JPS6035262A - Ａｔｐの分解及び測定並びに細胞の分解及び濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明が関係する技術分野は定量方法、また詳■１には
、ＡＴＰ及び単細胞有機体の測定方法である。

バクテリア、酵母細胞及び白血球のような三リン化アデ
ノシン＜ＡＴＰ）及び単細胞有機体の存在の定量的決定
は多くの分野で重要である。例えば、生物液、食品、産
業及び環境試料内のバクテリアの存在の検出は重要であ
る。もしバクテリア含有量が特定の最大限度を越えれば
、経済的損害が強烈であり得る。同様に、飲料及び酪農
品内の酵母含有伍の検出は醗酵の段階の監視を簡単化づ
ることができ、またこれらの製品の成功裡の使用のため
に肝要である。特定の範囲内のこのような細胞の存在及
び（又は）邑を検出Ｊるために使用し得る通常の方法は
一般に時開がかかり、比較的退屈な作業を必要とし、ま
た特に細胞８Ｉ度が約１Ｘ１０５ＨＪ胞／ｍｌ以下であ
る時には十分に正確でない。更に、複数の形式の細胞を
検出する際には、検出の過程が著しく複雑である。

従って、比較的低い８１度に於ても、また複数の形式の
単細胞有機体を含んでいる試ｒ１に対しても、ＡＴＰ及
び単細胞有機体を検出づる簡単な方法が要望されている
。

本明細書には、試料中に単細胞有機体を含／υ（・いる
三リン化アデノシンの濃度の測定方法が記載されている
。有機体を含んでいる試料は、所望の濾過膜上に有機体
をｍ縮するような相対的刺孔寸法を有する一連の濾過膜
を通じて上方に通される。

上方濾過は有機体を懸濁状態に保ち、こうして有機体の
析出を避け、イの結果高い精度で有機体カウントが得ら
れる。上方濾過及び複数の濾過器の使用は、干渉する物
理的デブリス及び化学的粒子のような望ましくない構成
要素を濃縮濾過器から除くという利点をも有する。濾過
器の閉塞も防止されている。

本発明の他の特徴は、一つの試料通過中に存在づる種々
の右機体を選択的に濃縮するような複数の濾過器のサイ
ジングを含んでいる。例えば、一つの試料内に含まれて
いる三つの別別の形式の細胞が、細孔寸法の異なる三つ
の間隔を置いた濾過器を通され、有機体の各々の一つは
濾過器の少なくども一つに対して不透過性であり、そこ
に集められ且濃縮される。

本発明の他の特徴は、微生物（ＡＴＰ）、非微生物ΔＴ
　ｌ）及び細胞外ＡＴＰを分離する方法を含んでいる。

これは、減少する細孔司法を右づる一連の濾過膜を通じ
て上方に種々の形態のＡ　−Ｉ’　Ｐを含んでいる試料
を通過させることにより実現されている。濾過器の細孔
の寸法は、瀘液内に集められ得る細胞外ＡＴＰの通過を
許づように選定されている。少なくとも一つの濾過膜は
、Ａ　Ｔ　Ｐを含んでいる細胞に対して不透過性の細孔
４法を＠するものとして選定されており、まに少なくと
も一つの濾過膜は、非微生物ΔＴＰを含んでいる細胞に
対して不透過性の細孔寸法を有づるものどして選定され
ている。非微生物ＡＴＰに対して不透過性の濾過膜は微
生物ＡＴＰに対して不透過性の濾過膜の上流に置かれて
いる。これはＡＴＰの源を集め、測定し且同定するだめ
の有用な方法を与える。

本発明の他の特徴は、特定の細胞形式の細胞を濃縮する
方法を含んでいる。複数の１１１胞形式を含んでいる試
料が減少する細孔Ｊ法を有りる一連の濾過膜を通じで上
方に通され、少なくとも一つの濾過膜は、濃縮されるこ
とが望ましい特定の細胞形式に対して不透過性である。

本発明の他の特徴は、実質的に純粋なバクテリア細胞の
正確なカウントに不利に干渉するであろう溶性インター
フエレンスを含んでいる試料から実質的に純粋なバクテ
リア細胞の試料を分離する方法を含んでいる。集められ
ることが望ましいバクテリア細胞をトラップし且濃縮す
るような細孔１法に選定された濾過膜を通じてインター
７エレンスの通過を許す上方濾過法がここに用いられて
いる。

それぞれの濾過器上での濃縮後に、濃縮された有機体を
含んでいる濾過膜は順次に溶解剤及びルミネセンス反応
剤で処理される。溶解剤は細胞を溶解して、細胞内に存
在する三リン化アデノシン（ＡＴＰ）を釈放する。次い
で、ＡＴＰはルミネセンス反応剤と反応させられ、ルミ
ネセンス応答（光）を生じ、それがルミノメータで測定
される。

本発明の上記及び他の特徴及び利点は以下の説明及び添
付図面から一層明らかになろう。

前記のように、本発明の方法の利点の一つは、単細胞有
機体を懸濁状態に保ち且有機体の析出をなくす方策であ
り、その結果一層正確なカウントを可能にする。他の利
点は外来材料の除去及び単−試料内の多重有機体の検出
能力を含んでいる。

本発明の方法は、大きい方の０径及び大きい方の細孔サ
イズの濾過器を第二の濾過器の上流（人きい方の細孔寸
法から小さい方の細孔寸法への流れの方向）に置いて二
つの濾過器ホルダーを含んでいる少なくとも二つの濾過
器の使用を含んでいる。典型的に、１３ＩｌｌＩｌ直径
及び０．７ＩμＩＩｌ細孔寸法のポリカーボネート濾過
器を内蔵する３　ｗ＋ｎｎｅｙ濾過器ホルダーが、２５
ＩＩＩＩＭ直径及び５μｍ細孔寸法の濾過器を内蔵する
２　５　ｍｍ′ａ過器ボルダ−に接続されている。

水溶性試わ［が殺菌注射器内に取られ、また注射器ポン
プによりほぼ２．５ｍｌ／ｍｉｎの速度で上方に、順次
に接続されている２　５　ｍｍｌ過器及びその後の１３
ｍｍ濾過器に押される。最終濾液は典型的に殺菌容器内
に集められ得る。

第一の濾過器は（乳頭細胞及び（又は）酵母のような）
大きい粒子又は一層大きい細胞を保留し、Ｊ、た例えば
試料内のバクテリア細胞は一層大きい細孔寸法の第一の
濾過器を通過し且第二の濾過器上でにＨ１δされること
になる。破れ／ｊ細胞及び他の源からの自由ＡＴＰ及び
染料、抗生物質、化学薬品等のような溶性インターフエ
レンスは両濾過器を通過し、最後には最終鑓液内に至り
、その結果として一層正確な細胞Ａ　Ｔ　Ｐ測定が行わ
れ得る。

出発試料及び最終濾液は、バクテリア細胞が小さい方の
細孔寸法の濾過器を逃げていないことを確認するように
、寒天培養基上に置くことにより比較して定すされ得る
。

本発明がルミノメータ上で細胞の個数を検出するものと
して説明されているが、この方法は同様に他の実験のた
めの細胞の簡単な分離のために用いられｆ！するａ濾過
器（１３ｍｍ及び（又は）２５ｎ＋ｍ）上に保留された
細胞は細胞の濃縮のため濃厚な栄養素の源で培養され得
る。更に、細胞の培養基の同定又は溶解及びルミネセン
ス反応剤による処理が行われ得る。Ｔ型コネクタが種々
の濾過器ホルダーと種々の分析のために取出される濾液
の試料との間に挿入され得る。ルミネセンス発光応答が
、ポリカーボネート、セルロース′の混合エステル、セ
ルローズ・アセテート及び１−ｅｒｌｏｌｌ　（Ｉｔ録
商標、ｃｌｕ　Ｐｏｎｔ　＜Ｉｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　＆
　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、　）膜のように単細胞有機体（細
胞）をトラップし且集めるのに十分な多孔性を有する任
意の通常用いられている重合体濾過膜上で得られる。細
胞を濃縮づるため、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ、　ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ノコリフオルニ
ア州から入手可能なポリカーボネート膜は、適当な撓み
性及び耐久性、を有しているので好ましい。

使用に当り、単細胞有機体について検査されるべき試料
は、もしそれが液体状であるならば、通常の濾過装置上
で直接に濾過される。また、しし試料が固体状であれば
、ａｔ胞が緩衝液又は水等により通常のように抽出され
得る。説明がここでは細胞という表現でなされているが
、実際の測定がほぼ等価な集落形成単位（ＣＦＬＩ）で
なされてよいことは理解されよう。

典型的に使用される濾過装置は、１＠１〜５０−の使い
捨て可能な殺菌注射器に接続された１３ｍ１ｎ又は２５
　ｍｄｌ過器ホルダー内に内蔵された複数個の濾過器を
含んでいる。濃縮された細胞を含んでいる股は一般に、
生物ルミネセンス決定のため適当な容器内に挿入されて
いる。

十分な溶解反応剤が、検査されている試料内の細胞のづ
べてを溶解させるのに用いられるべきである。沸ＩＩＩ
！Ｔｒｉｓ　（Ｔｒｉｓ　（ヒトｏｔｊｚメチル）アミ
ノメタン・ヒドロクロライド）のような大抵の通常の生
物細胞溶解法が細胞を溶解し且細胞ＡＴＰを釈放するの
に用いられ得るが、第４アンモニウム塩主体のＰＩＣＯ
ＥＸ（登録商標＞Ｂ（Ｐａｃｋａｒｄ　［ｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ　ＣＯ□［）　０Ｗｎｅｒｓ　Ｑ　ｒＯＶｅ。

イリノイ州）が本発明と共に有利に使用される。

室温で最低２分間に亘り濾過器に加えられた最低１００
μｍのＰＩＣＯＥＸ　Ｂが細胞の完全な溶解のために最
適であることが見出されている。

一旦細胞が溶解され且ＡＴＰが釈放されると、ルミネセ
ンス反応剤がルミネセンス応答を開始覆るべく加えられ
る。この応答はルミノメータ」二で最低１５秒間に亘り
積分される。任意のルミネセンス反応剤が用いられ得る
が、ｔ’１ｒｅｆｌｙ　１ｕｃｉｒｅｒａｓｅ　−１ｕ
ｃＨｅｒｉｎ主体のＰＩＣＯＺＹＭＥ　（登録商標）　
Ｆ　（Ｐ、ａｃｋａｒｄ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃ
ｏ、）が本発明と共に有利に使用される。ここで再び、
十分なルミネセンス反応剤が、濾過股上に集められた細
胞から釈放されｔｃ　Ａ　Ｔ　Ｐのすべてど反応するよ
うに加えられる。例えば、最小１００μｍのＰＩＣＯＺ
ＹＭＥ　Ｆが１３ｍｍ又は２５ｎ＋ｍ直径の濾過膜に対
して最適であることが見出されている。

任意のルミノメータが本発明と共に用いられ得るが、Ｐ
ＩＣＯＬＩＴＥ（登録商標）ルミノメータ（Ｐ　ａｃｋ
ａｒｄ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、　）が特に適
当であることが見出されている。ＰＩＣＯＬＩＴＥルミ
ノメータと共ｋｍＰＩｃＯＺＹＭＥ　Ｆを使用すると、
反応された各ＡＴＰ分子に対して一つの光子が理論的に
発せられる。

説明された多重濾過器による濾過技術を用いて、混合さ
れた純粋培養基、肉試料、乳試料及び尿試料が、膜濾過
器を発光させることにより得られる光応答と濾過試料内
の細胞の個数との相関を検査された。

例　１ Ｐ　、　’　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　＠胞のカウントが
通常の寒天板カウント法若しくは多重濾過法により研究
される。

相関り結果は第１表中に示されている。

第１表 濾　過　試　料　０．４μｍ濾過器上の光応答（１０ｍ
ｌ）　（カウント／　３０５ｅｃＢ　ｕｔｔａｒｆｉｅ
ｌｄのｔｉ衝液　１１，９２２（Ｂ、Ｂ、） ５００　ＣＦ　Ｕ　／　１０ＩＩｌｌ　２０，９１Ｇ５
０００　ＣＦ　Ｕ　／　１０ｍ１　１１２，２１７例　
２ 幾つかの形式のバクテリア細胞を含んでいる純粋なｊ８
養基の混合物の１０ｍ１のシリアル・ディリュージョン
が本発明の多重濾過システムを通された。試料中のバク
テリア細胞の個数は、第１図中に示されているように、
０．４μｌＩｌ濾過器上の発光に直線的に関係付けられ
ている。寒天板上での培養後の濾過器のＩ！！察から、
酵母Ｊ８養基のほと／。

どは第一の５μｍ細孔濾過器により停止された。

例　３ この実験では、［、ｃｏｌｉ及び酵母のみを含む濾過試
料及び５μＩＩｌ濾過器が濾過器上に保留された有機体
、おそらく酵母、を定量するため発光させられる。第２
図中に示されている二つの平行な線は、試料内の細胞の
増加と共にそれぞれ二つの濾過器から得られた光応答を
表わしている。［Ｅ、Ｃ０Ｉｉは０．４μｍ寸法の濾過
器上で濃縮され、また酵母のほとんどは５μｍ細孔寸法
の濾過器上で濃縮された。

例　４ 生物ルミネセンス定量と組合せて本発明の多重濾過シス
テム内でグラウンド・ビーフ内のバクテリア細胞から得
られた結果が、新鮮な肉に対しては第３図中に、また種
々の条件で腐敗させられた自滅料に対しては第４図中に
示されている。試料内のバクテリアＣＦＵと０．４μｍ
ｌｌ孔寸法の濾過器から得られた光応答との間には明確
な直線的曲係が存在する。得られたルミネセンス応答が
自滅わＩの生育可ａ　１ｆｌｉ　ｌｋ１カウントに良好
な相関を有することをａ察することは興味がある。

例　５ 乳、主として連鎖状菌及び乳酸菌、内に存在する３ｆ！
！！類又は４種類の形式のミクロ有機体がある。

脱脂乳の種々のディリュージョンが本発明の多重濾過器
システムを通過するとき、濾過器（５μｍ及び０．４μ
ｍの合計）上の光応答と試料のディリュージョンとの間
に相関が存在づる。第５図参照。乳試料内に存在する乳
頭細胞も関心があるので、５μＩＩＩにりも大きい細孔
寸法を有する濾過器が乳頭細胞を保留し且定伍するのに
用いられ得る。

例　６ 種々の条件で腐敗させられた魚全体又は魚の切り身の表
面汚染を抽出する緩！！ｉ７液を使用して実験が行われ
た。抽出試料は次いで多重濾過を通じて処理される。各
濾過器上の光応答の分布と板カウントどの光の相関とが
第２表及び第６図にそれぞれ示されている。（表中でＰ
Ｃはポリカーボネー１へを意味し、第一の数字は濾過器
のｌｌｌｌ１１直径であり、また第二の数字は濾過器の
μＩＩｌ…孔寸法である）。

腐敗させられた魚試料の最も汚染Ｊるミクロ有機体が１
μｍと０．４μｍとの間の１法を＠づることを示す光応
答のＡ−バーハーフがｌ）Ｃ／１３１０．４１′ｉＡ器
から得られた。好気板カランｌ−のＣＦＵは魚洗い落し
のグラム当たり１０５から１０８１１Ａ胞までの範囲で
ある。ＣＦＵの数は全ての三つの濾過器から得られた光
応答の合ａ］と非常によく相関している。Ｒ終濾液内に
見出される零〇ＦＵは、０．４μＩＩｌ濾過器を逃げる
ミグ０４１機体が存在しないことを示す。

例　７ スパイクされた人間尿試料からの結果が第７図中に示さ
れている。人間尿試料は種々の８１度のＥ、　ｃｏｌｉ
の純粋培養基及び酵母サツカロミセス・セレビシェでス
パイクされた。１５１のスパイクされた試料が多ｍｗｌ
過された。試料からのＣＦＵと全ての濾過器からの光応
答との間の相関が第７図に示されている。この結果は、
多徂′ａ過技術が生の尿を濾過し且１０！＋から１０８
までのＣＦＵ／１尿の範囲内のミクロ有機体を定ｍする
のに用いられ得ることを示した。

第　３　表 時間（ｍｉｎ　）　カ　ントｘ１ｏ”　３０ｓｅｃ０　
１、３１ １　１、２９ ２　１、３４ ３　１、３７ ４　１、２１ 例　８ 約２　、５　ｍｌ／１ｎの速度が、システムを通じて試
料を押すために最適な速度であると思われる。

り１３人中に示されている結果により示されるように、
１０ｍ１試１１の４分間の濾過の間に、試料懸濁物から
の細胞の認められる析出は見られなかった。

細胞をカウントする時に考慮に入れられるべき二重濾過
器システムの全死体積は約１．８ｍｌである。

膜支えスクリーン自体は約０．４１の液体を保持づる。

自由Ａ　ｌ　ｌ）又はＡＴＰ含有物かない清浄濾過器は
このシステムの高い分解能を明らかにする。自由△ＴＰ
を除去するべく殺菌水で溶解されている殺菌線過器を使
用し且全濾過システムをオートクレーブすることは好ま
しい。

濾過器ホルダーはＴｅｆｌｏｎ、ポリカーボネート又は
ステンレス鋼で製作され得る。封じる／ＣめのＯリング
はＴｅｆｌｏｎ、、エチレン、プロピレン又はＶｉＬｏ
ｎ　Ａにより製作され得る。膜濾過器としては、前記の
ように、ポリカーボネー１へ、ポリエステル、セルロー
ズの混合エステル及び窒化セルローズが用いられ得るが
、全てが例えばオートクレーブの際に異なる化学的能力
及び耐熱性を有することが念頭に置かれなければならな
い。また、それらのほとんどは例えば殺菌のためのメタ
ノールへの露出のちとに安定ではない。

本システムと共に前濾過器を使用づることは最適であり
、大きな粒子を除去することにより濾過を容易にし、そ
れにより続く濾過中のインターフエレンスを最小化する
。

本発明をその好ましい実施例について図示し説明してき
たが、本発明の範囲内でその形態及び細部に種々の変更
が行われ得ることは当業者により理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリカーボネート、１３ｍｍ直径、０゜４μＩ
Ｉｌ＃ｌｌＩ孔寸法膜濾過器上での混合バクテリア培養
基に対１−る光応答を示す図である。 １２図ハｔｆｔ合Ｅ、ｃｏｌｉ　及Ｕ酵Ｉｎ　ｆ８　ｔ
＆基に対する光応答を示す図である。 第３図はグラウンド・ビーフ試料の光応答を示す図であ
る。 第４図は腐敗させられたグラウンド・ビーフ試料に対す
る光応答を示す図である。 第５図は脱脂乳試料に対する光応答を示寸図である。 第６図は魚試料に対する光応答を示す図である。 第７図は人間尿試料の光応答を示す図である。 特許出願人　パラカード・インストルメント・カンパニ
ー 代　理　人　弁　理　士　明　石　昌　毅ＦＩＧ、　４ ン （ＨＦｕ／ｍｌ　Ｐ＋＋才　Ｌ−一）積本ＦＩＧ、　５

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物ＡＴＰ、非微生物ＡＴＰ及び細胞外△Ｔ　
   Ｐを分離づる方法に於て、減少する細孔寸法を４＝ｉす
   る一連の濾過膜を通じて上方に前記ＡＴＰを含む試料を
   通過させる過程を含んでおり、全ての膜がｍ１ｌｌ外Ａ
   ＴＰに対して透過性であり、少なくとも一つの濾過膜が
   微生物ＡＴＰを含む細胞に対して不透過性であり、また
   少なくとも一つの濾過膜が非微生物ＡＴＰを含む細胞に
   対して不透過性であり、非微生物ＡＴＰに対して不透過
   性の濾過膜が微生物△ＴＰに対して不透過性の濾過膜の
   上流に置かれていることを特徴とするＡＴＰの分離方法
   。
2. （２）単一の試斜内に含まれている複数の細胞形式を分
   離する方法に於て、減少する細孔寸法を有する一連の濾
   過膜を通じて上方に試料を通過さぜろ過程を含んでおり
   、各濾過器が他の濾過器と異なる細孔寸法を有しており
   、また各濾過器が順次に単細胞有機体の一つ以外の全て
   に対して透過性であることを特徴とする細胞の分離方法
   。
3. （３）ＩＩＩＩＡＴＰ及び細胞外ＡＴＰの分離及び測定
   の方法に於て、減少する細孔寸法を有する一連の濾過膜
   を通じて上方に前記Ａ　Ｔ　Ｐを含む試料を通過させる
   過程を含んでおり、全ての膜が細胞外ＡＴＰに対して透
   過性であり、少なくとも一つの濾過膜がｍｌ胞ＡＴＰを
   含む細胞に対して不透過性であり、また細胞を含んでい
   る不透過性濾過膜を順次に、細胞からヨリン化アデノシ
   ンを釈放づるべく溶解剤で、また釈放されたＡＴＰと反
   応させるべくルミネセンス反応剤で処理する過程を含ｌ
   υでおり、それにより濾過膜上に直接にルミネセンス応
   答を生じさせ、且ルミノメータによりルミネセンス応答
   を測定することを特徴とする△−［Ｐの分離及び測定方
   法。
4. （４）非微生物溶性インター７エレンスをも含む試料か
   ら実質的に純粋なバクテリア細胞を分離する方法に於て
   、減少する細孔寸法を有する一連の濾過膜を通じて上方
   に前記細胞を含む試別を通過さする過程を含んでおり、
   全ての膜はインターフェレンスに対して透過性であり、
   また少なくとも一つの濾過膜は前記細胞に対して不透過
   性で′あることを特徴とする細胞の分離方法。
5. （５）特定の細胞形式の細胞を濃縮する方法に於゛Ｃ１
   減少する細孔寸法を有する一連の濾過膜を通じて上方に
   複数の細胞形式を含んでいる前記細胞試別を通過させる
   ことにより複数の細胞形式を含んでいる試料から特定の
   細胞形式を濃縮する過程を合んでおり、少なくとも一つ
   の濾過膜は特定の細胞形式に対して不透過性であること
   を特徴どする細胞のｍ縮方法。