JPS6030686A - 乳酸桿菌属の細菌に供与ｄνａを導入する方法 - Google Patents
乳酸桿菌属の細菌に供与ｄνａを導入する方法Info
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- JPS6030686A JPS6030686A JP58140257A JP14025783A JPS6030686A JP S6030686 A JPS6030686 A JP S6030686A JP 58140257 A JP58140257 A JP 58140257A JP 14025783 A JP14025783 A JP 14025783A JP S6030686 A JPS6030686 A JP S6030686A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
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- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
- A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、供与１）ＮＡ （デオキシリボ核酸）を捕
捉させたリポソーム（Ｉ １ｐｏｓｏ＋ｎｅ ）を用０
て、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ Ｉｕｓ属）の
細菌の細胞内に、該ＤＮＡを導入する方法に関するもの
である。
捉させたリポソーム（Ｉ １ｐｏｓｏ＋ｎｅ ）を用０
て、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ Ｉｕｓ属）の
細菌の細胞内に、該ＤＮＡを導入する方法に関するもの
である。
従来、微生物に対して適宜の供与ＤＮＡを導入する技術
に関しては、遺伝子操作技術の基本テクニックとして、
種々の開発努力が払われており、その主なものを、その
原理上の観点から整理して列挙すると以下の通りである
。
に関しては、遺伝子操作技術の基本テクニックとして、
種々の開発努力が払われており、その主なものを、その
原理上の観点から整理して列挙すると以下の通りである
。
（１） コンピテント（ｃｏ＋ｎｐｅｔｅｎｔ）細胞に
、供与ＤＮＡを直接的に導入する方法。
、供与ＤＮＡを直接的に導入する方法。
（２） コンピテント細胞に対して、供与Ｄ Ｎ Ａ
ヲ捕捉させたリポソームを融合させる方法。
ヲ捕捉させたリポソームを融合させる方法。
（３） プロトプラスト化した細胞に対して、供与１）
ＮＡを直接的に導入する方法など。
ＮＡを直接的に導入する方法など。
しかしながら、これらの方法が適用される対象の微生物
は、特定のものに限られているのが現状である。とりわ
け、乳酸桿菌属の細菌に関しては、上記いずれの方法を
採用しても、その細胞内に供与ＤＮＡを導入することは
困難であって、今日に至るまで、該ＤＮＡの導入に成功
したとの報告は皆無であるというのが現状である。
は、特定のものに限られているのが現状である。とりわ
け、乳酸桿菌属の細菌に関しては、上記いずれの方法を
採用しても、その細胞内に供与ＤＮＡを導入することは
困難であって、今日に至るまで、該ＤＮＡの導入に成功
したとの報告は皆無であるというのが現状である。
乳酸桿菌属の細菌における、このような供与１） Ｎ
Ａ導入の困難性が由来する主たる障壁としては、例えば
、乳酸桿菌属の細胞に関しては、細胞を用いる方法が現
在のところ、実施不可能な状態にあること、更には、乳
酸坪菌属の細菌に関しては、そのプロトプラスト化が困
難であることから、上記（３）項記載のプロトプラスト
細胞を用いる方法についても研究例がないこと、これに
加えて、そもそも、乳酸桿菌属の細菌には、常時、多量
のＤＮＡ分解酵素を放出する性質があるので、供与ＤＮ
Ａを導入する好適な技術を確立することが困難な状況に
あること、などがあげられよう。
Ａ導入の困難性が由来する主たる障壁としては、例えば
、乳酸桿菌属の細胞に関しては、細胞を用いる方法が現
在のところ、実施不可能な状態にあること、更には、乳
酸坪菌属の細菌に関しては、そのプロトプラスト化が困
難であることから、上記（３）項記載のプロトプラスト
細胞を用いる方法についても研究例がないこと、これに
加えて、そもそも、乳酸桿菌属の細菌には、常時、多量
のＤＮＡ分解酵素を放出する性質があるので、供与ＤＮ
Ａを導入する好適な技術を確立することが困難な状況に
あること、などがあげられよう。
このように、乳酸桿菌属の細菌のもつ個有の特性に起因
する従来技術の適用の困難性の背景故に、乳酸桿ｎ“１
属の細菌に対して供与１）ＮＡを導入するだめの新技術
、ひいては、これに基づく乳酸桿菌属の細菌に関する遺
伝子操作技術を確立することが、当業界における急務の
課電として提起されていて、その解決が要請されている
ものである。
する従来技術の適用の困難性の背景故に、乳酸桿ｎ“１
属の細菌に対して供与１）ＮＡを導入するだめの新技術
、ひいては、これに基づく乳酸桿菌属の細菌に関する遺
伝子操作技術を確立することが、当業界における急務の
課電として提起されていて、その解決が要請されている
ものである。
かかる現状に鑑みて、本発明者らは、乳酸桿菌属の細菌
に関する遺伝子操作技術上の一つの障壁を克服して、該
細菌内への、供与１） Ｎ Ａの導入に関する有用な技
術を確立すべく、鋭意研究を積み重ねた。
に関する遺伝子操作技術上の一つの障壁を克服して、該
細菌内への、供与１） Ｎ Ａの導入に関する有用な技
術を確立すべく、鋭意研究を積み重ねた。
その結果、乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト化に加え
て、該プロトプラストと、リポソームとの融合化の条件
を調整して、プロトプラストに対して供与ＤＮＡを捕捉
させたリポソームを好適条件下で融合させれば、ＤＮＡ
分解酵素による分解作用に抗して、供与ＤＮＡを細菌の
細胞内に尋人し得ることを見い出して、本発明を完成す
るに至った。
て、該プロトプラストと、リポソームとの融合化の条件
を調整して、プロトプラストに対して供与ＤＮＡを捕捉
させたリポソームを好適条件下で融合させれば、ＤＮＡ
分解酵素による分解作用に抗して、供与ＤＮＡを細菌の
細胞内に尋人し得ることを見い出して、本発明を完成す
るに至った。
すなわち、この発明の目的は、従来、前述した種々の障
壁からその実施化が困難であったところの乳酸桿菌属の
細菌の細胞内に、供与１）ＮＡを導入する方法を提供せ
んとするものである。
壁からその実施化が困難であったところの乳酸桿菌属の
細菌の細胞内に、供与１）ＮＡを導入する方法を提供せ
んとするものである。
そして、かかる目的を達成するために採用される本発明
の構成は、プロトプラスト又はスフェロプラスト（以下
プロトプラストと総称する）化した乳酸桿菌属の細菌と
、供与ＤＮＡを捕捉させたリポソームとを、融合剤の存
在下で融合することにより、供与ＤＮＡをその細胞内に
尋人することを要旨とするものである。
の構成は、プロトプラスト又はスフェロプラスト（以下
プロトプラストと総称する）化した乳酸桿菌属の細菌と
、供与ＤＮＡを捕捉させたリポソームとを、融合剤の存
在下で融合することにより、供与ＤＮＡをその細胞内に
尋人することを要旨とするものである。
かかる構成を、より詳細に説明すれば以下の通りである
。
。
（１）宿主菌である乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト
化は、例えば、友近らの方法（日本細菌学雑誌、 ３７
．７７７−７８５（１９８２））によって行なわれる。
化は、例えば、友近らの方法（日本細菌学雑誌、 ３７
．７７７−７８５（１９８２））によって行なわれる。
（２）供与ＤＮＡのリポソームによる捕捉は、卵黄レシ
チンを材料として、逆相蒸発法により行なわれる。
チンを材料として、逆相蒸発法により行なわれる。
（３） プロトプラスト化した細胞と、リポソームとの
融合は、例えは、ポリエチレングリコールなどの融合剤
の存在下で融合処理を施すことによって実現され、これ
により、リポソームに捕捉させた供与ＤＮＡを乳酸桿菌
属の細菌細胞内に導入することができる。その際の融合
剤としては、ポリエチレングリコール４．０００、ポリ
エチレングリコール１．０００などが使用可能でアルカ
、その他の既知の融合剤を使用してもさしつかえない。
融合は、例えは、ポリエチレングリコールなどの融合剤
の存在下で融合処理を施すことによって実現され、これ
により、リポソームに捕捉させた供与ＤＮＡを乳酸桿菌
属の細菌細胞内に導入することができる。その際の融合
剤としては、ポリエチレングリコール４．０００、ポリ
エチレングリコール１．０００などが使用可能でアルカ
、その他の既知の融合剤を使用してもさしつかえない。
（４）融合化の完了したプロトプラスト細胞を、適当な
高張の培地中で培養することによって、乳酸桿菌属の細
菌内にて供与Ｄ Ｎ Ａの遺伝情報を発現させることが
できる。
高張の培地中で培養することによって、乳酸桿菌属の細
菌内にて供与Ｄ Ｎ Ａの遺伝情報を発現させることが
できる。
（５）供与ＤＮＡとしては、例えば、Ｊ１ファージ、Ｆ
Ｓ Ｗファージなどのファージ１）ＮＡ、プラスミド
ＤＮＡ、異種ＤＮＡを組換えＤＮＡ技術を用いて適宜の
ベクターに組込んで作製した組換え１）ＮＡ分子など、
適宜のＤＮＡを使用することができる。リポソームによ
る捕捉のための条件などの観点からは、分子足の小さい
Ｊ） Ｎ Ａが望ましいが、分子ｉ２．ｒｘ１ｏ７程度
の大きなりＮＡ分子でも使用可能である。
Ｓ Ｗファージなどのファージ１）ＮＡ、プラスミド
ＤＮＡ、異種ＤＮＡを組換えＤＮＡ技術を用いて適宜の
ベクターに組込んで作製した組換え１）ＮＡ分子など、
適宜のＤＮＡを使用することができる。リポソームによ
る捕捉のための条件などの観点からは、分子足の小さい
Ｊ） Ｎ Ａが望ましいが、分子ｉ２．ｒｘ１ｏ７程度
の大きなりＮＡ分子でも使用可能である。
（６）供与ＤＮＡを細菌の細胞内に導入して得た形質転
換体の検出及び選択に関しては、適宜の選択マーカーを
保有させた供与１）ＮＡを使用するなど、遺伝子操作技
術における形質転換体の通常的な検出・選択方法が採用
される。
換体の検出及び選択に関しては、適宜の選択マーカーを
保有させた供与１）ＮＡを使用するなど、遺伝子操作技
術における形質転換体の通常的な検出・選択方法が採用
される。
次いで、本発明の有用性について言及すると以下の通り
である。
である。
供与ＤＮＡとしての、有用な遺伝情報を保持したＤＮＡ
を適宜のベクターに組込んで成る組換えＤＮＡ分子に対
して、この発明の方法を適用することにより、当該有用
遺伝情報を乳酸桿菌属の細菌内にて、発現させることが
できることから、本発明の方法は、 （ａ） 乳酸桿菌属の細菌の細胞育種及び改良の手段と
なり得ること。
を適宜のベクターに組込んで成る組換えＤＮＡ分子に対
して、この発明の方法を適用することにより、当該有用
遺伝情報を乳酸桿菌属の細菌内にて、発現させることが
できることから、本発明の方法は、 （ａ） 乳酸桿菌属の細菌の細胞育種及び改良の手段と
なり得ること。
（ｂｌ 乳酸桿菌属の保有する遺伝情報の発現機構を解
明する有力な手段となり得ること、など、の点に鑑み、
発酵工業上有用な細菌である乳酸桿菌属の細菌の基礎研
元の分野及びその産業上の利用分野において、新展開を
もたらす技術としての、意義を持つものである。
明する有力な手段となり得ること、など、の点に鑑み、
発酵工業上有用な細菌である乳酸桿菌属の細菌の基礎研
元の分野及びその産業上の利用分野において、新展開を
もたらす技術としての、意義を持つものである。
続いて、本発明の実施例について詳細に説明すれば以下
の通りである。
の通りである。
なお、以下の実施例では、宿主菌としては、ラクトバチ
ルス・カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ １ｕｓｃａｓ
ｅｉ） ＹＩＴ９０３１ を採用し、更に、供与ＤＮＡ
としては、ラクトバチルス・カゼイ（、ｒ、ａｃ−ｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ）の毒性ファージＪ１
ＤＮＡ （日本農芸化学会誌、３９． ４７２−４７６
（１９６５）及びラクトバチルス・カゼイ（、Ｌａｃ−
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ）の溶原ファージ
φＦＳＷＤ Ｎ Ａ （Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、 ４５゜６６９−６７４ （１
９８３） ）を採用しているが、この発明の方法は、上
記以外の相料を採用することによっても、実施可能であ
る。
ルス・カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ １ｕｓｃａｓ
ｅｉ） ＹＩＴ９０３１ を採用し、更に、供与ＤＮＡ
としては、ラクトバチルス・カゼイ（、ｒ、ａｃ−ｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ）の毒性ファージＪ１
ＤＮＡ （日本農芸化学会誌、３９． ４７２−４７６
（１９６５）及びラクトバチルス・カゼイ（、Ｌａｃ−
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ）の溶原ファージ
φＦＳＷＤ Ｎ Ａ （Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、 ４５゜６６９−６７４ （１
９８３） ）を採用しているが、この発明の方法は、上
記以外の相料を採用することによっても、実施可能であ
る。
（実施例１）
（１） プロトプラスト細胞の調製
Ｎ−ア七チルムラミダーゼ ８Ｇ（Ｎ−ａｃｅ−ｔｙｌ
＋ｎｕｒａ＋ｎ１ｄａｓｅ ＳＱ ：大日本製薬社製、
Ａｇｒ。
＋ｎｕｒａ＋ｎ１ｄａｓｅ ＳＱ ：大日本製薬社製、
Ａｇｒ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、、３７．７９９−８０８ （１
９７３））を用いて、宿主菌のプロトプラスト化を行な
った。その際、先ず、宿主菌としてのラクトバチルス・
カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）
を、２５０＋ｎ７の下記組成の改変ドフリース（ｄｅＶ
ｒｉ−ｅｓ）培地にて、後述の培養条件に従って培養し
た。
９７３））を用いて、宿主菌のプロトプラスト化を行な
った。その際、先ず、宿主菌としてのラクトバチルス・
カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）
を、２５０＋ｎ７の下記組成の改変ドフリース（ｄｅＶ
ｒｉ−ｅｓ）培地にて、後述の培養条件に従って培養し
た。
すなわち、上記改変ドフリース培地は、培地１Ｅ中に、
ニュトリエントブロス（ディフコ社製） １２ ｇ醇母
エキス（ディフコ社製）５ｇ ツイーン８０ １ ＋ｎ１ Ｋ２ＨＰ（Ｊ４ ３ ｇ ＫＨ２ＰＵ４ Ｌ５ ｇ グルコース ０．４ｇ Ｍｇ５Ｕ４ ・７ Ｈ２ＯＬ １ ｇ Ｍｎ ８０４ ・４ Ｈ２Ｏ０，０２５ｇを含み、最終
ｐＨが６．８に調整されたものである。
エキス（ディフコ社製）５ｇ ツイーン８０ １ ＋ｎ１ Ｋ２ＨＰ（Ｊ４ ３ ｇ ＫＨ２ＰＵ４ Ｌ５ ｇ グルコース ０．４ｇ Ｍｇ５Ｕ４ ・７ Ｈ２ＯＬ １ ｇ Ｍｎ ８０４ ・４ Ｈ２Ｏ０，０２５ｇを含み、最終
ｐＨが６．８に調整されたものである。
上記組成のうち、グルコース、Ｍｇ５Ｕ４・７■１２０
、Ｍｎ５Ｕ４・４ Ｈ２（Ｊに関しては、各々別個に高
圧滅菌後、これらを上記の終末濃度になるように添加し
た。
、Ｍｎ５Ｕ４・４ Ｈ２（Ｊに関しては、各々別個に高
圧滅菌後、これらを上記の終末濃度になるように添加し
た。
次いで、培養を、３７℃、静置条件下にて行なった。そ
して、その際の菌の増殖を、波長６５０ｎｕｎにおける
吸光度（以下、（ＪＤ６ｓｏ と記す）の変化により測
定した。上記条件下で、細胞数約８ Ｘ １０ ／＋ｎ
ｌに至るまで培養した後、菌体を３０＋ｎｔ！ＯＪ ２
０＋ｎＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，８）を用いて
３回洗浄し、３ Ｑ＋ｎＩ！（７Ｊ Ｉ Ｍ蔗糖を含む
２０＋ｎＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐｉ−ｉｓ、ａ）
に対して０１）、５ｏ＝０．３となるように懸濁させた
。この懸濁液に、３μｇ ／＋ｎｌの終末濃度に相当す
るＩＸＪ−アセチルムラミダーゼ ＳＧを加えて、３７
℃にて、２０分間振蕩処理しつつ反応させた後、９．０
００ Ｘ ｇ にて１５分間迎６処理を行なった。
して、その際の菌の増殖を、波長６５０ｎｕｎにおける
吸光度（以下、（ＪＤ６ｓｏ と記す）の変化により測
定した。上記条件下で、細胞数約８ Ｘ １０ ／＋ｎ
ｌに至るまで培養した後、菌体を３０＋ｎｔ！ＯＪ ２
０＋ｎＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，８）を用いて
３回洗浄し、３ Ｑ＋ｎＩ！（７Ｊ Ｉ Ｍ蔗糖を含む
２０＋ｎＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐｉ−ｉｓ、ａ）
に対して０１）、５ｏ＝０．３となるように懸濁させた
。この懸濁液に、３μｇ ／＋ｎｌの終末濃度に相当す
るＩＸＪ−アセチルムラミダーゼ ＳＧを加えて、３７
℃にて、２０分間振蕩処理しつつ反応させた後、９．０
００ Ｘ ｇ にて１５分間迎６処理を行なった。
遠心処理後の上清を吸引により除去して得た沈澱物上に
、１９６（Ｗ／Ｖ） 牛血清アルブミン、１０％（Ｖ／
ｌ） 馬血清、１Ｍ 蔗糖を含有する０、５ｍＩ！ の
２ Ｇ ＋ｎＭリン酸カジカリウム緩衝液ｌ−１５，８
）を静かに加えた後、振蕩処理により、懸濁させて、約
１０細胞／＋ｎｌのプロトプラスト細胞液を得た。
、１９６（Ｗ／Ｖ） 牛血清アルブミン、１０％（Ｖ／
ｌ） 馬血清、１Ｍ 蔗糖を含有する０、５ｍＩ！ の
２ Ｇ ＋ｎＭリン酸カジカリウム緩衝液ｌ−１５，８
）を静かに加えた後、振蕩処理により、懸濁させて、約
１０細胞／＋ｎｌのプロトプラスト細胞液を得た。
（２） リポソームの調製
先ず、供与ＤＮＡを、神阪の方法（Ｊ、Ｑｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、、３７． ２０９−２１４（１９７７））
により精製した。すなわち、Ｊ１ファージ１）ＮＡを、
宿主菌であるラクトバチルス・カゼイ （Ｌａｃｔｏ−
ｂａｃ目１ｕｓ ｃａｓｅｉ ） ＹＩＴ ９０３１に
感染させることにより、該ファージＤＮＡを増殖させ、
該宿主菌を溶菌させて溶菌液を得た後、該溶菌液をＤ
Ｎ ａｓｅ、ＲＮａｓｅで処理して含有されている遊離
の核酸類を分解し、次いで、溶菌液中のファージ粒子を
ポリエチレングリコールを用いて濃縮した。この濃縮さ
れたファージ粒子を、常法の、塩化セシウム密度勾配遠
心法にて精製し、更に、フェノール抽出処理を施して、
供与ＤＮＡ溶液を調製した。こうして得られた供与ＤＮ
Ａと卵黄レシチンとに対して以下に述べる逆相蒸発法を
−施すことにより、供与Ｄ Ｎ Ａ含有リポソームを調
製した。
により精製した。すなわち、Ｊ１ファージ１）ＮＡを、
宿主菌であるラクトバチルス・カゼイ （Ｌａｃｔｏ−
ｂａｃ目１ｕｓ ｃａｓｅｉ ） ＹＩＴ ９０３１に
感染させることにより、該ファージＤＮＡを増殖させ、
該宿主菌を溶菌させて溶菌液を得た後、該溶菌液をＤ
Ｎ ａｓｅ、ＲＮａｓｅで処理して含有されている遊離
の核酸類を分解し、次いで、溶菌液中のファージ粒子を
ポリエチレングリコールを用いて濃縮した。この濃縮さ
れたファージ粒子を、常法の、塩化セシウム密度勾配遠
心法にて精製し、更に、フェノール抽出処理を施して、
供与ＤＮＡ溶液を調製した。こうして得られた供与ＤＮ
Ａと卵黄レシチンとに対して以下に述べる逆相蒸発法を
−施すことにより、供与Ｄ Ｎ Ａ含有リポソームを調
製した。
すなわち、卵黄レシチン ６４．５＋ｎｇ及びＤ型燐脂
質分解酵素（ｐｈｏｓｐＨｏ１ｉｐａｓｅ Ｉ））で部
分加水分解した卵黄レシチン ２１．５＋ｎｇ （Ｐｈ
ｏｓ −ｐｈｏｌｉｐｉｄｓ 、ｇｌｓｅｖｉｅｒ ）
’ｕｂｌｉｓｂｉｎｇ Ｃｏ、。
質分解酵素（ｐｈｏｓｐＨｏ１ｉｐａｓｅ Ｉ））で部
分加水分解した卵黄レシチン ２１．５＋ｎｇ （Ｐｈ
ｏｓ −ｐｈｏｌｉｐｉｄｓ 、ｇｌｓｅｖｉｅｒ ）
’ｕｂｌｉｓｂｉｎｇ Ｃｏ、。
９２−９３ （１，９６４） ）をｌ ｍａｎ Ｈｇに
て充分乾燥した後、これを３ Ｉｎｌのエーテルに溶解
した。これに供与ＤＮＡ ８２μｇを含有する０、４ｍ
ｔ！のＬ”ｒｉｓ−ＥＤＴＡｉ衝液（ｐＨ７，４）と０
．６Ｉｎ／のＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
５０ ＋ｎｔＭ Ｋに７．５０ ＋ｎＭＮａＣ１，０，
１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ７，４）を加えた後、水冷下
で、振蕩処理と１５秒間の超音波処理とを施し、直ちに
、２５℃、４００ ＋ｒｏｎ Ｈｇ の減圧下にて、エ
ーテルを留去した。約８分経過後、これに０．５＋ｎ／
（Ｄ前記ＨＥＰＥＳ緩衝液を追加し、振蕩処理後、再
び２５℃、Ｔ ００ ＋ｎｍ Ｈｇ 、 ２００ ｒｐ
＋ｎにて３０分以上蒸発処理を行なうことにより、残留
エーテルを充分に除去した。
て充分乾燥した後、これを３ Ｉｎｌのエーテルに溶解
した。これに供与ＤＮＡ ８２μｇを含有する０、４ｍ
ｔ！のＬ”ｒｉｓ−ＥＤＴＡｉ衝液（ｐＨ７，４）と０
．６Ｉｎ／のＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
５０ ＋ｎｔＭ Ｋに７．５０ ＋ｎＭＮａＣ１，０，
１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ７，４）を加えた後、水冷下
で、振蕩処理と１５秒間の超音波処理とを施し、直ちに
、２５℃、４００ ＋ｒｏｎ Ｈｇ の減圧下にて、エ
ーテルを留去した。約８分経過後、これに０．５＋ｎ／
（Ｄ前記ＨＥＰＥＳ緩衝液を追加し、振蕩処理後、再
び２５℃、Ｔ ００ ＋ｎｍ Ｈｇ 、 ２００ ｒｐ
＋ｎにて３０分以上蒸発処理を行なうことにより、残留
エーテルを充分に除去した。
こうして得られた粗リポソーム懸濁液を、１＋ｎＩ！の
０．４＋ｎＭマンニトールで希釈しく化学と生物、２０
．１７７−１８４ （１９８２））、３μ＋ｎ及び０＋
４μｍｎのＵｎｉ−Ｐｏｒｅフィルターを使用して連続
濾過（Ｂｉｏｃｂｅ＋ｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔ
ａ、 ５５７ 。
０．４＋ｎＭマンニトールで希釈しく化学と生物、２０
．１７７−１８４ （１９８２））、３μ＋ｎ及び０＋
４μｍｎのＵｎｉ−Ｐｏｒｅフィルターを使用して連続
濾過（Ｂｉｏｃｂｅ＋ｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔ
ａ、 ５５７ 。
９−２３ （１９７９））することにより、上記供与Ｄ
ＮＡを捕捉したリポソームの調製を完了した。
ＮＡを捕捉したリポソームの調製を完了した。
上記（１）項記載の処理にて、調製した新鮮なプロトプ
ラスト液５５μｌと、上記（２）項記載の処理にて、調
製したリポソーム液５μＥとを混合し、３７℃にて３０
分間ブレインキュベートした後、ポリエチレングリコー
ル溶液（２０ｇのポリエチレングリ：ｌ−／ｌ／ ４．
０００．１．４＋ｎｌの２０９６（ｗ／ｖ）牛血清アル
ブミン、２．８＋ｎＩ！ の馬血清及び５．８ｍＡ’（
Ｄ ４ｍＭ ）（ＥＰＨ８（ｐＨ７，４）を混合溶解し
たもの。全量は２８ ＋ｎＩ！。）を１４０／Ｉｔ／加
え、３７℃にて、２分間融合処理を施すことにより、プ
ロトプラスト融合細胞を得た。
ラスト液５５μｌと、上記（２）項記載の処理にて、調
製したリポソーム液５μＥとを混合し、３７℃にて３０
分間ブレインキュベートした後、ポリエチレングリコー
ル溶液（２０ｇのポリエチレングリ：ｌ−／ｌ／ ４．
０００．１．４＋ｎｌの２０９６（ｗ／ｖ）牛血清アル
ブミン、２．８＋ｎＩ！ の馬血清及び５．８ｍＡ’（
Ｄ ４ｍＭ ）（ＥＰＨ８（ｐＨ７，４）を混合溶解し
たもの。全量は２８ ＋ｎＩ！。）を１４０／Ｉｔ／加
え、３７℃にて、２分間融合処理を施すことにより、プ
ロトプラスト融合細胞を得た。
（４）供与ＤＮＡ導入細胞の検出
Ｊ１ファージＩ） Ｎ Ａが導入され、かつ発現した細
胞を寒天重層法（Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｐｈａｇｅ 、
Ｍａｒｋ。
胞を寒天重層法（Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｐｈａｇｅ 、
Ｍａｒｋ。
Ｈ，Ａｄａ＋ｎｓ、 ４５４−４５６． Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、Ｗｉｌｅｙプラスト細胞液２００μｌに、ＩＭ
蔗糖、 １％（Ｗ；／ｖ）牛血清アルフミン、１０９６
（ｖ／ｖ）馬血清、２０＋ｎＭ Ｔｒｉｓ −？ Ｌ／
イン酸緩衝液（ｐＨ６，４）を含有するファージ増殖用
ＭＲＴ培地（Ａｇｒｉｃ。
ｒｋ、Ｗｉｌｅｙプラスト細胞液２００μｌに、ＩＭ
蔗糖、 １％（Ｗ；／ｖ）牛血清アルフミン、１０９６
（ｖ／ｖ）馬血清、２０＋ｎＭ Ｔｒｉｓ −？ Ｌ／
イン酸緩衝液（ｐＨ６，４）を含有するファージ増殖用
ＭＲＴ培地（Ａｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ＋ｎ、 、３５．６６７−６７３
（１９７１）） ：１１！当り、ポリペプトン １０ｇ
、グルコーズ１０ｇ、酢酸ナト°リウム １０ｇ、酵母
エキス ３ｇ、肉エキｙ、３ ｇ、 Ｎａ１ｌ １．５
ｇ、 ＭｇＣ１７４１ｇ、Ｍｇ５Ｕ４−７Ｈ２Ｕ Ｏ，
２ｇ５Ｍｎ５Ｕ４− ）４２０１０＋ｎｇ、Ｆｅ５（Ｊ
４＊ ７Ｈ２０１＋ｎｇを含むもの）を１．８ｍｌ加え
、更に、これを３７℃にて３時間培養して、調製した培
養液１＋ｎＩ！に対して、約１０ 細胞／ｉｎｊ’のラ
クトバチルス・カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉ −１１
＋１Ｓ ｃａｓｅｉ ） ＹＩＴ ９０３１菌液０．５
１ｎｊ’ と、０．５Ｍ 蔗糖を含有する。、 ｓ ％
（ｗ／ｖ）ＭＲＴ軟寒天液９ ｍｌとを添加し、これ
を０．５ Ｍ 蔗糖を含有するＭＲＴ寒天平板上に重層
して、３７℃にて、２４時間培養した後、生じた溶菌斑
を測定した。
（１９７１）） ：１１！当り、ポリペプトン １０ｇ
、グルコーズ１０ｇ、酢酸ナト°リウム １０ｇ、酵母
エキス ３ｇ、肉エキｙ、３ ｇ、 Ｎａ１ｌ １．５
ｇ、 ＭｇＣ１７４１ｇ、Ｍｇ５Ｕ４−７Ｈ２Ｕ Ｏ，
２ｇ５Ｍｎ５Ｕ４− ）４２０１０＋ｎｇ、Ｆｅ５（Ｊ
４＊ ７Ｈ２０１＋ｎｇを含むもの）を１．８ｍｌ加え
、更に、これを３７℃にて３時間培養して、調製した培
養液１＋ｎＩ！に対して、約１０ 細胞／ｉｎｊ’のラ
クトバチルス・カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉ −１１
＋１Ｓ ｃａｓｅｉ ） ＹＩＴ ９０３１菌液０．５
１ｎｊ’ と、０．５Ｍ 蔗糖を含有する。、 ｓ ％
（ｗ／ｖ）ＭＲＴ軟寒天液９ ｍｌとを添加し、これ
を０．５ Ｍ 蔗糖を含有するＭＲＴ寒天平板上に重層
して、３７℃にて、２４時間培養した後、生じた溶菌斑
を測定した。
その結果、検液７ ＋ｎＩ！当り、１５０ ｐ ｆ、
ｕ、（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｔｎＩｎｇ ｕｎｉｔｓ）
の溶菌斑を検出した。検液ｊ＋ｎｌ中には、２．５μｌ
のリポソーム液（最大０．１μｇのＩ）ＮＡを含む）を
含んでいるので、ＤＮＡが導入され、かつ発現する頻度
は、少なくともＤＮＡ分子当り７ Ｘ １Ｏ−８（Ｊ
１フアージＤＮ＾の分子量は２．７Ｘ１０）であること
が判明した。
ｕ、（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｔｎＩｎｇ ｕｎｉｔｓ）
の溶菌斑を検出した。検液ｊ＋ｎｌ中には、２．５μｌ
のリポソーム液（最大０．１μｇのＩ）ＮＡを含む）を
含んでいるので、ＤＮＡが導入され、かつ発現する頻度
は、少なくともＤＮＡ分子当り７ Ｘ １Ｏ−８（Ｊ
１フアージＤＮ＾の分子量は２．７Ｘ１０）であること
が判明した。
（実施例２）
供与ＤＮＡ−とじて、精製したφＦＳＷファージＵＬＮ
Ａを使用した点を除いて、実施例１と同様の処理を施す
ことにより、φＦ８Ｗ ＤＮＡをラクトバチ／ｌ／スｌ
ｌカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）
ＹＩＴ ９０３１ に導入した。
Ａを使用した点を除いて、実施例１と同様の処理を施す
ことにより、φＦ８Ｗ ＤＮＡをラクトバチ／ｌ／スｌ
ｌカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）
ＹＩＴ ９０３１ に導入した。
上記処理のためのφＦＳＷ ＤＮＡに関しては、φＦＳ
ＷファージＤＮＡを、宿主菌であるラクトバチルス・カ
ゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ ）
ＹＩＴ ９０３１に感染させ、増殖、溶菌させて得た溶
菌液を、ポリエチレングリコールで処理して濃縮した後
、これをＤＮａｓｅ。
ＷファージＤＮＡを、宿主菌であるラクトバチルス・カ
ゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ ）
ＹＩＴ ９０３１に感染させ、増殖、溶菌させて得た溶
菌液を、ポリエチレングリコールで処理して濃縮した後
、これをＤＮａｓｅ。
几Ｎａ５ｅで処理して遊離の核酸類を分解除去し、更に
、残余物を常法の塩化セシウム密度勾配遠心法によって
精製して、該ＤＮＡを調製した。
、残余物を常法の塩化セシウム密度勾配遠心法によって
精製して、該ＤＮＡを調製した。
そして、φＦＳＷ ＤＮＡに関しても、ラクトバチルス
’ス”カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａ
−て確認された。
’ス”カゼイ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａ
−て確認された。
Claims (3)
- （１）乳酸桿菌属（ＬａｃｔｏｂａｃｉＮｕｓ属）の細
菌のプロトプラスト又はスフ二ロプラストと、供与１）
ＮＡ （デオキシリボ核酸）を捕捉させたリポソーム（
ｌ １ｐｏｓｏ＋ｎｅ ）とを融合剤の存在下で融合さ
せて、該供与ＤＮＡを乳酸桿菌属の細菌の細胞内に導入
する方法。 - （２）融合剤が、ポリエチレングリコールである特許請
求の範囲第（１）項記載の方法。 - （３）供与ＤＮＡが、有用遺伝情報を保有するＬ）ＮＡ
をファージベクター又はプラスミドベクターに組込んで
作製した組換えＤＮＡ分子である特許請求の範囲第（１
）項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58140257A JPS6030686A (ja) | 1983-07-30 | 1983-07-30 | 乳酸桿菌属の細菌に供与ｄνａを導入する方法 |
| EP84305178A EP0133046A3 (en) | 1983-07-30 | 1984-07-30 | A method of introducing a donor dna into a strain of the genus lactobacillus |
| AU31290/84A AU559308B2 (en) | 1983-07-30 | 1984-07-30 | Liposome encapsulated dna as donation method to transduce lactobacillus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58140257A JPS6030686A (ja) | 1983-07-30 | 1983-07-30 | 乳酸桿菌属の細菌に供与ｄνａを導入する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030686A true JPS6030686A (ja) | 1985-02-16 |
Family
ID=15264573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58140257A Pending JPS6030686A (ja) | 1983-07-30 | 1983-07-30 | 乳酸桿菌属の細菌に供与ｄνａを導入する方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0133046A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6030686A (ja) |
| AU (1) | AU559308B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60239323A (ja) * | 1984-02-20 | 1985-11-28 | ロ−ヌ−プ−ラン・スペシアリテ・シミ−ク | 新規な形態的特徴を持つ酸化第二セリウム及びその製造方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319690A1 (en) * | 1987-11-24 | 1989-06-14 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Method of introducing foreign DNA into certain bacteria |
| WO1991009131A1 (en) * | 1989-12-20 | 1991-06-27 | Valio Finnish Cooperative Dairies Association | Cloning vector for use in lactic acid bacteria |
| US5773221A (en) * | 1995-12-15 | 1998-06-30 | Oceanix Biosciences Corporation | Method of recovering a biological molecule from a recombinant microorganism |
| WO1997049820A1 (en) * | 1996-06-26 | 1997-12-31 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Methods for transferring gene into chromosome |
| EP1634948A1 (en) | 2004-09-10 | 2006-03-15 | Basf Aktiengesellschaft | Means and methods for preventing and/or treating caries |
| EP2133414A1 (en) | 2008-06-11 | 2009-12-16 | Basf Se | Uses and methods for preventing and /or treating oral malodour |
| BR112013016493A2 (pt) | 2011-01-24 | 2016-09-27 | Basf Se | uso de um microrganismo com capacidade de ligação ou fragmento deste, método de preparar uma composição, composição, e, microrganismo com capacidade de ligação ou fragmento deste |
| EP2777405B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-11-21 | Novozymes A/S | Novel Lactobacillus strains and the uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4394448A (en) * | 1978-02-24 | 1983-07-19 | Szoka Jr Francis C | Method of inserting DNA into living cells |
| CH640568A5 (fr) * | 1978-03-16 | 1984-01-13 | Nestle Sa | Procede de production ou maintien d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillus. |
| EP0061253A3 (en) * | 1981-03-18 | 1982-12-08 | Beecham Group Plc | Process for the transfer of genetic material into actinomycete cells, prepared cells and method of culturing these cells and isolating a metabolite |
-
1983
- 1983-07-30 JP JP58140257A patent/JPS6030686A/ja active Pending
-
1984
- 1984-07-30 EP EP84305178A patent/EP0133046A3/en not_active Withdrawn
- 1984-07-30 AU AU31290/84A patent/AU559308B2/en not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60239323A (ja) * | 1984-02-20 | 1985-11-28 | ロ−ヌ−プ−ラン・スペシアリテ・シミ−ク | 新規な形態的特徴を持つ酸化第二セリウム及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3129084A (en) | 1985-01-31 |
| EP0133046A3 (en) | 1986-01-15 |
| EP0133046A2 (en) | 1985-02-13 |
| AU559308B2 (en) | 1987-03-05 |
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