JPS6037987A - 制限部位の列からなるクローニングベクトル類およびそれらの構成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多数の独特のクローニング部位からなる小さ
いＤＮＡセグメントから成る制限部位の列（ｒｅｓｔｒ
ｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ｂａｎｋ）を含有し、かつ異
質ＤＮＡ物質の原核細胞および真核細胞へのクローニン
グを可能とするベクトル類（ｖｅｃｔｏｒｓ）に関する
。また、本発明は、このような制限部位の列を構成する
方法およびこのような制限部位の列を含有するベクトル
類の使用に関する。

制限酵素類は、組み換えＤＮＡ技術において、たとえば
、クローニングベクトルからおよびクローニングすべき
ＤＮＡ物質から相補的な凝着性の端を生成させ、こうし
て両者の組み換えを可能とすることにより、重要な役割
を演することはよく知られている。よく定められた部位
に対して特異的な多数のシのような制限酵素が現在入手
可能であり、対応する部位がベクトル中に存在するかぎ
り、クローニング実験において大きい融通性を可能とす
る。その上、これらの部位は制限された数で存在すべき
であり、好ましくは所望の組み換えＤＮＡを得るために
必要な数の組み換えの結果を誘発するように独特である
べきである。

原核生物類（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）のクローニング
のためのプラスミドベクトルの設計（ｄｅｓｉｇｎ）の
従来の概念は、独特の部位を含有する多数の抗生抵抗性
遺伝子類（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔ、ａｎ
ｃｅ　ｇｅｎｅＳ）の使用に集中されたので、これらの
部位の１つにおけるクローニングは抗生物質の１つにお
ける感受性を生じ［挿入的不活性化（ｉｎｓｅｒｔ１ｏ
ｎａ、１　１ｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）Ｊ、これにより
組み換えの検出が促進された。この概念はきわめて有用
であるが、制限を有する。第１に、多数の独特の制限部
位を含有するプラスミド、を構成することは困難である
。なぜなら、他の抗生抵抗性遺伝子類の添加は複製部位
を導入すると同時に、望ましくない大きさの増大に導く
からである。第２に、挿入不活性化が有用ではない多く
の場合が存在するからである。このような場合は、たと
えば、ショットカン（ｓｈｏｔｇｕｎ）の実験における
特別に稀な換え体をスクリーニングするとき、あるいは
抗生抵抗性遺伝子中の適当な独特のクローニング部位（
ｃｌｏｎｔｎｇ　５ｉｔｅ）が入手できないときである
。真核生物類（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）の場合において
、真核細胞類は一般にほとんどの抗生物質類に対して抵
抗性であるので、多数の抗生抵抗性遺伝子類をもつプラ
スミドベクトル類の使用はほとんど興味を起こさせない
。

これらの制限のために、他の方法で、たとえば、交雑プ
ローブ類（ｈｙｂｒｉｄａｔ　ｉ　ｏｎｐｒｏｂｅｓ）
、または遺伝的に標識づけらた宿主菌株の相補性を用い
て、あるいは単に制限酵素を用いるプラ、スミドＤＮＡ
調製物をスクリーニグすることにより、雑種コロニーを
スクリーニングすることを可能とする技術が開発された
。同様に、非組み換え新型プラスミドの比率は、結合前
のベクトルのアルカリ性フォスファターゼ処理により、
あるいは２つの異なる非相補的制限部位間の断片をクロ
ーニングすることにより、減少させることができる。こ
れらの理由で、本発明は、挿入的不活性化をプラスミド
構成における哲学として無視し、そして別の概念、すな
わち、制限部位の列の概念を導き出した。この明細書に
おいて、制限部位の列は小さい大きさを有しかつ多数の
独特の（ｕｎｉｑｕｅ）制限部位を有するように特別に
設計されたＤＮＡセグメントを有すると定義される。こ
の定義により、再分割または制＠部位の列への伺加（ａ
ｄｄｉｔｉｏｎ）も制限部位の列を生成する。

本発明によれば、従来のベクトルよりも大きい数の独特
の制限部位、好ましくは４旦ｏＲＩ、ＣＩａ１．Ｈ４ｎ
ｄＩ［Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＩＩ、Σ１ユＩ　
（Ａｃｃｌ、Ｈｉｎｃｌｌ）、人！」■、及ユｕＩ、Σ
工匹■、股上」■、八」ｕＩｌ、Ｐ互ユ１．Ｂ互」工、
ｌ工ｌ　ＩＩ、入玉」１、Ｐソ■１、影ａｌＩ、町已Ｉ
Ｉ、幻コニおよびＸｈｏＩから成る群より選ばれた少な
くとも１０の制限部位を含有するベクトルが提供される
。こうして、本発明のベクトルは、ＤＮＡ物質、たとえ
ば、完全な遺伝子のクローニングを、対応する制限酵素
によるＤＮＡ物質の分割（ｃｌｅａｖａｇｅ）の危険な
しに、可能とする。

本発明の好ましい実施態様は、図面を参照しなたら下に
詳述されている。

本発明の特定の実施態様によれば、バクチリオフｗ−’
ンＴＦＩ　Ｈ＋ｎＡｍ　Ｔ−Ｗｔ＃のＩＪ　Ｉ　ｎ　Ａ
ｍ−Ａヱ」１区域から誘導されかつ制限酵素のための独
特な部位ＨｉｎｄＤＴ、団工匹工、４上」■、戊ユｕＩ
１．Ｐ互」工、ｌエユＩＩ、入玉」Ｉ、Ｈｉ　ｎ　ｃＩ
Ｉ、ＰｖｕＴＩ、Ｂａ１Ｉ、Ｍ　ｓ　ｔ　ＩＩおよびＡ
ｖａＩを、示す順序で配置して、含有する制限部位の列
ｂｉからなることを特徴とする。原核有機体および真核
有機体における異質ＤＮＡ物質をクローニングするため
のベクトルが提供される。　このベクトルから、前述の
制限部位の列ｂｌの変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔ　ｔｏｎ
）により他のベクトルを誘導することができる。こうし
て、酵素のための制限部位及且」■およびＢｃｌＩが、
列ｂ１の９１０ｂＰＰ已Ｉ−ｂ已１１セグメントをプラ
スミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐＰｓｔＩ−ｌエユＩＩ
断片で置換することにより、列ｂ１へ付加されたベクト
ルも、提供される。得られる制限部位の列は、以後ｂ２
と呼び、こうして制限酵素のための独特な部位Ｈｉｎｄ
Ｉｌ］、１１匹■、４上ｎ１．戊ｓ　ｕ　ＩＩ　、尺互
」■、入且」■、Ｂｅユ■、旦」ＬユＩ１．Ｘｂａｒ、
Ｈｉｎｃｆｒ、アヱｕ　ＩＩ、ルエ」工、址互ｔ　ＩＩ
および戊ヱａＩ（示す順序で配置されている）からなる
。

木発明は、さらに、制限部位の列ｂｌおよびｂ２のＨ４
ｎｄＩ［［端をプラスミドｐＢＲ３２２からの見至ｏＲ
Ｉ−戊ヱ」工断片の友ヱ」■端と融合し、こうして制限
酵素のための追加のクローニング部位ＥｃｏＲＩ、見ユ
」工、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ　、旦匹ユＲＶ、Ｂ互ｍＨ１，
斗上」■、旦」」工Ｉ　（ＡＩＣＩ、Ｈｉ　ｎ　ＣＩＩ
）　、　ＸｍａｍおよびＮｒｕＩ（示す順序で配置され
ている）を導入することにより、前述のものから誘導さ
れたベクトルを提供する。このようにしてＭ成された新
規な制限部位の列は、以後それがｂｌまたはｂ２のいず
れから誘導されても、以後ｂ３またはｂ４と呼ぶ。

これらのベクトル中に含有される制限部位の列ｂ３およ
びｂ４は２つのＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ部位からなり、それ
らの１つは好ましくは存在すべきではない。したかって
、本発明は、また１列ｂ３またはｂ４のＰＢＲ３２２誘
導部分からの独特の蕉↓」ｃ　ＩＩからなる列ｂ３また
はｂ４の変更体（ｍｏｄｉｆｊｃａｔｉｏｎ）を含有す
るベクトルを提供する。このように変更された制限部位
の列は、以後それがｂ３またはｂ４のいずれから誘導さ
れても、以後ｂ５またはｂ６と呼ぶ。

同様に、制限部位の列ｂ４およびｂ６は２つのＸ　ｍ　
ａ　ｍ部位からなり、それらの１つはまた存在すべきで
はない。こうして５本発明は、また、列ｂ４またはｂ６
のｐＢＲ３２２Ｍ導部分からの独特のＸ　ｍ　ａ　ｍか
らなる列ｂ４またはｂ６の変更体を含有するベクトルを
提供する。このように変更された制限部位の列は、以後
それがｂ４またはｂ６のいずれから誘導されても、以後
ｂ７またはｂ８と呼ふ。

クローニングのために入手可能な有用な制限部位の数を
さらに増加するために、前述のベクトルのいずれかの制
限部位の列の戊ヱ」■端へ股上」■を導入することによ
り誘導されたベクトルが、木発明に従い提供される。制
限部位の列ｂ８の場合において、このようにして形成さ
れた制限部位の列は、次の制限酵素のための独特の部位
１工」ＲＩ、Ｃ１ａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、
Ｂａ四Ｈ１，Σ上」■、Σ１」■（戊旦匹工、焦土」旦
１■）、入玉」■、Ｎ工ｕＩ、ΣＡ匹Ｉ２艮上」■、戊
ユｕ　ＩＩ　、二重」１．１互ユニ、ＦＬＩＬｉＩＩ　
。

Ｘ１」Ｉ、尺ヱｕ　ＩＩ、影りＩ、生口１１およびＸｈ
ｏＩ（示す順序で配置されている）からなる。

クローニングのために入手可能な有用な制限ｆイｂ位の
数をさらに増加するために、本発明に従る。

それ以」−の面において、本発明は、前述のベクトル中
に含有される制限部位の列を構成する方法に関する。こ
うして１つの実施態様によれば、制限酵素のための独特
なりローニング部位Ｈｉｎｄｍ　、Ｓ　ａ　ｃ　Ｉ　、
４上」Ｉ、Ａ　ｓ　ｕ　ＩＩ、旦ユ」■、１エユＩＩ、
Ｘｂａｌ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ、月ａ１１
．￥二ｓ　ｔ　ＩＩおよびＡｖａＩからなる制限部位の
列ｂ１を構成する方法は、 ａ）　バクテリオファージ　Ｔ５　Ｈ４ｎｄｍＬ断片の
Ｈｉｎｄｍ〜戊ヱ」工区域中の２つのＸｂａＩ部位間の
セグメントを欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させて、単一の
しａＩ部位を生成させ、そして ｂ）　同一区域中に存在する２つの１工Ｉ　１１部位間
の１２５０ｂｐセグメントを欠失させて、単一のＡ　ｓ
　ｕ　ＩＩを生成させると同時に重複Ｌヱｕ　１１部位
を除去する、 工程からなる。

この第１制限部位の列ｂ１からそれ以上の列を生成する
ことができる。たとえば、制限部位の列ｂ２は、制限部
位の列ｂｉの９１０ｂｐＰ互」■−ＢＬｉＩＩセグメン
トをプラスミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐＰ已■−影１
１Ｉ断片で置換し、こうして制限酵素のための部位＼ｍ
ａｍおよびβｃｌＩを伺加する、方法に従い構成するこ
とができる。

ｂｌｉよびｂ２より大きいクローニング部位からなる、
なお他の制限部位の列は、プラスミドＰＢＲ３２２から
のＤＮＡ断片との融合によりそれらから構成できる。こ
うして、この構成方法の１つの実施態様によれば、制限
部位の列ｂ１の焦ユｎｄＩＩＩ端をプラスミドＰＢＲ３
２２からの１互」ＲＩ−戊ヱ」■断片の戊ヱ」工と融合
させる。この融合の結果、制限酵素のための追加のクロ
ーニング部位ＥｃｏＲ１，Ｃ↓３■、Ｈｉｎｄｍ　旦ｃ
ｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、Σ上」工、５ａｌＩ（Ａ。

＝１、Ｈｉ　ｎ　ｃｌｌ）　、Ｓｍａｍおよび祖工」■
（示す順序で配置されている）からなる制限部位の列ｂ
３が得られる。

この構成方法の他の実施態様によれば、制限部位の列ｂ
２のＨｉｎｄｍ端をｐＢ１３２２からの同−ＤＮＡ断片
の戊ヱ」１端と融合させる。この融合は列ｂ３における
のと同一の追加のクローニング部位を含有する制限部位
の列ｂ４を生ずる。

同一の制限部位の列ｂ４は、また、制限部位の列ｂ３を
用いて出発する方法により構成することができ、ここで
制限部位の列ｂｌ中に存在する過剰のＤＮＡ物質を制限
部位の列ｂ２の構成方法において説明したようにして除
去する。

制限部位の列ｂ３は酵素のための２つの部位旦１１匹Ｉ
Ｉを有する＝１・つはｐＢＲ３２２−訪導断片中の存在
し、そして他方はバタテリオファージ誘導区域中に存在
する。この制限部位の列から、Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＴのた
めの独特の部位を含有する列ｂ５を構成できる。本発明
によれば、これは、制限部位の列ｂｌの乱１」Ｈ−Ａヱ
」１区域中の焦土」ｃ　１１部位を欠失させると同時に
隣接する入ｂａＩ部位およびＬユｕ　ＩＩ部位を保持さ
せ、次いで得られた欠失区域を制限部位の列ｂ３のｌ工
」ＩＩ　−Ａｖａ１区域と置換することによって、達成
される。

同様に、独特のＨｉ　ｎ　Ｃ１１部位を含有する制限部
位の列ｂ６は、列ｂ１からの同一欠失区域を制限部位の
列ｂ４の１エユＩＩ−Ａ　ｖ　ａ　Ｉ区域と置換するこ
とによって、構成することができる。同一制限部位の列
ｂ６は、また、制限部位の列ｂ５を用いて出発する方法
に従い構成することができ、ここで制限部位の列ｂｌ中
に存在する過剰のＤＮＡ物質を制限部位の列ｂ２の構成
方法において説明したようにして除去する。

制限部位の列ｂ４は２つのＸ　ｍ　ａ　ｍ部位を有する
ニ一方はｐＢＲ３２２−誘導区域中に存在し。

そして他方はｐＫＣ７−？Ａ導断片中に存在する。

本発明の構成方法の他の実施態様によれば、後者のＸ　
ｍ　ａ　ｍ部位を欠失させ、これにより制限部位の列ｂ
７を得る。

から欠失させることができ、これにより制限酵素のため
の独特の部位１且ｏＲ１，Ｃ↓」■、且ユニｄｍ、旦至
ｏＲＶ、Ｂ互ｍＨ１，Σ上ｈ１．互ａＬＩ（ＡｃｃＩ、
Ｈｉ　ｎ　ｃｌｌ）　、　Ｘｍａｍ、ｙ工ｕＩ−Σａｃ
Ｉ・４上」■・戊ｓ　ｕ　ＩＩ・Ｌユ」１、Ｂ至ユＩ、
且［ＩＩ、入玉」工、尺ヱｕ　ＩＩ、１互ユニ、性旦ｔ
　ＩＩおよび戊ヱａＩ（示した順序で配置されている）
からなる制限部位の列ｂ８が得られる。

同一の制限部位の列ｂ８を本発明の方法に従い列７から
構成することもでき、ここで制限部位の列ｂｌの１工」
ＩＩ　−Ａ　ｖ　ａ　Ｉ区域中のＨｉ　ｎ　ｃ　１１部
位を欠失させ、次いで得られた欠失区域を制限部位の列
ｂ７のＢＪＬｉＩＩ　−Ａ　ｖ　ａ　Ｉ区域と置換する
。

前述の制限部位の列から、なおそれ以上の列を生成する
ことができる。たとえば、本発明の構成方法の１つの実
施態様によれば、前述のように構ｖａＩ端へ入玉」■を
融合し、こうしてもとのＡｖａＴを破壊する（しかしな
がら、ＡｖａＴはこの新しいＸｈｏＩ部位をまた分割す
る）。

ここに開示された方法に従い構成された制限部位の列は
、クローニング媒体（ｃＩｏｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ）
が如伺なる宿主であっても、その中に組み込むことがで
きるということが、本発明の１つの重要な面である。こ
うして、それらの制限部位の列は、原核有機体、たとえ
ば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、プソイ
ドモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　１上」ｃｉｅｓ
）など、または真核有機体、たとえば、酵母菌類、菌類
（ｆｕｎｇｉ）およびさらに動物または植物の細胞の中
の遺伝子をクローニングしかつ発現させるように設計さ
れたベクトル中に、挿入することができる。これらの異
る場合において、多数の独特の制限部位は例外的なりロ
ーニングの融通性を提供し、そしてそれらの集団形成（
ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）は引き続く操作、たとえば、サ
ブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）および大きい
クローニング断片の欠失分析を促進する。それらは、大
きい断片、たとえば、ニスミド類（ｃｏｓｍｉｄｓ）の
クローニングを可能とするベクトル中に組み込まれると
、ゲノムのライブラリー類（ｇｅｎｏｍｉｃ　１ｉｂｒ
ａｒｆ　ｅ　Ｓ）の構成に有用である。

本発明の制限部位の列の利点を得る１つの有用な方法は
、選択された宿主ならびにその宿主にある種の薬物、た
とえば、抗生物質、に対する抵抗性を付与する遺伝子ま
たは必須代謝物、たとえば、アミノ酸の、その栄養要求
変異種（ａ　ｕ　ｘ　。

ｔｒｏｐｈｙ）を相補する遺伝子の複製機構により認識
される、複製の起源（ａｎ　ｏｒｉｇｉｎｏｆ　ｒｅｐ
ｌｔｃａｔｉｏｎ）を有するプラスミドベクトル中へ、
本発明の制限部位の列を組み込んで、形質転換された有
機体のための効率よいスクリーニグを可能とすることで
ある。

原核有機体、より特定的にはＥ、ｃｏｌｉを形質転換す
るために現在使用されているほとんどのプラスミド類を
、この目的に使用できる。このようなプラスミド類は、
ｐＢＲ３２２および他の関連するプラスミドｐＢＲ３２
７、ｐＭＢ９などである。他のプラスミド類、たとえば
、自然レプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）Ｃｏ１．ＥＩお
よび他の関連プラスミド類、たとえば、Ｐ１５Ａ、Ｆ、
Ｒ３ＦＩＯＩＯ，Ｒ６１６などを、また、使用して、本
発明に従う制限部位の列を含有する効率よいベクトルを
設計することができる。

同様に、真核有機体の形質転換に使用されるプラスミド
類を使用できる。このようなプラスミド類の典型的な例
は、酵母菌、たとえば、ｐＪＤＢ２０７、ｐＪＤＢ２１
９、ｐＭｐ７８などの形質転換のために設計されたもの
である。

制限部位の列を構成するために本発明の段階的方法を適
用するとき、各工程において得られるよ部位を含有する
ＤＮＡ断片を、それ以上の処理のために十分な量で生産
しかつ単離しなくてはならない。これは、前記ＤＮＡ断
片を前述のよう、なプラスミドベクトル中に挿入し、選
択された宿主を得られたキメラのプラスミド（ｃｈｉｍ
ａｅｒｉＣｐｌａｓｍｉｄ）で形質転換することによっ
て、達成される。外因性のＤＮＡにより形質転換される
ことができる微生物をこの目的に使用できるが、Ｅ、ｃ
ｏｌｉは、良好に設計されかつ効率よい方法がその形質
転換のために存在するばかりでなく、かつまたＤＮＡの
増幅および回収のためにも存在するので、好ましい。以
下の実施例において、Ｅ　、ｃ　ｏ　ｌ　１ＭＭ２９４
株を、特記しないかぎり、宿主として使用する。プラス
ミドｐＪＲＤ１４３で形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ　Ｍ
Ｍ２９４は、オランダ国バールン所在のセントラールビ
ューロー拳プーア・シンメルスカルチュアーズ（Ｃｅｎ
ｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅ　
１ｓｃｕｌ’＝ｕｒｅｓ、ＢａａｒｎＮｅｔｈｅｒｌａ
ｎｄｓ）に１９８３年５月１１目に、ファイル番号ＬＭ
Ｄ　８３．０７＝ＣＢＳ　３９６−８３で受託され、そ
して本発明の一部分を形成する。

一般に、上に示した種々の有機体における複製および選
択を可能とするＤＮＡの現在入手可能なセグメン）・は
、制限部位の列の組み込みに直接適ちではなく、前もっ
た変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を必要とする。こ
れらの要件に従う典型的な手順は、以下の実施例中に記
載されている。

これらの実施例は、例示のみを目的とし、本発明を限定
するものではない。

この実施例において、構成する制限部位の列の複製に使
用するベクトルは、プラスミドＰＢＲ３２２からのＥ　
ｃ　ｏ　ＲＩＩの欠失により得られたプラスミドｐＢＲ
３２７の変更により誘導される（Ｓｏｂｅｒｏｎ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　９，１９８０．２８７−３０５）
。ｐＢＲ３２７の変更は、１旦」　遺伝子からＰｓｔＩ
部位および几」■■Ｉ部位を除去して、最終の制限部位
の列中に存在する独特のＬ互」１部位およびＨｉ　ｎ　
ｃ　１１部位をクロー、；ングに使用５丁能とすること
から成っていた。（これらの部位の除去を失敗すると、
１旦」　の選択的遺伝標識の不活性化によりプラスミド
のクローニングが妨害される）、ａｍ■　遺伝子中の独
特のＰｖｕＩ部位およびΣ至」１部位は、除去されない
。なぜなら、それらは最終の制限部位の列中に提供され
ず、かつある型の組み換え体の構成に有用でないことが
あるからである。用いる手順は、第１図に示されている
。ｐＢＲ３２７の見見」　遺伝子中のＨｓ　ｎ　ｃ　１
１　部位は、独特の５ａ１１部位とＮヱ」■部位との間
の融合により除去されて、テトラサイクリン感受性プラ
スミドｐＪＲＤｌ１７を与える。次いで、３見」　遺伝
子中のここで新規な独特のＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩを、タル
マッシおよびギルパートの方法（Ｔａｌｍａｄｇｅおよ
びＧ１１ｂｅｒｔ、Ｇｅｎｅ　１２．１９８０．２３５
−２４１）に従い、突然変異誘発、引き続＜ＤＮＡの単
離サイクルの反復、制限的分割（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ
ｎ　ｃｌｅａｖａｇｅ）および形質転換により除去した
。これにより、独特のＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ部位を失って
いると同時に１旦」　を保持してるプラスミドｐＪＲＤ
１２０が得られた。次いで、ｐＢＲ３２７の区域旦ｃｏ
ＲＩ−ＰｓｔＩ　［同調体類（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅ
ｓ）３２７１−２５２３］をｐＪ　ＲＤ　ＩＲＲ ２０に回復させてｌ旦」−ｔ　ｅ　ｔ　プラスミドｐＪ
ＲＤ１２２を生成させた。ここでこれは独特のＨｉ　ｎ
　ｃ　ＩＩ部位を有する。次いで、ｐＪＲＤ１２２をさ
らに突然変異誘発および制限的形質転換ＲＲ サイクルに付すと、１旦」、　ｔ　ｅ　ｔ　であるＰＪ
ＲＤ１２３が選択された。これは特待の焦土」ｃ　ＩＩ
を有し、かつＰｓｔＩ部位を欠いている。

この手順は、ｐＢＲ３２２の同調体３１３２に相当する
位置においてＧＣ−ＡＴの塩基対の変化を起こす追加の
突然変異を生じた。この突然変異は２つの重要な効果を
有する。第１に、それはプラスミドのコピーの数を約３
０から１２０に増加させるので、クローニングされた遺
伝子は、遺伝子の投与Ｊｌ（ｄｏｓａｇｅ）が増加する
ため、より良好に発現されるであろう。第２に、それは
プラスミドの通常の不適合性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉ
ｌｉｔｙ）を変更し、このプラスミドはここではｐＢＲ
３２２およびその誘導体類と同−細胞中に並んで共存す
ることができる（２つのｐＢＲ３２２型プラスミドは通
常これを行なうことができない）。同一の突然変異は従
来独立に記載された（ＴｏｍｉｚａｗａおよびＩ　ｔ　
ｏｗ、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃ、ＵｓＡ　７８゜１９８
１．６０９１−６１００）。この利点は、異るプラスミ
ド類」二でクローニングされた異る遺伝子を同一細胞中
に導入することが可能であるということである。

制　部位の夕の　一 本発明による制限部位の列の構成の基礎は、バクテリオ
ファージ　Ｔ５からのＨｉｎｄＩ［Ｉ−Ｔ、断片である
。この断片は、５ａｃ１．に、上ｎＩ、旦ｌ」ＩＩ　、
　Ｘ　ｂ　ａ　ＩおよびＬヱｕ　ＩＩのだめの制限部位
を含有し、これらの酵素のいずれもプラスミドｐＢＲ３
２７を分割することはできない。しかしながら、それは
大きすぎるので、過剰のＤＮＡおよび望ましくない制限
部位を除去することが必要である。

第２ａ図および第２ｂ図は、プラスミドベクトルｐＢ１
１３２２中に初めに挿入されたバクテリオファージ　Ｔ
５からのＨｉｎｄｍ−Ｌ断片を用いて出発する典型的な
手順を図解する（Ｂｒｕｎｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎ
ｅ　８，１９７９．５３−６８）。第１に、前記断片の
２つのＸｂａＩ部位間の４９０ｂｐ区域を除去して、中
−のＫ］且■を生成させた（第２図、ｐＪＲＤ１０９）
。

第２に、１２５０ｂｐＢ工１１１−ＢＩＩ　１１区域を
除去して、単一の乱ｌ」ＩＩを生成させると同時に望ま
しくないアーヱ」主１１部位を欠失させた（第２図、ｐ
ＪＲＤｌｌｏ）、第３に、１４０５ｂｐＡｖａＩ−Ａｖ
ａＩ断片を欠失させ、プラスミドｐＪＲＤＩＩＯの２つ
の戊ヱ」■部位の１つ、２っのＨ４ｎｄｍ部位の１つお
よび全体のＬｅｔ　区城を除去して（この後者は、ｔｅ
ｔ　プロモーター中のもとのＨｉｎｄｌｌｌ〜Ｌ断片の
挿入のため、発現されない）、プラスミドｐＪＲＤ１２
４を得た（第２図）。

次いで、後者のプラスミドの区域Ｎヱ」Ｉ−Ｈｉｎｄｍ
を、」二に説明したように構成したプラスミドｐＪＲＤ
１２３の対応する区域で置換した（第１図）。これによ
り、同時にｐＢＲ３２７のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩＩ　（７）
欠失、Ｐｓ　ｔ’およびＨｉｎｄ’突然変異を有するｐ
ＪＲＤ１２３のｔｅ’Ｗ　区域および増大した数の突然
変異が導入されて、プラスミドｐＪＲＤ１２５が得られ
た（第２図）。次いで、この後者のプラスミドの９１０
ｂｐＰｓｔＩ−ｌ工」１１区域をプラスミドｐＫＣ７か
らの９１０ｂｐアーｓｔＩ−Ｂｇｌｌｌ断片で置換しく
Ｒａ。

＆　Ｒｏｇｅｒｓ、Ｇｅｎｅ　７，１９７９゜７９−８
２）、　こうして過剰のＤＮＡを除去しかつ旦−免」工
ＩおよびＸ　ｍ　ａ　ｍ部位を導入し、プラスミドｐＪ
ＲＤ１２７を得た（第２図）。

プラスミドｐＪＲＤ１２６は、ｐＢＲ３２２の全Ｈｉ　
ｎｄｍ−ＡｖａＩ区域の欠失のため、テトラサイクリン
に対して感受性である（同調体２９−１４２４）。この
区域はいくつかの独特の制限部位を有し、挿入的不活性
化に使用することができ、したがって、本発明において
考慮するような制限部位の列中に有利に含めることがで
きる。したがって、前記Ｈ４ｎｄｍ−ＡｖａＩ区域を１
）ＪＲＤ１２６中に再導入してｐＪＲＤ１２９を得た。

これを実施するため、プラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ
をＡｖａＩで分割し、ＤＮＡポリメラーゼ　エ　クレー
ノウ（Ｋ　ｌ　ｅ　ｅ　ｎ　ｏ　ｗ）断片およびデオキ
シヌクレオシドトリホスフェ−Ｉ・で修復し、次いで旦
ｃｏＲＩで分割した。同時に、ｐＪＲＤ１２６のＤＮＡ
をＨｉｎｄｍで分割し、ＤＮＡポリメラーゼ　Ｉ　クレ
ーノウ断片およびデオキシヌクレオシドトリホスフェー
トで修復し、次いでＥｃｏＲＩで分割した。次いで、２
つのプラスミドを混合し、そして結合端一プラント端（
ｃｏｈｅｓｉｖｅ−ｅｎｄ−ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）結合
により、結合し、ｐＪＲＤ１２６のＥュＲＩ−戊ｖａＩ
区域と置換した。後者はｐＪＲＤ１２６（７）Ｈｉｎｄ
ｍおよびｐＢＲ３２２のＡｖａＩの両者を破壊した。生
ずるｐＪＲＤＬ２９はＲＲ １旦１．ｔｅｔ　であり、そして独特の焦土」ｄＩ１１
部位およびＮヱ」工部位を有する。

プラスミドｐＪＲＤ１２９は問題のほとんどの制限酵素
のための独特の制限部位を有するが、２つのＨｉｎｄｍ
を有するニ一方は１且」　区域に位置し、他方は問題の
他の部位を含有しない５００ｂｐ入上」■−尺ヱｕ　Ｉ
Ｉ断片中に位置する。後者の部位および隣接する過剰の
ＤＮＡは、ｐＪＲＤ１２６　（これは独特のＨｉ　ｎ　
ｃ　１１部位を有する）のＨｆ　ｎ　ｃ　ＩＩの消化お
よび引き続くヌクレアー上１１ユ　３１を用いる消化お
よびプラント端の結合により、除去した。得られるプラ
スミドを、＼ｂａＩおよび旦ヱｕ　ＩＩ部位の両者の保
持およびもとの及上ａＩ−ｐＪＲＤ断片（ｐＪ　ＲＤ　
１３０）の約８０ｂｐのみを保持する選択された欠失に
ついてスクリーニングした。次いで、この欠失は、月−
［」工Ｉ］十人工」■を用いる両者のプラスミドの消化
および引き続く結合および形質転換によりプラスミドｐ
ＪＲＤ１２９に形質転換し、プラスミドｐＪＲＤ１３３
を得た。

同様に、プラスミドｐＪＲＤ１３３は制限酵素入且」■
について２つの部位を有する二一力は↓且」　区域に位
置し、他方は」二に説明したようにしてｐＫＣ７から導
入された２１０ｂｐＰ玉」Ｉ−１１」ＩＩ区域中に存在
する。この区域は３つの焦土ａ　ＩＩ断片を含有し、そ
れらの１つはＸ　ｍ　ａ　Ｉ１１部位を有する。したが
って、単離された断片を■１３ＩＩで消化し、そして生
成物をＰｓｔＩ　−Ｂ３１１１分割ｐＪＲＤ１３３ベク
トル中に、ヘウスタースプレウトおよびデイビンン（Ｈ
ｅｕｓｔｅｒＳｐｒｅｕｔｅおよびＤａｖｉｓｏｎ、Ｇ
ｅｎｅ　１９８３　、ｉｎ　ｐｒｓｓ）の方法に従い、
結合した。得られるプラスミドｐＪＲＤ１３６は、すべ
ての且上」ＴＩ断片（１２７ｂＰ）の欠失を有し、そし
て旦！」　区域中に独特の入ｍａｍを含有する。

プラスミドｐＪＲＤ１３６は、６ｂｐ配列を認識する事
実上すべての商業的に使用されている制限酵素のための
独特の部位を有するが、Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉについての部位
を欠いている。したがって、ｘｂ３１部位を有するを有
するＤＮＡリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）はｐＪＲＤ１３６
ｃ７）ＡｖａＩ部位中に導入された（この部位は、戊ヱ
」■が４つの可能な認識部位を有するので、クローニン
グについて特に有用ではない）。これは、ＤＮＡポリメ
ラーゼ　■　クレーノウ断片を用いて戊ヱ」■分割ｐＪ
ＲＤ１３６を修復し、次いでリンカ−をプラント端結合
することによって、達成された。この手順はもとのＡｖ
ａＩ部位を破壊する（しかじなから、戊ヱ」■は新しい
入玉」■部位をまた分割する）。

最後に、ｔｅｔ　遺伝子とΣ互匹■部位との間の約２８
０ｂｐの望ましくない区域（望ましくない５ｃａＩ部位
を含有する）を除去した。ｐＪＲＤ１３６の小さいΣＡ
ユＩ−に上」■断片を、大きいΣ工」■−４上」■断片
から分離し、１且」■およびＲｓａＩで再分割し、次い
で大きい断片へ再結合した［Ｎｉ１ｓｏｎおよびＭｇｎ
ｕｓｓｏｎ（１９８３）およびＨｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅ
ｕｔｅおよびＤａｖｉｓｏｎ　（１９８３）ａ）技術に
従う］。この欠失は、１ヱ」　遺伝子の４つの末端アミ
ノ酸コドンを除去し、そしてそれらを中−のアミノ酸コ
ドンで置換し、その直後にナンセンスコドンで置換する
。得られるプラスミド（ＰＪＲＤＬ４０）は、テトラサ
イクリンに対して正常の抵抗を示す。次いで、独特のΣ
ｃａＩ部位を含有するプラスミドｐＪＲＤ１４３　（第
３［ｇ参照）中に得られた区域Ｈｉｎｄｍ−ＰｓｔＩで
置換することにより、欠失をプラスミドｐＪＲＤ１３９
へ移した。

ベクトルｐＪＲＤ１４３は、小さいＤＮＡ分子（＜１０
ｋｂ）のクローニングに非常に有用である小さいマルチ
コピー（ｍｕｌｔｉｃｏｐＹ）のプラスミドである。こ
のようなベクトルに固有の困難は、それらが特によく形
質転換しないこと（２Ｘ１０’クローン／ｐ−ｇのＤＮ
Ａ）およびそれらが大きいＤＮＡ挿入体をもつとき、こ
の形質転換が増大して非効率的となることである。なぜ
なら、この大きい数のクローンを所望の遺伝子について
スクリーニングしなくてなならずかつ、小さいＤＮＡ断
片が優先的にクローニングされるため、所望の遺伝子は
有効にクローニングされにくいからである。これらの困
難の１つの解決法は、ロスミド類（ｃｏｓｍｉｄｓ）を
使用することである。それらは、ＤＮＡのλカプシド類
（ｃａｐｓｊｄｓ）へのパッケージング（ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ）に要求されるバクテリオファージ入の旦」亙部
位を含有する小さいプラスミドである。ロスミド類は、
非常に大きいＤＮＡ分子のＥ、Ｃ０１ｊへの高い効率の
転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）をｒｒｆ能どし、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ内でそれらはプラスミド類として維持される。入のＣ
Ｏ５区域は、ＭＵＡＩＯの４００ｂＰＰ、已Ｉ−Ｐｓｔ
Ｉ断片」二に含有され（Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｓ　ｅｔ　
ａｌ、、１９８０）、したがって、ｐＪＲＤ１４３の独
特のＰｓｔＩ部位へ導入される。得られるコスミドｐＪ
ＲＤ１４４は、制限部位の列と、」二に概説したＭＵＡ
ＩＯのコスミドの性質をもつｐＪＲＤ１４３の高いコピ
ーの数の利点とを兼備する。これは、ｐ　Ｊ　Ｒ，Ｄ　
ｌ　４３のすべての部位をクローニングに使用できるよ
うにしくＰｓｔＩを除く）かっ、大きいＤＮＡ断片の引
き続くサブクローニングおよび欠失分析に特に効率的で
ある。

サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、基礎科学および応
用科学の両者にとって重要な有機体であり、そしてプラ
スミド類はＳ、ｃｅｒｅｖｉ　ｓａｅおよびＥ、ｃｏｌ
ｉの両者内で、それぞれ、酵母菌２Ｗプラスミドの複製
の起源（ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
）およびｐＢＲ３２２の複製の起源を用いて、複製する
ことかできる（Ｂｅｇｇｓ　１９８１）、このような酵
母菌ベクトルは、ｐＪＲＤ１４３に存在するような、よ
り多くの独特のクローニング部位を導入することにより
、利益を提供するであろう。

１セグメントのノ ベクトルｐＪＤＢ２０７は、３つの異るＤＮＡ必要な、
酵母菌プラスミド２ｐＬ；ＬＥＵ２−酵母菌栄養要求変
異種内でプラスミドの選択および維持を可能とする酵母
菌のＬＥＵ２遺伝子ニブラスミドｐＡＴ１５３、ｐＢＲ
３２７に類似するＰＢＲ３２２（７）欠失銹導体（Ｔｗ
ｉｇｇおよび５ｈｅｒｒａｔｔ　、１９８０）、区域２
ｇ−ＬＥＵ２は、比較的わずかの制限部位を有しかつこ
れらの制限部位が選択または複製のいずれかに必須の区
域に位置するので、変更をほとんど必要としない。

ｐＪＤＢ２０７中の至上」■部位は、２ｐＬプラスミド
の複製の起源中に位置する。前記盈ｂａＩは、末端をＤ
ＮＡポリメラーゼｌで充填し、次いでプラント端の結合
および形質転換により除去した。得られたプラスミド（
ｐＪＤＢ２０７　Ｘ↓ａＩ’）は、至上」工部位を欠く
が、酵母菌内で形質転換しかつ複製する能力くが未変化
である。

１ｔＪＩＲ１！ａＩｆｔｒＴ１万ｌのｎＴｎＴＩ９０７
Ｙ）Ｉｌ１丁＠＋ｂ二９」Ｌ入− その後、全プラスミドｐＪＲＤ１４３をｐＪＤＢ２０７
　左上ａＩ’中へ、１且ｏＲＩの消化および結合により
挿入し、こうしてｐＡＴ１５３プラスミドを精確に置換
した。得られるプラスミドｐＪＲＤ１４５Ｙ（第４図）
は、ｐＪＲＤ１４３の独特の制限部位のすべてを有し、
ただし入玉」■はここで二重でありかつＥｃｏＲＩはこ
こで三重である。同時に、このプラスミドはＰＪＤＢ２
０７の独特の焦土」■およびＢ　ｓ　ｔ　Ｅ　１１部位
を保持する。

このコスミドの構成は、ｐＪＲＤ１４５Ｙの５主」■−
乱１」１１区域をｐＪＲＤ１４４のそれと置換し、これ
により入ＣＯＳ部位を導入することにより達成した。こ
のコスミドｐＪＲＤ１４６Ｙは、ｐＪＲＤ１４４および
ｐＪＲＤ１４５Ｙの合わせた利点のすべてを有する。す
なわち、それはＥ　、　ｃ　ｏ　ｌ　ｉおよび酵母菌の
両者内で生育しかつ選択されることができ、そしてバク
テリオファージ入カプシド内にパフケージングされるこ
とができるので、１ＩＣｏｌｉ内のクローニングの効率
は非常に高い。

ｐＭＢＩレブリフンのみに基づくプラスミド（たとえば
、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２２および前述のものを包含する
それらの誘導体のすべて）の複製は、Ｅ、ｃｏｌｊおよ
びその密接な関係体に限定されるので、他のバクテリア
の棟内のクローニングは不可能である。これと対照的に
、広範な種類のグラム陽性バクテリア、たとえば、エシ
ェリヒア−コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃ　ｏ　１１
）、プソイドモナス・アエルギノサ（Ｐ　ｓ　ｅ　ｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ）、プソイドモナ
ス−プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕｔｔｄａ）、ア
グロバクテリウム・ラミファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）、リジゴビウ
ム拳メロチ（旦−エヱｌｉｎ＋＋口ｌ、アシドバクチル
・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌ
ａｎｄ±１）、アリカゲネスΦエウトロフス（戊」ｉｃ
ａ　ｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓ）　、ロドプソイド
モナス◆スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏ」ｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｓ　ｈｅｒｏｉｄｅ王）、メリロフィルス・メ
チロトロフス（Ｍｅｔｈ　ｌｏ　ｈｆｌｕｓ　ｍｅｔｈ
　１ｏｔｒ。

１互」）などの内部で複製することができる。クローニ
ングベクトルとして、それらのプラスミドの最も有望な
ものは、Ｒ５ＦＩＯＩＯである。これは高いコピーの数
を有しかつ比較的小さい大きさであるが、非常に少ない
独特の制限部位の列をもつという欠点を有する。（Ｎａ
ｇａｉおよびＳａｋａｇｕｃｈｉ　、１９７８）、した
がって、スルホンアミド類に対して抵抗性の遺伝子を含
有する非必須旦ｃ　ｏＲＩ−見上」１区域を、ｐＪＲＤ
１４３の旦至ｏＲＩ−及上」工区域と置換した。

この操作は、入玉」■リンカー類をＲ３Ｆ　Ｉ　ＯｌＯ
のＰｓｔ　Ｉ部位へ４１加することにより促進された。

得られるプラスミド（ｐＪＲＤ２０２Ｐ）は、ｐＪＲＤ
１４３の全制限部位の列を含有し、かつテトラサイクリ
ンおよびストレプトマイシンに対して抵抗性である。制
限部位のほとんどは、１旦」Ｉを除いて独特である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による複製セグメントの略図である。 第２ａ図および第２ｂ図は、本発明の制限部位の列の略
図である。 第３図は、本発明の方法によって得られたプラスミドベ
クトルの詳細な図である。 第４図は、本発明の制限部位の列を含有する酵母プラス
ミドの略図である。 特許出願人　ラボフイナ・ソシエテ・アノニムＨｄ　Ｐ
ｉ　Ｘｈ　Ｘｂ　ＰＶ　Ｈｄ ’ｒ５　Ｈｉｎｄ　ｍｌ− ｙ　＼　Δ ｂ７二＝＝】ｏ＊　Ｉニミニ：＝＝（！Ｉ　Ｈａｒｅｍ
　ｂ６ペ　メ ロ＝＝＝Ｉコ　１８　＠ＩＩＸＩ！Ｉ　ｂ８ＦＩＧ、　
２Ｂ ｂ５　、　１．０−−ゝＮｒｕ１ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 特願昭５９−９４３８１月 ２、発明の名称 制限部＜ｉγの列から′ｆ！ろクローニングベクトル類
おＬＱ、それらの偵成 ３補正をする渚 事件との関係　特許出願人 名　称　フボンイナ・ノンエラ゛・°アノニム（氏　名
） ４代　理　人〒１０７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バクテリオ７ｙ−ジ　Ｔ５　ＨｉｎｄＩ］ＩＬ断片
   のＨｉｎｄｍ−Ａヱ」１区域から誘導されかつ制限酵素
   のための独特な部位Ｈｉｎｄｍ、互１匹１．に上ｎ１．
   Δ」コシＩＩ、ＬＩＩ、１工」■１、Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ、
   Ｈｉｎｃｌｌ、ＰｖｕＩＩ、Ｂａユニ、性互ｔ　ＩＩお
   よび人工ｊ■を、示す順序で配置して、含イ１する制限
   部位の列ｂｉからなることを特徴とする、真核有機体お
   よび原核有機体における異質遺伝子をクローニングする
   ように設計されたベクトル。 ２、列ｂｌへの２つのクローニング部位入旦」ＩＩＩお
   よび旦−免」工Ｉの付加から得られ、こうして制限酵素
   のだめの独特な部位Ｈｉｎｄｍ、Ｓａｃ工、Ｌ］Ｉ、Δ
   」ヨ県１１、ＬＩＩ、て且」■、Ｂ　ｃ　Ｉ　Ｉ　、Ｂ
   ＬｉＩＩ、ＸｂａＩ、ＨＩ　ｎ　ｃ　ＩＩ、ヱヱｕ　Ｉ
   Ｉ、ｌ旦」工、挾ユｔ　ＩＩおよび戊ヱ」■を、示す順
   序で配置して、含有する制限部位の列ｂ２からなる、特
   許請求の範囲第１項記載のベクトル。 ３、列ｂ１へ、制限酵素のためのそれ以上の部位Ｅｃｏ
   Ｒ１，Ｃ↓」工、Ｈｉｎｄｍ、ＥｃｏＲＶ、１主ｍＨＩ
   、１上」工、１互ＩＩ（戊工匹工、ＨｉｎｃＩＩ）、盈
   ｍａＩＩＩおよびＮｒｕ　Ｉを、示す順序で配置させて
   、付加して得られた制限部位の列ｂ３からなる、特許請
   求の範囲第１項記載のベクトル。 ４、列ｂ２へ、制限酵素のための部位ＥｃｏＲ工、見工
   」工、Ｈｉｎｄｍ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、Σ上」■
   、５ａｌＩ（ＡｃｃＩ、ＨｉｎＣＩＩ）、Ｘ且」■およ
   び反工」■を、示す順序で配置させて、付加して得られ
   た制限部位の列ｂ４からなる、特許請求の範囲第２項記
   載のベクトル。 ５．１１ノｊ限部位の列ｂ３から１つのＨｉ　ｎ　ｃ　
   １１部位を除去して得られた制限部位の列ｂ５からなる
   、特８／Ｉ請求の範囲第３項記載のベクトル。 ６、制限部位の列ｂ４から１つの且ユｎ　ｃ　１１部位
   を除去して得られた制限部位の列ｂ６からなる、特許請
   求の範囲第４項記載のベクトル。 ７、制限部位の列ｂ４から１つの及且ａｍ部位を除去し
   て得られた制限部位の列ｂ７からなる、特許請求の範囲
   第４項記載のベクトル。 ８　制限部位の列ｂ６から１つの入玉」■部位を除去し
   て得られた制限部位の列ｂ８からなる、特許請求の範囲
   第６項記載のベクトル。 ９、制限部位の列がそのＡｖａｌ端ｌ＼融合した入玉」
   ■部位を特徴する特許請求の範囲第１または２項記載の
   ベクトル。 １０、制限部位の列がそのＮヱ」１端へ融合した左上」
   ■部位を特徴する特許請求の範囲第３〜８項のいずれか
   に記載のベクトル。 １１、制限部位の列が、複製起源および選択的遺伝標識
   としてｐ１遺伝子からなるｐＢＲ３２２−関連プラスミ
   ドの戊ヱａＩ−Ｈｉｎｄｍ区域へ結合されている、特許
   請求の範囲第１．２または９項記載のプラスミドベクト
   ル。 １２、制限部位の列が、複製起源および選択的遺伝標識
   としてｌ且」１遺伝子からなるＰＢＲ３２２−関連プラ
   スミドのへ上」■一旦至ｏＲＩ区域へ結合されている、
   特許請求の範囲第３〜８項および１０項のいずれかに記
   載のプラスミドベクトル。 １３、制限部位の列が、コピーの数を増加する突然変位
   およびｌユ」　遺伝子からβ−ラクタマーゼ活性を破壊
   しないで尺互ｔｒｙ且ユ」ｃ　Ｔｌを排除する突然変位
   を含むプラスミドｐＢＲ３２７の戊ヱａＩ−Ｈｔｎｄｍ
   区域の変更翻訳へ結合されている、特許請求の範囲第１
   １項記載のプラスミドベク）・ル。 １４、制限部位の列が、コピーの数を増加する突然変位
   およびｐ　遺伝子からβ−ラクタマーゼ活性を破壊しな
   いでＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　ｑ炙Ｉ旦ユ」ｃ　ＩＩを排除する
   突然変位を含むプラスミドｐＢＲ３２７のＡｖａＩ−１
   至ｏＲＩ区域の変更翻訳へ結合されている、特許請求の
   範囲第１２項記載のプラスミドベクトル。 １５．１ヱ」　遺伝子とΣａｃＩ部位との間の２８０ｂ
   ｐを欠失せ、ｌ旦」　遺伝子中に独特のΣｃａＩ部位を
   残すことにより、ΣｃａＩ部位を制限部位の列からから
   除去することにより得られた、特許請求の範囲第１２ま
   たは１４項記載のプラスミドベクトル。 １６、特許請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の
   制限部位の列に加えてコスミド配列を含む、４６＋ｊ詐
   請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載ノブラスミド
   ベクトル。 １７、特許請求の範囲第１−１６項のいずれかに記載の
   制限部位の列からなる、酵母２ｐ、プラスミドの複製の
   起源を特徴する特許請求の範囲第１〜１６項のいずれか
   に記載の酵母プラスミド。 １Ｂ、制限酵素のための独特な部位Ｈ４ｎｄｍ、　Ｓ　
   Ｆｈ　ＣＩ　、　Ｋ上」Ｉ、Ａ　ｓ　ｕ　ＩＩ、Ｐｓｔ
   ｌ、Ｌ［ユＩＩ、Ｘｂａｌ、Ｈ４ｎｃｌＩ、Ｐｖｕｌｌ
   、月見Ｉ１．性互ｔ　ＩＩおよび人ｖａＩからなる制限
   部位の列ｂｌを構成する方法であって、 ａ）　バクテリオファージ　Ｔ５　ＨｉｎｄｍＬ断片ｔ
   ７）Ｈｉ　ｎ　ｄｌｌＩ−Ａ　ｖ　ａ　Ｉ区域中の２つ
   のＸｂａＩｉ’ｆｌ１位間のセグメントを欠失させて、
   中−の入玉」１部位を生成させ、そして ｂ）　同一区域中に存在する２つの影已ＩＩ部位間の１
   ２５０ｂｐセグメントを欠失させて、中−のＬＬＬＩ■
   を生成させると同時に重複Ｌヱｕ　ＩＩ部位を除去する
   、 ことを特徴とする前記制限部位の列ｂＪを構成する方１
   大。 １９、列ｂｌの９１０ｂｐＰ已ｒ　−１１」ｒＩセグメ
   ントをプラスミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐ旦−５ｔＩ
   −Ｂ工ｌ　ＩＩ断片で置換し、こうして制限部位の列ｂ
   ｉ中に存在するＤＮＡ物質の一部分を除去し、そして制
   限酵素のだめの追加の部位各工」■およびＢｃｌＩを有
   する制限部位の列ｂ２を（ＩＩる、特許請求の範囲第１
   ８項記載の方法。 ２０、制限部位の列ｂｌのＨｆｎｄｌＩＩ端をプラスミ
   ドｐＢＲ３２２からの旦且ユＲ■−友ヱ」工断片のＮヱ
   」■端と融合し、こうして制限酵素のだめの追加の部位
   １且ｏＲＩ、以上」工、焦土」ｄＩ［１，Ｅｃ　ｏＲＶ
   、ＢａｍＨｌ、　Σ上ｎ１．Ａユ■（薄ニエ、Ｈｉ　ｎ
   　ｃｌＩ）　、　Ｘｍａｍおよび凡工」Ｉを侑する制限
   部位の列ｂ３を得る、特許請求の範囲第１８項記載の方
   法。 ２１、制限部位の列ｂ２のＨｉｎｄｍ端をプラスミドＰ
   ＢＲ３２２からの旦且ｏＲＩ−Ａヱ」工断片の戊ヱ」■
   端と融合し、こうして制限酵素のための追加の部位見工
   ｏＲ１，以ユａ１．Ｈ↓」ｄｍ、１工ｏＲＶ、ｌ互ｍＨ
   Ｉ、Σ上」Ｉ、Σ」ユＩ　（Ａｃ　ｃ　１．　Ｈｉ　ｎ
   ｃＩＩ）　、　ＸｍａｌＩ［および凡工」■を有する制
   限部位の列ｂ４を得る、特許請求の範囲第１９項記載の
   方法。 ２２、列ｂ３の９１０ｂｐＰ已■−ＢＪＬｉＩＩセグメ
   ントをプラスミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐアー５ｔＩ
   −１工Ｉ　ＩＩ断片で置換し、こうして制限部位の列ｂ
   ３中に存在するＤＮＡ物質の一部分を除去し、そして制
   限酵素のための追加の部位Ｘし■および１且」■を有す
   る制限部位の列ｂ４を得る、特許請求の範囲第２０項記
   載の方法。 ２３、工程； ａ）　制限部位の列ｂ１の１工Ｉ　ＩＩ−戊ヱ」１区域
   中のＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ部位を欠失させると同時に隣接
   するＫ１」■部位およびＬヱｕ　１１部位を保持させ、
   そして ｂ）　得られた欠失区域を制限部位の列ｂ３の旦ｌユＩ
   Ｉ−人工」１区域と置換し、こうして制限部位の列ｂ５
   を得る、 からなる特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４、工程： ａ）　制限部位の列ｂｌまたはｂ２の１■ユＩＩ　−戊
   ヱ」工区域中のＨｉ　ｎ　ｃ　１１部位を欠失させると
   同時に隣接するＸ　ｂ　ａ　Ｉ部位およびアニ兄」λ１
   １部位を保持させ、そしてｂ）　得られた欠失区域を特
   許請求の範囲第２１または２２項記載の方法に従い得ら
   れた制限部位の列の影り目Ｉ−戊ヱ」１区域と置換し、
   こうして制限部位の列ｂ６を得 る、 からなる特許請求の範囲第２１または２２項記載の方法
   。 ２５、列ｂ５の９１０ｂｐＦ已Ｉ−ＢエユＩＩセグメン
   トをプラスミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐＰｓｔＩ−Ｂ
   ｇｌＩＩ断片で置換し、こうして制限部位の列ｂ５中に
   存在するＤＮＡ物質の一部分を除去し、そしてＸ１」■
   および影ヨＩ制限部位を特徴する特許請求の範囲第２３
   項記載の方法。 ２６、プラスミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐア王」Ｉ−
   １−【」工ＩＩ断片中に存在する入玉」ｍ制限部位を欠
   失させ、こうして制限酵素のための独特の部位Ｘ　ｍ　
   ａ　ＩＩＩからなる制限部位の列ｂ７を得る、特許請求
   の範囲第２１または２２項記載の方法。 ２７、プラスミドｐｋＣ７からの２１０ｂｐヱ５ｔＩ−
   Ｂエユ■１断片中に存在するＸ　ｍ　ａ　ｍ制限部位を
   欠失させ、こうして〃Ｉ制限酵素ための独特の部位Ｅｃ
   ｏＲＩ、見上」Ｉ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ、ＥｃｏＲＶ、Ｂ
   ａｍＨＩ、ＩＩ、５ａｉｌ（Ａｃｃｌ、Ｈｉ　ｎｃｌｌ
   ）、Ｘｍａｍ、Ｎｒｕｌ、Ｓａ亙１．に上ｎ１．Ａユｕ
   　ＩＩ、Ｌ互」工、１旦」Ｉ　、　ＢＪＬｉＩＩ、及上
   ａＩ、Ｐヱｕ　ＩＩ、Ｂａ１Ｉ、Ｙ二ｓ　ｔ　ＩＩおよ
   びＮヱ」工からなる制限部位の列ｂ８を得る、特許請求
   の範囲第２４または２５項記載の方法。 ２８、工程： ａ）　制限部位の列ｂｌまたはｂ２の旦−１，ｊ　ＩＩ
   　−戊ヱ」１区域中のＨ＋　ｎ　ｃ　１１部位を欠失さ
   せると同時に隣接するＸｂａＩ部位およびΣ−ｖ　ｕ　
   １１部位を保持し、そしてｂ）　得られた欠失区域を制
   限部位の列ｂ７の旦■」ＩＩ−戊ヱ」１区域と置換し、
   こうして制限部位の列ｂ８を得る、 からなる特許請求の範囲第２６項記載の方法。 ２９、て上」１部位を特許請求の範囲第１８〜２８項の
   いずれかに記載の方法に従って得られた制限部位の列の
   戊ヱ」１端へ融合することからなることを特徴とする方
   法。 ３０、特許請求の範囲第１１〜１７項のいずれかに記載
   の方法に従って得られたプラスミドで形質転換された微
   生物または細胞培養物。 ３１、プラスミドｐＪＲＤ１４３で形質転換されたＥ、
   ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４゜ ３２、微生物内の選択されたＤＮＡ物質を、特許請求の
   範囲第１１〜１７項のいずれかに記載の方法に従って得
   られたプラスミド中に存在する制限部位のｊつ中に挿入
   し、この制限部位を前記ＤＮＡ物質が選択された部位に
   対応する制限酵素により分割されないように選択し、そ
   して前記微生物を得ゆれた組み換えプラスミドで形質転
   換する、ことを特徴とする微生物内のＤＮＡ物質をクロ
   ーニングする方法。 ３３、選択されたポリペプチドの暗号解読用ＤＮＡ物質
   を、特許請求の範囲第１１−１７項のいずれかに記載の
   方法に従って得られたプラスミド中に存在する制限部位
   の１つ中に挿入し、この制限部位を前記暗号解読ＤＮＡ
   物質が選択された部位に対応する制限酵素により分割さ
   れないように選択し、微生物を得られた組み換えプラス
   ミドで形質転換し、そして形質転換された微生物を培養
   して選択されたポリペプチド生産する、ことを特徴とす
   る選択されたポリペプチドを生産する方法。 ３４、適当機能的配列を形質転換の方向に関して前記暗
   号解読ＤＮＡ物質より上流の他の選択された制限部位に
   挿入することにより、前記暗号解読ＤＮＡ物質の転写を
   特徴とする特許請求の範囲第３３項記載の方法。