JPS6030655B2 - Ｃｓｆ産生腫瘍移植法を用いたｃｓｆの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＣＳＦ（ＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍ山ａｔｉｎｇＦ
ａｃｔｏｒ）の新規な製造法、より詳しくはＣ３日系マ
ウスに自然発生したＣＳＦ産生腫湯細胞を同系マウスに
移植し、その尿からＣＳＦを製造する方法に関する。

ＣＳＦは骨髄白血球前駆細胞（以下ＣＦＵ一Ｃとする）
に作用してこの細胞の額粒球又はマクロファージへの分
化増殖を促進する物質であり、骨髄細胞をｉｎｖｉｔｒ
ｏで培養するとき、ＣＦＵ−Ｃが分化と同時に増殖して
コロニーを形成するために必須な因子である。

（ｌｃｈｉｋａ欄、Ｙ．；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ鮫ｏｆ比
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ５６巻 、Ｐ．４８８、１９６６年．Ｍｅｔｃ
ａｌｆ、Ｄ．；ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩＨｅｍａのｌ
ｏｇｙｌ巻、Ｐ．１８ふ１９７３王）また、ヒトの骨髄
細胞に作用するＣＳＦ（以下ｈＣＳＦとする）も同様に
ヒトの各種臓器や細胞の培養液から分離されている。（
Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ａ．Ｗ．；ＢＩ皿ｄ４９筈Ｐ５７３、
１９７７年、ＡｉｄｏｎｓＪ．Ｌ．；Ｂｌｏｏｄ５７巻
Ｐ．１３、１９８１年、ＪｏｈｎＦ．ＤｉＰｅｒｓｉｏ
；Ｂ１ｏの５１巻Ｐ．５０７、１９７８甲）ｈＣＳＦは
種々の感染症あるいは放射線被曝及び制癌剤の投与等に
より白血球数が４０００以下に減少する白血球減少症の
治療剤としての応用が先ず期待される。

また新しい方向としてｈＣＳＦを用いて白血病細胞を分
化させ成熟白血球にすることによって白血病を根治させ
ようとする実験的試みも行なわれている。次に血液疾患
の診断への応用も期待される。

従来、白血病、再生不良性貧血等の診断は専ら骨髄穿刺
激の塗抹染色標本による形態観察によってきたが、ｈＣ
ＳＦの開発に伴い、骨髄細胞軟寒天培養法にｈＣＳＦを
加えることにより、顎粒球系幹細胞の定量的測定法が可
能となり、これら疾患の確定診断、予後判定、治療方針
決定に重要な指標を与えることが明らかにされつつある
。（高久史魔；日本内科学会誌７の蓋、Ｐ．１９５９、
１９８１年など）その他、近年白血病及び再生不良性貧
血等の難治血液疾患の根治療法として骨髄移植が注目さ
れているが、その際に骨髄の凍結保存が必要となり、そ
の保存状態の良否判定の際、ＣＳＦによるコロニー形成
率を利用するといった特殊な用途が期待される。上記の
ｈＣＳＦの治療、診断、検定への利用にあたっては先ず
、一定の力価を有する標準記ＣＳＦの安定供給が必須の
前提条件である。

従来、報告されているＣＳＦ活性を有する物質としてマ
ウスＣＳＦはマウス骨髄細胞を用いたｊｎｖｉｔｒｏの
培養試験によって、あるいはマウス尿、ヒト尿、血清な
どの体液成分、肺などの臓器、各種組織の細胞培養液か
ら得られている。

（Ｓｈｅｒｉｄｅｎ 、Ｊ．Ｗ．；Ｊｏｎｒ船ｌ ｏｆ
ＣｅｌＭａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ７浅蓋、Ｐ．４５
１、１９７１年）しかしながら尿中に含まれるＣＳＦは
あまりにも少く、大量に採取するための原料としては不
適当であり、又臓器、細胞を培養するには血清や成長因
子など高価な原料が不可欠であって、結局、必要量を安
価に入手できないことがこの分野における研究・開発を
阻害する要因である。

又、ｈＣＳＦの製造法としては、ヒト末梢血球細胞（Ｐ
ｒｉｃｅ、Ｇ．Ｂ．ら；ＢｉｓｃｈｅｍｊｃａＩ Ｊｏ
ｕｍａｌｌ４８巻、Ｐ．２０９、１９７５年）、ヒト胎
盤細胞（Ｂｍｇｅｓ、Ａ．Ｗ．ら；Ｊｏｍ脇ｌｏｆＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａＩＣｈｅｍｉｓｔび、２５２巻、Ｐ．１
９９８、１９７７年）、ＣＳＦ産生種場とよばれるある
種の癌細砲を培養する製造法（特関昭５４一１４０７８
９）及び、ヒト尿から分離した、生体内で顎料球を増殖
する糠蛋白質を含有する分画を培地成分として使用し、
ヒト末梢血から分離した単球及びマクロフアージを培養
し、培養液中より採取する製造法（特関昭５６−１８５
９１）などが知られている。

しかし、これら製造法は、高価なゥシ血清、ヒト血清又
は尿中糖蛋白質といった成分を培地成分として使用せね
ばならず製造コストが高くなるという欠点がある。

本発明者は、Ｃ粗系マウスに自然発生した腫湯細胞を同
系マウスに移植すると、薯明な末梢白血球数とりわけ成
熟額粒球の増加を認め、この腫場を移植したマウスにお
ける造血幹細胞の動態につき検討中にマウス尿中にＣＳ
Ｆ活性が認められへこれを発表した。

（別所正美、平嶋邦猛、奈良信雄、日本血液学会雑誌、
４４蓋、Ｐ．４２３、１９８１年）ところが更に研究を
重ねた結果、ＣＳＦ産性種湯を移植したマウス尿中にお
けるＣＳＦ含有量は異常に高く、腫湯を移植しないマウ
スの尿に比較し、数十倍のマウスＣＳＦが産生されるこ
と、かつそのＣＳＦがｈＣＳＦでもあり、ヒト骨髄の細
胞集団から吸着性細胞を除去した試験条件下においても
有効であるという事実を見出し、本発明を完成するに至
った。本発明によれば、ＣＳＦ採取原料はすべてマウス
中で産生でき、高価な血清、成長因子、試薬を使用しな
いため、ＣＳＦの大量生産がはじめて可能になった。

本発明に係るＣＳＦの製造法の１例として下記の工程が
一般的である。

【１｝ Ｃ汎／Ｈｅ系マウスで継代可能な腫傷細胞を２
〜３肋の立方体に細切し、Ｃ細／Ｈｅ系マウスの背部皮
下に移植する。

種湯細胞として顎粒球症惹起線雛肉瞳（以下Ｆｊｂｒｏ
ｓａｒｃｏｍａと略入Ｓａｒｃｏｍａ−１８０のごとく
、ＣＳＦ産生能を有するものであれば用いても良い。‘
２） ４〜５週間飼育後、尿を収集する。

【３’尿を透析後、ＤＥＡＥーセルロース等弱アニオン
性イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィー、
等露点電気泳動法及びゲル猿過法で精製した。‘４ー
本工程による精製ＣＳＦは、袴電点ｐＨ３．１、分子量
約８００００（ゲル渡過法）の物性値を有する蛋白質で
あり、マウス骨髄細胞及びヒト骨髄細胞の増殖を促進し
た。

ＣＳＦの活性は下記の方法により測定した。

直径３５帆のプラスチック培養皿に２０％牛胎児血清、
２％、５％、１０％の割のサンプル、０．３％の寒天及
び１×１び個のマウス骨髄細胞を含むＭｃＣｏＹｓ弘培
地１泌を入れ、７日間５％Ｃ０２を含む飽和水蒸気で培
養した。培養後、倒立顕微鏡下で検鏡し、５の固以上の
細胞集塊をコロニーの数とした。なお、ヒト骨駐留細胞
を用いる場合はメスナー法〔日．Ａ．Ｍｅｓｓｎｅｒ、
Ｊ．Ｅ．ＰｉｌｌａｎｄＥ．Ａ．ＭｃＣ山ｌｏｃｋ；Ｂ
ｌｏｏｄ４２巻、Ｐ．７０１、１９７３年〕により、非
吸着性骨髄細胞分画を集め、有核細胞（１×１び）を用
い、１４日間培養し５の固以上の細胞集塊をコロニーの
数とした。又ＣＳＦの活性は、コロニーを１個形成させ
る活性を１単位とした。実施例 Ｃ細／Ｈｅ系マウスで継代可能なＦｉｂｒｏｓａｒｃｏ
ｍａを２〜３肌の立方体に細切し、Ｃ細／Ｈｅ系マウス
の背部皮下に移植し、４〜５週経過時点で、２０匹のマ
ウスから５日間で２４５心の尿を集めＣＳＦの精製を行
った。

尿２４５の‘を５のＭリン酸ナトリウム緩衝液一０．０
５％ポリエチレングリコール、ｐＨ７．４（以下５机Ｍ
ＰＢＳと略記する）にて十分透析し、遠沈（５００仇
ｐｍ、２肌ｉｎ）して上精３１０の上を得た。

この中に、ＣＳＦ活性としてマウスＣＳＦ４７万単位、
ヒトＣＳＦ１２０００の単位存在することを確認した。
これを試料Ｎｏ．１として表１に示した。尚以下の精製
過程の活性測定は、マウス骨髄細胞を用いて行った。

この上蒲をあらかじめ５ｍＭ ＰＢＳで平衡、活性化し
たＤＥＡＥーセルロースカラム（３．５×１４ｃの）に
通液し、５ｍＭから５００ｍＭのＰ斑の直線濃度勾配港
出法により溶出させ、１１。

２必ずつ分取した。

表１に示す通り、ＣＳＦ活性を有するピークが２つ得ら
れ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ２０−２５を集めて試料Ｎｏ．２
とし、Ｆｒａｃｔｉｏｎ２６一３３を集めて試料Ｎｏ．
３とした。Ｎｏ．３を濃縮して更にヱ１０の‘ ＬＫＢ
ｃｏｌｕｍｎ（商品名）を用いて等亀点電気泳動を行っ
た。

４曲時間泳動後、１．６肌ずつ分取しＣＳＦ活性を測定
すると、等露点３．１の位置に活性ピークが得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ＣＳＦ産生腫瘍細胞をマウスに移植し、その尿から
   ＣＳＦを採取することを特徴とするＣＳＦの製造法。 ２ 腫瘍細胞が顆粒球症惹起線維肉腫由来の細胞である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項のＣＳＦの製造
   法。 ３ 尿を透析後、イオン交換クロマトグラフイー法、等
   電点電気泳動法及びゲル濾過法で精製し、ＣＳＦを採取
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項
   のＣＦＳの製造法。