JPH01285193A - Ｄ−アスパラギン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗生物質の修飾剤等として極めて有用な、Ｄ
−アスパラギン酸の製造方法に関する。

（従来技術および発明が解決しようとする課題）従来、
酵素法によりＤ−アスパラギン酸を製造する方法として
は、５−置換ＬダントインにＤ−ヒダントイナーゼを作
用させる方法（特公昭５６−１９０９号）やＮ−アセチ
ル−Ｄ−アスパラギン酸にＤ−アミノアシラーゼを作用
させる方法（特公昭５３−３６０３５号）などが知られ
ている。

しかし、これらの方法は高価な基質を使用したり、原理
的に原料の半分しか目的のＤ−アスパラギン酸に変換で
きないなど、経済的に優れた方法とはいえない。

また、我々は、上記の問題を解決する方法として、アミ
ノ基供与体り−アミノ酸を再生する酵素系を利用した、
オキサロ酢酸とアミノ基供与体り一アミノ酸からのＤ−
アミノ酸トランスアミナーゼ（Ｄ−アラニンアミノトラ
ンスフェラーゼ；ＥＣ２，６，１，２１，以下、Ｄ−Ａ
ＴＡと示す）の作用によるＤ−アスパラギン酸の製法を
見出だしく特開昭６２−２０５７９０号）、さらに研究
を進めている。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、Ｄ−ＡＴＡを利用し、安価な原料からＤ
−アスパラギン酸を製造する方法を確立するべく鋭意研
究した結果、アミノ基供与体り−アミノ酸を再生する酵
素系に付随するＮＡＤＨ再生系として、リンゴ酸および
リンゴ酸脱水素酵素（以下、ＭＤＩと示す）系を利用す
ると、原料ケト酸であるオキサロ酢酸までもが生成され
、利用できることに着目し、本発明を完成させた。

即ち本発明は、ＭＤＨ、アラニン脱水素酵素（以下、Ａ
１　ａＤＨと示す）、アラニンラセマーゼ（以下、Ａｌ
ａＲと示す）、およびＤ−ＡＴＡを共役させることによ
り、微量のアラニンおよびＮＡＤ＋の存在下、し−リン
ゴ酸とアンモニアからＤ−アスパラギン酸を製造する方
法である。

本発明は次の第１式に示すことができる。

第１式 つまり、基質のＬ−リンゴ酸はＭＤＩの作用によりオキ
サロ酢酸に変換され、このとき同時にＮＡＤ＋がＮＡＤ
Ｈに還元される。生成したオキサロ酢酸はＤ−ＡＴＡの
作用によりアミノ基供与体であるＤ−アラニンと反応し
、Ｄ−アスパラギン酸とピルビン酸を生成する。生成し
たピルビン酸からＡｌ　ａＤＨ％Ａ１ａＲの作用により
Ｄ−アラニンが再生され、同時にＮＡＤＨからＮＡＤ＋
が再生される。

本発明に使用されるＭＤＨ，Ａ１　ａＤＨ，ＡｌａＲ，
Ｄ−ＡＴＡはそれらの生産能を有する微生物、植物、動
物などより別個に或いは同時に調製することができ、そ
の起源は特に限定されないが、例えば、ＭＤＨは、エシ
ェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）、サーマス−７ラパス（Ｔｈｅｒｎｕｓ　ｆＩａｖｕ
Ｓ）等の微生物、豚心筋より得ることができ、また、市
販品を利用することもできる。

ＡｌａＤＨ，ＡｌａＲはバチルス属をはじめとする微生
物、植物より得ることができ、具体的には、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ１２５
５０から得られる酵素を、その安定性、生産性の点で優
れた酵素として挙げるとこができる。

Ｄ　−Ａ　Ｔ　Ａ’もまた、バチルス属をはじめとする
微生物、植物より得ることができ、具体的には、バチル
ス・エスピーＹＭ−１（微工研菌寄第８０５７号）より
得られるＤ−ＡＴＡ　（特開昭６１−１８７７８６号）
を挙げることができる。

これらの起源より上記４酵素を調製して本発明の反応に
使用し、光学純度の高いＤ−アスパラギン酸を得るため
には、その微生物、植物、動物が該酵素以外に生産して
いる酵素のうち、Ｄ−アスパラギン酸の光学純度を低下
させる原因となるものを精製によって除去するか、或い
は、阻害剤。

熱、ｐＨ等に対する感受性の差を利用して失活させる必
要がある０例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス
ＩＦＯ１２５５０由来のＡ　１　ａＤＨおよびＡｌａＲ
をコードする遺伝子と、バチルス・エスピーＹＭ−１株
由来のＤ−ＡＴＡをコードする遺伝子を同時に含有する
プラスミドｐＩＣＤＲＴ１１１（特願昭６２−１４０７
０７号）でＭＤＩを生産するエシェリヒア・コリを形質
転換すると、その形質転換株エシェリヒア・コリＨＢＩ
０１　（ＰＩＣＤＲＴＩＩＩ）は、上記４酵素を同時に
生産できるので本発明には好適である。

本発明の反応において基質となるし一リンゴ酸は５０〜
１０００ｍ　Ｍ、アンモニアはリンゴ酸の２倍量程度、
ＮＡＤ＋は０．１〜１０ｍＭ、アラニンはＤ、ＤＬ、或
いはＬ体を０．１〜１０ｍＭ、　Ｄ−ＡＴＡ、ＡｌａＲ
，ＡｌａＤＨおよびＭＤＨはそれぞれ０゜１〜１０Ｕ　
／　ｍｌ程度の濃度で添加される。また、補酵素である
ピリドキサール５°−リン酸（以下、ＰＬＰと示す）は
必要に応じて１〜１００μＭ程度添加される。

反応温度および反応液のｐＨは、使用される４酵素の至
適温度および至適ＰＨに合わせて調整されるが、一般に
２０〜５０℃、ｐＨ６〜１０の範囲が好ましい、ｐＨの
調整には各種の緩衝液を用いることもできるし、基質の
一つであるアンモニアを用いることもできる。

反応は通常４〜４８時間行われるが、他の条件に応じて
適当に変えることもできる。

反応液からのＤ−アスパラギン酸の採取は、例えば、反
応液に終濃度５％（１４／Ｖ）になるようにトリクｏｏ
酢酸を添加し、Ａｌ１ｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲ−１２０（
Ｈ”型）に通し、リンゴ酸、オキプロ酢酸等を素通りさ
せ、吸着したアミノ酸をＤｏｗｅｘ　１　（酢酸型）に
通し、アラニン等を素通りさせてからＤ−アスパラギン
酸を２Ｎ酢酸で溶出することにより行なうことができる
。

以下、実施例を以て本発明を説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。

（実施例） 実施例１ （１）Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドＰＩＣＴＩＩＩの創製 バチルス・エスピーＹＭ−１を表−１に示す培地で５５
℃、６時間培養した後集菌し、菌体６．Ｏｇを得た。

次に得られた菌体より斎藤−三浦法に従って染色体ＤＮ
Ａを抽出し、これをＨｉｎｄｌ（賓酒造製）によって３
時間消化して１〜１０Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を得た。

続いて、プラスミドｐＢＲ３２２３μｇを旦ｉｎｄ　Ｉ
［によって完全消化し、これを先に得られた染色体から
のＤＮＡ断片と７４ＤＮＡリガーゼ（賓酒造製）によっ
て連結し、この反応液をエタノール沈澱により濃縮した
。

この濃縮液を用いて、マンデルーヒガ（Ｍ　ａｎｄｅｌ
−Ｈｉｇａ　）の方法（ジャーナル・オプ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂ１１１．）　、　５
３゜１５９　（１９７Ｇ））によりエシェリヒア・コリ
Ｃ６００を形質転換した。

形質転換株の中からＤ−ＡＴＡをコードする遺伝子を含
有するプラスミドを有する株を選択するために、形質転
換株を表−２に示す組成の最少培地の寒天上で培養した
。目的の株は窒素源としてＤ−グルタミン酸資化性を獲
得するため、目的の株のみがこの培地上で生育可能であ
り、生育した株は約１００コロニーであった。

次にｉｎ　　５ｉｔｕにおけるＤ−ＡＴＡ活性を確認す
るため、ラエツ（Ｒａｅｔｚ）らの方法（プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・オブ・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、　７２．２２７４　
（１９７５））を一部改変した以下に示す方法に従って
活性染色を行なっな、即ち、プレート上に生育させた約
１００コロニーからフィルター上にレプリカを作成し、
リゾチーム処理（リゾチーム溶液＜ｉｏ■／ｍｌ）２ｍ
ｌ中で室温にて３０分間）し、余分な水分を除去した後
、１ｍｌの呼吸鎖阻害液（２０ｍＭ　　ＮａＮ３．１０
ｍＭＫＦ、１ｍＭ　Ｎａ　ＨＡＳＯ４，４ｍＭトリスー
塩酸ＭＷＩ液（ｐＨ７，４））を添加し、２度凍結、融
解し、溶菌した。

続いてこれを７０℃で２０分間処理した後、表−３に示
す反応液を１．５ｍｌ添加し、５０℃で１０分間反応さ
せた。これによってＤ−ＡＴＡ活性を有する株は青色を
呈するため、強い青色を呈したコロニーを１株選択した
。この株が含有しているプラスミドをｐｌＣＴｌｌｌと
した。

次に、ｐｌＣＴｌｌｌを才力の方法（ジャーナル　オブ
　バクテリオロジー（Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
）、Ｌ猥−，９１６（１９７８））に従い単離し、ｐｓ
ユＩ、堕ＲＩ、Ｂａｎ１ｌ［、Ｈｉｎｄｌｆ［，５ａｌ
Ｉ（賓酒造製）ニよりマツピングを行なった。ｐｌｃＴ
ｌｌｌの制限酵素切断地図を第１図に示す。

表　　−１ ポリペプトン　　　　　　　　０．５　　％酵母エキス
　　　　　　　　　０．２５％肉エキス　　　　　　　
　　　０．２　　％グリセロール　　　　　　　　０．
５　　％ＫＨ２ＰＯ４０，２％ に２ＨＰＯ４０，２％ ＮａＣ１０，０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０１％ ＤＬ−アラニン　　　　　　　０．３　　％し一グルタ
ミン酸　　　　　　０．２　　％ビオチン　　　　　　
　　　　４　Ｘ　１Ｇ’％００ｍ１ ＰＨ７，２ 表　　−２ チアミン　　　　　　　　　　　　１　　　■Ｌ−ロイ
シン　　　　　　　　　１０　　　　ＮＬ−スレオニン
　　　　　　　　２０　　　昭Ｍｇ５０　　・７Ｈ２０
５０■ ＭｎＣｌ２−４Ｈ２０５ｒａｔｚ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｎ（Ｉ ＣａＣ１２０，５ｒｓｔ 酵母エキス　　　　　　　　　　　０．５　■リン酸カ
リウム緩衝液（ｐｔ１７．２）　　　２０　　　　ｍ１
ｏｌアンピシリン　　　　　　　　　２５　　　■Ｄ−
グルタミン酸　　　　　　　　４ｇピルビン酸　　　　
　　　　　　　１ｇＪ 表　　−３ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）　　１’５０　　　
μｍｏｌＤ−システィンスルフィン酸　　　１．５μｍ
ｏｌα−ケトグルタル酸　　　　　　１５　　μ１ｏＩ
ＰＬＰ　　　　　　　　　　　　　　７５　　　ｎｍｏ
ｌフェナジンメトサルフェイト　１５０　　　ｎｍｏｌ
ニトロブルーテトラゾリウム　９００　　　ｎｍｏｌ（
２）Ｐ　ＩＣＴｌ　１１のサブクローニングＰＩＣＴＩ
ＩＩをエイチ、シー、バーンポイン・アンド・ジエイ、
ドーリ−（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｎ　ａｎｄ　Ｊ　、
　Ｄｏｌｙ）の方法（ヌクレイツク　アシッズ　リサー
チ（ＮＩＪＣｒｅｉＣＡＣｉｄＳ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　’）　。

ヱ、　１５１３（１９７９）　）に従い単離し、ｌ勉Ｒ
Ｉ（賓酒造製）で完全消化し、アガロースゲル電気泳動
後、約１．７Ｋｂの１臼ＲＩ−堕ＲＩ断片を含むゲルを
切り出し、ＤＮＡ断片を溶出した。

プラスミドｐＵｃ１８をＥＣ０ＲＩで完全消化し、これ
を精製したｐＩｃＴ１１２のＬ並ＲＩ−Ｅ印ＲＩ断片と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、この連結されたプラ
スミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０３を形質転換し、
形質転換株をイソプロピル−１−チオーβ−Ｄ−ガラク
トサイド、５−クロロ−４−ブロモ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトース及びアンピシリンを含むし培地（
１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
Ｃ１，０，１％グルコース；ｐＨ７，２）上で培養した
。

ここでＤ−ＡＴＡ活性を有する株は青色を呈さないので
青色でない株を選択した。この株が含有しているプラス
ミドをｐＩｃ７１１３とした。

次に、ｐＩｃＴ１１３を才力の方法に従い単離し、Ｐｓ
ｔＩ　、ＥｃｏＲＩ　、　Ｂａｎ１ｌｌ、Ｈｉｎｄｌ［
，５ａｔＩによりマツピングを行なった。ｐＩｃ７１１
３の制限酵素切断地図を第２図に示す。

ＰＩＣＴ１１３をエイチ、シー、バーンポイン・アンド
・ジェイ、ドーリ−の方法に従い単離した。

（３）ＡｌａＤＨをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドｐＩＣＤ１１２の創製 特開昭６０−１８０５９０号公報４〜５頁に記載の方法
（こ従い、該時開公報でいうところのｐＩＣＲ３０１を
創製しく我々はこれをｐＩｃＤ１１２と名付けた）、こ
れによってエシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した
。

次に、形質転換株からｐｌｃＤ１１２をエイチ。

シー、バーンポイン・アンド・ジエイ、ドーリ−の方法
に従い単離した。

＜４）ＡｌａＲをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＩｃＲ１１３の創製 バイオゲミストリ−（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）
　、　２５゜３２６８−３２７４　、　（１９８６）に
記載の方法に従い、ｐＩＣＲ４０１を創製しく我々はこ
れをｐｌｃＲ１１３と名付けた）、これによってエシェ
リヒア・コリｃ　ｅｏｏを形質転換した。

ｐＩｃＲ１１３をエイチ、シー、バーンポイン・アンド
・ジエイ、ドーリ−の方法に従い単離した。

（５）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−３ａｃ
　Ｉ断片の調製 （２）で得られたプラスミドｐｌｃＴ１１３３０μｒｔ
ｓａｃ　１３００　Ｕを含む５ａｃＩ用ＭＷＩ液（１０
ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　、７ｍＭ
　　ＭｇＣｌ　　、７ｍＭ２−メルカプトエタノ−ル（
２−ＭＥ）、０．０１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ））
４００μオ中で３７℃で５時間反応させ消化した後、５
Ｍ　　ＮａＣｌ３μｊ、冷エタノール８５０μｍを添加
し、遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収
した０回収したＤＮＡベレットを２０μｊのＴＥに溶解
し、ＥｃｏＲ１１５０Ｕを含むＥｃｏＲＩ用緩衝液（５
０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ７，５）　、７
ｍＭ　　ＭｇＣＩ　　、１００　ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ
　　２−ＭＥ、０．０１％ＢＳＡ）４００μｍ中で５時
間反応させ消化した後、８００μｍの冷エタノールを添
加し遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収
した。

（６）プラスミドｐＩｃＤ１１２のＥｃｏＲＶ−Ｈｌｎ
ｄｌｌ［断片の調製 （３）で得られたｐＩＣＤ１１２　４０μｇを制°　限
酵素Ｈ１ｎｄＩ［（宝酒造社製）　４０Ｕを含む辻１旦
ｄｌ用緩衝液（１０ｎＨ）リス−塩酸緩衝液（＋）Ｈ７
゜５）、７ｍＭ　　ＭｇＣＩ　　、６０ｍＭＮａ’ＣＩ
　）　３０Ｇμｍ中で３時間反応させ、５ＭＮａＣ１３
μｊ、冷エタノール６５０μ」を添加し、遠心分離によ
りＤＮＡをエタノール沈殿として回収した０回収したＤ
ＮＡベレットを２０μｍのＴＨに溶解し、４０Ｕの制限
酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）を含む１旦旦ＲＶ用緩衝
液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、７
ｍＭＭｇＣＩ　　、１５０　ｍＭ　　ＮａＣＩ、７１Ｎ
　　２−ＭＥ、０．０１％ＢＳＡ）３００μｍ中で３７
℃、３時間反応させ、冷エタノール６００μｍを添加し
遠心分離することにより、ＤＮＡをエタノール沈殿とし
て回収した。このＤＮＡを２０μオのＴＦ、に溶解し０
．７％ＬＭ　Ｐ　（ｌｏｗ　ｍｅｌｔｉｎｏ　ｐｏｉｎ
ｔ　）アガロース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて４℃にお
いて１００　Ｖで５〜６時間電気泳動を行い、Ａ１　ａ
ＤＨをコードする遺伝子を含有する１、４ＫｂのＨｉ　
ｎｄｌ−ＥｃｏＲＶ断片を分離し、この断片を含むアガ
ロースを切り取り、５倍容量のＴＥを加え６５℃で５分
間加熱してアガロースを溶解した。この溶液を、フェノ
ール抽出、フェノール−クロロホルム＜１：１）抽出、
クロロホルム抽出を各１回行った後、エタノール沈殿と
してＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を少量のＴ
Ｅに溶解し、逆相液体クロマトグラフィー　（ＮＥＮＳ
ＯＲＢ”２０、デュポン製）により精製し、５０％／タ
ノールで溶出し、乾固した後２０μオのＴＨに溶解し、
プラスミドｐｌｃＤ１１２の精製ＥｃｏＲＶ−Ｈ１ｎｄ
ｌ！７ｒ片を調製しな。

（７）プラスミドｐＩｃＲ１１３のＥｃｏＲＩ−３ａｃ
　Ｉ断片の調製 （４）で得られたｐｌｃＲ１１３４０μｇを制限酵素５
ａｃＩ（宝酒造社製）　３００　Ｕを含む且３ｃｌ用緩
衝液４００μｍ中で５時間反応させ消化した後、５Ｍ　
　ＮａＣｌ３μｊ、冷エタノール８５０μｍを添加し、
遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収した
０回収したＤＮＡベレットを２０μｍのＴＨに溶解し、
１５０　Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ　（宝酒造社製）を含
むＥｃｏＲＩ用ＩＩＷＩ液４００μオ中で３７℃、５時
間反応させ、冷エタノール８００μｍを添加することに
より、ＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。このＤ
ＮＡを２０μｍのＴＨに溶解し、０．７％ＬＭＰアガロ
ースを用いて４℃において１００Ｖで５〜６時間電気泳
動を行い、ＡｌａＲをコードする遺伝子を有する１、９
ＫｂのＥｃｏＲＩ−３ａｃ　Ｉ断片を分離し、この断片
を含むアガロースを切り取り、５倍容量のＴＥを加え６
５℃で５分間加熱してアガロースを溶解しな、この溶液
を、フェノール抽出、フェノール−クロロホルム（１：
１）抽出、クロロホルム抽出を各１回行いエタノール沈
殿としてＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を少量
のＴＨに溶解し、逆相液体クロマトグラフィーにより精
製し、５０％メタノールで溶出した後、乾固してプラス
ミドＰＩＣＲ１１３の精製ＥｃｏＲＩ−８ａｃ　Ｉ断片
を調製した。

（８）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−３ａｃ
　Ｉ断片と１ラスミドｐＩｃＲ１１３のムｏＲＩ−８ａ
ｃ　Ｉ断片の連結 （５）で調製したＰＩＣＴ１１３のＥｃｏＲＩ。

Ｓａｃ　Ｉ消化物を２０μｍのＴＨに溶解し、（７）で
調製したｐＩｃＲ１１３のＢｃｏＲＩ、５ａｃＩ消化物
を２０μｍのＴＥに溶解した。ｐＩｃＴ１１３のＥｃｏ
ＲＩ−８ａｃ　Ｉ断片溶液１．ｕｊ、ｐＩＣＲ１１３の
ＥｃｏＲＩ−３ａｃ　Ｉの断片溶液８μｍをＴ４ＤＮＡ
リガーゼ７００Ｕを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ用緩衝液（
６６ｍ　Ｍ　トリス−塩酸１街液（ＤＨ７，６）、６．
６ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　、１０ｍＭジチオスライトール
（ＤＴＴ）　、１ｎＨＡＴＰ）２０μ」中で一晩反応さ
せＤＮＡ断片を連結しな。

（９）（８）で連結したＤＮＡによるエシェリヒア・コ
リＨＢＩＯＩの形質転換 エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩを１００ｍ１のＹＴ培地
（ポリペプトン１ｔ、酵母エキス０．！ｚｒ、ＮａＣ１
Ｇ、５　ｇ／ｌＧＧ　ｍｌ、　ｐＨ７，２）で２〜３時
間培養し、遠心分離により菌体を回収して冷１００　ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２で洗浄後、冷１００ｍＭ　　ＣａＣｌ
２に懸濁し１時間氷上に放！した０次に遠心分離により
上滑を除去後、冷１００　ｍＭ　　ＣａＣ１２５ｍｌに
再懸濁し、コンピテントセルとした。

次に（８）で得られた連結したＤＮＡの溶液１０μｍと
コンピテントセル懸濁液２００μｍを０℃で混合し、時
々撹拌しながら氷上に６０分間放置した後、４２℃で２
分間放置し、氷上で急冷した０次にこの懸濁液に１ｍｌ
のＹＴ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、ア
ンピシリン含有（５０μｇ／ｍ１）ＹＴ−寒天培地（寒
天２０ｔ／ｊ）にル−ティングし、３７℃で一晩培養し
、形成したコロニーをアンピシリン含有ＹＴ−寒天培地
に再ブレーティングし、３７℃で一晩培養して得られた
コロニーを形質転換株とした。

（１０）目的とするプラスミドを保有する形質転換株の
選択 （９）で得られた１５個の形質転換株より１０株をアン
ピシリン含有（１００μｇ／ｍ１）ＹＴ培地５ｍｌで一
晩培養し、該株から小スケールで各１ラスミドを単離し
た。これらのプラスミドを（５）の方法に従いＥｃｏＲ
ＩおよびＳａｃ　Ｉで消化したところ、全ての１ラスミ
ドが、それぞれ１ケ所ずつ切られて約４．５Ｋｂの単一
なバンドを生じた。

また、ＥｃｏＲＩ、Ｓａｃ　Ｉのダブル消化により、約
２．７Ｋｂと約１．９Ｋｂの２本のバンドを生じたこと
より、すべてのプラスミドが、ベクターｐＵＣ１８由来
の部分であるｐｌｃＴ１１３のＥｃ。

Ｒ１−３ａｃＩ断片とＡｌａＲをコードする遺伝子を有
するｐＩｃＲ１１３のＥｃｏＲＩ−３ａｃＩ断片が１つ
ずつ結合したものであることがわかった。これらの１ラ
スミドをｐＩｃＲ１１４とした。

（１１）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片の調製 （２）で得られたｐｌＣＴ１１３　４０ｕｔを旦ｃｏＲ
１１ｓＯＵを含むＥｃｏＲＩ用緩衝液４００μｍ中で３
７℃、５時間反応させ消化した後、冷エタノール８００
μ」添加し遠心分離によりエタノール沈殿として回収し
な、このＤＮＡを２０μ」のＴＨに溶解し、（９）と同
様にしてＬＭＰアガロース電気泳動により分離後、Ｄ−
ＡＴＡをコードする遺伝子を有する約１．７ＫｂのＤＮ
Ａ断片を切り出し、（７）と同様にして精製し、２０μ
ｍのＴＥに溶解してプラスミドｐＩｃＴ１１３のＥｃｏ
ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片溶液を得た。

（１２）プラスミドｐｌｃＲ１１４のＥｃｏＲＩによる
消化 （１０）で調製したｐＩｃＲ１１４の一部（約４ｕｇ）
を、ＩＯＵのＥｃｏＲＩを含むＢｃｏＲＩ用ｗＩｗ液５
０μｍ中で３７℃、５時間反応させ消化した後、２００
μｍの冷エタノールを添加し、遠心分離によりエタノー
ル沈殿として回収し、１０μｍのＴＥに溶解してプラス
ミドｐｌｃＲ１１４のＦ、ｃ旦ＲＩ消化物溶液を得た。

（１３）プラスミドｐＩｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−Ｆ、
ｃｏＲＩ断片と、ｐｌＣＲ１１４のＢｃｏＲＩ消化物と
の連結 （１１）で調製したプラスミドｐＩＣＴ１１３のＥｃｏ
ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片溶液８μオと、（１２）で調製し
たｐｌｃＲ１１４のＥｃｏＲＩ消化物溶液０．５μオと
をＴ４ＤＮＡリガーゼ７００　Ｕを含むＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ用緩衝液２０μｍ中で、１６℃−晩反応させＤＮＡ
ＩＪｉ片を連結した。

（１４）　　（１３）で連結したＤＮＡによるエシェリ
ヒア　コリ　ＨＢＩＯＩの形質転換 （９）と同様にして調製したコンピテントセル２ＧＧμ
ｍと（１３）で連結したＤＮＡを含む反応液１０μｍと
を混合し、（９）と同様にして形質転換株を得た。

（１５）Ｄ−ＡＴＡ活性を有する形質転換株の選択（１
４）で得られた約２０００個の形質転換株のうち１６８
個のコロニーを５００μオの緩衝漆工（１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）　、０．０１％２−ＭＥ
、５０μＭピリドキサールー５°−リン酸（ＰＬＰ））
に懸濁し、３０秒間超音波破砕したものを酵素液として
Ｄ−ＡＴＡ活性を測定しな。

−Ｄ−ＡＴＡ活性の測定方法− トリス−塩ｖＩ緩衝液（ｔ）Ｈ８，１）　５０．ｔｚｍ
　ｏ　１　、ＰＬＰ５０ｎｍｏ　１　、ａ−ケトグルタ
ル酸１０μｍｏｌ、Ｄ−アラニン２５μｍｏｌ、乳酸脱
水素酵素（ＬＤＨ，ベーリンガーマンハイム山之内製）
５Ｕ、ＮＡＤＨｏ、２μｍｏｌ及び酵素を含む１ｍｌの
反応液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの
減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。

尚ＩＵはこの条件下１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減
少を触媒する酵素量とした。上記方法に従って１６８個
のコロニーのＤ−ＡＴＡ活性を測定した結果、２つのコ
ロニーにＤ−ＡＴＡ活性が認められた。

（１６）Ｄ−ＡＴＡ活性保持株の１ラスミドの確認（１
５）で選択した２株から小スケールでプラスミドを単離
した。これらのプラスミドを、５ａｃＩで消化したとこ
ろ約６．２Ｋｂの単一のバンドを生じ、ＥｃｏＲＩで消
化したところｐＩｃＲ１１４のＥｃｏＲＩ消化物と同じ
約４．５ＫｂのバンドおよびｐＩｃＴ１１３のＥｃｏＲ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片と同じ約１．７Ｋｂのバンドを生じ
た。また１且Ｋｂのバンド、ｐＩｃＲ１１４のＥｃｏＲ
Ｉ−旦ａｃｌ断片と同じ約１．９Ｋｂのバンドおよびｐ
Ｉ２．７Ｋｂのバンドを生じたことから、これらのプラ
スミドは、ｐＩｃＲ１１４のＥｃｏＲＩ消化物にｐＩｃ
Ｔ１１３のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が結合したもの
であることがわかった。

これらのプラスミドをｐ　ＩＣＲＴＩ　１１とした。

よって、得られたプラスミドｐｌｃＲＴ１１１はＡｌａ
Ｒをコードする遺伝子と、Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝
子とを同時に有するプラスミドである。

（１７）プラスミドｐＩｃＲＴ１１１の調製前述した方
法で、ｐＩｃＲＴｌｌｌにより形質転換されたエシェリ
ヒア・３９８８１０１株から、精製ｐ　ＩＣＲＴＩ　１
１を調製した。

（１８）プラスミドｐＩｃＲＴ１１１のＨｌｏｄｌ［［
−３ｍａＩ断片の調製 プラスミドｐＩｃＲＴ１１１　５μｔをＳｍａＩ２０Ｕ
（賓酒造製）を含むＳｍａＩ用ＨＷＩ液（１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液１ｐＨ８、Ｏ）　、７ｍＭＭｇＣ１２，
２０ｍＭ　　ＫＧ　１　、７ｍＭ　　２−ＭＥ　Ｏ，０
１％ＢＳＡ）５０μ」中で３７℃で５時間反応させ消化
した後、５Ｍ　　ＮａＣ１１μオ、冷エタノール１００
μ」を添加し、遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿
として回収した。

回収したＤＮＡベレットを２０μｍのＴＨに溶解し、Ｈ
ｌｎｄｌ［［２０Ｕを含むＨ１ｎｄｌｌＩ用緩衝液５０
μｍ中で５時間反応させ消化した後、５Ｍ　　ＮａＣ１
０，５μｍ、エタノール１００μオを添加し遠心分離に
よりＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。

回収したＤＮＡペレットを２０μｍのＴＢに溶解し、ｐ
ＩｃＲＴｌｌｌのＨｌ　ｎｄｌ［−３ｍａＩ断片溶液と
した。

（１９）プラスミドｐＩｃＤ１１２のＨｉｎｄｌ−Ｅｃ
ｏＲＶ断片とプラスミドｐ　ＩＣＲＴＩ　１１のＨｉ　
ｎｄｌｌｌ−３ｍａＩ断片の連結（６）で調製しｆｉｐ
ＩｃＤ１１２のＨｌｎｄｌ［−ＥｃｏＲＶ断片溶液ＩＱ
μｊと（１８）で調製したｐＩｃＲＴｌｌｌのＨｌｎｄ
ｌｌ［−３ｍａＩ断片溶液１０μｍをＴ４ＤＮＡリガー
ゼ７００Ｕを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ用Ｍ衝液３０μオ
中で一晩反応させ、ＤＮＡ断片を連結した。

（２０）　　（１９）で連結したＤＮＡによるエシェリ
ヒア・コリＨＢＩＯＩの形質転換 エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩを１００ｍ１のＹＴ培地
で３時間培養し、遠心分離により菌体を回収した０次に
、菌体を冷１００　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２で洗浄
後、冷１００ｍＭ　　ＣａＣｌ２に懸濁し、１時間氷上
に放１した０次に遠心分離により上清を除去後、冷１０
０　ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃ１２５ｍｌに再懸濁し、コンピ
テントセルとした。

（１９）で得られた連結したＤＮＡ溶液５μｍとコンピ
テントセル懸濁液２００μｍを０℃で混合し、時々攪拌
しながら氷上に６０分間装いた後、４２℃で２分間放置
し、氷上で急冷した０次にこの懸濁液に１　ｍｌのＹＴ
培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、アンピシ
リン含有（５０μｇ　／　ｍｌ　）　Ｙ　Ｔ　−寒天培
地（寒天２０ｔ／Ｊｌ）にブレーティングし、３７℃で
一晩培養し、形成したコロニーをアンピシリン含有ＹＴ
−寒天培地に再ブレーティングし、３７℃で一晩培養し
て得られたコロニーを形質転換株とした。

（２１）目的とするプラスミドを保有する形質転換株の
選択 １　）　Ａ　１　ａＤＨの活性染色 フィルター上に（２０）で得られた形質転換株のレプリ
カを作成し、プロシーディング・オブ・ナチュラル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ニーニスニー、　
７２．２２７４−２２７８（１９７５）に記載の方法に
従い、５０ｍ　Ｍグリシン−ＫＣＩ　−ＫＯＨＷ衝液［
ｐＨ９，０）　、５０ｍＭ　　Ｌ−アラニン、１．３　
ｍＭＮＡＤ”　、０．１２８　ｍＭフェナジンメトサル
フェート（ＰＭＳ）　、０．４８ｍＭニトロブルーテト
ラゾリウム（ＮＢＴ）を含む反応液２ｍｌと反応させ、
゛発色によりＡ１ａＤＨ活性を有する形質転換株を見分
け、分離した。

２）プラスミドの確認 １）で得られたＡｌ　ａＤＨ活性保有株のうちの６株を
アンピシリン含有（１００μｔ　／　ｍｌ　）　Ｙ　Ｔ
培地５　ｍｌで一晩培養し、小スケールで各プラスミド
を単離した。

これらのプラスミドを（６）の方法に従いＨｉｎｄｌｌ
［で消化したところ、全てのプラスミドが、各１ケ所切
られ約７．６Ｋｂの単一なバンドを生じた。

また、ＥｃｏＲＩ消化により約５．９Ｋｂのバンドおよ
びｐＩｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片と同じ
約１．７Ｋｂのバンドを生じた。Ｅｃ。

Ｒ１，５ａｃｌのダブル消化では、上記的１．７Ｋｂの
バンド、ｐｌｃＲ１１３のＥｃｏＲＩ−３ａｃｌ断片と
同じ約１．９Ｋｂのバンド、および約４゜ＩＫｂのバン
ドを生じた。

反Ｌ１１　、Ｈｉ　ｎ　ｄ　１Ｍのダブル消化では、ｐ
ｌｃＲＴＩＩＩのＫ」シＪ、Ｉ　、Ｈｌ　ｎ　ｄ　ＩＩ
！消化物と同じ約６．２Ｋｂのバンド、およびｐＩｃＤ
１１２の旦ｃｏＲＶ−Ｈ１ｎｄｌ［断片と同じ約１．４
Ｋｂのバンドを生じた。

以上のことから、これらのプラスミドは、ＰＩＣＲＴＩ
ＩＩのＨｉ　ｎｄｌｌ−３ｍａ　Ｉ　、断片とｐＩＣＤ
１１２のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄｕＩＩｒ片断とが結合し
たものであることが分かった。

このプラスミドをｐＩｃＤＲＴｌｌｌとした。

即ち、得られたプラスミドｐ　ＩＣＤＲＴＩ　１１はＡ
ｌａＲをコードする遺伝子、Ｄ−ＡＴＡをコードする遺
伝子およびＡ１　ａＤＨをコードする遺伝子を有するプ
ラスミドである。

（２２）ｐ　ＩＣＤＲＴＩ　１１を含むエシェリヒア・
コリ；エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＩＣＤＲＴ
ＩＩＩ）の創製および該菌体からの酵素液の採取 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー　（Ｊ
、　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、）　、録、　１５９−１６２
（１９７０）に記載の方法に従って、０℃付近で塩化カ
ルシウム処理したエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩをプラ
スミドｐ　ＩＣＤＲＴＩ　１１と接触させることによっ
て形質転換した。

次に菌株をアンピシリン含有（５ｇ／１００ｍ１）ＹＴ
培地７５０　ｍｌで３７℃、−晩培養し、遠心分離によ
り菌体を回収した０回収した菌体２．２ｇを、１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７゜２　、０．０１％２−メ
ルカプトエタノール、５０μＭ　　Ｐ　Ｌ　Ｐ　５０１
１に懸濁した。

超音波により菌体を破砕した後、１５，０ＯＯｒｕで２
０分間遠心分離して上滑を回収し、無細胞抽出液を調製
した゛。

次に、得られた無細胞抽出液の酵素活性を以下の方法に
より測定した。

−Ｄ−ＡＴＡ活性の測定法− （１５）に示した方法による 一ＡｌａＲ活性の測定法− グリシン−ＫＣＩ−ＫＯＨＩｌｉ液（ｐＨ９，０）１０
０　μｎｏｌ　、　ＰＬＰ５０ｎｍｏｌ、　Ｄ−アラニ
ン５０μ１１゜１　、　ＮＡＤ”　２．５　μ１ｌｏＩ
　、　Ａ　ｌ　ａＤＨ（バチルス・ステアロサーモフィ
ラスＩＦ０１２５５０由来）１０Ｕおよび酵素を含む１
ｍｌの反応液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡ
ＤＨの生成に由来する３４０ｎｍにおける吸光度の増加
を測定した。尚、ここでＩＵは、この条件下１分間に１
μ１１０１のＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。

−Ａ１　ａＤＨ活性の測定法− グリシン−ＫＣＩ−ＫＯＨＭ衝液（ｐＨ１０，７）１０
０μｍ１Ｇ＋　、　Ｌ−アラニン５０μｍｏｌ　、　Ｎ
ＡＤ”　２゜５μ１１ｏｌ　、および酵素を含む１ｍｌ
の反応液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨ
の生成に由来する３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測
定した。

尚、ここでＩＵは、この条件下１分間に１μｓｏｌのＮ
ＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。

−ＭＤＩ活性の測定法− トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）　５０μｓｏｌ　
、　Ｌ−リンゴ酸２０μｌｏｔ　、　ＮＡＤ”　２．５
μｓｏｌ　、および酵素を含む１ｍｌの反応液を３０℃
でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの生成に由来する
３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。尚、ここ
でＩＵは、この条件下１分間に１μｓｏｌのＮＡＤＨの
生成を触媒する酵素量とした。

その結果、Ｄ−ＡＴＡ活性は１０４０Ｕ　／　ｍｌ、Ａ
ｌａＲ活性は８Ｇ、　７Ｕ　／　ｍｌ、Ａｌ　ａＤＨ活
性は１０６　Ｕ／ｍｌ、ＭＤＨ活性は１８．５ＬＪ／ｍ
ｌであった。

次にこの無細胞抽出液を５０℃で３０分間処理し、熱処
理酵素液を得た。

（２３）得られた熱処理酵素液を用いたＤ−アスパラギ
ン酸の製造 次に、この熱処理酵素液１０μｍ、し−リンゴ酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）　１００μ＋１０１　、
　Ｌ−アラニン１μ１ＩＯｌ　、　ＮＡＤ”　０．１　
、ｔｃｌｌｏＩ　、　ＰＬＰ５０ｎ１０１を含む反応液
１ｍｌを３７℃で２４時間反応させた。

反応終了後、アミノ酸分析計およびキラルパックＷＨ（
ダイセル化学製）を用いた高速液体クロマトグラフィに
より、反応液中のＤ−アスパラギン酸の生成量を測定し
た。その結果、得られたＤ−アスパラギン酸は、２８゜
７μｓｏｌであった。

実施例２ 熱処理酵素液量を２０μｍに変えた他は、実施例１と同
様に反応を行なった。その結果、得られたＤ−アスパラ
ギン酸は、４０．６μＩＩｏｌであった。

（発明の効果） 本発明により、経済的に優れた方法でＤ−アスパラギン
酸を製造することが可能になった。

また、エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＩＣＤＲＴ
ＩＩＩ）を用いることによって、本発明の方法を非常に
簡潔に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐｌｃＴ１１１の制限酵素切断地
図である。 第２図は、プラスミドｐＩｃ７１１３の制限酵素切断地
図である。 特許出願人　ダイセル化学工業株式会社第　　１　　図 ｐＩｃＴｌｌｌの制限酵素切断地図 筒　　２　　図 ｐＩｃ７１１３の制限酵素切断地図 （Ｋｂ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リンゴ酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、アラニンラ
   セマーゼ、およびＤ−アミノ酸トランスアミナーゼを共
   役させることにより、微量のアラニンおよびＮＡＤ＾＋
   の存在下、Ｌ−リンゴ酸とアンモニアからＤ−アスパラ
   ギン酸を製造する方法