JPS6033475B2 - 固定化アミノアシラ−ゼ酵素及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

明細書 本発明は、ホ乳類、特にブタからアミノアシラーゼ酵素
を単離するための改良方法に関する。 本発明はまた、固定化アミノアシラーゼ酵素製剤及びそ
の製造方法に関する。周知の通り、ブタ腎臓中にはアミ
ノアシラーゼ酵素が最高濃度で存在し、このため、アミ
ノアシラーゼ酵素の公知単離方法においてはブタ腎臓が
原料として用いられる。 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７８，５０３（１９４９）
に記載の方法によれば、ブタ腎臓皮質から次のようにし
てアミノアシラーゼが単離される：ブタ腎臓皮質の水抽
出物を、エタノール濃度が１５％となるように７８％エ
タノールと混合し、混合物を−６℃に１幼時間放置し、
次いで遠０分離し、そして上清のエタノール含量を３０
％に調整する。 得られた液体のｐＨを６．３に調整し、そして混合物を
−１５００にさらに１餌時間放置する。混合物を遠心分
離して沈澱物を除去し、上清のｐＨを５．１に調整し、
そして混合物を再び１幼時間放置する。アミノアシラー
ゼ酵素を含む、分離した沈澱物を遠心分離によって単離
する。得られた物質の比活性は出発抽出物の比活性の約
４倍であり、これは極めて低い精製度に対応する。Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４，４５５（１９５２）には
６個の分別工程及びそれに続く凍結乾燥工程から成る、
ブタ腎臓の水抽出物からアミノアシラーゼを単離するた
めの一連の操作が開示されている。 この方法によれば、目的とする酵素が約３針音（これで
もまだ相対的に低い）の精製度で得られるが、この方法
は前述の方法よりもはるかに労力を要する。凍結乾燥品
の比活性はわずか４６４山筆位／雌である。Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｚ．３３６，１６２（１９６２）に開示された方
法によれば、ブタ腎臓の水抽出物から比活性１５，６８
６単位／収を有するアミノアシラーゼが極めて純粋な状
態で単離され得る。しかしながら、この方法の欠点は、
長時間を要し且つ労力を必要とする９個の分離及び精製
工程からなる点にある。Ｂｉｏｃｈｉｍｉｙａ２２，８
３８（１９５７）に開示された方法によれば、ブタ腎臓
から生成したアセトン粉末が出発物質として適用される
。アセトン粉末を燐酸塩緩衝液で抽出し、抽出物を硫酸
アンモニウムで２工程で飽和し、そして得られた懸濁液
を透析する。透析後に得られた溶液を６０つ０において
５時間熱処理し、次いで硫酸アンモニウム飽和溶液で２
工程で分別する。得られた沈澱物を水に溶解せしめ、溶
液を再び透析し、次いでアセトンで２工程で分別する。
最後の分別工程で得られた沈澱物を水に溶解せしめ、こ
の溶液を蒸留水に対して透析し、次いで凍結乾燥する。
１２個の操作工程から成るこの方法によれば、約１５，
００山単位／ｍｇの比活性を有する生成物を得ることが
できる。 前述のように、公知方法の共通の欠点は、目的とする酵
素が低または中純度で得られること及び適当に純粋な生
成物を製造するのに９〜１２個の精製工程から成る複雑
な一連の操作が必要であることにある。 本発明の目的は、公知方法のこのような欠点を排除する
ことにある。 本発明の新規方法は、実施の容易な精製工程を数個しか
必要とせず、比活性の高い目的アミノアシラーゼを提供
する。本発明は、ブタ腎臓の水抽出物を熱処理し、次い
で遠心分離し、滋酸によって形成された１価カチオンの
塩で上清を飽和し、得られた懸濁液から沈澱物を分離し
、水に溶解せしめ、この溶液を水に対して透析し、そし
て透析した溶液から酵素を分離すると、比活性が約３０
００〜３６０山単位／地のアミノアシラーゼ酵素粉末が
得られ、これは続いて精製することなく直接、固定化ア
ミ／アシラーゼ製剤の製造に使用できるという知見に基
づく。 しかしながら、前述のようにして得られた酵素粉末をク
ロマトグラフィーによる２個の精製工程に付すと、比活
性が約１５，０００単位／雌の極めて純粋なアミノアシ
ラーゼ製品が得られる。このように、たった３個の分離
工程と２個の精製工程とからなる前記方法によれば、目
的とするアミラーゼ酵素が極めて純粋な状態で得られる
。また、前記方法によればブタ腎臓よりもはるかに低濃
度でアミノアシラーゼを含み且つはるかに多量のバラス
ト蛋白質が混入している他のホ乳類の腎臓（たとえば、
ウマ、ウシまたは家兎の腎臓）からでさえ優れた結果を
伴って極めて純粋なアミノアシラ−ゼを単離できること
が観察された。本発明の固定化酵素の原料としての酵素
剤の製造においては、例えばそれ自体公知の方法で製造
された腎臓水抽出物を６０〜８０ｑ○で５〜１５分間熱
処理し、熱処理した混合物を遠心分離し、この上情に一
般式ＫＸＡ（式中、Ｋは１価カチオンを表わし、Ａは鉱
酸のアニオンであり、そしてｘはアニオンの原子価に等
しい）の塩２００〜３００夕／そを加え、得られた懸濁
液を遠心分離し、分離した沈澱物を水中に溶解せしめ、
この溶液を水に対して透析し、そして所望ならば、透析
した溶液または透析物から分離した酵素の、ｐＨ６．５
〜８．５の緩衝液中溶液をアニオン交換クロマトグラフ
ィーに付し、最後に、所望ならば、ク。 マトグラフイー工程で得られた活性フラクションまたは
活性フラクションから一般式ＫＸＡの塩で沈澱せしめら
れた酵素の、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液中溶液を、分
別分子量の上限が７０，０００より大きいゲルフィルタ
ー上でゲルクロマトグラフィ一に付し、そして酵素を前
述のようにして一般式ＸｘＡの塩で活性フラクションか
ら沈澱せしめる。原料酵素剤製造の第１工程においては
、腎臓の水抽出物を６０〜８０００で５〜１流ご間、好
ましくは７０℃で１０分間熱処理する。 この熱処理により、単離すべき酵素に随伴する蛋白質の
大部分を変性させる。変性した蛋白質は表面積の大きい
沈澱物として水溶液から分離する。また、この沈澱物は
清浄器としても作用し、溶解した状態で残された不純物
の大部分を吸収する。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４
，４５５（１９５２）中に論じられている方法に従って
６個の分離工程の後に得られる純度が本発明方法によっ
て３個の分離工程（熱処理、沈澱、透析）後にすでに充
分に鞍近し得る理由は、このことにより説明される。変
性した蛋白質の除去後に得られた水溶液を一般式ｋＸＡ
の塩２００〜３００夕／そ、好ましくは２５０〜２８０
夕／夕、中でも特に２６０〜２７０夕／そと混合して粗
製酵素を沈澱させる。 硫酸アンモニウムを沈澱剤として適用するのが好ましい
が、他の塩、たとえば、塩化アンモニウム、塩化ナトリ
ウム等を同様に使用できる。次いで、分離した沈澱物を
水に溶解せしめ、そしてそれ自体公知の方法に従ってこ
の水溶液を水に対して透析する。所望ならば、それ自体
公知の方法に従って、たとえば、凍結乾燥、噴霧乾燥、
蒸発等によって、透析した溶液から酵素含有固体を分離
できる。 得られた生成物の比活性は、３７０で測定した場合、約
３０００〜３６０山単位／の９であり、これは２０〜２
５倍の精製効率に対応する。この生成物はさらに精製す
ることなくそのまま、固定化酵素製剤の製造に適用でき
る。前述のようにして得られた粗製酵素をさらに精製し
ようとする場合には、透析した溶液から酵素含有固体を
分離することは絶対的に必要というわけではない。 透析した溶液は、場合によってはそのｐＨを調節した後
に、アニオン交換カラムに直接適用できる。アニオン交
換樹脂としてはＤＥＡＥ−セフアデックスＡ−５０のよ
うなセフアデックス樹脂を適用するのが好ましい。出発
物質として固体粗製酵素をアニオン交換クロマトグラフ
ィー中に適用する場合には、この固体は緩衝液、たとえ
ば、０．０９Ｍ燐酸カリウム緩衝水溶液（ｐＨ７．０）
中の溶液としてァニオン交換カラムに適用する。カラム
は酵素の適用前に同緩衝液で平衡させる。イオン交換カ
ラムは塩化ナトリウム、好ましくは０．３モル／その塩
化ナトリウムをさらに含む０．０９Ｍ燐酸カリウム緩衝
水溶液（ｐＨ＝７．０）で溶離するのが好ましいが、適
当なイオン強度を有する他の塩溶液も同様な目的に適用
できる。溶出液の活性フラクションを合し、そして所望
ならば、前述のような沈澱方法によって活性フラクショ
ンから酵素含有固体を分離する。一般に、この溶液１の
こ沈澱剤として一般式舷Ａの塩２００〜３００夕、好ま
しくは２５０〜２８０夕、中でも特に２６０〜２７０夕
、を加える。このためには硫酸アンモニウムを適用する
のが好ましい。分離した固体の比活性は、３７ｑ０で測
定した場合、６０００〜６６０山単位／の９であり、こ
れは出発抽出物に関して４０〜４３音の精製効率に対応
する。前述のようにして得られた、部分精製酵素をさら
に精製しようとする場合には、溶出液の活性フラクショ
ンから酵素含有固体を分離することが絶対的に必要とい
うわけではない。 活性フラクションは、場合によってはそのｐＨを調整し
た後に、ゲルカラム上に直接適用できる。セフアデック
スＧ一２００のようなセフアデツクスゲルを、ゲルクロ
マトグラフィ一による精製に適用するのが好ましい。し
かしながら、この精製操作には、分別分子量範囲の上限
が７０，０００より大きいようなゲルのみが適用できる
。ゲルクロマトグラフィ一に出発物質として酵素含有固
体を適用する場合には、この固体は緩衝液、たとえば、
０．０８Ｍ燐酸カリウム緩衝水溶液（ｐＨ＝７．０）中
の溶液としてゲルカラム上に適用する。ゲルカラムは、
酵素を加える前に同緩衝液で平衡させる。ゲルカラムは
０．０８Ｍ燐酸カリウム緩衝水溶液（ｐＨ＝７．０）で
溶雛するのが好ましいが、他の稀薄緩衝水溶液を適用す
ることもできる。溶出液の活性フラクションを合し、次
いで前述の沈澱方法によって溶液から酵素を分離させる
。この溶液１〆に沈澱剤として一般式ＫｘＡの塩を一般
に２００〜３００９、好ましくは２５０〜２８０夕、中
でも特に２６０〜２７０夕加える。このために硫酸アン
モニウムを適用するのが好ましい。分離した酵素の比清
性は、３７０で測定した場合、約１５，００山単位／雌
であり、すなわち、生成物の純度は極めて良好である。
上記の方法に従って得られた粗製の、部分精製された酵
素含有固体及びさらに精製された酵素含有固体を固定化
アミノアシラーゼの製造に有利に適用できる。 周知の通り、固定化アミノアシラ−ゼ製剤はＤＬ−アミ
ノ酸の分割に広く使用される。ブタ腎臓から単離された
酵素または微生物起源の酵素から出発してアミノアシラ
ーゼを固定する数種の方法がこれまでに開示されている
。 Ｊ．ＡｍＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４０２４（１９５９
）及びＣｏｉｌ．ＣｚｅｃｈＣｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．
３６，２３９８（１９７１）に論じられた方法によれば
、アミノアシラーゼをイオン結合によってＤＥＡＥセル
ロースに結合させる。しかしながら、アミノアシラーゼ
は共有結合によっても固定できる。公知方法の１つによ
れば、支持体としてＮ，Ｎ−メチレンーピス（アクリル
アミド）と架橋したアクリルアミドーメタクリレートコ
ポリマーを用い、この支持体をヒドラジンで処理し、次
いで塩酸の存在下において亜硝酸ナトリウムで活性化し
、最後に得られた酸アジド‘こ酵素をカップリングさせ
る〔Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ似ｅｓ４，３５０（１９７１
）〕。別の公知方法によれば、ェンズアクリル（Ｅｎｚ
ａｃｒｙｌ）ＡＡ型支持体（芳香族アミノ基を含むポリ
ァクリルアミド誘導体）を塩酸の存在下で亜硝酸ナトリ
ウムで活性化し、そして得られたジアゾ誘導体に酵素を
カップリングさせる〔Ｃｏｉｌ，Ｃｚｅｃｈ，Ｃｈｅｍ
，Ｃｏｍｍ肌，３８，９４３（１９７３）〕。 公知の固定方法は、比活性の低い固定化酵素製剤を提供
するという共通の欠点を有する。本発明者らは以外にも
、アクリルアミドとＮ，Ｎ′ーメチレンービス（アクリ
ルアミド）とのアクリレックス（Ａｋｍｅｘ）Ｐ型コポ
リマーの部分加水分解によって製造された支持体上にア
ミノアシラーゼ酵素を固定すると、公知の固定方法の場
合よりも少なくとも２桁大きい比活性を有する固定化酵
素製剤が得られることを見し、出した。 前記アクリレツクスＰ型コポリマーは、Ｎ，Ｎ′−メチ
レンービスーアクリルアミドにより架橋されたアクリル
アミドポリマーであり、これを部分的に加水分解するこ
とによりポリマー中のアクリルアミド成分の一部分がア
クリル酸となる。このため本発明に使用するコポリマー
はアクリルアミド、アクリル酸及びＮ，Ｎ′−メチレン
ービスーアクリルアミドから成るコポリマーである。ア
クリレツクスＰ型アクリルアミドーＮ，Ｎ′−メチレソ
−ビス（アクリルアミド）コポリマービーズ（アクリレ
ツクスＰ−３０，Ｐ−１００及びＰ 一２００）はハン
ガリーのＲｅａｎａＩＦｉｎｏｍｖｅｇ＄ｚｅｒｇの′
ｒによって市販されている。 このコポリマーを酸（たとえば、塩酸または別の強酸）
またはアルカリ（たとえば、水酸化ナトリウム、炭酸ナ
トリウムまたは別の強塩基）で加水分解すると、一ＣＯ
−ＮＨ２基の約５０％がカルボキシ基に変換されるが、
残りの−ＣＯ−ＮＨ２基は過酷な反応条件でも加水分解
されない。その結果、未変化一ＣＯ−Ｎは基は加水分解
されたコポリマー中においてカルボキシ基とカルボキシ
基の間に位置し、カルボキシ基を好ましくは立体位置に
固定する。それ自体公知のヵ′レボジィミド清隆方法で
アミノアシラーゼ酵素をカルポキシ基にカップリングさ
せる場合には、カルボキシ基の立体位置が好ましいため
に個々の固定イ坊酵素分子は互いに他の機能を妨害せず
、従って、固定酵素製剤は極めて高い比活性を有する。
前記知見に基づき、本発明は、固定化アミノアシラーゼ
酵素及びその製造方法を提供する。 固定化アミノアシラーゼはアクリルアミド−Ｎ．Ｎ′−
メチレンービス（アクリルアミド）ポリマーの部分加水
分解によって生成するアクリルアミド、アクリル酸及び
Ｎ，Ｎ′ーメチレンービスーアクリルアミドのコポリマ
ーと、該コポリマーに共有結合により結合したアミノァ
シラーゼ酵素とから成り、その製造方法は、前記のコポ
リマ−を、水に可溶であるカルボジィミド化合物又は有
機溶媒に０℃以下の温度において可溶であるカルポジィ
ミド化合物で処理し、得られた活性支持体にｐＨ６．５
〜８．５のアミノアシラーゼ溶液を適用し、得られた生
成物を洗浄し、そして所望により乾燥することを特徴と
する。前記方法では、任意の方法で単離された任意の起
源のアミノアシラーゼを酵素として適用できるが、前述
の新規方法によればホ乳類の腎臓から単離した酵素を出
発物質として使用するのが好ましい。 部分加水分解されたアクリレツクスＰ型コポリマーを活
性化するために、たとえば、１ーシクロヘキシル−３一
（２−モルホリノヱチル）−力ルボジイミドメトーｐ−
トルヱンスルホネートまたは１ーエチル−３−（３ージ
メチルアミノプロピル）−カルボジィミドをカルポジィ
ミド化合物として適用できる。 このためには水溶性カルポジィミドを用いるのが好まし
い。有機溶媒中にのみ可溶なカルボジィミド化合物とし
ては、低温でも、すなわち、０℃以下でも所定の有機溶
媒に適当に可溶なものを本発明方法に適用できｐＨ６．
５〜８．５の溶液から、好ましくはほとんど中性の溶液
（ｐＨ約７．０）から活性化支持体上にアミノアシラー
ゼを適用する。アミノアシラーゼは０．１Ｍ燐酸カリウ
ム緩衝液４ｐＨ＝７．０）で形成された溶液として適用
するのが好ましい。カップリング反応において得られる
固定イＱ酵素製剤をそれ自体公知の方法で洗浄し、所望
ならば、次いで乾燥する。 しかしながら、酵素製剤はまた、適当な安定剤、たとえ
ば、アジ化ナトリウムの存在下において水性懸濁液とし
て貯蔵することもできる。本発明に従って製造される固
定化酵素製剤の比活性は１５０〜２０山単位／側（キセ
ロゲル）であり、これはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ
４，３５０（１９７１）に論じられた方法によって得ら
れる０．５５〜２．２４単位／雌（キセロゲル）の比活
性に比較して少なくとも２桁の活性増加を表わす。 新規な固定化酵素製剤を試験したところ、意外にも、ア
ルカリ性のｐＨ域における酵素の安定性が固定時に増大
することが判明した。 この現象はＤＬーアミノ酸の酵素による分割に固定化酵
素製剤を適用する場合に極めて有利である。周知の通り
、ＤＬ−アミノ酸の酵素による分割はｐＨ約７．５にお
いて最大速度で進行し、反応速度はｐＨ値の低下につれ
て減少する。反応混合物のｐＨは分割の進行につれて絶
えず酸性側にシフトするので、反応速度は経時的に減少
し続ける。アルカリ性のｐＨ領域における安定性が増大
した、本発明に係る新規な酵素製剤をＤＬーアミノ酸の
分割に適用する場合には、通常よりも高いｐＨで分割を
開始でき、これにより、ｐＨの連続的低下の減速効果を
補うことができる。本発明を以下の非限定的な例によっ
て詳細に説明する。 例１ 原料酵素の調製例精製ブタ腎臓ｌｋ９を微粉砕し
、次いで冷（十４℃）蒸留水２そでホモジネートする。 ホモジネートを氷水裕上で１時間燈拝し、次いで遠心分
離する。上清を６０ｏｏに加熱し、同温度に１５分間保
持し、次いで氷水浴中で冷却し、そして遠心分離する。
この上情に硫酸アンモニウム２８０夕を加え、混合物を
一夜放置し、次いで得られた懸濁液を遠心分離する。沈
澱物を少量の冷（十４℃）蒸留水に溶解せしめ、そして
この溶液を蒸留水に対して透析して塩を除去する。然る
後に、透析した溶液を炉過し、そしてこの炉液を凍結乾
燥する。その結果、アミノアシラーゼ４．２夕を得る。
活性：Ｎーアセチル−Ｌ−メチオニン１０００マイクロ
モルの加水分解／時間／雌蛋白質。例２ 原料酵素の調
製例 精製ブタ腎臓ｌｋ９を微粉砕し、次いで冷（十４℃）蒸
留水２そでホモジネートする。 ホモジネートを氷水裕上で１時間燈拝し、次いで遠心分
離する。上情を８０ｑ０に加熱し、同温度に５分間保持
し、次いで氷水裕中で冷却し、そして遠心分離する。こ
の上情に硫酸アンモニウム３５９夕を加え、混合物を一
夜放置し、そして得られた懸濁液を遠心分離する。沈澱
物を少量の冷（十４００）蒸留水中に溶解せしめ、そし
てこの溶液を蒸留水に対して透析して塩を除去する。透
析した溶液を炉過し、そして炉液を凍結乾燥する。その
結果、アミノアシラーゼ１．１夕を得る。活性：Ｎーア
セチル−Ｌ−メチオニン８００マイクロモルの加水分解
／時間／机９蛋白質。例３ 原料酵素の調製例 精製ブタ腎臓８ｋｇを微粉砕し、次いで冷（十４℃）蒸
留水１６そでホモジネートする。 ホモジネートを氷水字谷上で１時間婿拝し、次いで遠心
分離する。上７青を７０００に加熱し、同温度に１０分
間保持し、次いで氷水浴中で冷却し、そして遠心分離す
る。この上清に硫酸アンモニウム２５５４夕を加え、混
合物を一夜放置し、そして得られた懸濁液を遠心分離す
る。沈澱物を少量の冷（十４℃）蒸留水中に溶解せしめ
、そしてこの溶液を蒸留水に対して透析して塩を除去す
る。透析した溶液を病過し、そして炉液を凍結乾燥する
。その結果、ァミノアシラーゼ７．２夕を得る。活性：
Ｎ−アセチル−Ｌーメチオニン２７３５マイクロモルの
加水分解／時間／ｍ９蛋白質。例４ 原料酵素の調製例 精製ウシ（ｃａ比ｌｅ）腎臓３．６ｋ９を微粉砕し、そ
して冷（十４℃）蒸留水７．２そでホモジネートする。 ホモジネートを氷水裕上で１時間蝿拝し、次いで遠心分
離する。上清を７０００に加熱し、同温度に１０分間保
持し、次いで氷水裕中で冷却し、そして遠心分離する。
この上清に硫酸アンモニウム１２３４夕を加え、混合物
を一夜放置し、そして得られた懸濁液を遠心分離する。
沈澱物を少量の袷（十４００）蒸留水中に溶解せしめ、
そしてこの溶液を蒸留水に対して透析して塩を除去する
。透析した溶液を炉遇し、そして炉液を凍結乾燥する。
その結果、アミノアシラーゼ３．４夕を得る。活性：Ｎ
−アセチル−Ｌーメチオニン７９１マイクロモルの加水
分解／時間／の９蛋白質。例５ 原料酵素の調製例 精製ウマ腎臓２．５ｋ９を微粉砕し、次いで、冷（十４
℃）蒸留水５そでホモジネートする。 ホモジネートを氷水浴上で１時間損拝し、次いで遠心分
離する。上清を７０００に加熱し、同温度に１び分間保
持し、次いで、氷水裕中で冷却し、そして遠心分離する
。この上清に硫酸アンモニウム１２００夕を加え、混合
物を一夜放置し、そして得られた懸濁液を遠心分離する
。沈澱物を少量の冷（十４００）蒸留水中に溶解せしめ
、そして溶液を蒸留水に対して透析して塩を除去する。
透析した溶液を炉遇し、そしてこの炉液を凍結乾燥する
。その結果、アミノアシラーゼ３．８夕を得る。活性：
Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン３１９マイクロモルの加
水分解／時間／の９蛋白質。例６ 原料酵素の調製例 例３に記載の方法により製造したブタ腎臓アミノアシラ
ーゼ３夕を０．０９Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ；７．
０）中に溶解せしめ、そしてこの溶液に、あらかじめ同
緩衝液で平衡させたＤＥＡＥセフアデックスＡ−５の鞍
脂５夕を加える。 得られた懸濁液を氷水浴上で３時間婿拝し、次いで冷蔵
庫中に十４℃で一夜放置する。翌日、樹脂を前記緩衝液
各１そで３回洗浄し、次いで同緩衝液１そ中に取り、そ
して懸濁液を直径５．３ｃｍ及び高さ５５ｃののカラム
に充填する。樹脂カラムを、塩化ナトリウム０．３モル
をさらに含む０．０Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ＦＨ＝７．
０）で２００の上／時間の流速で溶離する。溶出液を各
フラクション１００地ずつで回収する。酵素活性を示す
フラクションを合し、そして得られた溶液に硫酸アンモ
ニウム８０夕を加える。その結果、アミノアシラーゼ０
．７夕を得る。活性：Ｎ−アセチルーＬーメチオニン５
２４０マイクロモルの加水分解／時間／雌蛋白質。例７
原料酵素の調製例 例６に記載の方法により製造した、蛋白質５７の夕を含
む酵素懸濁液２５のＺを遠心分離し、そして沈澱物を０
．０９Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）９Ｍ中に
溶解せしめる。 あらかじめ同緩衝液で平衡させたセフアデックスＧ−２
００ゲルを充填した、直径２．４弧及び高さ４３仇のカ
ラムの上部にこの溶液を加える。ゲルカラムを同緩衝液
で流速６０の【／時間で熔離させる。溶出液を各フラク
ション５の【ずつ回収する。酵素活性を示すフラクショ
ンを合し、そしてこの溶液に硫酸アンモニウム９夕を加
える。その結果、アミノアシラーゼ２５の９を得る。活
性：Ｎーアセチル−Ｌ−メチオニン１０，０００マイク
ロモルの加水分解／時間／の９蛋白質。例８ 支持体材
料の調製アクリレツクス（Ａｋｒｉｌｅｘ）Ｐ−１００
キセロゲル３０夕をＩＮ水酸化ナトリウム水溶液１そ中
に懸濁せしめ、そして懸濁液を５０ｏｏに３時間保持す
る。 然る後、膨潤したゲルを中性になるまで蒸留水１２そで
洗浄し、次いで０．０州塩酸水溶液１０．５そで洗浄を
続ける。然る後に、ゲルを蒸留水３０そで洗浄し、次い
で凍結乾燥する。その結果、支持体材料を得る：結合熊
：６．１４ミリ当量／夕。例９ 固定化アミノアシラー
ゼの製造 例８に記載の方法により調製したキセロゲル１０夕を燐
酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）５００の【中に懸濁
せしめ、そして絶えず損拝し且つ氷水格で冷却しながら
この懸濁液に、１ーシクロヘキシル−３−（２ーモルホ
リノエチル）ーカルボジイミドメト−ｐ−トルェンスル
ホネート（２０夕）の冷（十４００）緩衝溶液（２５０
の‘）中溶液を加える。 蝿拝の１０分後に、例３に記載の方法により製造したア
ミノアシラーゼ（５・のの冷（十４００）緩衝溶液（２
５０の【）中溶液を加え、そして得られた懸濁液を十４
℃で４斑時間健梓する。ゲルを分離し、そしてｏ．ＩＭ
燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）各１そで３回、塩
化ナトリウム０．５モルをさらに含む０．１Ｍ燐酸力Ｉ
Ｊウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）各１そで３回及び０．１
Ｍ燐酸カリウム緩衝液各１そで３回、順次洗浄する。ゲ
ルを蒸留水各２．５ぐずつで４回洗浄して塩を除去し、
次いで凍結乾燥する。その結果、固定化アミノアシラー
ゼ製剤１８夕を得る。活性：Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオ
ニン１５８マイクロモルの加水分解／時間／の９乾燥物
質。例１０ 固定化ァミノアシラーゼの製造 例８に記載の方法により調製したキセロゲル１０夕を０
．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）５００の【
中に懸濁せしめ、そして絶えず鷹拝し且つ氷水格で冷却
しながらこの懸濁液に、１ーェチル−３−（３′ージメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド（１０夕）の袷
（十４℃）緩衝溶液（２５０の【）中溶液を加える。 損杵の１び分後に、例３に言己戦の方法により調製した
アミノアシラーゼ４５夕）の冷（十４℃）緩衝溶液（２
５０机‘）中溶液を加え、そして得られた懸濁液を十４
℃で４報時間燈梓する。ゲルを分離し、そして０．１Ｍ
燐酸カリウム各１そで３回、塩化ナトリウム０．３モル
をさらに含む０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液各１そで３回
及び０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）各１
そで３回洗浄する。ゲルを蒸留水各２．５そで４回洗浄
して塩を除去し、次いで凍結乾燥する。その結果、固定
化アミノアシラーゼ製剤１６夕を得る。活性：Ｎーアセ
チル−Ｌ−メチオニン２０２マイクロモルの加水分解／
時間／川９乾燥物質。例１１ 固定化酵素の使用例 例１０に従って製造した固定化アミノアシラーゼ酵素剤
６０夕を、直径５．５孤高さ７０ｃｍのガラスカラムに
充填し、そして０．１〜０．７モル／そのＮ−アセチル
−ＤＬ−アミノ酸を含有する水溶液を１ク／時の流速で
前記カラムに通す。 前記の水溶液はｐＨの利水酸化ナトリウム水溶液により
８．５に調整しておく。カラムの温度を３７０とする。
脱アシル化の進行を、ニンヒドリンによって遊離Ｌ−ア
ミノ酸量を測定することにより監視する。カラムからの
流出液を画分として集め、各画分のＮ−アシルーＬ−ア
ミノ酸の含量を、アミノアシラーゼを用いて酵素的に測
定する。この測定により不完全な脱アシル化が示される
場合、その画分のｐＨを８．５に調整し、そして得られ
た溶液を再度カラムに適用する。Ｌ−アミノ酸及びＮ−
アセチル−Ｄーアミノ酸のみを含有する（すなわち、Ｎ
−アセチル−Ｌ−アミノ酸を含有しない）流出液を氷酢
酸によりｐＨ５に酸性化し、この溶液を炭素で脱色し、
炉過し、そしてこの炉液を、真空中４ぴ○〜６０ｏｏに
おいて、結晶化が始まるまで蒸発せしめる。 濃縮物を４℃の冷蔵室に２日間放置し、次に、分離した
結晶Ｌ−アミノ酸をＧ−４糠結ガラスフィルター上で炉
取し、エタノール又はメタノールで洗浄し、そして乾燥
する。この結晶イリ段階を母液を用いて反復し、Ｌーア
ミノ酸の第２取得物を得る。２つのＬ−アミノ酸取得物
を一緒にし、そして８０％エタノール水溶液又は５０％
メタノール水溶液から再結晶化する。 Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸及び少量のＬ−アミノ酸を
含有する第２結晶イひ段階からの母液を蒸発させてシロ
ップにし、このシロップをバリオン（Ｖａｒｉｏｎ）Ｋ
Ｓタイプのイオン交換樹脂（ニトロケミア、ハンガリー
、によって製造されたもの）上でイオン交換クロマトグ
ラフィーにかける。 Ｎ−アセチル−Ｄーアミノ酸を含有する得られた溶液を
、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ〔メソド・イン・エンチモロジ
ー（Ｍｅ仇ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｖｏ
１３．５５４頁、Ｃｏｌｏ泌ｃｋＳ．Ｐ．及びＫａｐｌ
ａｎＮ．○．編、アカデミック・プレス、ニューヨーク
、１９５７〕の方法に従って脱アシル化する。得られた
Ｄ−アミノ酸を８０％エタノール水溶液又は５０％メタ
ノール水溶液から結晶化する。この方法により、Ｌーア
ミノ酸が７０％以上の収率で得られ、そしてＤ−アミノ
酸が４０％以上の収率で得られる。 例１２ 固定化酵素の使用例 １６６ｋ９のＮ−アセチル−ＤＬ−アラニンを１８００
その水に溶解し、卵水酸化ナトリウム水溶液を用いて溶
液のｐＨを８．５に調整する。 例１０に記載したようにして製造した固定化アミノアシ
ラーゼ酵素剤６０夕を、直径５．５孤高さ７０弧のガラ
スカラムに充填し、これに前記の溶液を通す。流速を１
夕／時に調整し、カラム温度を３７０とする。流出液を
氷酢酸によりｐＨ５に酸性化し、溶液を炭素で脱色し、
炉過し、そして炉液を真空中４０ｑ○〜６０ｑｏにおい
て、結晶化が始まるまで蒸発せしめる。この濃縮物を、
４℃の冷蔵室中で２日間放置し、次に、Ｌーアラニンの
分離した結晶をＧ−タイプの焼結ガラスフィルター上で
炉取し、メタノールで洗浄し、そして乾燥する。母液を
用いて上記の結晶化段階を反復し、Ｌ−アラニンの第２
取得物を得る。 Ｌ−ァラニンの２つの収得物を一緒にし、そして５０％
のメタノール水溶液から再結晶し、３９．５ｋｇのＬ−
アラニンを得る。〔Ｑ〕多＝十１４．３０（ｃ＝４％、
鮒塩酸）。窒素舎量１５．４２％（キュルダー法により
測定）。ＮーアセチルーＤーアラニン及び少量のＬーア
ラニンを含有する第２結晶段階から得られた母液を蒸発
せしてシロップにし、このシロップを、バリオンＫＳ樹
脂上でイオン交換クロマトグラフィーにかけＬ−アラニ
ンを除去する。Ｎーアセチル−Ｄ−アラニンを含有する
得られた混合物をＧｒｅｅｎｓｔｅｉｎの方法（例１１
を参照のこと）に従って脱アシル化する。Ｄーアラニン
を５０％メタノール水溶液から結晶化し２５．０ｋ９の
生成物を得る。

〔０〕容＝−１４．５０（ｃ＝４％、鮒
塩酸）。窒素舎量１５．４８％（キュルダール法により
測定）。例１３ 固定化酵素の使用例２２．４２ｋｇの
Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンを１６８その水に溶解
し、州水酸化ナトリウム溶液により上記溶液のｐＨを８
．５に調整する。 例１０に記載した方法により製造した固定化アミノアシ
ラーゼ酵素標品６０夕を直径５．５ｃｍ高さ７０ｃｍの
ガラスカラムに充填し、これに前記の溶液を通す。流速
を１そ／時に調整し、カラム温度を３７０のこする。流
出液を氷酢酸によりｐＨ５に酸性化し、この溶液を炭素
で脱色し、炉遇し、そして炉液を真空中４０〜６０℃に
て、結晶化が始まるまで濃縮する。この濃縮物を４℃の
冷蔵室に２日間放置し、次にＬ−メチオニンの分離した
結晶をＧ−４タイプの鱗給ガスフィルター上で７戸取し
、エタノールで洗浄し、そして乾燥する。母液を用いて
上記の結晶化段階を反復し、Ｌ−メチオニンの第２の収
得物を得る。 Ｌ−メチオニンの２つの収得物を一緒にし、そして８０
％エタノール水溶液から再結晶化し、７．３８ｋ９のＬ
−メチオニンを得る。〔ｏ〕色ｏ＝十２２．００（ｃ＝
５％、鮒塩酸）。窒素含量９．２７％（キュルダー法に
より測定）。Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン及び少量の
Ｌ−メチオニンを含有する第２結晶化段階から得られた
母液を蒸発せしめてシロップにし、シロップをバリオン
ＫＳ樹脂上でイオン交換クロマトグラフィーにかけるこ
とによりＬ−メチオニンを除去する。 Ｎーアセチル−Ｄ−メチオニンを含有する得られた混合
物を、Ｇｅｅｎｓｔｅｉｎ（例１１を参照のこと）の方
法に従って処理しＤーメチオニンを得る。この物質を８
０％エタノール水溶液から結晶化し３．８ｋ９のＤーメ
チオニンを得る。〔Ｑ〕色ｏ＝２２．００（ｃ＝５％、
が塩酸）。窒素含量９．２５％（キュルダール法により
測定）。例１４ 固定イ技酵素の使用例 １２．１５ｋ９のＮ−アセチル−Ｌ−バリンを７６４そ
の水に溶解し、印水酸化ナトリウム水溶液により上記溶
液のｐＨを８．５に調整する。 例１０に記載した方法により製造した固定化アミノアシ
ラーゼ酵素６０夕を、直径５．５伽高さ７０地のガラス
カラムに充填し、これに前記溶液を通す。流速を１〆／
時に調整し、カラム温度を３７０とする。流出液を氷酢
酸によってｐＨ５に酸性化し、この溶液を炭素で脱色し
、炉遇し、そして炉液を真空中４０ｑｏ〜６０℃にて、
結晶化が始まるまで蒸発せしめる。この濃縮物を４℃の
冷蔵室に２日間放置し、次に、Ｌーバリンの分離した結
晶をＧ−４タイプの焼結ガラスフィルター上で炉取し、
エタノールで洗浄し、そして乾燥する。母液を用いて上
記の結晶イロ郷皆を反復し、Ｌ−バリンの第２収得物を
得る。 Ｌ−バリンの２つの取得物を一緒にし、８０％エタノー
ル水溶液から再結晶化し、３．１３ｋ９のＬーバリンを
得る。〔Ｑ〕色ｏ＝＋２３．７０（ｃ＝４，鮒塩酸）。
窒素舎量１１．８２％（キュルダール法により測定）。
例１５ 比較例 この発明の固定化アミノァシラーゼ酵素製品を例１１〜
１４に記載した様にして使用する場合、その触媒活性が
長時間維持される。 すなわち、例えば例１３と同様にして、この発明の固定
化酵素によりＮ−アセチル−ＤＬーメチオニンを脱アシ
ルした場合、８０日間の連続運転の後、触媒活性の喪失
は約１０％であった。この発明の固定化酵素を最適ｐＨ
条件（ＰＨ７．５）のもとで７０００にて熱処理した場
合、６０分間の熱処理の後の触媒活性の喪失は５０％で
ある。 これに対して、溶解した酵素を最適ｐＨ条件（ｐＨ７．
０）のもとで７０ｏｏにて熱処理した場合、１び分間の
インキュベーションの後、酵素は完全に不活性化される
。文献に記載されている固定化ァミノァシラーゼ製品に
ついて下記の安定性データ−が得られた。エンチモロジ
ア（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ）３１，１５（１９６６）
に記載されている方法によって調製したＤＥＡＥ−セル
ロースーアミノアシラーゼ：力ラム中で１７日間連続使
用した後、その活性の喪失は４０％であった。アグリカ
ルチユラル・アンド．バイオロジカル．ケミストリ−（
Ａｇｒ．Ｂｊｏｌ．Ｃｈｅｍ．）３３，１０４７（１９
６９）に記載されている方法により調製したＤＥＡＥ−
セフアデツクスーアミノアシラーゼ：力ラム中で使用し
た場合、３２日間の連続使用の後、活性の喪失は４０％
であった。 ／ゞイオテクノロジーアンド・／ゞイオエワジニアリン
グ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｂｉｏｅｎｇ．）９，６０３（
１９６７）に記載されている方法により調製したＤＥＡ
Ｅ−セフアデツクスーアミノアシラーゼ：カラム中で使
用した場合、２０日間の連続使用後、活性の喪失は３５
〜６０％であった。 アーチブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフイジツクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈ侭．）１４７，７８８（１９７１）に記載されている
ィオドアセチルーセルロースーアミノアシラーゼ標品：
溶解酵素は８０００にて１０分間の熱処理の後完全に不
活性化された。 固定化酵素は同じ条件下で５０％の活性を維持した。ア
グリカルチユラル・アンド・バイオロシカル・ケミスト
リー（Ａｇｒ・Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）３塾＠ １５４
５（１９７５）に記載されているポーラス状ガラスビー
ズ上に固定化されたアミノアシラーゼ：３７０にてカラ
ム中で運転した場合、４０日間の運転サイクル中でゆる
やかな不活性化が著者により観察された。 この酵素の半減期は７８日であった。エンチモロジア（
Ｅｎｚのｍｏｌｏｇｉａ）４３，２１３（１９７２）は
ポリアクリルアミドゲルに捕捉されたアミノアシラーゼ
標品を記載している。 この標品は３７０にてカラム中で使用した場合、２０日
後に１０〜２０％の活性の喪失を示す。バイオテクロロ
ジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎ．Ｂｉｏｅｎｇ．）２１，４７７（１９７６）に記
載されている、アミノ−へキシルーセルロ−ス複合体上
に固定化されたアミノアシラーゼ：３７℃にてカラム中
で使用した場合、２０日間の半減期を有する。 すなわち２０日間の使用の後、わずか５０％の活性が維
持される。以上のデータは、この発明の固定化アミノァ
シラーゼ酵素製品が、公知の固定化アミノアシラ−ゼ製
品に比べて非常に安定であることを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクリルアミド−Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス（アク
   リルアミド）ポリマーの部分加水分解によつて生成する
   アクリルアミド、アクリル酸及びＮ，Ｎ′−メチレン−
   ビス−アクリルアミドのコポリマーと、該コポリマーに
   共有結合により結合したアミノアシラーゼ酵素とから成
   る固定化アミノアシラーゼ酵素。 ２ アクリルアミド−Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス（アク
   リルアミド）ポリマーの部分加水分解によつて生成する
   アクリルアミド、アクリル酸及びＮ，Ｎ′−メチレン−
   ビスアクリルアミドのコポリマーを、水に可溶であるカ
   ルボジイミド化合物又は有機溶媒に０℃以下の温度にお
   いて可溶であるカルボジイミド化合物で処理し、得られ
   た活性化支持体にｐＨ６．５〜８．５のアミノアシラー
   ゼ溶液を適用し、得られた生成物を洗浄し、そして所望
   により乾燥することを特徴とする、アクリルアミド−Ｎ
   ，Ｎ′−メチレン−ビス（アクリルアミド）ポリマーの
   部分加水分解によつて生成するアクリルアミド、アクリ
   ル酸及びＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドの
   コポリマーと該コポリマーに共有結合により結合したア
   ミノアシラーゼ酵素とから成る固定化アミノアシラーゼ
   酵素の製造方法。