JPS6034521B2 - 血清アルブミンの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液フラクションに関し、さらに詳しくは血清
アルブミンフランクションを高収率かつ高純度で製造す
る方法に関する。

アルブミンは血兼の最大フラクションを構成し、ショッ
ク症状におけるような医薬による治療において、そして
血数増補液として広範囲の用途を有する。

血液を各種の方法によってフラクション化してアルブミ
ンを得、そしてその他の分離された成分を回収すること
は確立された技術である。

標準血清アルブミンとして知られる市販の主要アルブミ
ンフラクションは少なくとも９６％のアルブミンを含有
する高度に精製された皿策フラクションの浸透圧上安定
な溶液である。その入手はハーバード・メディカル・ス
クールのコーン（Ｃｏｈｎ）氏等の研究により可能とな
り、その製造に関しては米国特許第２，３９０，０７４
号および同等２，４６９，１９３号明細書、Ｊ．Ａｍｅ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｃ．第斑巻．第４６９〜７５頁（１
９４６年）およびカーク・オスマー（Ｋｉｒｋ−○仇ｍ
ｅｒ）氏著のＥｎｃｙｌ．ｏｆＣｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．第
３巻，第５８４〜８８頁（１９６４王第２版）に記載さ
れている。標準血清アルブミンの製造に対する米国にお
けるすぐれた現行の方法は所謂「コーンの方法６」であ
る。その他の市販の主要アルブミンフラクションは少な
くとも８３％のアルブミンを１７％以下のＱおよび８ー
グロブリンの混合物と共に含有する血酸フラクションの
溶液である、所謂血数蛋白フラクション（ＰＰＦ）であ
る。

米国において現在採用されているＰＰＦの製造方法は米
国特許第５，９斑，６２８号明細書およびＶｏｘＳａｎ
ｇ第２巻，第１７４頁（１９５４年）に記載されている
／・ィンク（Ｈｉｎｋ）の方法である。比較的高度に濃
縮された標準血清アルブミンおよび濃縮度の比較的低い
ＰＰＦを製造する前述の方法ではフラクション化過程に
おいて袷エタノールが沈殿剤として使用される。

アルブミンフラクションを製造するその他の各種の既知
の方法においてエーテル、メタノールまたは硫酸アンモ
ニウム塩のようなその他の沈殿剤が使用されるか、ある
し・はゲル上の吸着またはイオン交換クロマトグラフィ
ーが包含される。さらに最近になって、アルブミンの分
離を包含する血液のフラクション化に対して、各種の重
合体性物質例えば、米国特許第３，４１５，８０４号明
細書記載のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、カーボワ
ックス）、米国特許第３，８５０，９０３号明細書およ
びドイツ特許出願公開公報第５，４０３，０６５号記載
の酸化エチレンとポリオキシプロピレンポリマーとの共
重合体（プルロニツク）、およびある種の特異的な高分
子電解質例えば米国特許第３，５５４，９８５号および
同第３，５５５，００１号明細書に開示されているよう
なエチレン／無水マレイン酸交さ結合共重合体誘導体が
開発された。

以上のような重合体怪物質を使用する利点はそれらが標
準室温において使用可能であり、従って前述のコーンエ
タノールフラクション化法における低温要件を回避する
ことができることにある。ＰＰＦの製造に対しては各種
の重合体性フラクション化方法が有用であるが、そのよ
うな方法によっては一般に前述の冷エタノール法によっ
て得られるような標準血清アルブミンフラクションの最
高収率および最高純度は達成されない。精製された血清
ァルブミンを得るさらにその他の方法は米国特許第２，
７０５，２３０号および同等２，７６５，２９９号明細
書、Ｊ．Ｂｊｏ１．Ｃｈｅｍ．第１６２巻，第１８１〜
９８頁（１９４６年）およびＢ１ｕｔ巻３の筈，第１２
１〜１３４頁（１９７５年）に配致されているようなカ
プリレートまたはその他の脂肪酸アニオン安定化剤の存
在下において加熱することにより、血清アルブミンの変
性を起こさずに血清グロブリンを選択的に変形させるこ
とを包含する。

この方法はＰＰＦタイプのアルブミンフラクションの製
造には有用であるが、ｙーグロブリンを破擁することな
く、一層高度に精製された標準血清アルブミンを高収率
で製造するには一般に適さない。前記の方法は通常ウイ
ルス不含のアルブミン生成物を提供する低温殺菌工程と
して行なわれる。本発明によれば、高度のアルブミン吸
着能力を有する樹脂状重合体性物質と接触させ、ＰＨ値
を約５．０〜約５．５に保持しながら約６５００〜約７
〆○の温度において約１時間〜約４時間加熱し、そして
次にアルブミンを前記の樹脂−蛋白塊から約３．５〜約
４．５のｐＨにおいて選択的に溶離させることより、血
清アルブミンフラクションが高収率かつ高純度において
皿環およびその他のアルブミン含有血液フラクションか
ら製造される。

本発明において使用される前記の樹脂状重合体性物質は
ジメチルアミンプロピル官能性懸垂基を含有するエチレ
ンと無水マレィン酸との水不溶性交ご結合高分子電解質
共重合体である。前述の高分子電解質共重合体を使用し
て前記加熱処理および吸着−溶離工程を組み合わせるこ
とによりアルブミン生成物は前記加熱処理工程または吸
着−溶離工程のいずれかにより別個に得られる場合より
も実質的に一層高い純度および収率で堤供される。本発
明により製造される血清アルブミンは全血、血※および
血清、あるいはアルブミンを含有することが知られてい
るそれらのフラクションから得られる。

前に述べたように本発明において行なわれる加熱処理に
より該処理物質中に存在するグロブミンが変性される傾
向がある故、多くの場合ｙ−グロブリンのような特定の
所望のアルブミンフラクションを本発明方法の実施に先
立って最初に単離しておくのが有用である。凝固因子、
ＡＨＦおよびプロトロンピンコンプレツクスのようなそ
の他の価値ある血液フラクションもまた本発明方法の実
施前に血酸出発物質から最初に分離されることができる
。前記のフラクションは当業界において既知の慣用の方
法によって分離されることができる。本発明において使
用される前記の水不落‘性交さ結合高分子電解質共重合
体はジメチルアミノプロピル官能性懸垂基を含有するエ
チレンと無水マレィン酸との共重合体である。

エチレン一驚水マレィン酸のベース共重合体（ＥＭＡ）
は例えばエチレンと無水マレィン酸とを過酸化物触媒の
存在下において適当な溶媒中で反応させることによって
製造されうる。前記の共重合体は好ましくは実質的に等
モル量のエチレン残基と無水物残基とを含有するであろ
う。ＥＭＡ共重合体を次に２個の第１級アミン残基を含
有し交さ結合ＥＭＡ共重合体に導くメチルィミノピスプ
ロピルアミンと反応させることができる。次いで所望の
ジメチルアミノプロピル官能性懸垂基がジメチルアミノ
プロピルァミンと前言証ハ心共重合体の無水物残基との
反応によって前記の交さ結合共重合体中に導入されうる
。前記高分子電解質共重合体をその塩酸塩の形態にかえ
て取扱い特性を一層容易にすることもまた望ましい。以
上のような高分子電解質共重合体の製造および構造に関
するさらに詳細な説明は米国特許第３，５５４，９８５
号明細書になされている。高分子電解質共重合体を血液
のフラクション化に使用することに関しては米国特許第
３，５５５，００１号明細書に開示されている。本発明
において使用するのに好適な高分子電解質共重合体は前
記ＥＭＡ共重合体中無水マレィン酸１００単位あたり約
５個のメチルィミノビスプロピルアミン交さ結合基およ
び約９針嵐のジメチルアミノプロピルアミン官能性懸垂
基を含有する。予想外にも、前述の高分子電解質共重合
体は異なったアミン官能性懸垂基を有するある種の別の
高分子電解質共重合体と比較してアルブミン吸着に対し
て高い能力を有することが見出された。すなわち、本発
明における高分子電解質共重合体は血液フラクション中
のすべてのアルブミンを実質上完全に吸着することが可
能であり、前記アルブミンは次に前述の加熱処理および
選択的溶離に従って９０％以上の収率および９４％以上
の純度で回収されうる。比較として、前記の懸垂基の代
りに、２一（アミノェチル）−１−エチルピロリジン懸
垂基を有する類似の高分子電解質共重合体は約２２％の
アルブミンを吸着したに過ぎず、吸着された物質のうち
加熱処理後の港雛によってわずかに約６７％の純度を有
する生成物が得られたに過ぎなかった。さらに、前記懸
垂基の代りに、３−（ジーｎ−ブチルアミノ）ープロピ
ルアミン懸垂基を有するその他の類似の高分子電解質共
重合体はアルブミンの大部分を吸着したが加熱処理後に
おいてはアルブミンは何も溶離され得なかった。本発明
方法の実施に際しては、前記の高分子電解質共重合体を
血酸または血清、あるいはアルブミン含有血液フラクシ
ョンと好ましくは共重合体約１％〜約５％の範囲の濃度
で混和する。

前記の樹脂−蛋白混合物のｐＨ値を各種の水準に調整す
ることにより選択された蛋白が最初に除去されうる。約
５．５〜７．５のｐＨ値において、ァルブミン、Ｑ−お
よび３ーグロブリンおよびフイブリノーゲンが前記樹脂
により吸着され、一方ｙ−グロブリンの大部分は未吸着
で保持され上澄み液から治療用として回収されうる。好
適にはこのｙ−グロブリンの初期分離はｐＨ約６におい
て行なわれる。吸着されたＱ−および８−グロブリンな
らびにフイブリノーゲンの一部は次に前記樹脂−蛋白混
合物のｐＨ値を約４．７に調整し、そして脱着された上
澄み液を集めることによって回収されうる。樹脂−蛋白
混合物は次に約５．０〜約５．５のＰＨ範囲に調整され
、約６５００〜約７？０の温度において約１時間〜約４
時間加熱される。

好適には、ＰＨ値を約５．２〜５．３に道整され、樹脂
−蛋白混合物は約７０００において約１時間加熱される
。前記加熱処理工程中、残留グロブリン、主としてＱ−
および８ーグロプリンは変性されるが一方、同時にアル
プミンは変性されず容易に回収されうる。

加熱処理に続いて、ＰＨ値を約３．５〜約４．５の範囲
に調整して所望のアルブミンを樹脂−蛋白混合物から溶
離させる。

好ましくは樹脂−蛋白混合物は前記のｐＨ調整に先立っ
て冷却され、次いでｐＨ値は約４に調整される。アルブ
ミンの回収は沈降、炉過または遠心分離のような各種の
分離方法によって行なうことができるが、好ましくは前
記のｐＨ調整された樹脂−蛋白混合物を海過し、炉過ケ
ーキを洗浄しそして炉液を高度に精製されたアルブミン
フラクションとして集めることにより行なわれる。

前記の工程中、ＰＨ値の所望の水準への調整は臨床上許
容しうろことが知られている酸性またはアルカリ性緩衝
剤物質による処理例えば酢酸ナトリウム一驚酸緩衝剤の
使用あるいは酸性化のためのクエン酸の使用あるいはア
ルカリ性を増大するための重炭酸ナトリウムまたは水酸
化ナトリウムの使用によって行なわれうる。

さらに前記加熱処理工程中ナトリウムアセチルトリプト
フアネートおよびナトリウムカプリレートのような既知
のアルブミン安定化剤をそれらの既知の安定化作用によ
り前記樹脂−蛋白混合物中に含有させることもまた好ま
しい。

本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明
はこれら特定の例に限定されるものではない。

実施例 １ この例において、高分子電解質共重合体はメチルィミノ
ビスプロピルアミン（ＭＩＢＰＡ）と交さ結合させそし
て次にさらにジメチルアミノプロピルアミン（ＤＭＡＰ
Ａ）とＥＭＡ共重合体中マレイン配無水物１０■単位あ
たり約５個のＭＩＢＰＡ交さ結合基および約９の固のＤ
ＭＡＰＡ懸垂基が得られるように反応させ、そしてその
塩酸塩の形態にかえた、実質的に等モル部のエチレンお
よび無水マレィン酸の樹脂状反応生成物（ＥＭＡ）から
なっていた。

最初に、前記高分子電解質共重合体を０．０４モルＮａ
Ｃク中で洗浄した。プールされた人血液から得られた皿
環をその１部あたり３部の水を使用して希釈し、次に前
記の洗浄された高分子電解質共重合体２重量％（２夕／
１００の【）と混合した。この樹脂／血数混合物をＰＨ
６．０に調整し、３粉ご間混合し、炉過し次に０．００
２モルＮａＣ夕で洗浄した。主としてｙーグロブリン、
Ｂーグロブリン、フィブリノーゲンおよび付随血液因子
からなる炉液を残留樹脂−蛋白炉過ケーキから分離した
。吸着されたァルブミンを含有する前記樹脂−蛋白炉過
ケーキをｐＨ５．２の酸性にした。０．０１２農度を与
えるのに十分なナトリウムカプリレート安定化剤を樹脂
−吸着蛋白と混合し、ＮａＣそを加えて０．００２モル
濃度とした。

次に前記の樹脂−吸着蛋白を７０℃において１時間加熱
し、その後炉過し、炉液を排棄した。０．００２モルＮ
ａＣそ中クエン酸でＰＨ４．０に酸性化し、３び分間混
合しそして炉遇することによってアルブミンを残留樹脂
−蛋白炉過ケーキから溶解させた。

炉液は所望のアルブミンフラクションとして９６．６％
の収率（最初の血数中のアルブミン濃度基準）および９
８．５％の純度で保持された。前記樹脂から溶離された
生成物のアルブミン純度はアガ。−スゲル電気泳動によ
りバルビタール緩衝剤中軸８．６においてコーニング（
Ｃｏｒｎｉｎｇ）ＡＣＩ電気泳動装置を用いて測定され
た。この測定に際してはクマシーブリリアントブルーＲ
２５０（Ｃ．１．４２６６０）で色付けする方法が実質
上Ｂｉｃｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ＄．Ａｃｔａ 第７１巻
，第３７７〜９１頁（１９６３年）に記載（ＦａｚｅＫ
ａｓｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ氏外著）の方法に従って採用
され、測定値はゲルマン（蛇ｌｍａｎ）ＡＣＤ−１５農
度計により６０仇ｍにおいて測定された。クマシーブリ
リアントブルーＲ２５０は中２０仏夕／弧までべーアの
法則に従い下は中０．５仏夕／肌まで感受性を示すぐれ
た感度の蛋白染料である。このような感度の故に、クマ
シーブリリアントブルーＲ２５０はアルブミン生成物中
の蛋白混合物の高度の検出を可能にし、得られた分析値
は高純度のアルブミン生成物が製造されたことを確認す
る。実施例 ２ 原料皿糠としてＡＨＦ−減少化血糠を使用する以外は実
施例１の方法をくり返した。

アルブミン生成物の収率および純度は実施例１で得られ
た値と実質上同様であった。実施例 ３ 実施例１の方法をくり返したが、さだし付加的グロブリ
ンおよびフィブリノーゲンを血※から除去するために中
間工程を加熱処理工程の前の第一の炉過操作後に行なっ
た。

前記中間工程において、第一の炉週によって得られる樹
脂−蛋白炉過ケーキを０．００２モルＮａＣそ中クエン
酸でｐＨ４．７に調整し、３０分間混合した。この混合
物を炉過し、洗浄し次に加熱処理およびその後の実施例
１に記載の工程に付した。ｐＨ４．７における処理後の
炉液はＱ−および８−グロブリンおよびフイプリノーゲ
ルを含有し、これらは各種の既知の治療用または診断用
便用に対して保持されうる。最終アルブミン生成物は実
施例１と実質上同様の収率および純度で得られた。本発
明による精度アルブミン生成物の回収に続いて、前記ア
ルブミンを所望の水準に濃縮することが可能であり、濃
縮された生成物は生理学的に許容しうるｐＨおよび電解
質含量に調整され、さらに加熱してウイルスを殺滅し、
そして炉過あるし、はその他の方法によって澄明化する
ことにより臨床上許容しうる生成物を提供しそしてその
他の点では標準血清アルブミン生成物に対する公的（例
えばＢｕｒｅａｕｏｆＢｉｃｌｃｇｉｃｓによる）規制
を満足することができる。従来行なわれている有用な濃
縮方法の例は‘１｝５％または２５％のような所望の水
準を達成する凍結乾燥およびそれに続く再溶解法および
（２｝限外炉過法である。以上の記載から、本発明の範
囲を逸脱することなく前記以外の各種の実施態様が当業
者に理解されるであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルブミン−蛋白混合物を、ジメチルアミノプロピ
   ル官能性懸垂基を含有するエチレンと無水マレイン酸と
   の水不溶性交さ結合高分子電解質共重合体からなる群か
   ら選択される樹脂状重合体性物質と約５．０〜約５．５
   のｐＨおよび約６５℃〜約７２℃の温度において約１時
   間〜約４時間接触させ、次に該混合物をｐＨ約３．５〜
   約４．５に調整して所望のアルブミンを選択的に溶離さ
   せることを特徴とする、血清アルブミンフラクシヨンを
   その他の血液蛋白成分との混合物から高収率かつ高純度
   で製造する方法。 ２ 樹脂状重合体性物質がアルブミン−蛋白混合物の約
   １重量％〜約５重量％の濃度で使用されることを特徴と
   する前記第１項の方法。 ３ 樹脂状重合体性物質をメチルイミノビスプロピルア
   ミンと交さ結合させることを特徴とする前記第１項の方
   法。 ４ 樹脂状重合体性物質が無水マレイン酸１００単位あ
   たり約５個のメチルイミノビスプロピルアミン交さ結合
   基および約９０個のジメチルアミンプロピル懸垂基を含
   有することを特徴とする前記第３項の方法。 ５ 加熱処理工程中のｐＨが約５．２〜約５．３である
   ことを特徴とする前記第１項の方法。 ６ 溶離工程中のｐＨが約４．０であることを特徴とす
   る前記第１項の方法。 ７ 加熱処理が約７０℃の温度において行なわれること
   を特徴とする前記第１項の方法。 ８ アルブミン−蛋白混合物が全血血漿であることを特
   徴とする前記第１項の方法。 ９ アルブミン−蛋白混合物がＡＨＦ−減少化血漿フラ
   ンクシヨンであることを特徴とする前記第１項の方法。 １０ アルブミン−蛋白混合物が最初にフランクシヨン
   化されてγ−グロブリンが除去されている前記第１項の
   方法。１１ γ−グロブリンを除去するための最初のフ
   ランクシヨン化がアルブミン−蛋白混合物を樹脂状重合
   体性物質とｐＨ約５．５〜約７．５において接触させそ
   して未吸着物質をγ−グロブリンフランクシヨンとして
   分離することをらなることを特徴とする前記第１０項の
   方法。 １２ 最初のフランクシヨン化がｐＨ約６．０において
   行なわれることを特徴とする前記第１１項の方法。１３
   吸着されたアルブミン−蛋白混合物をｐＨ約４．７に
   調整しそして脱着された上澄み液をそれから分離するこ
   とからなるα−およびβ−グロブリンを除去するための
   付加工程を包含することを特徴とする前記第１０項の方
   法。