JPS6026979B2 - 肺動脈の塞栓症の検査方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、姉動脈の血塞栓症存在決定のための検査方法
に関する。

姉動脈血栓塞千全症は増加する激痛のくり返しを伴なう
非常に頻繁にある疫病であり、主要な死因の１つである
。

合理的で、非常に効果的な治療法が利用できるので適切
な早期の発見認識が決定的に重要であるが、臨床的診断
が困難であり、よく不正確になる。ときに、決断できな
い現在の放射線学的方法よりも大きな規模で利用できる
診断指針が要求されている。このような診断指針は、ス
クリーニング法としても、また放射線学的方法の補償的
情報としても役立つことができる。肺動脈の血栓塞キ全
症の認知法は、世界的で、重要な医学的問題であるので
、そのための簡単なスクリーニング検査法は、広く用い
られ、この問題の医学的管理に衝激を与えよう。ヒト血
清中の抗原の存在は、肺動脈蚤栓症の存在を確認するに
安全で、信頼性のあり、効果的な根拠を与えることを見
出した。

ヒトの肺に通常見られる抗原は、肺動脈塞栓症の存在下
の血清中に流れこむ。

抗原は動物血液中の抗体の産生を刺激するに用いること
ができる。逆に、抗体は、血清中の抗原の存在を検出す
るに用いられ、それにより、肺勤脈塞栓症の存在を確認
できる。従って、本発明は、第一に、正常な肺組議を用
し、、動物血清中の抗体の産生を刺激し、その後、抗体
を含む血清をテストすべきヒト血清で培養することによ
りヒトの腕動脈塞栓症の存在を決定する検査方法よりな
る。

肺動脈塞桧症の腸性存在は、免疫反応が生ずることによ
り示される。抗原組成物の単離と抗体の調整について。
どのような動物も抗体生産にほゞ用いることができるが
、このような処理の場合と同様に、便宜上処理法は、兎
の利用の場合についてのみ説明される。当業者は、より
大きな動物例えば、山羊、馬、牛などを、同様に用いら
れることができ、事実、多量の抗体産生に用いられよう
ことは認識している。肺洗練物は、まず５０〜１００夕
の正常なヒト肺試料を筆張性生理的食塩水（０．８５％
ＮａＣＩ水溶液）により抽出することにより調整した。

肺は、癌のための外科摘出を行って得たものであった。
約５０叫の４つの抽出物を夫々凍結乾燥させ、約１０の
‘の等張性生理的食塩水に再び溶解せしめ、２．５仇直
径、２６０の‘の床容量をもつセフアデツクスＳｅｐｈ
ａｄｅ幻Ｇ−２００カラムにかけた。１０の‘分を、１
６℃で１０地／時間の流速で回収した。

カラムを０．１Ｍのトリス［Ｔｒｉｓ］−ＣＩ、ｐＨ７
．４一ＩＭＮａＣＩで展開せしめた。フラクションを２
８仇肌 での吸収物について蛋白質分子の特徴的吸収特
性を検査した。最初の排他的ピーク、表面活性剤フラク
シヨン（フラクション１０一２５）をプールし、５の【
の部分に流し入れた。１つのこのような部分を同じフロ
ィンド（Ｆｒｅ血ぬ）補助液（アジュバンド）と混合し
たものを、兎の抗体の展開のために用いる。

抗原を含む混合物調整の他の代替方法では、０．４〜１
夕のヒト腕の部分を同様に０℃での摘除により得、その
後−７５０ 〜一８５ｏｏ で小さな片に切断し、０℃
で３の上の０．１Ｍ燐酸カリウムｐＨ ７．０で均質化
した。

代替的均質化賦形薬は、３の‘の０．２９Ｍサックロー
ズ一１ｍＭの燐酸カリウムｐＨ７．４である。均質化は
、ガラス組織粉砕器中で、モーター騒動テフ。

ン乳綾或は、モーター駆動のローデス（ゆｕｒｄｅｓ）
ステンレスステイール均質器で行う。付加的バッファー
を徐々に添加し、１５の上に容量を増やす。次に混合物
をフロィンド（ＦｒｅｕＭ′ｓ）補助液の等容量に添加
し、０℃で混合をつづけ濃厚なクリーム状混合物を作る
。

この懸濁物を抗体産生を刺激するに用いることができる
。約５の‘の抗原含有媒体を、成熟した白色雄兎に皮下
注射し、これは、一般には−回、しかし、４回まで別の
側に行った。

注射は、約１６週間約２週間の間隔でくり返えした。−
蓮処理の後に、兎を心臓穿刺により、或は、耳の血管か
ら採血する。

血液を放置凝結せしめ、血清を１０分間２００瓜ｐｍの
遠心分離により分離した。兎血清中の異質の抗体は、正
常なヒト血清中に吸収させて除去する。

これは、正常なヒト血清を兎血清と、約０．０３〜１対
０．１〜１のヒト対兎の容量割合で混合させることによ
り行った。混合物の室温で３び分間燈拝し、次に、約１
母時間４℃で貯蔵した。混合物を１００００夕で３０分
間４℃で遠心分離し、異質の抗原−抗体反応の反応産性
物を沈降せしめた。正常なヒト血清を用いたとき、望ま
しい抗体は反応しなく、上燈液に残った。処理法は、数
回（約３回）くり返し、潜存的な干渉性の抗体の出来る
だけ完全な除去を確保するようにした。最終の上澄液を
テスト組成物として用いる。このテスト組成物は、ヒト
肺上燈液（下記で説明する如く調整する）。肺界面活性
剤フラクション、又は、肺動脈塞干全症の存在のため肺
動脈走査により診断され陽性とされる患者の血清と培養
されると免疫反応を示すものである。しかし乍ら、正常
なヒト血清には反応しない。抗原はヒト腕に通常存在す
るが正常なヒト血清中には通常存在せず、肺動脈塞栓症
にかかった患者の血清には存在していることが明らかで
ある。ヒト肺上燈液は、１：１で０．２９ Ｍサツクロ
−ズ・１ｍＭ．燐酸塩 ｐＨ７．４で懸濁したもので均
質化したヒト肺片を超遠心分離で１０００００夕、４℃
で９０分間遠心分離することにより調整した。

抗原性調整物は、界面活性剤フラクションであり、セフ
アデツクスＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００カラムから単
離されたものであり、更に精製できる。精製するために
は、界面活性剤フラクションは脱イオン水で２独特間透
析をし、凍結乾燥し、残留分を０．１ＭトリスＴｒｉｓ
−ＣＩ、ｐＨ８．６に溶解する。１の‘の溶解凍結乾燥
物を、ＤＥＡＥセルローズカラム（２．５×○＆れ）上
でイオン交換にかけ、０．３３の【／分の流速で、０．
１ＭＴｒｉｓ／ＣＩ、ｐＨ８６（混合室）と、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ８．６十ＩＭＮａＣ１（貯蔵室）
の等容量間の勾配で溶鱗せしめる。

１０の‘のフラクションを回収し、凍結乾燥し、０．５
の‘の脱イオン水に溶解する。

３マイクロリッター程の試料で、マイクロ〔拡散〕法に
より兎抗体血清で陽性テストが与えられるのである。

ヒト腕の界面活性剤液フラクションヒト肺の１００００
０タ上燈液及び溝流走査により腕勤脈塞キ全症に対し腸
性の患者からのヒトの血清を、標準的マイクロ免疫拡散
法、マクロ免疫拡散法、及び亀気泳動法法により兎血清
抗体に対してテストした場合、３つの試料は全て共通の
抗原の存在を示した。

マイクロ免疫拡散法は、聡〃Ｍバルビタールバッフア一
触 ８２中１．５％〔Ｐｉｆｃｏ〕の特殊な不活性寒天
（ａ解「）２−５羽をプラスチック顕微鏡用スライド上
に注ぐことによって行った。

ウェル（ｗｅｌｌ）及びトラフ（ｔｒｏｕｇｈ）を（寒
天）中に切って作った。抗体調整物を、トラフに添加し
、抗原調整物をウェルに添加した。マクロ免疫拡散法は
、マイクロ法と同じ寒天８の【からの寒天層を有する１
００×１．５仇のべトリ皿を作り、次にウェル及びトラ
フを作ることによって行つた。

一つのタイプの拡散法は、３７０２４〜７２時間の培養
によって行った。

ゲルを約２錨馬間、通常の生理的食塩水で数回変えて洗
液した。沈降物の線は、水、メタノール、酢酸５：５：
１（容量比）中の１％のアミノプラック染料溶液で染め
ることによって可視化した。抗体及び抗原調整物の最適
の濃度は、ウェル中の抗原の濃度を、トラフ中の抗体を
一定にして変化させることにより決定された。

沈降素線は数回の簡単な観測で十分である。免疫電気縁
勤法は、７．５×２．＆スガラス或はプラスチックスラ
イド上で行った。

拡散法の如く緩衝した〔寒天〕を注ぎ、中央部の同じあ
った側にウェルを作る。抗原調整物は、ウェル中におか
れ、２時間室温で、一定電圧の電力供給で鰭気泳動させ
、スライド間の電位差は４０ボルトであった。ゲルスラ
ィド及びバッファー貯蔵室を微細多孔室の隔膜灯心で結
合した。噂気泳動後、、トラフを切り出し、抗体組成物
或は血清を添加した。培養及び染色は；免疫拡散法法の
如くした。沈降反応は、沈降によって明らかな如く、最
初のゥェルのアノード側で行なわれた。上記から明らか
の如く、抗原は、姉組識から抽出によって分離できる。

生理的食塩水或は他の抽出剤を用いることができる。そ
の後、ク。マトグラフ法によって精製できる。しかし、
姉均質物の比較的な粗は懸濁液を有用に用いることがで
きるので、そうすることは不必要である。これらの肺組
識物はいずれも、抗体産生を刺激するに用いることがで
きる。本発明の検査方法を説明するに用いた主要な免疫
反応は、免疫拡散法或は蚤気泳動法を用いる（寒天）中
の沈降素反応であったが、他の方法も用いられることは
明らかである。

これらには、例えば、橘体結合及び血球凝集反応を含む
。抗原は、１３１１、１２９、１４Ｃ或は４６の如き検
出できる放射性元素により札或はラベルをつけることが
できる。ラベリングは、フルオレセン、ローダミン或は
オーラミンの如き蟹光材料、或はパーオキシターゼ、８
ーグルコロニダーゼ、ウレア−ゼなどの如き酵素により
同様に行うことができる。抗体−抗原反応は、次に、比
色法或は放射線計数法により検出することができる。便
宜上、本発明の抗原は、仮にＬＡ抗原と名づけた。

決定を見合わされた姉動脈菱栓症について姉動脈走査で
検査された１０６人の患者についての曙気泳鰯研究では
、診断されたものの６７％がＬＡ抗原検出でき、陽性と
され、１２〜１４％の患者が陰性走査であった。この結
果は、示されているものよりも実際良好であり、なぜな
らば、走査技術は、多数の髭の陽性及び陰性を与えるこ
とが一般に認められているからである。次の非制限的実
施例は、精製された抗原の調製物及び、その検査を例示
し、そのイヒ学的及び物理的特性を確立するものである
。

実施例の分析により、抗原は、約２１００００の見かけ
上の分子量をもつ蛋白質であり、水性媒体中ｐＨ８．２
で負に荷電され、等電位点が５以上であることが示され
る。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では、それは、単純
なコオマシェ（ｃ皿ｍ畑ｓｉｅ）の青い染色帯を与える
。

検出されるリポタンパク質或いはグリコタンパク質を含
まなく、即ち、見かけの脂質或いは炭化水素分を含んで
し、ない。精製された抗原或は抗原調製物は、価値があ
り、抗体産生を刺激するに用いると、汚染されていない
抗体が生じ、上記の如く正常のヒト血清に吸収されて、
省略することができるのである。更に、精製された抗藤
組成物では、高濃度の抗体が動物血清中で作られる。更
に、放射免疫検査法の感度を著しく改良することができ
る。実施例 ０℃のヒトの肺組織を全部で３４０夕、小片に切断し、
０．０１Ｍトリスー０．２９Ｍ塩化ナトリウムＰＨ７．
６の４容量中で、混合機中で、５分間３鼠砂間隔で３〜
５℃で均質化した。

均質化物を６０００夕で６０分間５℃で遠心分離した。
次に上燈液を２時間４５０００夕で５℃で遠心分離した
。得られた上燈液を次に塩分割にかけた。

アンモニウムサルフェート分割を、飽和アンモニウムサ
ルフェートを徐々に添加し、０〜５００で３０％飽和で
損拝することにより行った。

その液体をＰＨ７．８に州水酸化ナトリウムで調節し、
２時間燈拝し、得られた沈降物を６０００夕で除いた。
上燈液を次に、同じ方法でアンモニウムサルフェートに
より５０％飽和にし、沈降物を６０００夕３０分間の遠
心分離により回収した。沈降物を、もとの均質物容量の
１／４の通常の生理的食塩水に溶解し、同じ溶液で４℃
、２蝿時間完全に透析した。

（通常の生理的食塩水は０．０１Ｍトリスー０．２９Ｍ
塩化ナトリウムでおきかえることができる。）透析され
た溶液は、６０００夕６０分間の遠心分離により清澄化
され、沈降物を除去した。

上燈液を、正確に同じ方法で、３０〜５０％のアンモニ
ウムサルフヱートで行い、透析し、得られる透析溶液を
ｐＨ３０にＩＮ塩化水素酸を徐々に添加、約１時間、
ゆるやかに燈拝して調節した。

その溶液を６０００夕、６び分間遠心分離にかけ、不落
沈降物を分離し、除去した。酸性化した溶液を、一定蝿
拝しながら、等容量の飽和アンモニウムサルフェートを
徐々に添加して５０％アンモニウムサルフェート飽和物
にした。

縄梓を２時間続けて混合物を半時間６０００夕で遠心分
離をした。沈降物を等容量の０．０１Ｍトリス−０．２
８Ｍ塩化ナトリウム、 柵７．４に溶解した。酸性化及
びアンモニウムサルフェート沈降工程をくり返し、沈降
物を再び初期の容量の１／４のトリス・バッファーに溶
解した。その溶液を同じ溶液で透析し、６０００夕１時
間遠心分離にかけ沈降物を除去した。その溶液をセファ
ローゼ紐カラム（トリスバッフアーでｐＨ７．４に前以
つて平衡化された２．６×８３力）上でゲルロ過に、３
０〜３５泌／時間の流速でかけた。

２．５叫の溶離したフランクションをＬＡ抗原をさがし
出すための免疫電気泳動法でテストした。

そのＬＡ抗原は、フラクション９５〜１１３に出現し、
約９．９％の蛋白質を２８加川の吸収により示していた
。蛋白質回収率は、９８．６％であった。ＬＡ抗原含有
フラクションをプールし、脱イオン水で約４℃に完全に
透析した。沈降物は、６０００夕１時間の遠心分離で除
去した。上燈液をトリス・バッファー軸７．４で透析し
、６０００夕１時間の遠心分離で沈降物を除いた。容量
を、透析バック中の溶液上に空気流を吹くことにより減
少せしめ、溶液を、セフアローゼ紐カラムのゲルｏ週に
２度かけた。

ＬＡ抗原含量フランクションを全ての３つのゲルロ過中
に等しくおいて、免疫電気泳動法により確認した。ＬＡ
抗原含有フランクションをプールし、濃縮化し、０．０
１Ｍ燃酸カリウムで４℃、約１畑時間ＰＨ６で透析した
。透析物を６０００夕３０分間遠心分離にかけた。上燈
液をカルボキシメチルセルロースカラム（２×１８肌で
５６ｍ‘のベッド容量、０．印水酸化ナトリウム、水、
０．印遠酸、０．州酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、及び
０．０８ Ｍ酢酸ナトリウムであらかじめサイクルされ
たもの）にかけ、０．０１Ｍ燐酸カリウムバッファーで
ＰＨ６平衡化した。溶液を０．０１Ｍ燐酸カリウムバッ
ファーＰＨ６．０の分離フランクションで段階的に溶離
し、初期のバッファー溶液は、塩化ナトリウムがなく、
従って、溶液は、夫々０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１８
Ｍ及び０．２Ｍの塩化ナトリウムを含んでいる。溶離さ
れたフラクション（夫々２．５の‘）を、免疫蟹気泳敷
法により分析し、ＬＡ抗原を、０．１９ Ｍ塩化ナトリ
ウムを含むフラクション中に見出した。（ここの又、前
記の分析の免疫蚤気泳動法は、免抗ヒト肺抗血清を用い
て行なつた。）抗原を含むフランクションをプールし、
容量を減らし、０．０１Ｍ燐酸カリウムＰＨ６．８によ
り透析した。

透析物を遠心分離し、沈降物を除いた。上澄溶液を、０
．８×１５仇のブルサィト（ｂｒ雌ｈ船）一 ヒ ドロ
キ シ アパタイト（ｈｙｄｒｏ刈ａｐａｔｉに）・
力ラム（アナリテイカルバイオケミストリ：Ａ雌ｌｙｔ
ｉｃａｌ、Ｂｉ比ｈｅｍｉｓｔひ ５９１６〜２３ １
９７４）（０．０１Ｍ燐酸カリウム、軸６８で予め平衡
化したもの）にかけ、０．０１、０．１、０．２及び０
．４Ｍの燐酸カリウム ｐＨ６．８で段階的に溶離した
。

フラクション（２．５Ｍ）を、上記の如く、免疫電気泳
動法でテストした。ＬＡ抗原は、０．２Ｍ燐酸カリウム
で溶離したフランクションに位置していた。フランクシ
ョンをプールし、容量を減らし、トリス・バッファー
ＰＨ７．４で４℃、約１０時間透析した。

透析物中のＬＡ抗原を分析した。

ＬＡ抗原は免抗ヒト腕抗血清と免疫学的に反応するタン
パク質である。セファローゼ粥ロ過でその分子量は約２
１００００である。オルンステイン及びテービス（ｏｍ
ｓにｉｎ、Ｄａｖｉｓ）の方法（Ａ皿ａｌｓｏｆｔｈｅ
ＮｏｗＹｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｏｉｅｍｅ
１２１、３２１〜４０４：２．５ミリァンベア／管、
１．虫時間の操作時間）によるポリアクリルアミド ゲ
ル 電気泳動法では、約５肌で、長さ約５弧のゲルの頂
上からの単一のコオマシェ（ｃｏｍａｓｉｅ）の青い染
色体を与える。材料は、ＦａｔＲｅｄ７Ｂ染色（Ｃｏｍ
ｉｎｇＦａｔＲｅｄ７ＢＳ紬ｕ、ｓｅｔ、カタログ番号
第４７０１２６号１９７４年７月の指示書、舷ｎｉｎｇ
ＡＣ１ ４９０ＳａｎＡｎｔｏｎｊｏＲｏａｄ、Ｐａｌ
ｏ幻ｔｏ、Ｃａｌｉｆ、班３００）により検出されるリ
ポタンパク質を含んでいない。更に、山ｃｉａｎＢＩ股
染色でのテスト、アナリテカル バイオケミスト（Ａｎ
ａｌれｉｃａＩ Ｂｉ比ｈｅｍｊｓｔび ４９、６０７
、１９７２に記載される方法を行うと、グリコタンパク
質を明らかに含んでいない。更に本発明の態様は次のも
のを有している。‘１’ ヒト腕組織に含まれる抗原で
刺激されることにより動物血清中に産生された抗体を含
む抗血精により検査すべきヒト血清を培養し、免疫反
−応の発生により肺動脈菱栓症腸性を決定することを特
徴とするヒトの姉動脈塞栓症の検査方法。

【２１ 第‘１１項方法において、 免疫反応は沈降素反応である。

‘３１ 第‘１｝項方法において、 免疫反応は微小免疫拡散法（マイクロィムノデイフュジ
ョン）により同定される。

｛４’第‘１｝項万法において、 免疫反応は、マイクロィムノディフュジョンにより固定
される。

【６１第■項方法において、 該反応は、蚤気泳動法（ェレクトフオリシス）により、
同定される。

【６）第‘１｝項反応において、 該動物は鬼である。

｛７１ 第‘１｝項万法において、 該抗血清は、検査すべき血清で培養される前に、正常な
ヒト血清により予吸着を受ける。

‘８｝ 第【１１項方法において、該反応はラジオノム
ノアッセィ（放射線免疫検出法）により、固定される。

【９｝ 肺動脈塞栓症に確患のヒトの血清中にあらわれ
るヒト腕組織中の正常の抗原と反応する抗体を含む抗体
調整物。

００ 約２１００００の見掛け分子量を有し、水性媒体
中で負に荷電し、５以上の等軍点を有し、ポリアクリル
アミド電気泳動において単一のコオマシェ青色染色帯を
与え、脂質或は炭水化物単量体のない蛋白質であり、更
に動物血清の抗体産生を刺激し、肺動脈塞栓症確患ヒト
の血清で培養されると、免疫反応により該肺動脈塞栓病
の存在を示すことのできる抗血清を産生する能力を特徴
としている抗原。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトの肺動脈の塞栓症の存在決定のための検査方法
   において、ヒトの肺組織を用いて、動物血清中の抗体の
   産生を刺激し、前記血清を正常なヒト血清により吸収せ
   しめ、異質の抗体を除去し、得られた抗血清を分離し、
   その抗血清を、検査すべきヒト血清と培養して、免疫反
   応をおこさせることにより肺動脈塞栓症の陽性の存在を
   決定することを特徴とする検査方法。 ２ 免疫反応が沈降素反応である特許請求の範囲第１項
   の検査方法。 ３ 反応をマイクロ免疫拡散法により確認する特許請求
   の範囲第２項の検査方法。 ４ 反応をマクロ免疫拡散法により確認する特許請求の
   範囲第２項の検査方法。 ５ 反応を免疫電気泳動法により確認する特許請求の範
   囲第２項の検査方法。 ６ 動物が兎である特許請求の範囲第１項の検査方法。 ７ 反応を放射線免疫検出法によつて確認する特許請求
   の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の検査方法
   。