JPS60256384A - ストレプトミセスプラスミドｐｓｇ５ - Google Patents
ストレプトミセスプラスミドｐｓｇ５Info
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- JPS60256384A JPS60256384A JP60064033A JP6403385A JPS60256384A JP S60256384 A JPS60256384 A JP S60256384A JP 60064033 A JP60064033 A JP 60064033A JP 6403385 A JP6403385 A JP 6403385A JP S60256384 A JPS60256384 A JP S60256384A
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- streptomyces
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明バストレフトマイシスガーナエンシス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ ） ＤＳＭ
２９３２から単離されうる新規プラスミドｐｓｏ ５
、ならびにプラスミドベクター例えばストレプトミセ
ス菌株と他の微生物との間のシャトルベクター調製のだ
めのこのプラスミドの使用に関する。
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ ） ＤＳＭ
２９３２から単離されうる新規プラスミドｐｓｏ ５
、ならびにプラスミドベクター例えばストレプトミセ
ス菌株と他の微生物との間のシャトルベクター調製のだ
めのこのプラスミドの使用に関する。
公開番号第６６．７０１のヨーロッパ特許出願にハ、ス
トレプトマイシスガーナエフシス株ＡＴＣＣ１４，６７
２から単離されたストレプトミセスプラスミドｐＳＧ
２が開示されている。このプラスミドは内因性プラスミ
ドなのでストレプトマイシス・ガーナエンシス中に挿入
されるべきプラスミドベクターを構成するのに適する。
トレプトマイシスガーナエフシス株ＡＴＣＣ１４，６７
２から単離されたストレプトミセスプラスミドｐＳＧ
２が開示されている。このプラスミドは内因性プラスミ
ドなのでストレプトマイシス・ガーナエンシス中に挿入
されるべきプラスミドベクターを構成するのに適する。
今や、ｐＳＧ５と呼ばれる表示されるプラスミトカスト
レプトマイシスガーナエンシス株ＤｓＭ２９３２中に出
現することが見出された。このプラスミドは制限部位（
第１表）および制限地図（第１図）により特徴づけられ
る。
レプトマイシスガーナエンシス株ＤｓＭ２９３２中に出
現することが見出された。このプラスミドは制限部位（
第１表）および制限地図（第１図）により特徴づけられ
る。
第 １ 表
選択された制限酵素に対するｐｓＧ ５プラスミド中に
おける切断点の数 Ｋｐｎｌ Ｑ Ｂｇｌ Ｉ ０ Ｈｐａ ｒ 。
おける切断点の数 Ｋｐｎｌ Ｑ Ｂｇｌ Ｉ ０ Ｈｐａ ｒ 。
ＨｉｎｄｌＩＩ ０
Ｃ１ａｌ Ｑ
ＥｃｏＲＶ １
ＥｃｏＲＩ １
Ｘｈｏｌ Ｉ
Ｂｃｌｌ １
Ｓｐｈｌ ２
Ｂｇｌ ｎ２
Ｐｓｔｌ ３
Ｓａｉｌ ＞５
Ｓｓｔｌｌ ＞５
Ｓｍａｌ ＞６
ＢａｍＨＩ ン７
１細胞当り１０〜２０個のプラスミドが包含される。こ
のプラスミドは約１２．７キロ塩基対（以下ｋｂと略記
する）の分子長さを有し従ってｐｓＧ２より幾分短い。
のプラスミドは約１２．７キロ塩基対（以下ｋｂと略記
する）の分子長さを有し従ってｐｓＧ２より幾分短い。
ハイブリット形成データではｐＳＧ ２とｐｓＧ ５と
の間には何ら関連性が存在しないことが示される。
の間には何ら関連性が存在しないことが示される。
幾分小さめの寸法とは別に、ｐｓＧ５は制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ 、 ＥｃｏＲＶ、 ＸｈｏｌおよびＢｃｌｌに対
する少くとも４個の独特の切断点を有することによりｓ
ＰＧ ２と区別される。従ってこのプラスミドを遺伝子
工学目的１例えばプラスミドベクターの構成に使用する
いくつかの可能な方法が存在する。
ＲＩ 、 ＥｃｏＲＶ、 ＸｈｏｌおよびＢｃｌｌに対
する少くとも４個の独特の切断点を有することによりｓ
ＰＧ ２と区別される。従ってこのプラスミドを遺伝子
工学目的１例えばプラスミドベクターの構成に使用する
いくつかの可能な方法が存在する。
さらに、ｐｓＧ５が拡大された宿主範囲を有することも
見出された。例えばｐｓＧ ５から調製されたプラスミ
ドベクターはストレプトマイシスリビダンス（Ｓ、 １
ｉｖｉｄａｎｓ ）およびストレプトマイシスゲイシレ
ンシス（Ｓ、 ｇｅｙｓｉｒｅｎｓｉｓ ）に形質転換
しうる。
見出された。例えばｐｓＧ ５から調製されたプラスミ
ドベクターはストレプトマイシスリビダンス（Ｓ、 １
ｉｖｉｄａｎｓ ）およびストレプトマイシスゲイシレ
ンシス（Ｓ、 ｇｅｙｓｉｒｅｎｓｉｓ ）に形質転換
しうる。
もう一つの利点は、ｐＳＧ５が他のストレプトミセス科
レプリコン、例えばストレプトマイシスガーナエンシス
からのプラスミドＪ）ＳＧ ２ 、ストレプトマイシス
ベネズエラ（Ｓ、 ｖｅｎｅｚ、ｕｅｌａｅ ）ＤＳＭ
４０７５５からノｐｓＶＨ１（ヨー ｏツバ特許出願
公開番号第７０，５２２号）、ストレプトマイシスリビ
ダンスからの５ＬＰ１，２Ｃ米国特許第４．３６０，５
９７号、シー・ジエー・トンプソン（Ｃ。
レプリコン、例えばストレプトマイシスガーナエンシス
からのプラスミドＪ）ＳＧ ２ 、ストレプトマイシス
ベネズエラ（Ｓ、 ｖｅｎｅｚ、ｕｅｌａｅ ）ＤＳＭ
４０７５５からノｐｓＶＨ１（ヨー ｏツバ特許出願
公開番号第７０，５２２号）、ストレプトマイシスリビ
ダンスからの５ＬＰ１，２Ｃ米国特許第４．３６０，５
９７号、シー・ジエー・トンプソン（Ｃ。
、ｒ、 ＴｈＯｍｐ８０ｎ ） 、ジエー・エム・ウオ
ード（Ｊ、Ｍ。
ード（Ｊ、Ｍ。
Ｗａｒｄ）およびディー・ニー・ホップウッド（Ｄ。
Ａ、 Ｈｏｐｗｏｏｄ ）氏の［ネーチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ ） Ｊ第２８６巻第５２５頁（１９８０年）、シ
ー・ジエー・トンプソン、ティー・ギーザー（Ｔ、 Ｋ
ｉｅｓｅｒ ） 、ジエーリ ・エム・ウオードおよびディー・ニー・ホップウッド氏
の「ジーン（ｇｅｎｅ ） Ｊ第２０巻第５１頁（１９
８２年）参照〕およびストレプトマイシスリビダンスか
らのｐ工Ｊ１０１〔ティー・キーザーーディー・ニー・
ホップウッド、エッチ・エム・ライト（Ｈ，Ｍ、 Ｗｒ
ｉｇｈｔ ）およびシー・ジエー・トムソン（Ｃ，Ｊ、
Ｔｈｏｍｓｏｎ ）氏の「モル・ゲン・ゲネト（Ｍｏ
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ、ｔ’） Ｊ第１８５巻第２
２３頁（１９８２年）〕と相溶性を有することである。
ｒｅ ） Ｊ第２８６巻第５２５頁（１９８０年）、シ
ー・ジエー・トンプソン、ティー・ギーザー（Ｔ、 Ｋ
ｉｅｓｅｒ ） 、ジエーリ ・エム・ウオードおよびディー・ニー・ホップウッド氏
の「ジーン（ｇｅｎｅ ） Ｊ第２０巻第５１頁（１９
８２年）参照〕およびストレプトマイシスリビダンスか
らのｐ工Ｊ１０１〔ティー・キーザーーディー・ニー・
ホップウッド、エッチ・エム・ライト（Ｈ，Ｍ、 Ｗｒ
ｉｇｈｔ ）およびシー・ジエー・トムソン（Ｃ，Ｊ、
Ｔｈｏｍｓｏｎ ）氏の「モル・ゲン・ゲネト（Ｍｏ
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ、ｔ’） Ｊ第１８５巻第２
２３頁（１９８２年）〕と相溶性を有することである。
従ってｐｓＧ ５はすでＫこれらプラスミドの１種を担
持する菌株中にも付加的に挿入されうる。
持する菌株中にも付加的に挿入されうる。
個々の遺伝子が異なるプラスミド中にクローニングされ
そして１個の同じ細胞中に挿入される場合このことは重
要である。その上異なるコピー数の両立しうるベクター
プラスミドの存在によ＃）１個のストレプトミセス菌株
中において異’１７ｙ＊（Ｄ＠ｋ（Ｄａ＆“０１”８５
”１容−ｇｉ 、ｉる。生合成経路の研究ならびに収量
の最適化９ために異なる適合性を有するプラスミドベク
ターの存在が決定的に重要である。
そして１個の同じ細胞中に挿入される場合このことは重
要である。その上異なるコピー数の両立しうるベクター
プラスミドの存在によ＃）１個のストレプトミセス菌株
中において異’１７ｙ＊（Ｄ＠ｋ（Ｄａ＆“０１”８５
”１容−ｇｉ 、ｉる。生合成経路の研究ならびに収量
の最適化９ために異なる適合性を有するプラスミドベク
ターの存在が決定的に重要である。
トランスポゾン突然変異生成およびクローニングにより
、複製領域が最も大きいＢａｍＨＩ断片（４，４５ｋｂ
）上に、即ち第１図に相当する１〜３ｋｂの範囲に存在
することが見出された。従ってストレプトミセス中で複
製するベクターの構成にとってこの「必須領域」は充分
である。
、複製領域が最も大きいＢａｍＨＩ断片（４，４５ｋｂ
）上に、即ち第１図に相当する１〜３ｋｂの範囲に存在
することが見出された。従ってストレプトミセス中で複
製するベクターの構成にとってこの「必須領域」は充分
である。
前記した４、４５ｋｂの長さのＢａｍＨＩ断片は１例え
ばこの「ミニマルレプリコン」の構成に適当である。こ
の断片を環化させると、得られたプラスミドはＢｃｌｌ
、 ５ｐｈｌ 、 ＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＩおよ
びＸｈｏ Ｉに対する独特の切断点により区別される。
ばこの「ミニマルレプリコン」の構成に適当である。こ
の断片を環化させると、得られたプラスミドはＢｃｌｌ
、 ５ｐｈｌ 、 ＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＩおよ
びＸｈｏ Ｉに対する独特の切断点により区別される。
後者の４種類の切断点についてはこれらがクローニング
に用いられうろことが示されている。
に用いられうろことが示されている。
その上、この断片上にもＰｖｕ ＩＩに対する切断点（
第１図に示された１２．６，３．２および３．６ ｋｂ
における）が存在（−１これらは「必須領域」の外に在
り従つてクローニングにまたけ一層の短縮に利用しうる
。さらに５ｓｔＴＩに対する切断点（第１図の０．６゜
１．８および３．６５ｋｂにおける）も見出され、その
うち中央の１つは恐らく「必須領域」中に存在する。そ
の他に少くとも５個の５ａｌＩ切断点が存在する。
第１図に示された１２．６，３．２および３．６ ｋｂ
における）が存在（−１これらは「必須領域」の外に在
り従つてクローニングにまたけ一層の短縮に利用しうる
。さらに５ｓｔＴＩに対する切断点（第１図の０．６゜
１．８および３．６５ｋｂにおける）も見出され、その
うち中央の１つは恐らく「必須領域」中に存在する。そ
の他に少くとも５個の５ａｌＩ切断点が存在する。
４、４５ ｋｂのＢａｍＨＩ断片をチオストレプトン抵
抗性遺伝子（ｔｓｒ）を有するプラスミドル工Ｊ６〔ト
ンプソ：ｙ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ）氏他のネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ ）の前記引用個所参照〕から得られる
１、 １ ｋｂのＢｃｌｌ断片と連結させると、ノ・イ
ブリッドプラスミドｐＧＭ １が得られ、このものはス
トレプトミセス中で複製しそしてそのチオストレプトン
抵抗性のゆえに容易に選択されうる１１％にｚｃｏＲｆ
およびＸｈｏ Ｉの独特の切断点は外来遺伝子の挿入に
利用しうる。第２図はｐＧＭ １の制限地図を示す（こ
こでレプリコン中６個の５ａｌｌ切断点のみが地図に示
される）。
抗性遺伝子（ｔｓｒ）を有するプラスミドル工Ｊ６〔ト
ンプソ：ｙ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ）氏他のネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ ）の前記引用個所参照〕から得られる
１、 １ ｋｂのＢｃｌｌ断片と連結させると、ノ・イ
ブリッドプラスミドｐＧＭ １が得られ、このものはス
トレプトミセス中で複製しそしてそのチオストレプトン
抵抗性のゆえに容易に選択されうる１１％にｚｃｏＲｆ
およびＸｈｏ Ｉの独特の切断点は外来遺伝子の挿入に
利用しうる。第２図はｐＧＭ １の制限地図を示す（こ
こでレプリコン中６個の５ａｌｌ切断点のみが地図に示
される）。
例えばプラスミドｐＧＭ１をＸｈＯｌで開環させそして
ストレプトミセス中および大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）中
において有効なネオマイシン抵抗性遺伝子ａｐｈ■を担
持する２、 ５５ ｋｂのＴｎ ５からのＸｈｏ ｌ断
片〔ヨルジンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ）代地の「モ
ル・ジン・ゲネト（Ｍｏ１． ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
） Ｊ第１７７巻第６５頁（１９７７年）、およびエ
フ・ジエー・ドブルージン（Ｆ、 Ｊ、 ｄｅ Ｂｒｕ
ｉｊｎ ）およびジエー・アール・ラプスキー（Ｊ、
Ｒ，Ｌｕｐｓｋｉ ）氏の「ジーン（ｏｅｎｅ）Ｊ第２
７巻第１３１頁（１９８４年）参照」と連結すると、ハ
イブリッドシラスミドｐＧＭ ２が得られる（第６図、
レプリコン中３個の５ａｌｌ 切断点のみが地図に示さ
れる）。このプラスミドはかくの如くストレプトミセス
中に５） おいて有効な２種類のマーカーを有しておりそしてその
分子寸法ａ１ｋｂおよびＥｃｏＲＩ 、 ＢｉｎｄＩＩ
Ｉ 、Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｃ１ａ ＩおよびＥｃｏＲＶ
に対し独特の切断点を有していて良好なりローニングベ
クターである。Ｂｇｌｒｌ切断点はａｐｈｎ遺伝子中に
存在し、一方ＣｏａｌおよびＥｃｏＲＶはｔｓｒ遺伝子
の内部を切断する。かくの如くこれらの酵素を用いるク
ローニングは挿入不活性化により容易に立証されうる。
ストレプトミセス中および大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）中
において有効なネオマイシン抵抗性遺伝子ａｐｈ■を担
持する２、 ５５ ｋｂのＴｎ ５からのＸｈｏ ｌ断
片〔ヨルジンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ）代地の「モ
ル・ジン・ゲネト（Ｍｏ１． ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
） Ｊ第１７７巻第６５頁（１９７７年）、およびエ
フ・ジエー・ドブルージン（Ｆ、 Ｊ、 ｄｅ Ｂｒｕ
ｉｊｎ ）およびジエー・アール・ラプスキー（Ｊ、
Ｒ，Ｌｕｐｓｋｉ ）氏の「ジーン（ｏｅｎｅ）Ｊ第２
７巻第１３１頁（１９８４年）参照」と連結すると、ハ
イブリッドシラスミドｐＧＭ ２が得られる（第６図、
レプリコン中３個の５ａｌｌ 切断点のみが地図に示さ
れる）。このプラスミドはかくの如くストレプトミセス
中に５） おいて有効な２種類のマーカーを有しておりそしてその
分子寸法ａ１ｋｂおよびＥｃｏＲＩ 、 ＢｉｎｄＩＩ
Ｉ 、Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｃ１ａ ＩおよびＥｃｏＲＶ
に対し独特の切断点を有していて良好なりローニングベ
クターである。Ｂｇｌｒｌ切断点はａｐｈｎ遺伝子中に
存在し、一方ＣｏａｌおよびＥｃｏＲＶはｔｓｒ遺伝子
の内部を切断する。かくの如くこれらの酵素を用いるク
ローニングは挿入不活性化により容易に立証されうる。
プラスミドｐＳＧ ５および「必須領域」を含有するそ
の短縮物はいわゆるシャトルベクターの構成にも適する
。例えばプラスミドｐｓＧ ５を大腸菌プラスミドｐＡ
ＣＹ０１８４またはｐＢＲ３２５と融合させると、ハイ
ブリッドプラスミドは大腸菌中においてのみならずスト
レプトマイシスｆｌｌｆ％にス）Ｌ／’；”）マイシス
ゲイシレンシス（Ｓ、 ｇｅｙ−ｓｉｒｅｎｓｉｓ）お
よびストレプトマイシスリビダンス中においても増殖し
うる。
の短縮物はいわゆるシャトルベクターの構成にも適する
。例えばプラスミドｐｓＧ ５を大腸菌プラスミドｐＡ
ＣＹ０１８４またはｐＢＲ３２５と融合させると、ハイ
ブリッドプラスミドは大腸菌中においてのみならずスト
レプトマイシスｆｌｌｆ％にス）Ｌ／’；”）マイシス
ゲイシレンシス（Ｓ、 ｇｅｙ−ｓｉｒｅｎｓｉｓ）お
よびストレプトマイシスリビダンス中においても増殖し
うる。
プラスミドｐＡＣＹ０１８４ （シャンク（Ｃ’ｈａｎ
ｇ）代地、「ジエー・バクチリオル（、ｒ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）」第１６４巻第１１４１頁（１９７８年
）参照〕をＢＣＩ Ｉを用いて開環させそして直線状、
とされたプラスミドをプラスミドｐＩＪ ６からの１．
１ ｋｂのＢｃｌＩ断片と連結させるとハイブリッドプ
ラスミドｐＳＬＥ４１が得られる。
ｇ）代地、「ジエー・バクチリオル（、ｒ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）」第１６４巻第１１４１頁（１９７８年
）参照〕をＢＣＩ Ｉを用いて開環させそして直線状、
とされたプラスミドをプラスミドｐＩＪ ６からの１．
１ ｋｂのＢｃｌＩ断片と連結させるとハイブリッドプ
ラスミドｐＳＬＥ４１が得られる。
例えばプラスミドｐ８Ｇ ５およびｐＦ３ＬＥ４１ ヲ
それらのＥｃｏＲＩ切断点を介して融合させるとハイブ
リッドプラスミドｐｓｗ ３４４Ｋ （第５図参照）が
得られ、このものは大腸菌中においてはｐＡＣＹ０１８
４レプリコンゆえにそしてまたストレプトミセス中にお
いてはｐｓＧ ５レプリコンゆえに安定に複製される。
それらのＥｃｏＲＩ切断点を介して融合させるとハイブ
リッドプラスミドｐｓｗ ３４４Ｋ （第５図参照）が
得られ、このものは大腸菌中においてはｐＡＣＹ０１８
４レプリコンゆえにそしてまたストレプトミセス中にお
いてはｐｓＧ ５レプリコンゆえに安定に複製される。
大腸菌中における選択はｐＡＣＹ０１８４部分のテトラ
サイクリン抵抗性により行われ、一方ストレプトミセス
中における選択にはチオストレプトン抵抗性が用いられ
うる。従ってプラスミドｐｓＷ３４４Ｅは大腸菌とスト
レプトミセス株との間の理想的なシャトルベクターであ
る。外来ＤＮＡのクローニングにはなかんずく制限部位
Ｘｈｏｌ 、 ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌｌｌが利用
できる。
サイクリン抵抗性により行われ、一方ストレプトミセス
中における選択にはチオストレプトン抵抗性が用いられ
うる。従ってプラスミドｐｓＷ３４４Ｅは大腸菌とスト
レプトミセス株との間の理想的なシャトルベクターであ
る。外来ＤＮＡのクローニングにはなかんずく制限部位
Ｘｈｏｌ 、 ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌｌｌが利用
できる。
シャトルベクターの長所は、大腸菌中におけるクローニ
ングされたストレプトミセス遺伝子が遺伝子工学的に修
飾されそしてその機能がストレフトミセス細胞中にパッ
クトランスファー後に検査されうろことにある。
ングされたストレプトミセス遺伝子が遺伝子工学的に修
飾されそしてその機能がストレフトミセス細胞中にパッ
クトランスファー後に検査されうろことにある。
ｐ８ＬＥ４１をＢａｍＨＩで開環させそしてｐｓＧ ５
の４．４５ ｋｂ ＢａｍＨｌ断片と連結させると、ハ
イブリッドプラスミドｐＧＭ １０１が得られる（第６
図参照。
の４．４５ ｋｂ ＢａｍＨｌ断片と連結させると、ハ
イブリッドプラスミドｐＧＭ １０１が得られる（第６
図参照。
ここでレプリコン中３個の５ａｌｌ切断点のみが地図に
示される）。このプラスミドは必須でない領域中にＨｌ
ｎｄ ＩＩＩおよびＸｈｏｌの独特の切断点を有する。
示される）。このプラスミドは必須でない領域中にＨｌ
ｎｄ ＩＩＩおよびＸｈｏｌの独特の切断点を有する。
選択に利用できるマーカーはクロラムフェニコール抵抗
性（大腸菌中およびチオストレプトン抵抗性（ストレプ
トマイシス中）である。分子寸法は９．９ｋｌ：＋であ
る。
性（大腸菌中およびチオストレプトン抵抗性（ストレプ
トマイシス中）である。分子寸法は９．９ｋｌ：＋であ
る。
ｐＧＭｌｏｌから１ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ −Ｘｈｏ
Ｉ断片をとり出しそしてその代りにネオマイシンに対
するａｐｈＩＩ抵抗性遺伝子を担持するＴｎ ５からの
１．６ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏｌ断片を挿入す
ると、ハイブリッドプラスミドｐＧＭ１０２が生成され
る（第７図参照、ここでレプリコン中には３個のＳａｌ
ｌ切断点のみが図示される）。こめものは大腸菌中お
よびストレプトマイシスリビダンス中で複製する。大腸
菌における選択にはクロラムフェニコール抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できそしてストレプトマイシ
スリビダンスにおいてはチオストレプトン抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できる。クローニングするに
は大腸菌においてはＥＣ０ＲＩの独特の切断点（クロラ
ムフエ警 ニコール抵抗性の不活性化〕およびＢｇｌｌ
ｌの独特の切断点（ネオマイシン抵抗性の不活性化）が
役立てられ、そしてストレプトミセスにおいてはＥｃｏ
ＲＶの切断点（チオストレプトン抵抗性の不活性化）お
よび同じ（Ｂｇｌｌｌのそれが用いられ、その他にＨｉ
ｎｄｌＩＩおよびＸｈｏ Ｉの独特の切断点も用いられ
る。
Ｉ断片をとり出しそしてその代りにネオマイシンに対
するａｐｈＩＩ抵抗性遺伝子を担持するＴｎ ５からの
１．６ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏｌ断片を挿入す
ると、ハイブリッドプラスミドｐＧＭ１０２が生成され
る（第７図参照、ここでレプリコン中には３個のＳａｌ
ｌ切断点のみが図示される）。こめものは大腸菌中お
よびストレプトマイシスリビダンス中で複製する。大腸
菌における選択にはクロラムフェニコール抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できそしてストレプトマイシ
スリビダンスにおいてはチオストレプトン抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できる。クローニングするに
は大腸菌においてはＥＣ０ＲＩの独特の切断点（クロラ
ムフエ警 ニコール抵抗性の不活性化〕およびＢｇｌｌ
ｌの独特の切断点（ネオマイシン抵抗性の不活性化）が
役立てられ、そしてストレプトミセスにおいてはＥｃｏ
ＲＶの切断点（チオストレプトン抵抗性の不活性化）お
よび同じ（Ｂｇｌｌｌのそれが用いられ、その他にＨｉ
ｎｄｌＩＩおよびＸｈｏ Ｉの独特の切断点も用いられ
る。
この種のシャトルベクターは「ストレプトミセスレプリ
コンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリッドプラ
スミド」なる名称を有する同日出願の西ドイツ特許出願
Ｐ ３４１２０９３．９号の目的物である。これらはス
トレプトミセスプラスミドについて米国特許第４，２７
３．８７５ 号、 同第４，３３２，９００号、同第４
，３３８，４００号、同第４．３４０，６７４号、同第
４，３４３，９０６号、同第４．３６２，８１６号、同
第４，３６２，８１７号、同第４．３９３，１３７号、
同第４，４０１，７６１号および同第４．４１６，９９
４号に記載されているように抗生物質、酵素または生物
学的に活性なポリはプチドの調製に適する。
コンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリッドプラ
スミド」なる名称を有する同日出願の西ドイツ特許出願
Ｐ ３４１２０９３．９号の目的物である。これらはス
トレプトミセスプラスミドについて米国特許第４，２７
３．８７５ 号、 同第４，３３２，９００号、同第４
，３３８，４００号、同第４．３４０，６７４号、同第
４，３４３，９０６号、同第４．３６２，８１６号、同
第４，３６２，８１７号、同第４．３９３，１３７号、
同第４，４０１，７６１号および同第４．４１６，９９
４号に記載されているように抗生物質、酵素または生物
学的に活性なポリはプチドの調製に適する。
ストレプトマイシスガーナエンシスＤＳＭ ２９３２菌
株からのプラスミドｐｓＧ、 ５の単離は例えばヨーロ
ツ、Ｊ特許出願公開番号第６６，７０１号および同第７
０，５２２号に記載されているようにそれ自体知られた
方法で遂行されうる。菌株の培養は先にあげたヨーロツ
、０％許出願または米国特許第５．６７４，８６６号明
細書実施例２の記載に従い遂行されうる。
株からのプラスミドｐｓＧ、 ５の単離は例えばヨーロ
ツ、Ｊ特許出願公開番号第６６，７０１号および同第７
０，５２２号に記載されているようにそれ自体知られた
方法で遂行されうる。菌株の培養は先にあげたヨーロツ
、０％許出願または米国特許第５．６７４，８６６号明
細書実施例２の記載に従い遂行されうる。
下記の実施例により本発明をより詳細に説明する。百分
率の記載は別に断わりなければ重量によるものとする。
率の記載は別に断わりなければ重量によるものとする。
実施例 １
菌株培養
続いて溶解させるための培養には下記培地が適当である
。
。
酵母抽出物 ４ｇ 麦芽抽出物 ６ｇ グリッツ１０ｇ
罰、ＰＯ４２Ｆ グルコース １０．！ｉ’ Ｈ２Ｏ１
１に２ＨＰＯ４４，９スクロース３４０ｇＭｇ５Ｏ４０
，５，９グリシン ５１／グリシン Ｉ Ｏ＃ ＭｇＣ
ｌ２・６Ｈ２０１１）（２０１１Ｈ２Ｏ１１ ５００−のエレンマイヤーフラスコ中で栄養培地約１０
０ｄ中に均質化された単一コロニーを接種しそして軌道
振盪話中（１２０ｒｐｍ） ３０℃で２〜６日間保温培
養する。
罰、ＰＯ４２Ｆ グルコース １０．！ｉ’ Ｈ２Ｏ１
１に２ＨＰＯ４４，９スクロース３４０ｇＭｇ５Ｏ４０
，５，９グリシン ５１／グリシン Ｉ Ｏ＃ ＭｇＣ
ｌ２・６Ｈ２０１１）（２０１１Ｈ２Ｏ１１ ５００−のエレンマイヤーフラスコ中で栄養培地約１０
０ｄ中に均質化された単一コロニーを接種しそして軌道
振盪話中（１２０ｒｐｍ） ３０℃で２〜６日間保温培
養する。
実施例 ２
プラスミド単離
５日令の、均質化された液状培養物的５Ｄｔｔ／をベッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）冷却遠心器Ｊ：２１Ｃ型のＪ
Ａ−２０管中に収穫し７（１０分、 １１００００ｒｐ
、 ２５℃）そしてＴＥＳｕ （１０ｍＭ トリス−Ｈ
ＣＬ 、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）および１０チ
スクロース）中１回洗浄する。
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）冷却遠心器Ｊ：２１Ｃ型のＪ
Ａ−２０管中に収穫し７（１０分、 １１００００ｒｐ
、 ２５℃）そしてＴＥＳｕ （１０ｍＭ トリス−Ｈ
ＣＬ 、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）および１０チ
スクロース）中１回洗浄する。
細胞２ｇをリゾチーム溶液（０，３Ｍスクロース。
２５ｍＭ）リス−ＨＣｔ（ｐＨ８） 、 ２５ ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８）１４ダ／＋１１／リゾチーム）５−
中に再懸濁しそして３７℃で軌道振盪話中（１００ｒｐ
ｍ）で保温培養する。３０〜４５分後細胞をプロトプラ
ストに変換する。溶菌混合物（０，３Ｍ ＮａＯＨ，２
％ドデシル硫酸ナトリウム）２．５−を添加しそして直
ちに強く混合することにより細胞膜を溶解させそしてＤ
ＮＡを変性させる。１０分間加熱処理（７０℃）して溶
解および変性を完結させる。蛋白質を変性させそしてＤ
ＮＡを復元させるために室温で酸性フェノール／クロロ
ホルム溶液８００μｔを加エル（酸性フェノール／クロ
ロホルム溶液はクロロホルム５００ｉ、 Ｈ２Ｏ２００
ｒｎｌ、フェノール５００ｙおよびヒドロキシキノリン
０．５ｇを混合しそして下相を用いる）。この混合物を
振ｊｌ器〔ポルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ■）〕中約２０
秒間充分に混合しそして次に冷却遠心器でベレットとな
す（５分間、１２０００ｒｐｍ＋ ４℃）。
ＥＤＴＡ（ｐＨ８）１４ダ／＋１１／リゾチーム）５−
中に再懸濁しそして３７℃で軌道振盪話中（１００ｒｐ
ｍ）で保温培養する。３０〜４５分後細胞をプロトプラ
ストに変換する。溶菌混合物（０，３Ｍ ＮａＯＨ，２
％ドデシル硫酸ナトリウム）２．５−を添加しそして直
ちに強く混合することにより細胞膜を溶解させそしてＤ
ＮＡを変性させる。１０分間加熱処理（７０℃）して溶
解および変性を完結させる。蛋白質を変性させそしてＤ
ＮＡを復元させるために室温で酸性フェノール／クロロ
ホルム溶液８００μｔを加エル（酸性フェノール／クロ
ロホルム溶液はクロロホルム５００ｉ、 Ｈ２Ｏ２００
ｒｎｌ、フェノール５００ｙおよびヒドロキシキノリン
０．５ｇを混合しそして下相を用いる）。この混合物を
振ｊｌ器〔ポルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ■）〕中約２０
秒間充分に混合しそして次に冷却遠心器でベレットとな
す（５分間、１２０００ｒｐｍ＋ ４℃）。
プラスミドを含有する上澄み液７−を次に超遠心器中で
さらに精製する。Ｃ５ＣＬ ７ ｇ 、溶解物７−およ
びエチジウムブロマイド溶液（３０■／−）０．２−を
混合しそして超遠心器〔コントロン（ＫＯＮＴＲＯＮ■
）ＴＧＡ５０］中３４００Ｏｒｐｍで４８時間遠心分離
する（２０℃）。プラスミドバンドをＵｖ熱照射より螢
光による視認可能となしそして注射器でとり出す。この
溶液を脱色および透析させるとさらに研究に使用できる
。このものは溶液２０μを当り約１μｇのプラスミドＤ
ＮＡを含有する。
さらに精製する。Ｃ５ＣＬ ７ ｇ 、溶解物７−およ
びエチジウムブロマイド溶液（３０■／−）０．２−を
混合しそして超遠心器〔コントロン（ＫＯＮＴＲＯＮ■
）ＴＧＡ５０］中３４００Ｏｒｐｍで４８時間遠心分離
する（２０℃）。プラスミドバンドをＵｖ熱照射より螢
光による視認可能となしそして注射器でとり出す。この
溶液を脱色および透析させるとさらに研究に使用できる
。このものは溶液２０μを当り約１μｇのプラスミドＤ
ＮＡを含有する。
実施例 ３
プラスミドの特徴づけ
ｐＳＧ ５ ＤＮＡを調製後電子顕微鏡で計測する。
標本は知られた方法で調製される〔リュー・フェルグソ
ン（Ｊ、 Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ）およびアール・ダブリ
ュー・デビス（Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ ）氏の［アドバ
ンスト・テクニクス・イン・バイオロジカル・エレクト
ロン・マイクロスコピー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ） ＩＩ Ｊ、シュプリ
ンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ）−出版、ベルリン、第１
２６頁（１９７８年）参照」。プラスミドの長さを測定
すると４．２μｍなる数字が得られる。
ン（Ｊ、 Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ）およびアール・ダブリ
ュー・デビス（Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ ）氏の［アドバ
ンスト・テクニクス・イン・バイオロジカル・エレクト
ロン・マイクロスコピー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ） ＩＩ Ｊ、シュプリ
ンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ）−出版、ベルリン、第１
２６頁（１９７８年）参照」。プラスミドの長さを測定
すると４．２μｍなる数字が得られる。
種々の酵素に対する制限部位の数を測定するためにｐｓ
Ｇ ５− ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼを用
い適当な培養条件下に１時間処理する（第２表参照）。
Ｇ ５− ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼを用
い適当な培養条件下に１時間処理する（第２表参照）。
第 ２ 表
制限条件
酵 素 培養温度 製造者 培養緩衝液（１０
ＢａｍＨＩ ３７ Ｂｏｅ
Ｂｇｌｌ ３７ Ｂｏｅ
Ｂｇｌ■ ５７ ＢＲＬ
ＢＣｌｌ ６０ Ｂｏｅ
ＥＣＯＲＩ ３７ Ｂｏｅ それぞれ製造ＥｃｏＲＶ
５７ Ｂｏｅ 者の推薦によりｌａｌ ５７ ＢＲＬる Ｈｌｎｄ ＩＩＩ ３７ Ｂｏｅ ＨｐａＴ ５７ Ｂｏｅ Ｋｐｎｌ ５７ ＢＲＬ Ｐｓｔｌ ３７ Ｂｏｅ Ｓａｌｌ ３７ ＢＲＬ Ｓｍａｌ ３７ Ｂｏｅ Ｓｐｈｌ ３７ Ｂｏｅ Ｓｓｔｌ ３７ ＢＲＬ Ｘｈｏ Ｉ ５７ ＢＲＬ Ｂｏｅ ＝ベーリンガーマンハイム、Ｍａｎｎｈｅｉｍ
ＢＲＬ ＝ ＢＲＬ 、Ｎｅｕ −Ｉｓｅｎｂｕｒｇ反
応混合物の総量は２０μｔであり１下記組成を有する。
５７ Ｂｏｅ 者の推薦によりｌａｌ ５７ ＢＲＬる Ｈｌｎｄ ＩＩＩ ３７ Ｂｏｅ ＨｐａＴ ５７ Ｂｏｅ Ｋｐｎｌ ５７ ＢＲＬ Ｐｓｔｌ ３７ Ｂｏｅ Ｓａｌｌ ３７ ＢＲＬ Ｓｍａｌ ３７ Ｂｏｅ Ｓｐｈｌ ３７ Ｂｏｅ Ｓｓｔｌ ３７ ＢＲＬ Ｘｈｏ Ｉ ５７ ＢＲＬ Ｂｏｅ ＝ベーリンガーマンハイム、Ｍａｎｎｈｅｉｍ
ＢＲＬ ＝ ＢＲＬ 、Ｎｅｕ −Ｉｓｅｎｂｕｒｇ反
応混合物の総量は２０μｔであり１下記組成を有する。
１０倍濃縮された培養緩衝液 ２μｔ
ＤＮＡ溶液（約０．５μＩのＤＮＡを含有） Ｘμを制
限酵素（１単位含有） １μｔ Ｈ２０１７−ｘμｔ ブロムフェノールブルー溶液５μｔの添加により反応を
停止させる。アガロースゲル電気泳動により断片を分離
する〔トリスアセテート緩衝液（０，０４Ｍ）リスアセ
テート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ ）中の１チアガロー
ス〕。４時間の操作で電位はゲル長さ１ｃＩｎ当＃）４
ボルトである。長さの標準物〔λ−ＤＮＡ 、 Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄｌＨで開裂、長さは知られている〔
フィリップセン（Ｐｈ１ｌｌｉμ５ｅｎ）およびデービ
ス（Ｄａｖｉｓ ）氏の［フォーカス（Ｆ〇−ｃｕｓ
） Ｊ第１巻第５頁（１９７９年）参照〕〕と比ｊ）
、Ｉｆ、□＝１よ、−０８ケケ□〜３６゜制限分析によ
シ切断点の数と並んで断片の長さならびにプラスミドの
全体の長さが得られる。
限酵素（１単位含有） １μｔ Ｈ２０１７−ｘμｔ ブロムフェノールブルー溶液５μｔの添加により反応を
停止させる。アガロースゲル電気泳動により断片を分離
する〔トリスアセテート緩衝液（０，０４Ｍ）リスアセ
テート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ ）中の１チアガロー
ス〕。４時間の操作で電位はゲル長さ１ｃＩｎ当＃）４
ボルトである。長さの標準物〔λ−ＤＮＡ 、 Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄｌＨで開裂、長さは知られている〔
フィリップセン（Ｐｈ１ｌｌｉμ５ｅｎ）およびデービ
ス（Ｄａｖｉｓ ）氏の［フォーカス（Ｆ〇−ｃｕｓ
） Ｊ第１巻第５頁（１９７９年）参照〕〕と比ｊ）
、Ｉｆ、□＝１よ、−０８ケケ□〜３６゜制限分析によ
シ切断点の数と並んで断片の長さならびにプラスミドの
全体の長さが得られる。
適当な複数回消化により最終的に制限地図が描かれうる
。
。
実施例 ４
ハイブリッドプラスミドの構成
ａ） ｐ８ＬＥ ４１の構成
プラスミドを担持する細胞から知られた方法〔マニアテ
イス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ）民地、［モレキュラークロ
ーニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）
Ｊ 、コールドスプリングハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ） 。
イス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ）民地、［モレキュラークロ
ーニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）
Ｊ 、コールドスプリングハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ） 。
１９８２年参照］によりｐＡＣＹｏ １８４− ＤＮＡ
が取得されうる。しかしながら野生型大腸菌細胞はＤＮ
Ａを修飾してＢｃｌｌでの必要な制限が可能でなくなる
ダム（Ｄａｍ）−メチラーゼを有している。すなわちこ
の場合ＤＮＡを単離するには大腸菌のダム−、、： 突然変異体が用いられる。
が取得されうる。しかしながら野生型大腸菌細胞はＤＮ
Ａを修飾してＢｃｌｌでの必要な制限が可能でなくなる
ダム（Ｄａｍ）−メチラーゼを有している。すなわちこ
の場合ＤＮＡを単離するには大腸菌のダム−、、： 突然変異体が用いられる。
プラスミドｐＩＪ ６はストレプトマイシスリビダンス
ＴＣ１４から知られたス）Ｌ／ブトミセス技法に従い単
離されうる（前記参照）。
ＴＣ１４から知られたス）Ｌ／ブトミセス技法に従い単
離されうる（前記参照）。
クローニングするにはプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を制
限酵素Ｂｅ１ｌを用いて線状となす。
限酵素Ｂｅ１ｌを用いて線状となす。
ＤＮＡ １μｇを開裂緩衝液中１単位のＢＣＩ Ｉ （
ＢＲＬ製、ノイーアイゼンブルク（Ｎｅｕ −１ｓｅｎ
ｂｕｒｇ ））の存在下５０℃で１時間保温培養する。
ＢＲＬ製、ノイーアイゼンブルク（Ｎｅｕ −１ｓｅｎ
ｂｕｒｇ ））の存在下５０℃で１時間保温培養する。
フェノール処理によシ反応を停止させそしてエタノール
沈澱によりＤＮＡを精製する。続いてアルカリフオスフ
ァターセ〔仔牛の腸からのもの、ベーリンガーーマンハ
イム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）社
製品〕で処理することによ、ｉ） ＤＮＡの５７−ホス
ペード末端を除去しそしてｐＡＣＹｏ １８４の再連結
を阻止する。チオストレプトン抵抗性を担持するＤＮＡ
断片を得るには＋ ｐＩＪ ６− ＤＮ八をＢｅｌ １
で切断する（操作は前出）。
沈澱によりＤＮＡを精製する。続いてアルカリフオスフ
ァターセ〔仔牛の腸からのもの、ベーリンガーーマンハ
イム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）社
製品〕で処理することによ、ｉ） ＤＮＡの５７−ホス
ペード末端を除去しそしてｐＡＣＹｏ １８４の再連結
を阻止する。チオストレプトン抵抗性を担持するＤＮＡ
断片を得るには＋ ｐＩＪ ６− ＤＮ八をＢｅｌ １
で切断する（操作は前出）。
２種類のＤＮＡ試料（開裂緩衝液中）を混合しく ｐＡ
ｃｙｃ １８４０．１μＮ １ ｐ Ｉ Ｊ ６１μｇ
）そしてＨ−橋を開かせるために７０℃に加熱する。メ
ルカプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）およびＡ
ＴＰ（０，１ｍＭ）の添加により反応条件を調整する。
ｃｙｃ １８４０．１μＮ １ ｐ Ｉ Ｊ ６１μｇ
）そしてＨ−橋を開かせるために７０℃に加熱する。メ
ルカプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）およびＡ
ＴＰ（０，１ｍＭ）の添加により反応条件を調整する。
このＤＮＡをＴ４− ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・
マンハイム社製品）１単位の存在下に４℃で１２時間保
温培養する。
マンハイム社製品）１単位の存在下に４℃で１２時間保
温培養する。
このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌を形質転換させ（マニ
アテイス代地の前記方法参照）そして細胞をテトラサイ
クリンおよびクロラムフェニコール抵抗性について選択
する。
アテイス代地の前記方法参照）そして細胞をテトラサイ
クリンおよびクロラムフェニコール抵抗性について選択
する。
それぞれのコロニーをそれらの寸法を測定するために迅
速に溶解させる。アガロースゲル中で寸法５．４ｋｂの
プラスミド（ｐＡＣＹＣ１８４４，３ｋｂ＋チオ抵抗性
１．１ ｋｂ ）をさがす。要求される長さを有するプ
ラスミドを担持する細胞からＤＮＡを単離（前出）しそ
して正しいＤＮＡ断片が挿入されたか否かを制限分析に
より検べる。その断片の制限切断点は知られている（キ
ーザー代地）ので、クローニングの成功は証明されうる
。
速に溶解させる。アガロースゲル中で寸法５．４ｋｂの
プラスミド（ｐＡＣＹＣ１８４４，３ｋｂ＋チオ抵抗性
１．１ ｋｂ ）をさがす。要求される長さを有するプ
ラスミドを担持する細胞からＤＮＡを単離（前出）しそ
して正しいＤＮＡ断片が挿入されたか否かを制限分析に
より検べる。その断片の制限切断点は知られている（キ
ーザー代地）ので、クローニングの成功は証明されうる
。
ｂ）プラスミドｐｓＷ ３４４Ｅの調製プラスミドｐｓ
ＬＥ ４１は大腸菌から知られた方法（マニアティス代
地）によシ得られうる。プラスミドｐＳＧ ５はストレ
プトマイシスガーナエンシス２９３２から前記のように
して単離される。
ＬＥ ４１は大腸菌から知られた方法（マニアティス代
地）によシ得られうる。プラスミドｐＳＧ ５はストレ
プトマイシスガーナエンシス２９３２から前記のように
して単離される。
クローニングするには２種類のプラスミドをＥｃｏＲＩ
を用いて平行して線状となす。ＤＮＡ １μｙを開裂緩
衝液中１単位のＦＣＯＲＩ（ベーリンガー・マンハイム
社製品）の存在下に６７℃で１時間保温培養する。フェ
ノール処理により反応を停止させそしてＤＮＡをエタノ
ール沈澱により精製する。ｐｓＬＥ ４１− ＤＮＡは
再連結を阻止するためにアルカリフォスファターゼでさ
らに処理するのが好都合である。次にＤＮＡ試料（開裂
緩衝液中）を混合しく０．２μＪ ｐｓＬＥ ４１およ
び１μ、９ ｐｓＧ５）、 ７０℃に加熱しそしてメル
カプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）およびＡＴ
Ｐ （ａ、１ｍＭ ）の添加によリガーゼ反応条件に調
整する。１単位のＴ４− ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ー・−ｑ７ハイム社製品）の存在下にこの混合物を４℃
で１２時間保温培養する。続いてこの混合物を大腸菌中
に形質転換させ（マニアティス代地）そしてコロニー上
テトラサイクリン抵抗性およびクロラムフェニコール感
受性を用いて選択する。
を用いて平行して線状となす。ＤＮＡ １μｙを開裂緩
衝液中１単位のＦＣＯＲＩ（ベーリンガー・マンハイム
社製品）の存在下に６７℃で１時間保温培養する。フェ
ノール処理により反応を停止させそしてＤＮＡをエタノ
ール沈澱により精製する。ｐｓＬＥ ４１− ＤＮＡは
再連結を阻止するためにアルカリフォスファターゼでさ
らに処理するのが好都合である。次にＤＮＡ試料（開裂
緩衝液中）を混合しく０．２μＪ ｐｓＬＥ ４１およ
び１μ、９ ｐｓＧ５）、 ７０℃に加熱しそしてメル
カプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）およびＡＴ
Ｐ （ａ、１ｍＭ ）の添加によリガーゼ反応条件に調
整する。１単位のＴ４− ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ー・−ｑ７ハイム社製品）の存在下にこの混合物を４℃
で１２時間保温培養する。続いてこの混合物を大腸菌中
に形質転換させ（マニアティス代地）そしてコロニー上
テトラサイクリン抵抗性およびクロラムフェニコール感
受性を用いて選択する。
適当な抵抗パターンを有するコロニーをプラスミドの寸
法測定のために迅速溶解させる。要求される長さく１８
．１ｋｂ）を有するプラスミドを含有する細胞からＤＮ
Ａを単離しそしてＤＮＡがｐｓＬＥ ４１およびｐｓＧ
５の連結が起った場合に必要な適当な制限パターンを
生成しているか否か制限分析によシ解明する。
法測定のために迅速溶解させる。要求される長さく１８
．１ｋｂ）を有するプラスミドを含有する細胞からＤＮ
Ａを単離しそしてＤＮＡがｐｓＬＥ ４１およびｐｓＧ
５の連結が起った場合に必要な適当な制限パターンを
生成しているか否か制限分析によシ解明する。
類似方法でハイブリッドプラスミドｐＧＭ １゜ｐＧＭ
２ 、 ｐＧＭ １０１およびｐＧＭ１０２が調製さ
れうる。
２ 、 ｐＧＭ １０１およびｐＧＭ１０２が調製さ
れうる。
実施例 ５
ｐｓＧ ５からの最小レプリコンの構成前記のようにし
てストレプトマイシスガーナエンシスＤＳＭ ２９５２
からプラスミドｐｓＧ ５を単離する。プラスミドｐｓ
ＬＥ４１は知られた方法（マニアテイス代地）により大
腸菌から得られうる。
てストレプトマイシスガーナエンシスＤＳＭ ２９５２
からプラスミドｐｓＧ ５を単離する。プラスミドｐｓ
ＬＥ４１は知られた方法（マニアテイス代地）により大
腸菌から得られうる。
ｐＳＬＥ ４１中にｐｓｏ ５の断片がクローニング吏
れる。すなわちＳｐｈ Ｉ 、 ＢａｍＨＩおよびＢｇ
ｌｌｌの断片がｐＳＬＥ ４１のＳｐｈ Ｉ 、 Ｂａ
ｍＨＩおよびＢｇｌｌｒ切断点に連結される。クローニ
ングするには２種類のプラスミドを上記した酵素を用い
て平行して線状となす（製造者および培養条件は第２表
参照）。フェノール処理により反応を停止させそしてエ
タノール沈澱によりＤＮＡを精製する（マニアテイス代
地の前記方法参照）。
れる。すなわちＳｐｈ Ｉ 、 ＢａｍＨＩおよびＢｇ
ｌｌｌの断片がｐＳＬＥ ４１のＳｐｈ Ｉ 、 Ｂａ
ｍＨＩおよびＢｇｌｌｒ切断点に連結される。クローニ
ングするには２種類のプラスミドを上記した酵素を用い
て平行して線状となす（製造者および培養条件は第２表
参照）。フェノール処理により反応を停止させそしてエ
タノール沈澱によりＤＮＡを精製する（マニアテイス代
地の前記方法参照）。
再連結を阻止するためにｐｓＬＥ ４１− ＤＮＡをさ
らにアルカリフォスファターゼで処理するのが好都合で
ある（マニアテイス代地の前記方法参照）。
らにアルカリフォスファターゼで処理するのが好都合で
ある（マニアテイス代地の前記方法参照）。
次にＤＮＡ試料（開裂緩衝液中）を混合しく０．２μｐ
ｐｓＬＥ４１および１μｍ１ ｐｓｉｌ ５ ） ＋
７０℃に加熱しそしてメルカプトエタノール（最終濃度
１０ｍＭ）およびＡＴＰ （０，１ｍＭ）の添加により
リガーゼ反応条件に調整する。１単位のＴ４− ＤＮＡ
＋７ガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製品）の存
在下にこの混合物を４℃で１２時間保温培養する。
ｐｓＬＥ４１および１μｍ１ ｐｓｉｌ ５ ） ＋
７０℃に加熱しそしてメルカプトエタノール（最終濃度
１０ｍＭ）およびＡＴＰ （０，１ｍＭ）の添加により
リガーゼ反応条件に調整する。１単位のＴ４− ＤＮＡ
＋７ガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製品）の存
在下にこの混合物を４℃で１２時間保温培養する。
続いてこの混合物を大腸菌中に形質転換させ（マニアテ
イス代地の前記方法参照）そしてｐｓＬＥ４１ヲコロニ
ー上クロラムフクロラムフェニコール抵抗性ラサイクリ
ン感受性を用いて選択する。
イス代地の前記方法参照）そしてｐｓＬＥ４１ヲコロニ
ー上クロラムフクロラムフェニコール抵抗性ラサイクリ
ン感受性を用いて選択する。
適当な抵抗パターンを有するコロニーを寸法測定のため
に迅速溶解させる〔チー・ニックハル） （Ｔ、 Ｅｃ
ｋｈａｒｄｔ）氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ）
Ｊ第１巻第５８４頁（１９７８年）参照〕。必要な長
さのプラスミドを含有する細胞からＤＮＡを単離しそし
て予期された融合プラスミドが生成したか否か制限分析
によりはつきりさせる。
に迅速溶解させる〔チー・ニックハル） （Ｔ、 Ｅｃ
ｋｈａｒｄｔ）氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ）
Ｊ第１巻第５８４頁（１９７８年）参照〕。必要な長
さのプラスミドを含有する細胞からＤＮＡを単離しそし
て予期された融合プラスミドが生成したか否か制限分析
によりはつきりさせる。
これらプラスミドを慣用の方法に従いストレプトマイシ
スリビダンスＴＫ２３に形質転換させ〔チー・エフ・シ
ャーチル（Ｋ、 Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒ ） 、ディー・
ニー・ホップウッド（Ｄ、 Ａ、 Ｈｏｐｗｏｏｄ）
、ティー・キーチーおよびシー・ジエー・トンプソン氏
ノ［シーン・クローニング・イン・ストレプトマイシス
、カレント・トピックス・イン・ミクロビオル・アンド
・イミュノル（Ｇｅｎｅ Ｃ１ｏｎ−！ ｉｎｇ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 、 Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ
、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ、） Ｊ第９６巻第６９−
９５頁（１９８２年）参照〕そしてチオストレプトン抵
抗性について選択する。チオストレプトン抵抗性ストレ
フトマイシスリヒダンスコロニーカラ標準的操作〔ティ
ー・キーザー氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ）
Ｊ第１２巻第１９頁（１９８４年）、ストレプトマイシ
スリビダンスおよび大腸菌からのｃｃｃＤＮＡの単離に
影響する因子、参照〕を用いてプラスミドＤＮＡを単離
しそしてその組成について検査する。
スリビダンスＴＫ２３に形質転換させ〔チー・エフ・シ
ャーチル（Ｋ、 Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒ ） 、ディー・
ニー・ホップウッド（Ｄ、 Ａ、 Ｈｏｐｗｏｏｄ）
、ティー・キーチーおよびシー・ジエー・トンプソン氏
ノ［シーン・クローニング・イン・ストレプトマイシス
、カレント・トピックス・イン・ミクロビオル・アンド
・イミュノル（Ｇｅｎｅ Ｃ１ｏｎ−！ ｉｎｇ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 、 Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ
、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ、） Ｊ第９６巻第６９−
９５頁（１９８２年）参照〕そしてチオストレプトン抵
抗性について選択する。チオストレプトン抵抗性ストレ
フトマイシスリヒダンスコロニーカラ標準的操作〔ティ
ー・キーザー氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ）
Ｊ第１２巻第１９頁（１９８４年）、ストレプトマイシ
スリビダンスおよび大腸菌からのｃｃｃＤＮＡの単離に
影響する因子、参照〕を用いてプラスミドＤＮＡを単離
しそしてその組成について検査する。
チオストレプトン抵抗性のコロニーから得られるすべて
のプラスミドは複製に必要なｐ８Ｇ ５プラスミドの遺
伝子を担持している。従って総合した結果から合目的々
な「ミニマルレプリコン」（ここでは４．４５ｋｂの１
３ａｍＨＩ断片）が確認され、このものは他のクローニ
ング実験およびに１１Ｈｃよ、オー７４−、ッ、、７２
．２□−＝７□ □）よりさらにミニマム化されうる。
のプラスミドは複製に必要なｐ８Ｇ ５プラスミドの遺
伝子を担持している。従って総合した結果から合目的々
な「ミニマルレプリコン」（ここでは４．４５ｋｂの１
３ａｍＨＩ断片）が確認され、このものは他のクローニ
ング実験およびに１１Ｈｃよ、オー７４−、ッ、、７２
．２□−＝７□ □）よりさらにミニマム化されうる。
第１図はプラスミドｐｓＧ ５の構造を示す。
第２図はプラスミドｐＧＭ１の構造を示す。
第３図はハイブリッドプラスミドｐＧＭ ２の構造を示
す。 第４図はハイブリッドプラスミドｐｓＬｇ４１の構造を
示す。 第５図はハイブリッドプラスミドｐｓＷ ３４４ Ｆｉ
の構造を示す。 第６図はハイブリッドプラスミドｐＧＭ１０１の構造を
示す。 第７図はハイブリッドプラスミドｐＧＭ１０２の構造を
示す。 特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト聞
血鼎工 妬 糾 八 ｋ４シ 手続補正書 昭和６０年６月４日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第６４０５３号 ２・発明の名称え、Ｖプ、９ヤオプ５Ｚｉ Ｆ’ｐ８Ｇ
５ 、イ。 取得法およびその使用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ヘキスト・アクチェンゲゼルゾヤフト４、代理人 ５、補正命令の日付（自発） 昭和 年 月 日（発送日 昭 ） ６・補正の対象 ８８ユ、。。ゆ。工、カヨ４．−１２
補正の内容 第２９頁第１２行の「Ｂｇ１ｍｌ切断ｊ ｆ 「Ｂａｍ
Ｈ１切断」と補正します。 以上
す。 第４図はハイブリッドプラスミドｐｓＬｇ４１の構造を
示す。 第５図はハイブリッドプラスミドｐｓＷ ３４４ Ｆｉ
の構造を示す。 第６図はハイブリッドプラスミドｐＧＭ１０１の構造を
示す。 第７図はハイブリッドプラスミドｐＧＭ１０２の構造を
示す。 特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト聞
血鼎工 妬 糾 八 ｋ４シ 手続補正書 昭和６０年６月４日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第６４０５３号 ２・発明の名称え、Ｖプ、９ヤオプ５Ｚｉ Ｆ’ｐ８Ｇ
５ 、イ。 取得法およびその使用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ヘキスト・アクチェンゲゼルゾヤフト４、代理人 ５、補正命令の日付（自発） 昭和 年 月 日（発送日 昭 ） ６・補正の対象 ８８ユ、。。ゆ。工、カヨ４．−１２
補正の内容 第２９頁第１２行の「Ｂｇ１ｍｌ切断ｊ ｆ 「Ｂａｍ
Ｈ１切断」と補正します。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ストレプトマイシスガーナエンシス（８ｔｒｅｐｔ
。 ｍｙｃｅｓ ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ ） ＤＳＭ ２９
３２の培養物から得られる約１２．７ｋｂの分子長さを
有するプラスミ ド ｐＳ（） ５ 。 ２）ストレプトマイシスガーナエンシスＤＳＭ２９６２
の培養物を溶菌させそしてその溶菌物からプラスミドを
分離することからなるプラスミドｐＳＧ ５の単離法。 ３）前記特許請求の範囲第１項記載のプラスミドｐｓＧ
５を切断しそしてそれを外来ＤＮＡと連結させること
からなるプラスミドベクターの製法。 ４）前記特許請求の範囲第１項記載のプラスミドｐ８０
５の完全な複製領域を含有するフラクションを外来ＤＮ
Ａと連結させることからなるプラスミドベクターの製法
。 ５）外来ＤＮＡがストレプトマイシスと異なる微生物属
において有効なレプリコンを含有する前記特許請求の範
囲第６項記載の方法。 ６）外来ＤＮＡのレプリコンが大腸菌（Ｅ、 ｃｏｉｉ
）において有効であることからなる前記特許請求の範囲
第５項記載の方法。 ７）外来ＤＮＡがストレプトマイシスと異なる微生物属
において有効なレプリコンを含有することからなるＭｊ
Ｊ記特許請求の範囲第４項記載の方法。 ８）外来ＤＮＡのレプリコンが大腸菌において有効であ
ることからなる前記特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９）ストレフトマイシスガーナエンシスＤＳＭ２９３２
の生物学的に純粋な培養物。 １０）前記特許請求の範囲第１項記載のシラスミドｐｓ
Ｇ ５またはその完全な複製領域を含有するハイブリッ
ドプラスミド。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3412092.0 | 1984-03-31 | ||
| DE19843412092 DE3412092A1 (de) | 1984-03-31 | 1984-03-31 | Das streptomyceten-plasmid psg5, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
| DE19843412093 DE3412093A1 (de) | 1984-03-31 | 1984-03-31 | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
| DE3412093.9 | 1984-03-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60256384A true JPS60256384A (ja) | 1985-12-18 |
| JP2526203B2 JP2526203B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=25819922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60064033A Expired - Lifetime JP2526203B2 (ja) | 1984-03-31 | 1985-03-29 | ストレプトミセスプラスミドｐｓｇ５ |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4880746A (ja) |
| EP (1) | EP0158872B1 (ja) |
| JP (1) | JP2526203B2 (ja) |
| AU (1) | AU582149B2 (ja) |
| CA (1) | CA1246475A (ja) |
| DE (1) | DE3567676D1 (ja) |
| DK (1) | DK167775B1 (ja) |
| ES (1) | ES541716A0 (ja) |
| GR (1) | GR850797B (ja) |
| PT (1) | PT80188B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH029376A (ja) * | 1988-03-23 | 1990-01-12 | Hoechst Ag | ストレプトミセテス突然変異体を製造する方法 |
| JP2013099712A (ja) * | 2011-11-08 | 2013-05-23 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 活性汚泥処理法、活性汚泥処理剤、活性汚泥処理装置および活性汚泥処理システム |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3614903A1 (de) * | 1986-05-02 | 1987-11-05 | Hoechst Ag | Gentamycin-resistenzgene und ihre verwendung als marker |
| GB2338236B (en) * | 1998-06-13 | 2003-04-09 | Aea Technology Plc | Microbiological cell processing |
| JP4258874B2 (ja) * | 1999-02-10 | 2009-04-30 | チッソ株式会社 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60217895A (ja) * | 1984-03-31 | 1985-10-31 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト | ストレプトミセス科レプリコンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリツドプラスミド |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| DE3117131A1 (de) * | 1981-04-30 | 1982-11-25 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "plasmid psg 2 und verfahren zu seiner gewinnung" |
| US4513086A (en) * | 1981-10-15 | 1985-04-23 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| US4416994A (en) * | 1981-10-19 | 1983-11-22 | Eli Lilly And Company | Plasmid pEL7 and related cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
-
1985
- 1985-03-23 DE DE8585103461T patent/DE3567676D1/de not_active Expired
- 1985-03-23 EP EP85103461A patent/EP0158872B1/de not_active Expired
- 1985-03-29 AU AU40599/85A patent/AU582149B2/en not_active Ceased
- 1985-03-29 ES ES541716A patent/ES541716A0/es active Granted
- 1985-03-29 GR GR850797A patent/GR850797B/el unknown
- 1985-03-29 JP JP60064033A patent/JP2526203B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-29 DK DK145185A patent/DK167775B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-29 PT PT80188A patent/PT80188B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-03-29 CA CA000477966A patent/CA1246475A/en not_active Expired
-
1987
- 1987-10-14 US US07/110,105 patent/US4880746A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60217895A (ja) * | 1984-03-31 | 1985-10-31 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト | ストレプトミセス科レプリコンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリツドプラスミド |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH029376A (ja) * | 1988-03-23 | 1990-01-12 | Hoechst Ag | ストレプトミセテス突然変異体を製造する方法 |
| JP2013099712A (ja) * | 2011-11-08 | 2013-05-23 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 活性汚泥処理法、活性汚泥処理剤、活性汚泥処理装置および活性汚泥処理システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4059985A (en) | 1985-10-03 |
| PT80188A (de) | 1985-04-01 |
| DK145185D0 (da) | 1985-03-29 |
| EP0158872A1 (de) | 1985-10-23 |
| ES8603572A1 (es) | 1985-12-16 |
| JP2526203B2 (ja) | 1996-08-21 |
| PT80188B (pt) | 1987-09-18 |
| CA1246475A (en) | 1988-12-13 |
| DK167775B1 (da) | 1993-12-13 |
| US4880746A (en) | 1989-11-14 |
| EP0158872B1 (de) | 1989-01-18 |
| ES541716A0 (es) | 1985-12-16 |
| DE3567676D1 (en) | 1989-02-23 |
| DK145185A (da) | 1985-10-01 |
| AU582149B2 (en) | 1989-03-16 |
| GR850797B (ja) | 1985-11-25 |
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