JPS60259196A - ラウウオルフイア属植物の組織培養によるラウウオルフイア系アルカロイドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 末完引け、ラククオルフイア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）
植物の組織培養法によるラククオルフイア系アルカロイ
ド特にレセルピンの製造法に関するものである。

ラククオルフイア系アルカロイドはキヨクチクトク科の
植物の主として根に生成し、血圧降下作用、神経系に働
き、鎮静、催眠作用を現わす＃１か精神安定作用を有し
、医薬として広く使用されており、現在商業的にけラク
クオルフイア・セルペンチナ（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ　５
ｅｒｐｅｎｔｉｎａ　）、ラククオルフイア・カネセン
ス（Ｒ＠　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ　）、　ラククオルフイ
ア・ミクランタ（Ｒ＊ｍ１ｃｒａｎｔｈａ　）、ラクク
オルフイア令ボミトリア（Ｒ＠ｖｏｍｉｔｏｒｉａ　）
等の根から抽出されているが、最近では原料核物の生産
量が低下し、植物の採取が困難になってきている。

従って、上述のような有用なアルカロイドを気象状件に
左右される天然植物からの抽出に頼ることなし忙、たと
えば植物細胞の培１１によって一定して得ることができ
れば非常に有意義なことである。而して組織培ＩＩＫよ
るアルカロイド生産の試みは比較的古くからなされ、そ
の生産能は培地中の生育ホルモンの種類や量と関係する
ことも知られている。

そして「インディアン・ジャーナル・オグ・エクスペリ
メンタル・バイオロジー」第２巻第４９〜５１頁（１９
６４年）Ｋはラククオルフイア・セルペンチンのカルス
を固型培養して痕跡程度のレセルピンを確認しており、
又、最近では、レセルピンの生成量をかなりあけた培養
方法も開発されてきている。（持分１１１（５２−２０
５５４号公報）。

しかしながら、まだ実用に適するほどの生成量には至っ
てい々い。

本発明者らはラククオルフイア系植物の組織培ＩＩＫよ
って、従来のものより高収率のラククオルフイア系アル
カロイド特にレセルピンを含有しているカルスを得る方
法にりいて検討した結果、カルスを一時悪化せしめてカ
ルスを変異せしめることにより、復帰後のカルスは高含
有のレセルピンを有するものであることを確認し、本発
明に至った。

本発明において、ラククオルフイア属植物として、クク
クオルフイア・セルペンチナ（Ｒａｕｗｏｌｆｉａｓｅ
ｒｐｅｎｔｉｎａ　）　、ラククオルフイア■ボミトリ
ア（Ｒ＠ｖｏｍｉｔｏｒｉａ）　、ラククオルフイア・
カネセンス（Ｒ−ｃａｎｅｓｃｅｎｓ　）　、ラククオ
ルフイアーリグストリナ（Ｒ−１ｉｇｕｓｔｒｉｎａ）
　、ラククオルフイア・ヘテロフイラ（Ｒ＊　ｈｅｔｅ
ｒｏｐｈｙｌｌａ　）　、ラククオルフイア・カフイラ
（Ｒ−ｃａｆｆｉｒａ）、　９ククオルフイア・オグス
キュラ（Ｒ−ｏｂｓｕｃｕｒａ　）　、ラククオルフイ
アーセンペルフロレンス（Ｒ＠　５ｅｎｐｅｒｆ　１ｏ
ｒｅｎｓ　）、ラウクオルフイア・ナタレンシス（Ｒ−
ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）等を使用でき、これらの植物を
以下述べる本発明の組織培養法によってラククオルフイ
ア系アルカロイド特にレセルピン（ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ
　Ｃ１０Ｈ４００９Ｎｚ　）をはじめレスシナメン（ｒ
　ｅＳＣＩ　ｎｎａｌｎｌ　ｎｅ　Ｃ３５Ｈ４２０ｇ　
Ｎ２　）　＋ヨヒンビン（ｙｏｈｉｍｈｉｎｅ　Ｃ２１
Ｈ２ｓ０３Ｎ２　）　、アジマリシ（ａ　ｊｍａ　Ｉ　
Ｉｎｅ　Ｃ２ｏＨ２６０２Ｎ２　）　＋　アジマリシン
（ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ　（４１ＨｕＯ３Ｎ２）　、ラ
ククオルフィニ＞　（ｒａｕｗｏｌｆｅｎｉｎｅ　Ｃ１
＠ＨＨＯ２Ｎｚ　）　、セルペンチン（５ｅｒｐｅｎｔ
ｉｎｅ　Ｃ１１Ｈ，、Ｏ，Ｎ、　）　、レセルビニン（
ｒｅｓｅｒｐｉｎｉｎｅ　ＣｇＨｙ１０４Ｎ１　）　、
デセルピジン（ｄｅｓｅｒｐｉｄｉｎｅ　Ｃ３１Ｈ１＠
ＯｓＮ、　）　、サルノ（ジン（ｓａｒｐａｇｉｎｅ　
Ｃ１ｇ　ＨＨＯ＠　Ｎｚ　）等を得ることができる。

即ち本発明け、ラククオルフイア属植物の組織片よりカ
ルスを誘導しそのカルスを基本栄Ｓ源を含む培地に２，
４−ジクロロフェノキシ酢酸及び必要に応じてカイネチ
ンを加えて々る培地に数世代培養し、得られたカルスを
基本栄養源を含む培地にα−す７タレン酢酸並び匠ベン
ジルアデニン及びカイネチンからなるサイトカイニン類
のうちのいづれかを加えた培地に移植させてカルスの生
育状態を悪化させ、悪化させたカルスを前述の生育増＠
ＶＣ適した基本栄養源を含む培地に２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸及び必要に応じてカイネチンを加えてなる
培地に戻して培養し、得られたカルスかもなるラククオ
ルフイア系アルカロイド特にし士ルピンを抽出分離する
ことを特徴とするラククオルフィア系アルカロイド特に
レセルピンの製造法である。さらに本発明についてラク
クオルフイア・セルペンチナの茎菜部位をカルス誘導材
料とした場合を一例として詳述する。

本発明ニおいて、ラククオルフイア・セルペンチナの茎
菜部位のＭｉ繊を用いてカルスを誘導するには表ＩＶＣ
示すリンスマイヤー・スクーグ（以下Ｌ　Ｓ　）　培地
Ｖｃ　２，４−ジクロロフェノキシ酢酸１〜３　ｐｐｍ
　好ましくけ１７〜λ４　ｐｐｍ　又はインドール−３
−酢酸１〜３　ｐｐｍ　好ましくは１５〜２、１　ｐｐ
ｍ　及び寒天粉末０．８〜１％を加えた固型培地に組織
片を置床し、２５℃近辺の環境下でカルス誘導させる。

得られたカルスを継代培養するＫｈＬＳの改変培地（ア
ンモニア急窒素をすべて硝酸態窒素に変えたもの）　Ｋ
　２，４−ジクロロフェノキシ酢酸と必要に応じてカイ
ネチンを添加し、そのｐＨを５〜７とした後、寒天粉末
を０．８〜１％加えた培地で２５℃近辺、暗所条件下で
固型培養を約３週問毎に行なう。又、液体培養を行なう
場合には好ましくけ固型培養で少なくとも３代以上継代
培養した後に固型培地から寒天粉末を除いた組成の液体
培地に移植して２〜３週間毎に継代をすると、カルスは
分散し小集塊状の細胞や遊離細胞が得られる。又、集塊
状の細胞と遊離細胞を分別する場合には所定のふるい目
を有した金網やナイロンフィルターを用いてＦ別し、固
型培養時と同じ環境下で行なう。又、液体培養法として
は一般に用いられている往復振温培養器、遊回培養器、
通気式ジャー７アーメンター等を用いることができる。

以下固型培養若しくけ液体培養で培養するカルスあるい
け小集塊状細胞あるいけ遊離細胞等を培養細胞という。

その際培地中に添加する２、４−ジクロロフェノキシ酢
酸の量はα１〜２．２　ｐｐｍ　、　又必要に応じて添
加すゐカイネチンの量Ｆｉｏ〜α２２ｐｐｍ　で使用し
た場合、培養細胞のｊｌ！１ａＦｉ最良の結果を示す。

前記の継代培養して得られた培養細胞（以下原株という
）をＬＳ培地忙α−す７タレン酢酸並びにベンジルアテ
゛ニン及びカイネチンからなるサイトカイニン類のうち
のいづれかを加えた培地（変更培地）において２５℃近
辺でかつ暗所下で約３遍同の培養を行ない生育を悪化せ
しめる。

原株を固型変更培地あるいは液体変更培地で培養しても
悪化する進行速度に若干差＃′ｉ、Ｓつでも、いづれも
増殖速度は低下していく。

この際培地中ＶＣ添加するα−ナフタレン酢酸のＭは０
．１８〜５　ｐｐｍ　が、又、サイトカイニン類の量は
０．１〜２．２　ｐｐｍ　が最も好適である。

生育を悪化せしめた培養細胞は黄白色から黄褐色に変色
し、ｙ！、に悪化が進入、で褐色になると全く増殖せず
死細胞になってしまう。

すなわち、原株の継代培ＩＩＫ於ける３１１１間゛目の
増殖倍数け７〜１１倍であるのに対し、変更培地で培養
したものは３週間毎の継代をα−ナフタレン酢酸５　ｐ
ｐｍ及びサイトカイニン類をｇ　２　ｐｐｍ加えｆｃ　
ｔｍ地で培養を２回線シ返し行なった場合で２〜３倍に
低下し、又、α−す７タレン酢酸を０、１８　ｐｐｍ　
及びサイトカイニン類をＱ　１　ｐｐｍ加えた培地では
継代毎に徐々に生育状態が悪化し５代目に至って３〜４
倍になった。

α−す７タレン酢酸が５　ｐｐｍを越えたり、サイトカ
イニン類が１２　ｐｐｍを越えたりすると移植した培養
細胞の生育が培地変更後１代目の培養期間中に著しく抑
制されたりあるいは細胞のほとんどが死んでしまう。又
、α−ナフタレン酢酸が０．１８ｐｐｍ未満であったり
、サイトカイニン類がαｌｐｐｍ未満であったシすると
、本発明の目的とする細胞の悪化効果が小さくなり、か
つラククオルフイア系アルカロイドＩ／＃＃にレセルピ
ンの生産能が低下して好ましくない。

このように変更培地によって生育性の悪化した培養細胞
を原株の継代培養と同じ培養条件に戻して増殖性を回復
させる。復帰後の培養細胞の増殖性は原株の増殖性より
も低下しており、その後同−培地にて継代を続けても原
株の増殖曲線（細胞のタイムコース）Ｋは一致せず、そ
の培養３．ｌｉ間後の増殖倍数は５〜８倍に達っして安
定した。

このようにして得られた培ａｍ胞からクククオルフイア
系アルカロイド特にレセルピンを抽出分離するＫは［ジ
ャーナル・オプ・アメリカン　ケミカル　ソサエティ」
第７７巻第３５５４頁（１９５５年）　Ｋ　Ｆ、んＨｏ
ｃｈｓｔｅｉｎ　、　Ｋｏｔａｒｏ。

Ｍｕｒａｉ　、　Ｗ、　Ｈ，Ｂｏｅｇｅｎｍａｎｎ　Ｋ
よって報告されている方法を参考にした。すなわち培養
細胞を凍結乾燥した後、粉末にして５０　ｇｒ秤量しこ
れをメチルアルコール５００ｔｎｌで一昼夜ソツクスレ
ー抽用を行なった。メチルアルコール抽出液を５０−に
濃縮し、再度−昼夜４℃以下の冷蔵庫中匠放置して析出
し、てくるエチルアルコール不溶物質をＦ別して除去し
Ｖ液を得た。このメチルアルコール抽出Ｆ＃：Ｋ　ｓ　
９６酢酸水溶液１００−を加え、更にノルマルヘキサン
１００ｄを加えて分液ロートで分液操作を行々い脱脂処
理をした。この操作を２回繰り返し行なった後、分液し
た５％酢酸水溶液層を水冷下で２８％アンモニア水を加
えてｐＨ１０にした。ｐＨ１０のアルカリ水溶液にクロ
ロホルムを１５０献加えて３回分液操作を行々った。

分液したクロロホルム層を合わせ、１００ｄＫ濃縮する
が、このクロロホルム層にはラククオルフイア系アルカ
ロイドの全量が粗アルカリイドとして含有されている。

次にレセルピンを含有する弱塩基性アルカロイドを分画
する為に濃縮したクロロホルム層１０〇−に５％酢酸水
溶液１００ｄを加え分液操作を３回行ない分液クロロホ
ルム層を得た。更にこの弱塩基性アルカロイドからレセ
ルピンを単離する為に高速液体クロマトグラフィーによ
ってレセルピン溶出部分を分取し、これを濃縮乾固した
後、メチルアルコールで再結晶化させ、針状結晶物質を
得た。

高速液体クロマトグラフィーによってレセルピンを分取
する為に先の弱塩基、性アルカロイドを含有スルクロロ
ホルム層からクロロホルムを減圧して留去した後再びノ
ルマルヘキサン６２部、クロロホルム３５部、メタノー
ル３部から々る溶離液に溶解させこれを高速液体クロマ
トグラフィー分析器に注入して分離展開させた。

このよう圧して単離した針状結晶物質を高速液体クロマ
トグラフィー分析、赤外線吸収スペクトル分析、紫外線
吸収スペクトル分析、質量分析、元素分析、核磁気共鳴
分析によってレセルピンであることを確認した。

赤外線吸収スペクトル分析の結果を図ＩＫ示し、核磁気
共鳴分析（ＩＨ−ＮＭＲ）を図２に示す。

図１からは波形により、又図２から積分曲線により、カ
ルスより単離した結晶物はレセルピン標準品と酷似し、
レセルピンでちること＃′ｉ明らかである。

表１　基本培地の組成 カルスの増殖培養における２、４−ジクロロフェノキシ
酢酸上必要に応じて添加するカイネチンの濃度を種々に
変えた実験例を下記の実施例１に示す。

実施例１ ラククオルフイア・セルペンチナの葉起源のカルスを基
本栄養源を含む培地としてＬＳ培地、改変ＬＳ培地１、
ムラシゲ・スクーグ培地（ＭＳ培地と略し表ＩＫ組成を
示す）を基本培地とし、それぞれの培地に２，４−ジク
ロロフェノキシ酢酸、カイネチンの濃度を変えて添加し
た後、Ｉ　Ｎ　−ＫＯＨでｐＨを５．６　Ｋ　ｔｉｌｌ
整し、更に寒天粉末をｏ、　ｓ　９６加えてオートクレ
ーブで蒸気圧Ｌ　２　Ｋｐ／ｍ、加熱時間１５分聞の条
件で滅菌処理をした。

これらの栄養培地にカルスを移殖して２５℃暗所下で３
Ｍ間毎の継代培養を行なった。少くとも１０代以上継代
してカルスの安定増殖性を確認した後にそれぞれの培地
条件下でのカルスの増殖倍数を培養３週間毎の一カルス
の新鮮型を整梳したカルスの新鮮型の比として表わした
。

その結果を表２に示す。

表２ 本願発明についての実験例を下記実施例２及び実施例３
に示す。

実施例２ ラククオルフイア・セル゛ベンチナの茎起源のカルスを
酸９ＬＳ培地に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸Ｑ　２
２　ｐｐｍとカイネチンＱ　２２　ｐｐｍ　を含む栄養
培地で継代培養を行なってきたカルスをＬＳ培地にα−
す７タレン酢酸Ｌベンジルアデニンを種々の濃度の組合
せで添加し実施例１と同じ方法にて滅菌処理した固型培
地に移植し２５℃暗所下で３週間毎の継代培養を行なっ
た。

次いでそれぞれの変更培地でカルスの生育性を悪化させ
た後、すなわち、それぞれの変更培地での最終継代培養
全しだカルスの一部を変更１０の増ＭＶｃ適した改変Ｌ
Ｓ培地に２．４−ジクロロフェノキシ酢酸０．２　ｐｍ
）ｍ　とカイネチン０．２２　ｐｍ）ｆｆｌ　を含んだ
栄養培地に再移植して２５℃、暗所下で３週間毎の固型
培地による継代培養を５代行なった。

継代培養に際してｔ′１ａｏｏ−容のエルレンマイヤー
フラスコに寒天粉末１％、を含む培地を７５−入れ、カ
ルスを新鮮型でＺ５ｇｒ　植付けた。５代継代培養した
時点での３週問後の増殖量をフラスコ１本あたりのカル
スの新鮮型及び乾燥重でめた。

更にそれぞれの同一条件で培養して得られたカルスを同
一条件カルスとして集め乾燥重として１０ｇｒ　を得、
先の詳細が説明の項で記したＨｏｃｈｓｔｅｉｎによる
ラククオルフィア系アルカロイドの抽出操作ｔ−１１５
のスケールで行ない総アルカロイド成分を作成し、それ
を減圧乾固して乾燥重量をめた。

仁の乾燥物の一定量をノルマルヘキサン９０部、エチル
アルコール１ｏ部、酢酸０．５都、トリエチルアミン０
．３部の溶離液に溶かし、高速溶体クロマトグラフィー
分析を行ないレセルピン含有量を標準レセルピンの検量
線からめた（処理区）。

又、培地変更をしなかったカルスを対照として２．４−
ジクロロフェノキシ酢酸０．２２　ｐｐｍ　とカイネチ
ンα２２　ｐｐｍを含む栄養培地で３週間毎の継代培養
を８代行なった後、増殖状態及びカルスのレセルピン分
析を行なった（未処理区）。

これらの結果を表３に示す。

又、図３のＡに示したものは表３の未処理区の力／Ｌ／
　スノ状１１を撮影したものである。即ちホルモン条件
は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸ｏ、２２ｐｐｍ　ｒ
カイネチン０．２２　ｐｐｍ用いる基本培地に改変リン
スマイヤー・スクーグ培地で８代継代したカルスである
。同じくＢに示したものは表３０処埋置の憲２のカルス
であり、ホルモン条件α−ナフクレン酢ｆｔ　Ｌ　９　
ｐｐｍ　、ペンジルアテニンｌｌｐｐｍ、用いる基本培
地はリンスマイヤー・スクーグ培地で３代継代したカル
スである。

この写真で明らかなとおり、処理区のカルスは黄褐色で
、枯褐状態に近く生育が悪化していることを示している
。

実施例３ ラククオルフイア・ボミトリアの根起源のカルスをＭＳ
培地［２，４−ジクロロフェノキシ酢酸２．２　ｐｐｍ
　ｋカイネチン０．２２　ｐｐｍ　を含む栄養培地で液
体振温培養を行なってきた培養細胞をＭＳ培地に４）〜
す７タレン酢酸ＬＯｐｐｍ１カイネチンα１　ｐｐｍを
含む栄養培地に移植し２５°Ｃ暗所下で振温回数１００
　ｐｐｍで４代繰返し継代処理をした。

処理後前記のＭ　Ｓ培地に２．４−ジクロロフェ／キシ
酢酸２．２　ｐｐｍ　とカイネチンα２２ｐｐｍｆ含む
栄養培地に処理細胞の中から６０メツシユのナイロンフ
ィルターで液体培地から戸別した培養細胞を新鮮型で２
．２ｇｒ取り出し移植した。培養容器にＨ３Ｏ０Ｗｄ！
容のエルレンマイマーフラスコを用い、７５−の栄養培
地を入れ、その培地中で３週聞毎の継代培養を５代行な
った。５代目の培養細胞の生育ヤ）゛け良好で増殖量は
新鮮型でフラスコ１本あたり１９．４ｇｒ　で乾燥型Ｈ
Ｌ１３ｇｒ　であった。又、比較例には培地変更をしな
かった培養細胞を対照として処理を施さなかった場合を
除いてその他の培養条件は同じとして行なった。培養細
胞の増殖量はフラスコ１本あたり新鮮型で２５．６ｇｒ
　で乾燥型ｔ′ｉ０．８９ｇｒ　であった。

分析＃′ｉ実施例２と同じ方法で行なった。

その結果を表４に示す。

表４

【図面の簡単な説明】

図１は、カルスより単離した結晶物及びレセルピン標準
品の赤外線吸収スペクトル（ＩＲスペクトル）分析結果
、図２＃′ｉカルスより単離した結晶物及こト１／セル
ドー・標へ脅品の核磁気共１１”ｒ　（ｌｌｉ−Ｎ　Ｍ
　Ｒ）分析結果を示１−１図３はカルス（培養細胞集塊
）未処理［メ（Δ）及び＄１．　］Ｕ！　ｌ’Ｉ　（Ｂ
）のものを撮影１゜ｆｒ、でＪ、ｊ真でＪ）る３、 図　１ １、　Ｒスヘ゛り１・九 ′：：［ 図　２ ’ｌ−ｌ−１−Ｎス公りｌ−ル 籟今齢１ 図３ Ｉ４ 手続補正書（方式） 特許庁長官学賀逍部殿 １　事件の表示 昭和５８年特許願第１８７１１１号 ２　発明の名称 ラウウオルフイア属植物の組織培養によるラウウオルフ
イア系アルカロイドの製造方法３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 奈良県奈良市南京終町−丁目２５番地 （２４４）積水化成品工業株式会社 代表者　川　本　貢 ４代理人 ５　補正命令の日付　昭和６０年２月６日（昭和６０年
２月２６日発送） ６　補正の対象　図　面 ７　補正の内容 （１）図３を削除します。 ８備考 昭和６０年２月６日付（昭和６０年２月２６日発送）の
補正命令に対して、昭和６０年３月２２日付の手続補正
書（方式）を提出しましたが、昭和６０年５月１６日付
（昭和６０年６月２５日発送）の別紙添付の写の書類と
ともにこの手続補正書（方式）は返却されました。 ９　添付書類の目録 （１）昭和６０年５月１６日付（昭和 ６０年６月２５日発送）のＮｏ、　Ｐ −８９２の特許庁長官殿の書類 の写　１　通 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 ■　事件の表示 昭和５８年特許願第１８７１１１号 ２　発明の名称 ラウウオルフイア属植物の組織培養によろラウ＋− ウオルフイア系アルカロイドの製造方法３　補正をする
者 事件との関係　特許出願人 奈良県奈良市南京終町−丁目２５番地 Ｃ２４４）積水化成品工業株式会社 代表者　用　本　貝 ４代理人 ５　補正命令の日付　昭和６０年２月６日（昭和６０年
２月２６日発送） ６　補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 ７　補正の内容 （１）ｒ４、図面の簡単な説明」を下記のとおりに訂正
します。 「図１は、カルスよりＩｊＬ＠シた結晶物及びレセルピ
ン標乍品の赤外線吸収スペクトル（ｆＲスペクトル）の
分析結果を示す図表、及び図２は、カルスより単層した
結晶物及びレセルピン標準品の核磁気共鳴（’Ｈ−ＮＭ
Ｒ）の分析結果を示す図表である。」８備考 昭和６０年２月６日付（昭和６０年２月２６日発送）の
手続補正指令書（方式）に対して、昭和６０年３月２２
日付の手続補正書（方式）を提出しましたが、昭和６０
年５月１６日付（昭和６０年６月２５日発送）の別紙添
付の写の書面とともにこの手続補正齋（方式）は返却さ
れました。 ９　添付書類の目録 （１）昭和６０年５月１６日付（昭和 ６０年６月２５日発送）のＮｏ、　Ｐ −８９２の特許庁長官殿の書面 の与　１　通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）２ククオルフイア属植物（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）　
   の組織片よりカルス（培養細見集塊）を誘導し、そのカ
   ルスを基本栄養源を含む培地に２，４−ジクロロフェノ
   キシ酢酸及び必要ＫＪｆ；じてカイネチンを加えてなる
   培地に数世代培養させ、得られたカルスを基本栄養源を
   含む培地にα−ナフタレン酢酸並び匠ベンジルアデニン
   及びカイネチンからなるサイトカイニン類のいづれかを
   加えた培地に移植させてカルスの生育状態を悪化させ、
   悪化させたカルスを前述の生育増殖に適した基本栄養源
   を含ｔｒ゛ＭＪ＊に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及
   び必要に応じてカイネチンを加えてなる培地に戻して培
   養し、得られたカルスからツククオルフイア系アルカロ
   イド特にレセルピンを抽出分離することを特徴とするラ
   ククオルフイア系アルカロイド特にレセルピンの製造法
   。 ２）カルスの生育増殖に適した培地が培地中に２．４−
   ジクロロフェノキシ酢酸を０．１　ｐｐｍ〜λ２　ｐｐ
   ｍ　と必要に応じてカイネチンな０〜０．２２　ｐｐｍ
   添加した培地である特許請求の範囲第１項記載のラクク
   オルフイア系アルカロイド特にレセルピンの製造法。 ３）カルスを悪化させるための培地が、培地中にα−す
   ７タレン酢酸を（１１８ｐｐｍ　−５ｐｐｍ並びにベン
   ジルアデニン及びカイネチンからなるサイトカイニン類
   のうちのいづれかを（Ｌｌｐｐｍ−２，２ｐｐｍ添加し
   た培地である特許請求の範囲第１項記載のラククオルフ
   イ１系アルカロイド特にレセｌレピンの製造法。 ４）培養方法が固型培養法又は液体培養法のいづれでも
   よくラククオルフイア系アルカロイド特にレセルピンを
   含有する細胞形態がカルスあるいけ遊離細胞であシ、こ
   れらの培ｌｌ１ｆＢ胞からラククオルフイア系アルカロ
   イド特にレセルピンを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のラククオル７イア系アルカロイド特にレセルピン
   の製造法。