sites de liaison non spécifiques et le lavage des plaques, 50 titres de PBS contenant
0, 1% (v/v) de Tween-20 et 0, 2% de BSA (p/v) ont été ajoutés par puits. Les surnageants de cultures - (50"mitres) ont alors été répliqués sur plaque dans les puits correspondants de plaques d'essai et dans des plaques de contrôle qui avaient été traitées avec de la
PLL et bloquées, mais exemptes de bactériens. Après incubation et lavage, des anticorps de seconde étape conjugués à une enzyme litres par puits), de l'IgG de chèvre antihumaine conjugues avec de la peroxydase de raifort, et de l'IgM de chèvre antihumaine ou dilution appropriée dans du PBS contenant du Tween-20 0, 1% (v/v) et du BSA 0, 2% (p/v),
ont té ajoutés aux puits et l'essai a été mené à son terme, comme décrit dans l'exemple 2.
Les surnageants contenant l'anticorps, qui se liait au rassemblement d'immunotypes Fisher, mais non ä la plaque de contrôle, ont été testés une seconde fois
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en utilisant séparément chacune des bactéries des sept immunotypes Fisher. L'anticorps präsent dans le surna- geant d'un puits, 20H11, se liait uniquement aux immunotypes Fisher 2,6 et 7 de P. aeruginosa. Les cellules ont été sous-cultivées d'une manière répétée à des densités de cellules décroissantes jusqu'à ce que touslespuitsavecunecroissancesécrètentde
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l'anticorps.
La 1ignée cellulaire et 1'anticorps monoclonal -e tous deux identifiés la-a < eslgration Eextei-apres---------Une seconde transformation a été réalisée, dans laquelle la source des cellules B était le sang périphérique d'un patient souffrant d'une fibrose cystique, connu pour avoir eu une infection chronique ä P. aeruginosa. Les CMSPE- ont été préparées, comme décrit ci-dessus, et cocultivees avec la lignée de cellules transformantes, 1A2, dans une proportion dans 72 cellules 1A2 par CMSPE-. Le mélange de cellules a
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été mis sur plaque dans 15 plaques de microtitration de 96 puits à fond rond à une concentration de 7, x 104 cellules-part puits et cultiva comme ci--
4dessus.
Les surnageants ont été testés par ELISA pour la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa seize jours après que la transformation ait été mise sur plaque.
L'essai a été réalisé comme décrit pour la transformation précédente, excepté que le rassemblement de souches de P. aeruginosa utilise pour L'examen initial était composE des souches immunotypes Fisher F2, F4, F6 et F7 de reference (A. T. C. C. no 27313,27315, 27316 et 27317), outre trois isolats cliniques provenant de la Genetic Systems Corporation Organism Bank (GSCOB) qui avaient des immunotypes LPS et types de flagelles différents. L'isolat clinique PSA 1277 (GSCOB) porte des flagelles de type a et l'immunotype Fisher 1 LPS;
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EMI49.1
le second isolat PSA G98 (GSCOB). des flagelles de pes - (GSCOB) v -Tles b et l'immunotype Fisher 5 LPS. Ce melange de souches de r--reerence-et-d' " isolars c iniq einblement de P. aeruginosa flagelle.
Les surnageants - aitauxplaques contenansbe non aux plaques de contrôle couvertes de PLL, ont testespar unes & cjnnde-fois m- & s-solches individuelles du rassemblement. Un puits, 3C1, se liait aux souches de référence F2, F6 et F7 et à l'isolat clinique F625.
Le clonage des lignées de cellules 3C1 a été accompli en sous-cultivant d'abord les cellules en deux tournées de sous-cultures basse densite, d'abord a 20 cellules par puits de plaques a 96 puits, puis par la culture à 2 cellules par puits. Le clonage formel des cellules produisant l'anticorps spécifique a été réalisé en mettant sur plaque les cellules à une densité d'environ l cellule par puits dans des plaques Terasaki à 72 puits (Nunc nid 1-36538) dans un volume de 10/alites par puits de milieu HAT exempt d'aminoptérine (milieu HT).
Les plaques ont été placées dans un incubateur pendant 2 à 3 heures pour permettre aux cellules de sédimenter au fond des puits et ensuite examinées au microscope par deux proposes pour la recherche des puits contenant une cellule unique. Les puits ont été nourris quotidiennement avec du milieu HT et, quand la croissance était suffisante, les cellules ont été transférées vers une plaque à 96 puits a fond rond. Tous les puits avec une croissance ont été testés par ELISA sur des souches de P. aeruginosa portant les flagelles de type b et tous se sont révélés produire l'anticorps approprie.
La lignée de cellules et l'anti-
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corps monoclonal (isotype 19M) deux idenifJ. l l7'antJLgene"identifie ii-g alt formé par des flagelles, comme l'indiquent fluorescence niques ont été réalisées fondamentalement comme décrit ---d-ans et 3. Pour-tre-fest-d'i. fluorescence indirecte, des souches de P. aeruginosa portant-des flagelles de type b, immunotypes Fisher F2, --F6-eFTe c T. -2 ,-27-e- 27318) et une souche portant des flagelles de type a, immunotype Fisher 4 de référence (A. T. C. C. n" 27315) ont été préparées comme décrit dans l'exemple 3. Le type de flagelles des souches de référence a été determine par typage avec les anticorps monoclonaux
EMI50.2
murins et FA6 IIGS. Les lames ont été préparées pour l'observation comme décrit ecrit dans
PaF4 IVE8l'exemple 2.
Les sources des deux anticorps ont été les surnageants de cultures, et le réactif conjugué à de l'ITCF était de l'Ig de chèvre antihumaine conjuguée ä de l'UCF- (polyvalent) (Tago, Burlingame, CA) en dilution 1 : 100 dans du PBS contenant 0, 5% (p/v) de gammaglobulines bovines (Miles Scientific, Cat., n* 82- 041-2, Naperville, IL) et de l'azide sodique 0, 1% (p/v) comme antiputride.
La coloration fluorescente par les anticorps 20Hll et 3C1 a été observée uniquement avec les souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type b et pas avec la souche portant des flagelles de type a, l'immu- notype Fisher 4 de reference. L'image fluorescente observée était une image linéaire sinusoldale émanant d'une extrémité de la bacterie, indiquant que les anticorps se liaient aux flagelles des bactéries.
L'immunoblotting a été réalisé comme décrit dans l'exemple 2. Les flagelles de type b purifiés à
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partir de la souche de reference de "P."afg1. 2r73T3l-e-les-flageriesde type a purifies S 8 de reference (A. T. C. C. na 33353 et 33355) ont été prepares comme décrit dans l'exemple 3. Les antig nes ont été séparés sur un gel à 10% de polyacrylamide (voir exemple 3) et transférés sur une MNC. Les- surnageants de cultures contenant les anticorps 20H11 ou
EMI51.2
3C1, le surnageant de contenant un anticorps non kekix-de-c q-ue n incubes avec la MNC et la réaction a une Ig de chèvre antihumaine conjuguée avec de la phosphatase alcaline (polyvalente) (Tago, Burlingame, CA) diluée dans du PBS contenant du Tween-20 0, 05% (v/v).
Le substrat d'enzyme a été prepare comme decrit dans L'exemple 2. L'immunoblotting a montré que les deux antigènes se liaient à la protéine flagelline de PM 53. 000 de l'immunotype Fisher 2 et pas à la protéine flagelline de PM 51. 700 de Habs 6, ni ä la protéine flagelline de PM 47. 200 de Habs 8. Aucune réaction n'a été observée ni avee l antc0rps non spécifique humain, ni avec les milieux de culture.
Une confirmation supplementaire que les anticorps 20H11 et 3C1 se liaient seulement aux flagelles de type b et pas au type a, a été obtenue par ELISA, auxquelles fins les souches Habs 1-12 ont été liées individuellement avec de la PLL d'un puits de plaque de microtitration Immulon à 96 puits. Les anticorps se liaient seulement aux souches Habs 2,3, 4,5, 7, 10, 11 et 12, qui sont des souches portant le type b (Ansorg et al., (1984) J. Clin. Microbiol., 20 : 84).
EXEMPLE 7.-
L'exemple 7 illustre des precedes pour la production d'un anticorps monoclonal humain qui se lie aux flagelles de type a de P. aeruginosa.
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Un échantillon de sang périphérique recueilli chez un individu immunisé avec une preparation de polysaccharide de haut poids moleculaire (Pier et al.
(1981) Infect. Immun., 34 : 461) a servi de source de cellules B. Les cellules mononucléaires ont été separées & partir du sang et ensuite débarrassées des
EMI52.1
-ceLluLes comme décrit dansl'exemple eTTjes ont alors été gelées dans du SFV contenant 10% de dimthylsulfoxyde dans une cuve liquide.
-A- da e dégelées rapidement ä 37 C, lavées une fois dans du milieu d'Iscove et remises en suspension dans du milieu
HAT. La transformation avec entrainement cellulaire a été accomplie en cocultivant les CMSPE avec des cellules 1A2 dans une proportion de 30 cellules 1A2 par CMSPE-. Le mélange de cellules a été mis sur plague dans 30 plaques de culture de tissu z 96 puits ä une concentration de 62. 000 cellules par puits. Les cellules ont été nourries le septième jour après la mise sur plaque par remplacement de la moitié du volume par-du milieu HAT. La prolifération des cellules a été observée dans 100% des puits le quatorzième jour après la mise sur plaque et les surnageants ont été extraits des puits et festes ä ce moment.
Les surnageants ont été testés par ELISA pour la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa en utilisant le rassemblement de P. aeruginosa flagelle et des plaques traitées par PLL comme contrôle de la façon décrite dans l'exemple 6. Les surnageants contenant des anticorps qui se liaient au rassemblement flagelle, mais pas aux plaques PLL de contrôle, ont été testes de nouveau sur les souches de bactéries individuelles du rassemblement flagelle. Un puits, 21B8, contenait un anticorps qui se liait & PSA I277, PSA G98 et l'immu- notype Fisher 4 de référence, qui sont les trois
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souches du rassemblement flagelle qui portent des - "'Leclonage e-Ta née te" accompli comme décrit dans l'exemple 6 pour la lignée de l'étampe de clonage formel.
Après que les puits des - piaques-de-Teasai-aient t a-prse d'une a été transférée de Terasaki ä un- -----v-idue-l-d2-uue-4e-cul-t-ur-e dans un volume de look treks de milieu HAT exempt d'aminopterine (milieu HT). Des cellules lymphoblastoides non transformantes sensibles au HAT ont été incluses dans tous les puits à une densité de 500 cellules par puits en tant que cellules nourricières. Cinq jours après 1a mise sur plaque, lOOlitres de milieu HAT ont été ajoutés aux puits pour tuer sélectivement les cellules nourricières. Les puits ont encore été nourris aux jours 7 et 9 après la mise sur plaque par remplacement de la moitie du surnageant par du milieu HAT.
Les-cellules ont alors été nourries avec du rniieu--- HT jusqu'à ce que les cellules soient d'une densité suffisante pour détecter la présence d'un anticorps par ELISA. Tous les puits avec une croissance produisaient de l'anticorps qui se liait aux souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type a. La lignée de cellules et l'anticorps monodonal (isotype IgGl) sont tous deux identifiés sous la designation 21B8 dans le texte ci-après.
L'antigene identifie par 21B8 était forme des flagelles, conune l'indiquent l'immunofluorescence indirecte et l'immunoblotting (voir exemple 6 pour les descriptions des techniques). La coloration fluorescente par l'anticorps 21B8 a été observée uniquement avec la souche immunotype Fisher 4 de reference de
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P. aeruginosa 27315) qui porte des -- f sd tansorache immunotype de référence de . aerugYnosa *. porte des flagelles de type a. L'image fluorescente observetaTtuneImagelineairesinusoldaleemanant observee Ztait une image linéaire sinusoIdale emanant d'une se liait eHres-de-a-bac se liait aux L'immunobl. dans l'exemple 2. Des firagelles de- a purifiés ---provenant-de--a--suehe--Habs --de--reference-de--- P. aeruginosa (A. T. C.
C. n* 33353) et des flagelles de type b provenant de la souche immunotype Fisher 2 de référence de P. aeruginosa (A. T. C. C. n* 27313) ont été
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prepares 3. Les repar6s comme decrit dans p ont été séparés sur un gel de polyacrylamide 10% (voir exemple 3) et transférés sur une MNC. Les surnageants de cultures contenant soit 21B8, soit un anticorps humain non spécifique, et les milieux de culture ont été mis à réagir avec la MNC et la réaction a été détectée avec une Ig de chèvre antihumaine conjuguée à une phosphatase alcaline (polyvalente) et un substrat d'enzyme comme décrit dans les exemples 2 et 6.
L'immunoblotting a illustre que l'anticorps 21B8 se liait seulement à 1a protéine flagelline de PM 51. 700 de Habs 6 et pas à la protéine flagelline de PM 53. 000 de l'immunotype Fisher 2. Aucune réaction n'a été observée ni avec l'anticorps humain non spécifique, ni avec les milieux de culture.
EXEMPLE 8.-
L'exemple 8 illustre la protection de souris immunisées passivement avec des anticorps humains antiflagelles 20H11, 3C1 et 21B8, contre l'injection infectante de P. aeruginosa sur modèle de souris brûlée.
Les anticorps monoclonaux humains anti-
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flagelles ont été testés sur modèle de souris brûlée (voir exemple 4). Les anticorps 21B8 et 20Hll ont été préparés par précipitation de surnageants de cultures obtenus a partir des lignées de cellules respectives avec du sulfate d'ammonium (concentration finale 50%)
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(Good et al., Selected Methods in Cellular Immunology, "MishenTBTBT T"ed7, . teörü-an et Co" San Francisco, CA, 1980, 279-286).
-ölubilis PBS, dialysé cöntre ---rmit-ä-4C-et-ensuite avant l'administration aux animaux. La source de l'anticorps 3C1 et celle de l'anticorps non spécifique anti-LPS utilise comme contrôle négatif dans cette étude étaient des surnageants de cultures. Le controle positif pour chaque étude était l'anticorps monoclonal murin purifie approprié PaF4 IVE8 ou FA6 IIG6.
La souche portant des flagelles de type a utilisée dans les essais sur animaux était l'isolat clinique PSA A522 (GSCOB) qui exprime l'immunotype Fisher 1 LPS et la souche à flagelles de type b était - 1-1 iso-l-at clinique PSA A447 (GSCOB) qui exprime l'immunotype Fisher 6 LPS. Les anticorps humains (0, 45 ml) ont été prémélangés avec les bactéries (plus de 5 DL100 dans 0, 05 ml) et inoculés sous escarre immédiatement aprbs que la brûlure soit administrée. Les résultats des essais sur animaux sont présentés dans les tableaux III, IV et V.
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TABLEAU III Etude de la protection par l'anticorps monoclonal Etude de la protection par l'anticorps monoclona de souris brûlée.
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<tb>
<tb>
Pourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> FA6 <SEP> IIG5,---mutin
<tb> antiflagelles <SEP> a3 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 88 <SEP> 88 <SEP> 88 <SEP> 88 <SEP> 88
<tb> 21B8,
<tb> humain
<tb> antiflagelles <SEP> a <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 20H11
<tb> humain
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> PBS, <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb>
1. Les souris ont été infectées sous escarre par plus
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de 5 DLIOO de P. aeruginosa 2. Le pourcentage de survie est bas sur le nombre de souris survivantes par groupe de huit animaux.
Les jours sont après brûlure et injection infectante.
3. L'anticorps purifié (lOog dans 0, 45 ml PBS) a été prémélangé avec les bactéries et administré sous escarre après la brûlure et l'injection infectante.
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TABLEAU IV --EtüdedelapEpActionparlJLanticorpsmonocionalhumain20H11antiflagellestype humain 20H11 antiflagelles , ij2e b dans le modble de souris brûlée.
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<tb>
<tb> b <SEP> danPourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> PaF4 <SEP>
<tb> murin,
<tb> IVE8, <SEP> antiflagelles <SEP> b3 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 20H11,
<tb> humain
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 21B8
<tb> humain
<tb> antiflagelles <SEP> a <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Milieux <SEP> 80 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
EMI57.3
1.
Les souris ont été infectées sous escarre par plus de 5 DIOO PSA A447 de P. aeruginosa.
2. Le pourcentage de survie est base sur le nombre de souris survivantes par groupe de cinq animaux. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
3. L'anticorps purifié (10 g dans 0,45 ml de PBS) a été premelange avec les bactéries et administré sous escarre après la brûlure et l'injection infectante.
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TABLEAU V
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- - - - - - --- - Etjudss ionpar] humain 3Cl b dans le de souris .
EMI58.2
<tb>
<tb> dela <SEP> pfotecPourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> PaF4 <SEP> IVE8,
<tb> mur-in7'"
<tb> antiflagelles <SEP> b3 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 3C1,
<tb> humain
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80
<tb> Anticorps
<tb> monoclonal
<tb> non <SEP> spécifique
<tb> anti-LPS <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
1. Les souris ont été infectées sous escarre par
5 OL100 de PSA A447.
2. Le pourcentage de survie est basé sur le nombre de souris survivantes par groupe de cinq animaux. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
3. L'anticorps purifié (40 g) a été administré par voie intraveineuse deux heures avant la brûlure et l'injection infectante.
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EMI59.1
Une les type a ou bien avec l'un ou l'autre des anticorps antiflagelles de type b et ensuite infectées par injection de l'antigène correspondant. Réciproquement, 88-100% des souris non traitées, mais injectées, ou celles traitees avec un anticorps antiflagellaire non réactif ou avec un anticorps non spécifique anti-LPS, mourraient.
Comme il a été observé avec les anticorps monoclonaux murins (voir exemple 4), les- anticorps humains antiflagelles protègent spécifiquement contre une injection létale uniquement pour les organismes portant le type de flagelles correspondant, c'est-àdire que l'anticorps humain antiflagelles de type a protege contre une injection létale de l'organisme portant des flagelles de type a et non de type b, et que les anticorps antiflagelles de type b protègent les souris injectées avec des souches portant des flagelles de type b, mais non de type a.
EXEMPLE 9.-
L'exemple 9 illustre la reactivit croisee des anticorps humains antiflagelles 20H11, 3C1 et 21B8 avec des isolats cliniques de P. aeruginosa.
Des isolats cliniques de P. aeruginosa (115) obtenus dans des hôpitaux et cliniques et isolés primitivement à partir de plaies brûlées et de sang ont été identifiés comme portant des flagelles de type a ou de type b, en typant avec les anticorps monoclonaux murins FA6 IIG5 ou PaF4 IVES (voir exemples 2,3 et 5).
Cinquante-cinq des isolats cliniques ont été identifies comme portant des flagelles de type a par leur réaction avec l'anticorps monoclonal murin FA6 IIG5, et 59 ont été identifiés comme portant le type b par leur réaction avec l'anticorps monoclonal murin PaF4 IVE8.
La réactivité croisée de l'anticorps mono-
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clonal humain antiflagelles de type a, 21B8, était --considerrabte de-s-- 56-isolats-clintques-portant -frageTTes (96%). de 20Hll avec les isolats portantdes llesdetype du fat-que-t'anticorps-a-reconnu-54aussi du fait que 20Hll a reconnu tous les 59 isolats (100%).Aucontraire,l'autreanticorpsmonoclonal - antiflagelles de type 3CI, se liait uniquement a 43 des 59 isolats (73%). Ces résultats démontrent que
EMI60.2
un-äpi-ton ,-e épitoge sur au moins environ 95% des souches pan-r & act-if- (-cle-st---ä--d-i-r-e-unflagellées de P. aeruginosa), tandis que 3C1 se lie à un épi tope non présent sur toutes les molécules de flagelline de type b.
Bien que l'antigene des flagelles de type b apparaisse sérologiquement uniforme quand il est analysé avec des antisérums polyclonaux (Lanvi, B., supra, et Ansorg R., supra), les modèles de réactivité croisée de 20Hll et de 3C1 montrent de façon surprenante que le type b des flagelles comprend au moins deux épi topas séparés qui peuvent être identifies par anticorps monoclonaux.
La réactivité croisée considérable des anticorps 21B8 et 20H11 avec les isolats cliniques de P. aeruginosa indique l'utilité clinique particulière de ces anticorps dans l'immunothérapie des infections à P. aeruginosa.
EXEMPLE 10. -
L'exemple 10 illustre des procédés pour la production d'un autre anticorps monoclonal humain exemplaire qui se lie aux flagelles de type b de P. aeruginosa, de même que l'activite protectrice de l'anticorps contre l'infection par P. aeruginosa sur
EMI60.3
modèle de souriS
Une lignée de cellules transformées a été préparée et clones essentiellement comme décrit dans
<Desc/Clms Page number 61>
EMI61.1
l'exemple 7, excepté que le mélange de cellules - de 2250 CMSPE- par puits. Les surnageants ont été initialement testés par ELISA sur le rassemblement flagellé comme décrit dans l'exemple 6, excepte que les souches
EMI61.2
- jmmytTrher-tet yTCµ--du rassemblement.
Les puits positifs ont té ensuite sur souche du rassemblement- --eompenant & trypes--Fisher -4T-E < a-lgnee cellules isolées finalement et l'anticorps monoclonal (isotype IgG) sont tous deux identifiés par la désignation 12D7 dans le texte ci-après.
L'anticorps monoclonal humain 12D7 a révélé une réactivité croisée considérable avec des isolats de type a, en reconnaissant 54 des 56 isolats cliniques portant des flagelles de type a testés (96%). L'activité protectrice de l'anticorps monoclonal 12D7 ressort du tableau VI. Les etudes de protection ont été réalisees essentiellement comme décrit dans l'exemple 4, excepté que La-dose injectée était de 1 DLIOO et que la-- souche injectée était 1624, qui est un isolat clinique exprimant l'immunotype Fisher 2 LPS et le type a des flagelles.
<Desc/Clms Page number 62>
EMI62.1
TABLEAU VI Etude de la protection par I*anticorj2s humain i2D7 antlflaqelles tsne a dans le modèle de souris brûlée
EMI62.2
<tb>
<tb> monoclonalPourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9---
<tb> 12D7,
<tb> humain,
<tb> antiflagelles <SEP> a <SEP> - <SEP> 100 <SEP> -1-00 <SEP> 100 <SEP> -100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 2H9,
<tb> humain
<tb> anti-Fisher <SEP> 2 <SEP> LPS <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90
<tb> 11G5
<tb> murin
<tb> antiflagelles <SEP> a <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 15F4
<tb> humain,
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 37,
<SEP> 5 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb>
Les souris ont été infectées sous escarre par
1 DLloo (950 CFU) de P. aeruginosa.
2. Le pourcentage de survie est bas sur le nombre de souris survivantes par groupe de dix animaux, excepté pour le groupe 15F4 où N=8. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
3. L'anticorps purifié (50 g dans 0, 5 ml de PBS) a été administré par voie' intraperitoneale avant la brûlure et l'injection infectante.
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EMI63.1
EXEMPLE L.Eexemple anticorps flagelles de type b de P.. aeruginosa et la protection de souris immuniseespassivement par cet anticorps contre une infection par injection de P. aeruginosa sur modèle de
EMI63.2
souris-brulée.--------=-------Une lignée de cellules a été préparée et clonée essentiellement comme dans -----lexemple -sau-que-le-Fappt-de-1A2 üJres-Bpour la transformation d'environ 60 et que le transforméesmélange de cellules transformées a été mis sur plaque dans 15 plaques à une concentration d'environ 1930 CMSPE- par puits.
De même, les cellules ont été testées sur un rassemblement de souches de P. aeruginosa comprenant G98 (immunotype Fisher 3, flagelles de type a) et 1739 (un isolat clinique de l'immunotype Fisher 5, flagelles de type b) et confir- mees sur un rassemblement différent de souches de P. aeruginosa : 1277, G98, 1739 et les immunotypes Fisher-F2, F4, F6 et F7. La lignée de cellul-es isolées finalement et l'anticorps monoclonal sécrété (isotype IgGl) sont tous deux désignés sous l'appellation 2B8 dans le texte ci-après.
Un test d'itumunofluorescence realise avec 2B3 a été positif sur une souche à flagelle de type b immunotype Fisher 2, mais négatif sur une souche de reference a flagelle de type a, immunotype Fisher 4. Dans le test d'isolats cliniques 59/59 (100%) des isolats flagelles de type b se sont révélés positifs.
L'activiste protectrice de 2B8 ressort du tableau VII. Les etudes de protection ont été réalisées comme décrit dans l'exemple 10, excepté que l'isolat clinique F164 (immunotype Fisher 4, flagelles de type b) a été utilisé pour l'infection par injection.
<Desc/Clms Page number 64>
TABLEAU VII
EMI64.1
"Etüde par humain 288 antiflael1es type de souris brûlée
EMI64.2
<tb>
<tb> Pourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> 2B8,
<tb> humain, <SEP> - <SEP>
<tb> antiflagelles <SEP> b3 <SEP> 100 <SEP> 89 <SEP> 89 <SEP> 89 <SEP> 89 <SEP> 89 <SEP> 89 <SEP> 89 <SEP> 89
<tb> PaF4 <SEP> IVES,
<tb> murin
<tb> antiflagelles <SEP> b4 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90
<tb> VH3,
<tb> murin
<tb> anti-Fisher <SEP> 2 <SEP> LPS4 <SEP> 90 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb>
1. Les souris ont été infectées sous escarre par
1 DLIOO (105 CFU) de P. aeruginosa.
2. Le pourcentage de survie est basé sur le nombre de souris survivantes par groupe de dix animaux, excepté pour le groupe 2B8 où N=9. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
3. L'anticorps purifie (50 g dans 0, 5 ml de PBS) a été administre par voie intraperitoneale avant la brûlure et l'injection infectante.
4. L'anticorps purifié (5 g dans 0,5 ml de PBS) a été administré par voie intraveineuse deux heures avant la brûlure et l'injection infectante.
<Desc/Clms Page number 65>
EMI65.1
. Qpg la production d'un un autre anticorps monoclonal humain reactif avec P. aeruginosa ä flagelles de type b et la protection de souris immunisées passivement par cet anticorps contre une infection par injection de P. aeruginosa sur modèle de sourisbrûlée.
Une lignée de cellules transformées a été preparee et clonée essentiellement comme décrit dans
EMI65.2
----- ) c" UnTihdividu-different a été immunisé et al., : tr'45 : 309 : 1 et a servi de source de cellules B, et le nombre de CMSPE- était d'environ 2.000 cellules par puits pour la mise sur plaque. L'examen a été réalisé sur les immunotypes Fisher 1 à 7 rassembles. La lignée de cellules isolées finalement et l'anticorps mono- clonal secrete (isotype IgG) sont tous deux désignés sous l'appellation 14C1 dans le texte ci-après.
Au test clinique, 59/59 (100%) des isolats flagelles de type b se sont révélés positifs avec 14C1.
- Les etudes de protection ont été réalisées comme décrit à l'exemple 11 ci-dessus et sont indiquées au tableau VIII.
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TABLEAU VIII
EMI66.1
Etüde protection Etud w humain 14C1 antiflagelles type b le modèle de souris brûlée.
EMI66.2
<tb>
<tb> de <SEP> laPourcentage <SEP> de <SEP> survie <SEP> par <SEP> jour2
<tb> Traitement <SEP>
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 314Cl,
<tb> humain,
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 90
<tb> PaF4 <SEP> IVE8,
<tb> murin
<tb> antiflagelles <SEP> b <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> VH3
<tb> humain
<tb> anti-Fisher <SEP> 2 <SEP> LPS <SEP> 100 <SEP> 40 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb>
1.
Les souris ont été infectées sous escarre par
EMI66.3
1 DLIOO (90 CFU) de P. aeruginosa F164.
2. Le pourcentage de survie est basé sur le nombre de ¯souris par groupe de survivantesexcepté pour le groupe PaF4 IVE8 où N=9. Les jours sont après brûlure et injection infectante.
3. L'anticorps purifie zo dans 0, 5 ml de PBS) a été administré par voie intrapéritonéale avant la brûlure et l'injection infectante.
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11 ressort de ce qui précède que les lignées --de-c ente nvent tttruent-d & s-moyenspour fragments de ceux-ci qui sont réactifs avec les FTagellesdeV. croisée contre diverses souches de P. aeruginosa. Chose surprenante-deaembr. antricorps aeti-fs--= avec pitopesdjLjEferentssur flagelles ont été isolés. Les anticorps de la presente e H. inventionpermettentdeproduiredefaçonplusaiséeet économique des compositions prophylactiques et thérapeutiques pour l'utilisation contre des infections dues à la plupart des souches de P. aeruginosa. De plus, les lignées de cellules fournissent des anticorps qui trouvent des applications dans les tests immunologiques et d'autres modes opératoires bien connus.
Les lignées d'hybridomes de souris PaF4IVE8 et FA6 IIG5 citées dans les exemples 2 et 3 ont été déposées & l'A. T. C. C. le 20 juin 1986 sous les réfé-
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rences HB9129 et HB9130, respectivement.
Les lignees humaines 20Hll et 2188 citees dans les exemples 6 et 7 ont été déposées à l'A. T. C. C. le 23 décembre 1986 sous les références CRL 9300 et CRL 9301, respectivement.
Les 1ignées de cellules lymphoblastoldes humaines 12D7, 2B8 et 14C1 citees dans les exemples 10, 11 et 12 ont été déposées à l'A. T. C. C. le 12 mai 1987 sous les références CRL 9422, CRL 9423 et CRL 9424, respectivement.
Bien que la présente invention ait été décrite avec différents dEtails par voie d'illustration et d'exemples dans un but de clarté et comprehension, il est evident qu'elle est susceptible de diverses variantes et modifications sans sortir de son cadre.