JPS60259966A - 細菌および菌類感染の迅速検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は宿主における細菌または菌類感染症の病固体を
診断するための迅速な方法に関する。

この方法はプロフェッショナル食細胞を破壊して摂取さ
れた病原体の可溶性成分を放出させた後特異的結合アッ
セイで検出することよりなる。

背景技術 感染の診断には原因となる病原体の決定を伴うことが多
い。細菌感染の場合には、病原体を知ることによりその
情報を踏まえた抗生物質の選択が可能となる。

臨床診断には多くの方法が案出されている。

これらの中には培養法、イムノアッセイ、顕微鏡法１分
析化学、および核酸ハイブリッド形成法がある。

格段的に最も汎用されている培養法は、栄養培地に検体
を接種し次いで生物増殖度を測定することを伴う。培養
法は時間がかかり、また生存生物の存在しか究明できな
いという制約がある。首尾よく診断を行うには病固体の
増殖を強める適地な培地および培養条件を選択すること
が必要である。難培養性の生物例えばマイコプラズ７　
（Ｍｉｃｏｐｌａｓｍａ　）　Ｓｐｐ、　、ナイセリア
（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ）ｓｐｐ、ｔ　ヘモフィルス（Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　）　Ｓｐｐ、などおよび例えば
すべての無条件的嫌気性生物は特殊な培養条件および長
時間を増殖に必要とする。

適切な増殖条件が満たされないと標準的な培養スクリー
ニング手順にかけた際にこれら難培養性病固体をみのが
してしまう可能性がある。

イムノアッセイは診断の迅速化の可能性を約束するもの
のすべての敗血症の３０〜５０チの間に血液１−あたり
１コロニ一形成単位（ＣＦＵ）以下で存在する微生物の
検出に必要な感度を欠いていることが多い〔Ｋｉｅｈｎ
、　Ｔ、　Ｅ、ほか、　Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｍｉｃｒｏ、　１８．３００−３０４　（１９８３）　
）。

顯微鏡法１分析法１化学的方法およびノ・イブリッド形
成方法は、精緻な装置化および検体調製を必要とするこ
とが多く、そのため大変な労力を必要とする。

いわゆるプロフェッショナル食細胞が多くの微生物病原
体を摂取することは知られている。

生物の中には細胞内寄生物として食細胞内に住みつくも
のもあれば、最低でも食細胞の内部的分解プロセスによ
り非生存状態にされ極端にはこれらの分解プロセスによ
って消化されてし１うものもある。

シールド氏（Ｚｉｅｒｄｔ　）らは１家兎における敗血
症中の病原細菌の検出には非溶解血液培養法よりも溶解
−沖過血液培養の方が高感度の培養法であることを示し
た。彼らは溶解溶液（ツイーン（Ｔｖｒｅｅｎ　）　−
２０とローザイム（Ｒｈｏｚｙｍｅ　）の混合物）が食
細胞を浴解し１それによって食細胞の内部的分解プロセ
スによ）生存性が破壊されていない摂取病原体を放出す
るものと仮定している。彼らは通常の培養法を用いて病
原体の存在を検出した（　Ｚｉｅｒｄｔほか、　Ｊ、　
Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　、　１５゜７４−７７　（
１９８２）］。

シールド氏らの用いた溶解溶液は緩和な非イオン洗剤（
ツイーン−２０）と一部リパーゼおよびヌクレアーゼを
含むプロテアーゼ（Ｒｈｏｚｙｍｅ　）の混合物である
（　Ｚｉｅｒｄｔ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、
、　１５゜１７２−１７４　（１９８２）　］。

シールド氏らの用いた溶解溶液は確かに食細胞を溶解し
て以後の培養のための生存病原体を放出するが、その溶
解溶液中にプロテア−七およびヌクＶアーゼが存在して
いるため、他の検出システム、例えばタンパクである抗
体の使用を必要とするイム／アッセイや核酸プローブの
使用を必要とするハイブリッド形成法には問題を生じる
可能性がある。

シールド氏らによれば、食細胞からの生存病原体の放出
が望寸しいのは、培養に基づく検出システムでの増殖に
利用可能な生存生物の総数が多くなるからである。

スラマ、ティー・ジー（Ｓｌａｍａ、　Ｔ、　Ｇ、　）
氏らは。

エヌ・ゴノロエアエ（Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　
）細胞壁抗原のりボボリサッカライドに由来するＧＣ２
ポリサンカライドは細菌菌体が食作用を受けた後２〜６
時間でＰＭＮ−含有液中で免疫化学的に検出可能である
旨報告した。２４時間後は、それと同じＰＭＮ含有液は
特異抗血清と反応しなかった。

食作用から６時間後のＰＭＮ含有液からの細菌を培養し
ようとする−試みＦｉ核液が滅菌状態であることを示し
た。結果は、完全なＰＭＮ菌体を含むＰＭＮ含有液を用
いたエヌ・ゴノロエアエのアッセイのための培養法およ
び免疫化学的方法は適用可能ではあるが、比較的短時間
の間、過渡的に可能であるにすぎないことを示した［　
Ｓｌａｍａ。

Ｔ、　Ｇ、ほか、Ｓｅｘ　ＴｒａｎｓｍＤｉｓ、　、　
９．７Ｏ−７３（１９８２）ｌ。

培養に基づく検出システムではなくイム／アッセイオた
けハイブリッド形成に基づく病原体検出システムを用い
れば、食細胞の内部分解プロセスに付された病原体の非
生存生成物を与える食細胞溶解物を臨床診断に有利に使
用できることを見出した。食細胞の分解プロセスは少く
とも２例において抗原がそれらの相補的抗体によりもは
や認識され得なくなるまで抗原を分解することはないこ
とを見出した。

本発明の開示 本発明は （１）　プロフェッショナル食細胞を含む細胞集団を含
む検体を宿主から単離し； （２）　その集団を食細胞を破壊して病原体の少くとも
１糊の可溶性成分を放出することはできるが食作用を受
けていない病原体を破壊することはできない溶解剤と接
触させ；（３）　その可溶性成分をそれに対する生物特
異的結合パートナ−と接触させ；そして （４）結合度を測定する ことよりなる。前記宿主における食作用を受けかつ該宿
主のプロフェッショナル食細胞による少くとも部分的な
分解を受ける細菌または菌類病原体の存在の検出方法で
ある。

本発明の詳細な説明 本発明は人間および他の哺乳動物における多くの細菌お
よび菌類の感染症の診断に適用できる。この方法は人間
および動物の医療に有用である。本発明方法によシ検出
できる細菌および菌類は食作用を受けかつ少くとも部分
的に食細胞中で分解されるものである。多くの臨床上重
要な病原体がこの群に属する。一般にダラム陽性および
グラム陰性細菌を検出できる。個別的には、スタフィロ
コッカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　）　。

ストレプトコッカス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）
　、リステリア（Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　）　＊クロストリ
ジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびコリネバクテ
リア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ　）属に属するグ
ラム陽性細菌を検出できる。エンテロバクテリアセアエ
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　）科に属す
るグラム陰性細菌を検出できる。ヘモフィルス、バクテ
ロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　）　、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）、ナイセリアおよび
レキオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　）属に属するグラ
ム陰性細菌を検出できる。カンジグ（Ｃａｎｄｉｄａ　
）　、クリプトコツカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
　、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　）
およびヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏ−ｐｌａｓｍａ　）
属に楓する菌類を検出できる。これら様々な科および属
に属する細菌および菌類は多形核白血球（ＰＭＮ　）、
単球および組織マクロファージよりなるいわゆるプロフ
ェッショナル食細胞により捕食されることが知られてい
る。時間の経過に伴って病原体はファゴライリゾーム系
によって徐々に分解される。ファゴラインゾーム分解の
度合および速度は生物の年令およびその化学的組成に依
存して変化しうる。この分解プロセスにより病原体の特
徴的な表面構造成分例えばナイセリアからは毛、ストレ
プトコッカス・ニュモニアエ（５ｔｒｅｐｔｏ２ｏｃｃ
ｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）からは莢膜ポリサッカ
ライドおよび実質的にすべてのグラム陽性細菌にみられ
るリポタイコ酸などが除去される。分解プロセスが続く
につれて、微生物細胞壁および膜の統合性がＰＭＮ特異
的分解プロセスおよび微生物特異的自己溶解素（ａｕｔ
ｏｌｙｓｉｎ　）の作用によって変化を受ける。最も内
側の細胞膜が破壊されるとＤＮＡやＲＮＡなどの病原体
の細胞内成分が放出されることになる。

食細胞のライリゾーム内に含まれる細菌からの放射性ト
レーサー標識細菌菌体構成成分の放出の追跡によりライ
ンシーム分解プロセスが時間の関数として研究されてい
る［　Ｃｏｈｎ、　Ｚ、Ａ、　、　Ｊ。

ＥＸＪ）、　Ｍｅｒ３．　、１１７．２７−４２　（１
９／＋３）　；　Ｆｒ１ｅｄｌａｎｄｅｒ。

Ａ、　Ｍ、　、　Ｉｎｆ、　Ｉｍｍ、、２２．１４８−
１５４（１９７８））。

本発明の実施に適した細胞集団は血液、尿。

を髄液１滑液、粘膜分泌物および診断用掻爬小片（ｓｃ
ｒａｐｌｎｇｓ　）などを包含する（　ＰＭＮを含有す
る）血液が好ましい。集団を選択する主な基準はそれが
プロフェッショナル食細胞を含んでいることである。

細胞集団を、プロフェッショナル食細胞を破壊する能力
（−１：有するが食作用を受けていない病原体を破壊す
る能力は有しない溶解剤と接触させる。このようにして
、生存病原体全体がＰＭＮから放出されたものであろう
とあるいは媒質中に遊離しているものであろうと１本発
明の比較的迅速な可溶性成分結合アッセイ検出スキーム
の推定結果を確認するだめの培養に基づく検出に利用で
きることになる。適当な分解剤にはツイーン−２０、（
１５以下のＨＬＡ指数を有する緩和な非イオン表面活性
剤）および特に精製された形のサボゲニングリコシド１
例えばサポニンなと（１９７５年５月１３日にドルン（
Ｄｏｒｎ）に交付された米国特許第５．８８３，４２５
号明細書参照。

この文献を参照文献としてここに含める。）が包含され
る。加熱、タンパク分解酵素１強い還元剤１強酸および
強塩基などの激しい処理を避けることが必要である。何
故ならばそれらは生存病原体を殺してしまうだけでなく
食作用による分解プロセスから生じる可溶性病原体成分
を変性してこれら成分を抗体および核酸を含むそれらの
生物特異的結合パートナ−により認識し得なくしてしま
う可能性があるからである。

完全な病原体の食細胞分解によって生じる可溶性病原体
成分には、肖該病原体またはその病原体が一員である分
類学的な群に独特な様々な化学的な物質種が包含される
。可溶性成分の特定の具体例およびそれらの微生物有無
の診断への関係を第１表に示す。

第１表 グラム陽性およびグラム陰性微生物の化学的組成Ｒブチ
ドグリカン※　＋　十 要 リポ゛ポリサッカライド　＋ リポタンパク　＋ ホスホリピド　＋ タンパク　十ｋ　＋ ポリサッカライド　＋／−− Ｘ原核生物にのみみられる高分子 ［：　Ｇｂｕｙｓｅｎ、　Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ、　ｒ
　％構造決定への細菌溶解酵素の使用およびそれらの細
胞代謝における役割（Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎＤｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｌｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎ
ｄ　ｔｂｅｉｒＲｏｌｅ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ　）　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ　３２：４２５−４６４．１９６８．）
。

可溶性成分は操作上、病原体全体をベレット化するのに
十分な遠心分離の場に付した際にペレット画分に沈降し
ない病原体特異的成分として定義することができる。

可溶性成分は該成分に対する生物特異的結合ハードナー
と接触させる。極めてしばしば、結合パートナ−は抗体
である。可溶性成分が核酸（ＤＮＡかまたはＲＮＡ　）
である場合には結合パートナ−は相補的塩基対を有する
核酸である。

可溶性成分がその生物特異的結合パートナ−に結合する
程度は様々な周知の方法により測定できる。抗体に基づ
くシステムには様々なイムノアッセイ、例えばラジオイ
ムノアッセイ、酵素結合免疫収着剤アッセイ、放射免疫
拡散、補体結合、などを用いることができる〔「感染症
診断における免疫血清学（Ｉｍｍｕｎｏｓｅｒｏｌｏｇ
ｙ　ｉｎ　ｔｈｅＤｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　）　Ｊ　Ｆｒ、ｌｅ
ｄｍａｎ＋Ｈ１ほか（編者）　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）。

１９７９年、１−７６頁。この文献を言及により本明細
書の一部に含める〕。核酸検出にはハイブリッド形成シ
ステム例えば１９８２年１１月９日にＦａｌｋｏｗに交
付された米国特許第４，３５８，５３５号明細書に記載
のシステムを用いることができる。

驚くべきことに、プロフェッショナル食細胞の溶解の際
に放出される細胞内ラインシーム酵素１例えばプロテア
ーゼ、リパーセおよびヌクレアーゼは生物特異的結合パ
ートナ−を不働化することにより本発明方法を妨害する
ことはない。

本発明方法は食細胞を破壊して食作用を受けていない病
原体の生存性に影響を与えることなく可溶性病原体成分
を放出するので、検体は。

細胞集団を溶解剤と接触させた後に好オしくは遠心分離
によシ２相、すなわち不溶性生存病原体を含有する相と
可溶性成分を含有する相とに分離することができる。次
いで各相の分画アリフォートを試験することができる。

可溶性成分は本発明に従って検出でき、一方不溶性成分
（生存病原体全体）は増殖試験の行われる栄養培地に添
加することができる。このようにして、伝統的な培養に
基づく方法を本発明を構成する比較的迅速な方法の確認
に用いることができる。

好都合にも２相への分離はデュポン社からアイソレータ
ー（ｌ５ｏｌａｔｏｒ　）の商標名で売られている１９
７８年１２月２６日にドルン（Ｄｏｒｎ　）に交付され
た米国特許第４，１３１，５１２号明細書に記載の管を
用いて行うことができる。

（特に一般的に小量の検体である小児科の検体の検査に
おいて）本発明の方法と共に使用できる別の手順は、検
体を特定時間の間溶解剤と接触させ１次いでそのほかの
検体処理を行わずに、直接培養アッセイおよび特異的結
合アッセイにかけるやり方である。

スタフィロコッカス・エビデルミゾイス（Ｓ　ｔａ　ｐ
ｈｙｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　）
の成分であるペプチドグリカン、およびストレプトコッ
カス・フェカリス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａ
ｅｃａｌｉｓ　）のりボテイコ酸の検出について伝統的
な培養に基づく方法を本発明の方法と比較する次の実施
例によって本発明を例示する。

実施例　１ 精製はブチドグリカンを抗原として用いてモノクローナ
ル抗体を調製した。ペプチドグリカンは大部分の細菌の
主要細胞壁構成成分であることが知られている。ペプチ
ドグリカンはβ−（１→４）結合によって連結したＮ−
アセチルグルコサミン（ＮＡＧ　）およびＮ−アセチル
ムラミン酸（ＮＡＭ）が交互に繰り返す単位よりなる長
鎖ムコポリサンカライドである。それらは一部のＮＡＭ
残基のラクチル側鎖基に結合したＤおよびＬ−アミノ酸
を含有する短はプチド鎖を含んでいることが知られてい
る。前記ムコポリサッカライド鎖はこれらペプチドセグ
メント間の共有結合により共に連結されている。高度架
橋鎖の網状構造はサッカラス（５ａｃｃｕｌｕｓ　）と
呼ばれる。

各種ハイブリドーマによシ産生された抗体をはブチドグ
リカンへの結合能についてスクリーニングした。ペプチ
ドグリカンと特異的に結合したいくつかのハイブリドー
マセルラインからの免疫グロブリンを精製しそして次の
ようにしてサンドイッチ式イムノアッセイに用いた。す
なわち、抗−にブチドグリカン抗体（α−ｐｇ）をラテ
ックス粒子に結合した。細胞壁にはブチドグリカン（ｐ
ｇ）を含有することが知られている細菌全体０例えばス
タフィロコッカス・オーレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　ｉたはエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などをα−ｐ
ｇ−ラテックス粒子の存在下にインキュベートした。

２時間のインキュベーションの後に、未結合細菌を洗浄
除去した。次にβ−ガラクトシダーセ（β−ｇａｌ）に
接合されたα−ｐｇを前記ラテックス粒子に添加した。

２時間のインキュベーションの後に未結合α−ｐｇ−β
−ｇａｌを洗浄除去した。最後に、β−ｇａｌに対する
基質であるＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（０ＮＰＧ）を添加しそして４１０ｎｍでの光学
密度を測定し、た。結果は、１０５〜１０６全細菌がこ
のアッセイの最低検出限界であることを示した。この感
度は直接顕微鏡検査のそれに匹敵する。

他のイムノアッセイ形式、すなわち、全細菌のケイ光抗
体検出；全細菌を微量滴定板の壁に結合した後にマウス
α−９５１次いで標準ヤギ抗マウス′ＩｇＧを結合させ
るエライザ（ＥＬＪＳＡ　）　；α−ｐｇを微量滴定板
の壁に結合した後に細菌次いで標識α−ｐｇを結合させ
るＥＬＩＳＡを検討した。

コレらの別法としてのイムノアッセイ形式のいずれにお
いても感度は向上しなかった。

血液１−あたり約５８コロニー形成単位（ＣＦ’Ｕ、）
のスタフィロコッカス・エビチルミゾイスという濃度の
画面を有することが知られている患者から１０−アリコ
ートの全血を多数採血した。

それら血液検体を常法および本発明を構成する方法によ
り分析した。

１つの１０イアリコートの血液を５０−のトリゾチケー
スンイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ｂｒｏ
ｔｈ）（ＴＳＢ）を含む通気された血液培養びんに入れ
た。

ＴＳＢは本質的に等張でありまた赤血球ないしプロフェ
ッショナル食細胞を溶解しない。この手／ＩＥ’＋は細
菌の増殖を促進することが知られている。

前記肉汁に血液を添加した後様々な時点でアリコートを
取り出しそして前述のイムノアッセイ形式を用いて細菌
の有無を試験した。３５０℃で約１２時間インキュベー
ション後、細菌をイムノアッセイで検出した。しかしな
がらこの時点では肉汁の肉眼検査および直接顕微鏡検査
によっても細菌を検出できた。

第２の１Ｑｍｌアリコートの血液を１９７８年１２月２
６日にドルン（Ｄｏｒｎ　）に交付された米国特許第４
，１３１．５１２号明細書に記載された溶解−遠心分離
装置に入れた。血液検体を遠心分離しそして上澄液の最
頂部８．５−を取り出して４℃に維持した。ペレット化
した微生物を含有する残留液を激しく攪拌して以後微生
物濃縮液と呼ばれる懸濁液を生成した。略１−の微生物
濃縮液を寒天富化増殖培地に直接塗布した。残りの０．
５ｍｌの微生物濃縮液を１０−の緩衝された食塩水に入
れ、セしてＨ−１００００−夕を用いたＤｕ　Ｐｏｎｔ
８ｏｒｖａｌｌ　ＲＴ　−６０００冷却遠心分離器で細
菌を３００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄液は
傾瀉して捨てた。前記はレットは前述のイムノアッセイ
形式および４００倍および１０００倍の光学顕微鏡法に
より細菌の有無を試験した。それら試験のいずれにおい
ても細菌は全く検出されなかった。しかしながら１２時
間の増殖時間の後、細菌のＪ・、コロニーが培地上に肉
視できた。これらの結果は肉汁培養によシ得られるもの
に匹敵した。ｍ（述のａ５−の上澄液について細菌の有
無を試験した。栄養培地での増殖または直接顕微鏡検査
のいずれによっても細菌は全く検出されなかった。しか
しながら１イムノアツセイでははプチド陽性であった。

画面症患者（ｂａｃｔｅｒｅｍｉｃ　ｐａｔｉｅｎｔ　
）の血液に由来する血漿についても検査したつ 細菌培養、直接顕微鏡法およびｐｇに対するイムノアッ
セイはすべて陰性であった。

溶解−遠心分離装置の上澄液中のｐｇの存在が全細菌に
対するプロフェッショナル食細胞（例えばＰＭＮ　）の
作用に生じたとする仮設を試験するだめに試験管内モデ
ルシステムを作った。スタフィロコッカス・エビデルミ
ゾイスをＰＭＮ　細胞に、前述の培養に基づかない方法
、すなわちイノ・ノアツセイおよび直接顕微鏡法のいず
れによってもルーチンには検出できない濃度であるＩ　
Ｑ’　ＣＦＵ／−の濃度で添加した。スタフィロコッカ
ス・エビデルミゾイスの添加後様々な時点でＰＭＮ／細
菌混合物の部分的アリコートを取出しそして平板培養、
直接顕微鏡法およびイムノアッセイにより細菌を検査し
た。更に１部分的アリコートを溶解−遠心分離装置に入
れた。培養結果（ブレーティングの２４時間後）は、細
菌をＰＭＨにさらしてから１時間以内に９０％を超える
細菌がＰＭＮによシ殺され、２時間後には９９チを超え
る殺菌が認められることを示した。４００倍または１０
００倍で多くの顕微鏡視野を探索した後、直接ケイ光顕
微鏡法（アクリジンオレンジ染色）はほんのｆＣまにし
か単一のケイ光細菌を示さなかった。ＰＭＮ　／細菌混
合物から直接分析された検体からのイムノアッセイ結果
は陽性結果の得られた約８時間までは陰性であった。

溶解−遠心分離装置から得られた上澄液検体についての
イムノアッセイ結果は、細菌をＰＭＮと混合してわずか
１時間後にｐｇの存在を示した。

ｐｇの濃度は１２時間直線的に増大した。イムノアンセ
イに先立って溶解−遠心分離上澄液を遠心分離してもイ
ムノアッセイ結果を有意に変えることはなかった。

実施例　２ ストレプトコッカス・フェカリスから得られた精製リポ
ティコ酸（ＬＴＡ　）を抗原として用いて調製されたモ
ノクローナル抗体を用いて実施例１の手順を繰り返した
。

リポティコ酸のポリグリセロールホスフェート背骨構造
を用いて細胞表面上まだはその近傍にＬＴＡを有するこ
との知られるグラム陽性細菌を凝集させる能力に対して
モノクローナル抗体をスクリーニングした。ＬＴＡのポ
リグリセロールホスフェート部分に対し特異的な抗体を
そのモノクローナル抗体によるＬＴＡ含有細菌の凝集を
阻害する脱アシル化カルディオリビンの能力に基づいて
更に選択した。この阻害はそのように選択されたモノク
ローナル抗体が背骨構造に関連し、たエピトープまたは
結合部位に対する特異性を有し、　Ｌ’Ｉ’Ａ末端また
はその近傍のエピトープに対する特異性は有しないこと
を示した。

この選択によりＰＭＮ分解後に細菌ＬＴＡとの反応性を
維持する確率が一段と高い抗体が得られる。

何故ならば、ラインシーム酵素はよシ典型的には末端結
合を分解するエキソハイドロラーゼだからである。実施
例１で得られた結果と本質的に同じ結果が実証された。

すなわち、リポティコ酸を含有することが知られている
細菌菌体に対する最低検出限界は細菌菌体個数として１
０５〜１０６個程度であった。培養に基づく検出と溶解
−ＰＭＮ上澄液から得られたりポテイコ酸の免疫検出と
の比較は、リポティコ酸の免疫検出の方が高感度の方法
であることを示した。培養において何らかの肉視しうる
増殖を認めうる少くとも８時■１前にはイムノアッセイ
により細菌の存在を検出できた。更に、溶解ＰＭＮ上澄
は免疫陽性であったのに対し等容量の未処理ＰＭＮ含有
血液検体は免疫陰性であった。従ってペプチドグリカン
およびリポティコ酸モノクローナル抗体試薬を用いて同
様な実験を行っても本質的に同じ結果が得られた。

実施例１および２はいずれも本発明による方法が、伝絖
的な培養に基づく検出システムよりも実質的に短時間で
信頼しうる臨床的に有意な結果を与え得ることを示して
いる。

特許出願人　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース・
アンド・コンパ二一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　（１）　プロフェッショナル食細胞を含む細胞集
   団を含む検体を宿主から単離し； （２）その集団を食細胞を破壊して病原体の少くとも１
   釉の可溶性成分を放出することはできるが食作用を受け
   ていない病原体を破壊することはできない溶解剤と接触
   させ；（６）その可溶性成分をそれに対する生物特異的
   結合パートナ−と接触させ； （４）結合度を測定する ことよりなる、前記宿主における食作用を受けかつ該宿
   主のプロフェッショナル食細胞による少くとも部分的な
   分解を受ける細菌または菌類病原体の存在の検出方法。 ２）更に１検体の一部を病原体が増殖できる栄養培地と
   接触させそして培地での増殖を検査しそれによって特許
   請求の範囲第１項記載の方法を用いて得られた結果の確
   認を行うことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）生物特異的結合パートナ−が抗体である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ４）生物特異的結合パートナ−が核酸プローブである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）プロフェッショナル食細胞が多形核白血球である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）溶解剤がサポニンである特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ７）病原体がスタフィロコッカス・エビデルミゾイス（
   ５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
   ｓ　）であり。 プロフェッショナル食細胞が多形核白血球であり、検体
   が血液であり、溶解剤がサポニンでアシ、可溶性成分が
   ペプチドグリカンでありそして生物特異的結合パートナ
   −がモノクローナル抗−はプチドクリカン抗体である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ８）病原体がストレプトコッカス・ンエカリス（５ｔｒ
   ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｅａｃａｌｉｓ　）であり、
   プロフェッショナル食細胞が多形核白血球であり、検体
   が加液であり、溶解剤がサポニンであり１可溶性成分が
   りポテイコ酸でありそして生物特異的結合パートナ−が
   モノクローナルｔｆｉＣ−リボティコ酸抗体である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。