JPS62104585A - ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾 - Google Patents
ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾Info
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- JPS62104585A JPS62104585A JP61249403A JP24940386A JPS62104585A JP S62104585 A JPS62104585 A JP S62104585A JP 61249403 A JP61249403 A JP 61249403A JP 24940386 A JP24940386 A JP 24940386A JP S62104585 A JPS62104585 A JP S62104585A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に関する。１つの面に
おいて、本発明は酵母の組込み形質転換（ｉｎｔｅｇｒ
ａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関する
。他の面において、本発明は酵母の部位特異的突然変異
（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）に
関する。さらに他の面において、本発明は新規なＤＮＡ
配列に関する。をらに他の面において、本発明は新規な
生物に関する。
おいて、本発明は酵母の組込み形質転換（ｉｎｔｅｇｒ
ａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関する
。他の面において、本発明は酵母の部位特異的突然変異
（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）に
関する。さらに他の面において、本発明は新規なＤＮＡ
配列に関する。をらに他の面において、本発明は新規な
生物に関する。
従来技術
組換えＤＮＡ技術が近年開発されるにつれて、種々の有
用なポリにプチドが微生物によって制御下に生産できる
ようになった。多くの真核生物のポリ−’（プチトゝ類
、例えばヒト成長ホルモン、白血球インターフェロン、
ヒトインシュリンおヨヒヒトプロイ／シュリンは種々の
微生物によってすでに生産されている。すでに開発され
た技術の連続使用は、多くの他の有用なポＩＪ ６プ
テド産物の微生物による生産を可能にすることが将来期
待される。
用なポリにプチドが微生物によって制御下に生産できる
ようになった。多くの真核生物のポリ−’（プチトゝ類
、例えばヒト成長ホルモン、白血球インターフェロン、
ヒトインシュリンおヨヒヒトプロイ／シュリンは種々の
微生物によってすでに生産されている。すでに開発され
た技術の連続使用は、多くの他の有用なポＩＪ ６プ
テド産物の微生物による生産を可能にすることが将来期
待される。
組換え技術においてしばしば用いられる基本要素はプラ
スミドであシ、このプラスミドは数種の微生物に見い出
せる染色体外性の二本鎖ＤＮＡである。プラスミドが自
然界で微生物中に存在する場合に、それらは往々にして
１個の細胞当たり多くのコピー数で存在することが知ら
れている。自然界に存在するプラスミドのほかに、種々
の人ニブラスミドゝすなわちハイブリッドベクターも構
築された。都合の悪いことに、宿主細胞はそのプラスミ
ドを常に保持できるとは限らない。それどころか、微生
物が増殖して数世代を経過するにつれてプラスミドは失
われる。従って、外来性ＤＮＡを適当な宿主生物内に安
定に導入する方法が非常に興味をもたれ、また大いに重
要になってくる。
スミドであシ、このプラスミドは数種の微生物に見い出
せる染色体外性の二本鎖ＤＮＡである。プラスミドが自
然界で微生物中に存在する場合に、それらは往々にして
１個の細胞当たり多くのコピー数で存在することが知ら
れている。自然界に存在するプラスミドのほかに、種々
の人ニブラスミドゝすなわちハイブリッドベクターも構
築された。都合の悪いことに、宿主細胞はそのプラスミ
ドを常に保持できるとは限らない。それどころか、微生
物が増殖して数世代を経過するにつれてプラスミドは失
われる。従って、外来性ＤＮＡを適当な宿主生物内に安
定に導入する方法が非常に興味をもたれ、また大いに重
要になってくる。
現在までのところ、種々のポリ（プテド金生産するため
に組換えＤＮＡ技術を用いる商業的努力は宿主生物とし
ての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に集
中していた。しかしながら、いくつかの場合において大
腸菌は宿主として不適当であることがわかっている。例
えば、大腸菌は多くの発熱性毒性因子を含有しており、
これらの因子は医薬品として有用な＋＋’リ Ｏプチド
から除去しなければならない。この精製を達成するだめ
の効率は、もちろん個々のポＩＪ ｏプチドにより変
化するであろう。
に組換えＤＮＡ技術を用いる商業的努力は宿主生物とし
ての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に集
中していた。しかしながら、いくつかの場合において大
腸菌は宿主として不適当であることがわかっている。例
えば、大腸菌は多くの発熱性毒性因子を含有しており、
これらの因子は医薬品として有用な＋＋’リ Ｏプチド
から除去しなければならない。この精製を達成するだめ
の効率は、もちろん個々のポＩＪ ｏプチドにより変
化するであろう。
さらに、大腸菌のタン／ξり質分解作用はいくつかの有
用な生産物の収量をかなり制限する。その上。
用な生産物の収量をかなり制限する。その上。
大腸菌により生産された異種遺伝子産物の多くは不溶性
であることが知られている。これらおよび他の考察から
別の宿主への興味が高まっている。
であることが知られている。これらおよび他の考察から
別の宿主への興味が高まっている。
とりわけ、ｒｆ ＋） ＜プチド産物の生産用として真
核生物の使用が関氾・金もたれている。
核生物の使用が関氾・金もたれている。
酵母のような真核生物系をポＩＪ ６プチド産物の生
産手段として利用することは、組換えＤＮＡによってコ
ードされるポリペプチドの生産のために大腸菌のような
原核生物系を使用することに比べて、明らかに有利であ
るだろう。大規模な大腸菌発酵が比較的最近になって出
現したのに対して、酵母は何世紀にもわたって大規模発
酵において利用されてきた。酵母は一般に細菌よりも高
い細胞密度へと増殖することがでさ、そして連続発酵法
へ容易に適合させることができる。実際に、ピチア・パ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような
酵母の超高細胞密度（すなわち１００９／ρ以上の細胞
密度）への増殖はウニブナ−（Ｗｅｇｎｅｒ ）の米国
特許第４４１４３２９号（フィリップス・Ｒトロレウム
社に譲渡）に開示されている。酵母宿主のその他の利点
には、この生物の多くの重要な機能（例えば酸化的リン
酸化）がオルガネラの内部に存在し、そのために野生型
宿主細胞にとって外来性のポリペプチドの生産が原因で
起こりうる有害作用にさらされることがないという事実
が含まれる。真核生物としての酵母は発現されたｚ Ｉ
Ｊ−ｓプチド産物をグリコジル化しうろことが立証され
ており、このようなグリコジル化がポリペプチド産物の
生物活性にとって重要である場合に酵母は価値を有する
。また、真核生物としての酵母は高等生物と同じコド／
優先性を示すと考えられ、こうして酵母は呻乳動物遺伝
子からの発現産物または例えば咄乳動物ｍＲＮＡから逆
転写により得られる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの発
現産物のより一層効率のよい生産に役立つであろう。
産手段として利用することは、組換えＤＮＡによってコ
ードされるポリペプチドの生産のために大腸菌のような
原核生物系を使用することに比べて、明らかに有利であ
るだろう。大規模な大腸菌発酵が比較的最近になって出
現したのに対して、酵母は何世紀にもわたって大規模発
酵において利用されてきた。酵母は一般に細菌よりも高
い細胞密度へと増殖することがでさ、そして連続発酵法
へ容易に適合させることができる。実際に、ピチア・パ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような
酵母の超高細胞密度（すなわち１００９／ρ以上の細胞
密度）への増殖はウニブナ−（Ｗｅｇｎｅｒ ）の米国
特許第４４１４３２９号（フィリップス・Ｒトロレウム
社に譲渡）に開示されている。酵母宿主のその他の利点
には、この生物の多くの重要な機能（例えば酸化的リン
酸化）がオルガネラの内部に存在し、そのために野生型
宿主細胞にとって外来性のポリペプチドの生産が原因で
起こりうる有害作用にさらされることがないという事実
が含まれる。真核生物としての酵母は発現されたｚ Ｉ
Ｊ−ｓプチド産物をグリコジル化しうろことが立証され
ており、このようなグリコジル化がポリペプチド産物の
生物活性にとって重要である場合に酵母は価値を有する
。また、真核生物としての酵母は高等生物と同じコド／
優先性を示すと考えられ、こうして酵母は呻乳動物遺伝
子からの発現産物または例えば咄乳動物ｍＲＮＡから逆
転写により得られる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの発
現産物のより一層効率のよい生産に役立つであろう。
同定が不十分な酵母菌種を宿主／ベクター系として開発
することは、形質転換条件および外来性ＤＮＡを宿主細
胞内に安定に導入するだめの適当な技法に関する知識が
欠乏しているためにかなり妨げられる。さらに、栄養要
求変異株は栄養要求の相補性により形質転換細胞の直接
選択を妨げるために、しばしば利用することができない
。組換えＤＮＡ技術がその約束を完全に保持するならば
、ＤＮＡ操作全容易にし且つ挿入されたＤＮＡ配列の発
現を最適化し、それにより制御された条件下で目的とす
るポリペプチド産物を高収量で生産しつる新しいｊＪ主
ｙ＜フタ−系が考案きれるであろう。
することは、形質転換条件および外来性ＤＮＡを宿主細
胞内に安定に導入するだめの適当な技法に関する知識が
欠乏しているためにかなり妨げられる。さらに、栄養要
求変異株は栄養要求の相補性により形質転換細胞の直接
選択を妨げるために、しばしば利用することができない
。組換えＤＮＡ技術がその約束を完全に保持するならば
、ＤＮＡ操作全容易にし且つ挿入されたＤＮＡ配列の発
現を最適化し、それにより制御された条件下で目的とす
るポリペプチド産物を高収量で生産しつる新しいｊＪ主
ｙ＜フタ−系が考案きれるであろう。
発明の目的
本発明の目的１は、酵母ゲノムの所定の位置にＤＮＡ１
挿入する方法全提供することである。
挿入する方法全提供することである。
本発明の旭の目的は、本質的に復帰し得ない酵母の安定
な栄養要求変異株を作る方法を提供することである。
な栄養要求変異株を作る方法を提供することである。
本発明のてらに他の目的は、本質的に復帰し得ない安定
な栄養要求変異株を提供することである。
な栄養要求変異株を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、酵母の形質転換に有用な新
規ＤＮＡ配列全提供することである。
規ＤＮＡ配列全提供することである。
本発明のさらに他の目的は、酵母による異種タンパク質
の増産に有用なアルコールオキシダーゼマイナス変異株
宿主を作る方法を提供することである。
の増産に有用なアルコールオキシダーゼマイナス変異株
宿主を作る方法を提供することである。
本発明のこれらの目的および他の目的は以下の記述およ
びここに添付の特許請求の範囲から明らかになるであろ
う。
びここに添付の特許請求の範囲から明らかになるであろ
う。
発明の構成
本発明によれば、ピチア属酵母のゲノムを部位特異的に
修飾するための新規な方法が開発きれた。
修飾するための新規な方法が開発きれた。
各末端に挿入可能なＤＮＡ配列（すなわち宿主ゲノムと
相同の配列であって、それぞれが少なくとも約２００の
ヌクレオチド長を有するもの）を含み且つそれらの間に
少なくとも１つの追加ＤＮＡフラグメント（例えば選択
可能なマーカー遺伝子）全含む線状ＤＮＡフラグメント
’６用いて酵母を形質転換することにより、そのマーカ
ー遺伝子とその両側に存在する挿入可能々ＤＮＡ配列と
が高い頻度で宿主に取り込まれる。この線状ＤＮＡによ
る形質転換の結果として、組込み部位のＤＮＡ配列が破
壊および／または欠失され、選択可能なマーカー遺伝子
および形質転換用線状１）ＮＡフラグメントの一部とし
て含まれる他のＤＮＡが宿主酵母のゲノム内に組み込ま
れた斯く修飾された酵母菌株が作られる。
相同の配列であって、それぞれが少なくとも約２００の
ヌクレオチド長を有するもの）を含み且つそれらの間に
少なくとも１つの追加ＤＮＡフラグメント（例えば選択
可能なマーカー遺伝子）全含む線状ＤＮＡフラグメント
’６用いて酵母を形質転換することにより、そのマーカ
ー遺伝子とその両側に存在する挿入可能々ＤＮＡ配列と
が高い頻度で宿主に取り込まれる。この線状ＤＮＡによ
る形質転換の結果として、組込み部位のＤＮＡ配列が破
壊および／または欠失され、選択可能なマーカー遺伝子
および形質転換用線状１）ＮＡフラグメントの一部とし
て含まれる他のＤＮＡが宿主酵母のゲノム内に組み込ま
れた斯く修飾された酵母菌株が作られる。
上記方法で宿主酵母のゲノム内に挿入された外来性ＤＮ
Ａは、多くの増殖世代を通して宿主により安定に保持さ
れる。従って、本発明方法は外来性１）ＮＡが自律的複
３１続ける染色体外性フラグメントの一部として提供さ
れる場合、または外来性ＤＮＡが環状ＤＮＡ分子の一部
としてゲノム内に組み込まれる場合のプラスミドの不安
定性による外来性ＤＮＡの欠失の問題を排除することが
できる。このような環状ＤＮＡ分子の組込みは宿主ゲノ
ム配列の直接反復配列によってはさまれた外来性ＤＮＡ
配列の宿主ゲノム内への挿入をもたらす。この種の直接
反復配列はその後の組換えのための基質であるから、直
接反復配列の間に挿入された外来性ＤＮＡは不安定であ
る。
Ａは、多くの増殖世代を通して宿主により安定に保持さ
れる。従って、本発明方法は外来性１）ＮＡが自律的複
３１続ける染色体外性フラグメントの一部として提供さ
れる場合、または外来性ＤＮＡが環状ＤＮＡ分子の一部
としてゲノム内に組み込まれる場合のプラスミドの不安
定性による外来性ＤＮＡの欠失の問題を排除することが
できる。このような環状ＤＮＡ分子の組込みは宿主ゲノ
ム配列の直接反復配列によってはさまれた外来性ＤＮＡ
配列の宿主ゲノム内への挿入をもたらす。この種の直接
反復配列はその後の組換えのための基質であるから、直
接反復配列の間に挿入された外来性ＤＮＡは不安定であ
る。
本発明の部位特異的ゲノム修飾は特定遺伝子の全部また
は選ばれた部分を欠失した変異株をもたらすことができ
る。突然変異が望まれる遺伝子の実質的部分を排除する
ことによって、突然変異の復帰の可能性は本質的になく
なる。従って、本発明により得られた変異株は非常に安
定である。
は選ばれた部分を欠失した変異株をもたらすことができ
る。突然変異が望まれる遺伝子の実質的部分を排除する
ことによって、突然変異の復帰の可能性は本質的になく
なる。従って、本発明により得られた変異株は非常に安
定である。
また、本発明の部位特異的ゲノム修飾は、当分野で知ら
れたｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＩＩＩＡ技術と共にいろ
いろな宿主ゲノムの正確な（じ飾、例えば１つまたはそ
れ以上の異種遺伝子の宿主ゲノムへの付加、天然遺伝子
の発現を制御する調節配列の変更、天然遺伝子と非天然
源の遺伝子との交換などを可能にする。
れたｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＩＩＩＡ技術と共にいろ
いろな宿主ゲノムの正確な（じ飾、例えば１つまたはそ
れ以上の異種遺伝子の宿主ゲノムへの付加、天然遺伝子
の発現を制御する調節配列の変更、天然遺伝子と非天然
源の遺伝子との交換などを可能にする。
鷺くべきことに、ピチアでの異種遺伝子のメタノール誘
導発現は、ピチアの第一アルコールオキシダーゼ遺伝子
が破壊されたピチア菌株を遺伝子発現用宿主として使用
することにより劇的に高められることが見い出された。
導発現は、ピチアの第一アルコールオキシダーゼ遺伝子
が破壊されたピチア菌株を遺伝子発現用宿主として使用
することにより劇的に高められることが見い出された。
さらに、ピチア・パストリスの菌株は渠−アルコールオ
キシダーゼ遺伝子を破壊された宿主菌株て天然のビチア
・パストリスに対して遅い速度とはいえメタノール上で
生長する能力を保持させる第二のアルコールオキシダー
ゼ遺伝子ヲ有することが判明した。
キシダーゼ遺伝子を破壊された宿主菌株て天然のビチア
・パストリスに対して遅い速度とはいえメタノール上で
生長する能力を保持させる第二のアルコールオキシダー
ゼ遺伝子ヲ有することが判明した。
添付の図面において、
第１図はプラスミドｐＹＭＩ１の制限地図であり；第２
図はプラスミドｐＹＭＩ１の一部ｔピチア染色体のＨＩ
Ｓ、ｉ位置へ挿入することを示し；第３図はプラスミド
ｐＹＪ８の制限地図であり；第４図はグラスミ）’ｐＹ
ＭＩ３ａの制限地図であり： 第５図はグラスミ）？ｐＹＭＩ３ａの一部をビチア染色
体のＨＩＳ４位置へ挿入することを示し；第６図１４プ
ラスミ）’ｐＢＰＧ１−１の制限地図であり； 第７図はプラスミドｐＹＭＩ７の制限地図であり；第８
図はプラスミドｐＹＭＩ７の一部全ピチア染色体のアル
コールオキシダーゼ位置へ挿入すること金示し； 第９図はプラスミドｐｓＡＯＨ５およびｐＴＨＢｓ３か
らのプラスミド’ｐＹＭ３９の作製全示し：第１０図は
プラスミドｐＹＭ３９およびｐＰＧ３．２からのプラス
ミド’ｐＹＭＩ６の作製を示し；第１１図はプラスミド
’ｐＹｌｉｌ！■５およびｐＢｓＡ０５工からのプラス
ミビｐＢｓＡＧ工５Ｉの作製を示し；第１２図は第１１
図よりも詳細なプラスミドｐＢｓＡＧＩｓＩを示す制限
地図であり；第１３図（はプラスミドｐＢｓＡＧＩ５工
の一部をビテア染色体のアルコールオキ／ダーゼ位置へ
挿入することを示し； 第１４図はグラスミ）ｐＹＭＩＩ２ａの制限地図であり
； 第１５図はプラスミドｐＹＭｆ１２ａの一部を第二ピチ
アアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ ２ ）の位
置へ挿入することを示し； 第１６図はｐＢＲ３２２’ｅベースとするプラスミドＴ
）ＰＧ４．０およびｐ ＰＧ ３．０中のピテア挿入物
の但］：恨肋図である。第１６ａ図に示す挿入物は第一
ピチアアルニールオキンダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ）の位
置からのものであり、第１６ｂ図に示す挿入物は第二ピ
チアアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２）の位置
からのものである。第１６ｃ図ばＡＯＸ １遺伝子位置
（第１６ａ図と関連）の既知アルコールオキシダーゼ（
ＡＯＸ）コーディング部分を示す； 第１７図はプラスミドｐＹＭ２５の制限地図であり；そ
して、 第１８図はプラスミドｐＴ７６Ｈ３の制限地図である。
図はプラスミドｐＹＭＩ１の一部ｔピチア染色体のＨＩ
Ｓ、ｉ位置へ挿入することを示し；第３図はプラスミド
ｐＹＪ８の制限地図であり；第４図はグラスミ）’ｐＹ
ＭＩ３ａの制限地図であり： 第５図はグラスミ）？ｐＹＭＩ３ａの一部をビチア染色
体のＨＩＳ４位置へ挿入することを示し；第６図１４プ
ラスミ）’ｐＢＰＧ１−１の制限地図であり； 第７図はプラスミドｐＹＭＩ７の制限地図であり；第８
図はプラスミドｐＹＭＩ７の一部全ピチア染色体のアル
コールオキシダーゼ位置へ挿入すること金示し； 第９図はプラスミドｐｓＡＯＨ５およびｐＴＨＢｓ３か
らのプラスミド’ｐＹＭ３９の作製全示し：第１０図は
プラスミドｐＹＭ３９およびｐＰＧ３．２からのプラス
ミド’ｐＹＭＩ６の作製を示し；第１１図はプラスミド
’ｐＹｌｉｌ！■５およびｐＢｓＡ０５工からのプラス
ミビｐＢｓＡＧ工５Ｉの作製を示し；第１２図は第１１
図よりも詳細なプラスミドｐＢｓＡＧＩｓＩを示す制限
地図であり；第１３図（はプラスミドｐＢｓＡＧＩ５工
の一部をビテア染色体のアルコールオキ／ダーゼ位置へ
挿入することを示し； 第１４図はグラスミ）ｐＹＭＩＩ２ａの制限地図であり
； 第１５図はプラスミドｐＹＭｆ１２ａの一部を第二ピチ
アアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ ２ ）の位
置へ挿入することを示し； 第１６図はｐＢＲ３２２’ｅベースとするプラスミドＴ
）ＰＧ４．０およびｐ ＰＧ ３．０中のピテア挿入物
の但］：恨肋図である。第１６ａ図に示す挿入物は第一
ピチアアルニールオキンダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ）の位
置からのものであり、第１６ｂ図に示す挿入物は第二ピ
チアアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２）の位置
からのものである。第１６ｃ図ばＡＯＸ １遺伝子位置
（第１６ａ図と関連）の既知アルコールオキシダーゼ（
ＡＯＸ）コーディング部分を示す； 第１７図はプラスミドｐＹＭ２５の制限地図であり；そ
して、 第１８図はプラスミドｐＴ７６Ｈ３の制限地図である。
本明細書で用いる次の略号は制限酵素を表わす：略号
制限酵素 Ａｓ ＡｓｕＩｉ Ｂ ＢａｍＨＩ Ｂ２ Ｂｇｌｌｌ Ｃ１ａＩ Ｒ１Ｅ ｃ ｏ ＲＩ Ｒｓ Ｅ ｃ ｏ ＲＶＨ３Ｈｌｎｄ
Ｉ Ｉ Ｉ ＨｐＩＨｐａ） Ｋｐ Ｋｐｎ ｉ Ｎｒ Ｎｒｕ■ Ｐｓ Ｐｓｔ Ｉ Ｐ ｙ ｚ Ｐ ｖ ｕ ｌ ＩＲｅ
Ｒｓａｉ Ｓ ５ａ１１ Ｓ ａ Ｓ ａ ｕ ３ Ａ ＩＳｍ
Ｓｍａ Ｉ Ｓｐ ５ｐｈｌ Ｓｔ ５ｔｕｌ Ｔｈ Ｔｈａ ｉ Ｘｂ Ｘｂａ ■ ｘｈ ＸｈｏＪ 添付の図面において、ＤＮＡフラグメント操作のために
使用されるが、連結の際に破壊される制限部位は、破壊
された部位の略号をかっこ内に記入することによって示
される。
制限酵素 Ａｓ ＡｓｕＩｉ Ｂ ＢａｍＨＩ Ｂ２ Ｂｇｌｌｌ Ｃ１ａＩ Ｒ１Ｅ ｃ ｏ ＲＩ Ｒｓ Ｅ ｃ ｏ ＲＶＨ３Ｈｌｎｄ
Ｉ Ｉ Ｉ ＨｐＩＨｐａ） Ｋｐ Ｋｐｎ ｉ Ｎｒ Ｎｒｕ■ Ｐｓ Ｐｓｔ Ｉ Ｐ ｙ ｚ Ｐ ｖ ｕ ｌ ＩＲｅ
Ｒｓａｉ Ｓ ５ａ１１ Ｓ ａ Ｓ ａ ｕ ３ Ａ ＩＳｍ
Ｓｍａ Ｉ Ｓｐ ５ｐｈｌ Ｓｔ ５ｔｕｌ Ｔｈ Ｔｈａ ｉ Ｘｂ Ｘｂａ ■ ｘｈ ＸｈｏＪ 添付の図面において、ＤＮＡフラグメント操作のために
使用されるが、連結の際に破壊される制限部位は、破壊
された部位の略号をかっこ内に記入することによって示
される。
本発明によれば、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント
、選択可能なマーカー遺伝子、および第二の挿入可能な
ＤＮＡフラグメントヲ含む直列配置の線状ＤＮＡフラグ
メントを用いてピチア属の宿主菌株を形質転換すること
から成る、ビチア属酵母を予め定められたゲノム部位で
部位選択的にゲノム修飾する方法が提供される。第一お
よび第二の挿入可能なＤＮＡ７ラグメ／トはそれぞれ少
なくとも約２００ヌクレオチド長であり、ゲノム修飾が
おこる天然ピチアゲノム部位の分離された各部分と相同
なヌクレオチド配列金有する。選択可能なマーカー遺伝
子は遺伝子産物がその遺伝子金量けとる細胞に選択可能
な表現型を与える遺伝子であって、例えば抗生物質耐性
遺伝子または生長に必要な栄養素を細胞に合成させる生
合成遺伝子であり得る。選択可能なマーカー遺伝子は、
それがＤＮＡベクター上に存在する場合、そのゝフタ−
ＤＮＡを受は取った細胞のみ全選択的増殖条件下で増殖
てせる。選択可能なマーカー遺伝子は第一および第二の
挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づけることが
重要であり、また挿入可能なり ＮＡフラグメントばそ
れらが線状ＤＮＡフラグメントによるゲノム修飾を受け
る宿主細胞のゲノム内に存在するときと同じ向きで互い
に対して方向づけることか大切である。
、選択可能なマーカー遺伝子、および第二の挿入可能な
ＤＮＡフラグメントヲ含む直列配置の線状ＤＮＡフラグ
メントを用いてピチア属の宿主菌株を形質転換すること
から成る、ビチア属酵母を予め定められたゲノム部位で
部位選択的にゲノム修飾する方法が提供される。第一お
よび第二の挿入可能なＤＮＡ７ラグメ／トはそれぞれ少
なくとも約２００ヌクレオチド長であり、ゲノム修飾が
おこる天然ピチアゲノム部位の分離された各部分と相同
なヌクレオチド配列金有する。選択可能なマーカー遺伝
子は遺伝子産物がその遺伝子金量けとる細胞に選択可能
な表現型を与える遺伝子であって、例えば抗生物質耐性
遺伝子または生長に必要な栄養素を細胞に合成させる生
合成遺伝子であり得る。選択可能なマーカー遺伝子は、
それがＤＮＡベクター上に存在する場合、そのゝフタ−
ＤＮＡを受は取った細胞のみ全選択的増殖条件下で増殖
てせる。選択可能なマーカー遺伝子は第一および第二の
挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づけることが
重要であり、また挿入可能なり ＮＡフラグメントばそ
れらが線状ＤＮＡフラグメントによるゲノム修飾を受け
る宿主細胞のゲノム内に存在するときと同じ向きで互い
に対して方向づけることか大切である。
さらに、本発明によれば、第一の挿入可能なＩ）ＨＡフ
ラグメント、選択可能なマーカー遺伝子および帛二の挿
入可能なＤＮＡフラグメンＨ含む直列配置の線状ＤＮＡ
フラグメントが提供される。第一および第二の挿入可能
なＤＮＡフラグメントはそれぞれ少なくとも約２００の
ヌクレオチド長であり、ビチア属菌種のゲノムＤ Ｎ
Ａの各部分と相同なヌクレオチド配列を有し、そしてそ
れらがピチアのゲノム中に存在するのと同じ向きで線状
フラグメント中に互いに対して方向づけられる、マーカ
ー遺伝子は第一および第二の挿入ｏＪ能なＤＮＡフラグ
メントの間に位置づけられる。
ラグメント、選択可能なマーカー遺伝子および帛二の挿
入可能なＤＮＡフラグメンＨ含む直列配置の線状ＤＮＡ
フラグメントが提供される。第一および第二の挿入可能
なＤＮＡフラグメントはそれぞれ少なくとも約２００の
ヌクレオチド長であり、ビチア属菌種のゲノムＤ Ｎ
Ａの各部分と相同なヌクレオチド配列を有し、そしてそ
れらがピチアのゲノム中に存在するのと同じ向きで線状
フラグメント中に互いに対して方向づけられる、マーカ
ー遺伝子は第一および第二の挿入ｏＪ能なＤＮＡフラグ
メントの間に位置づけられる。
本発明に従ってピテア属全形質転換する際に使用する基
本要素は最小の３つの成分：すなわち第一の挿入用能な
ＤＮＡフラグメント、第二の挿入可能なＤＮＡフラグメ
ント、および選択可能なマーカー遺伝子 を含有する。
本要素は最小の３つの成分：すなわち第一の挿入用能な
ＤＮＡフラグメント、第二の挿入可能なＤＮＡフラグメ
ント、および選択可能なマーカー遺伝子 を含有する。
第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントはそれ
ぞれ少なくとも約２００のヌクレオチド長であるべきで
あり、一般には約２００〜５０００ヌクレオチドの範囲
の長さが用いられる。好ましくは、操作および取扱いを
簡単にするために、約５００〜２０００ヌクレオチドの
範囲のフラグメントが使用される。
ぞれ少なくとも約２００のヌクレオチド長であるべきで
あり、一般には約２００〜５０００ヌクレオチドの範囲
の長さが用いられる。好ましくは、操作および取扱いを
簡単にするために、約５００〜２０００ヌクレオチドの
範囲のフラグメントが使用される。
第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントとして
有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾がおこる天然ピ
チアゲノム部位の分離された各部分と相同なヌクレオチ
ド配列である。従って、例えばゲノム修飾がアルコール
オキシダーゼ遺伝子の位置でおこる場合、使用する第一
および第二の挿入可能なＤＮＡ７ラグメ／トはアルコー
ルオキシダーゼ遺伝子位置の分離された各部分と相同な
配列であるだろう。本発明によるゲノム修飾がおζるた
めには、２つの挿入可能なＤＮＡフラグメントハ、それ
らがピチアゲノム中に存在するのと同じ相対的方向で、
線状フラグメント中に互いに対して方向づけられねばな
らない。
有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾がおこる天然ピ
チアゲノム部位の分離された各部分と相同なヌクレオチ
ド配列である。従って、例えばゲノム修飾がアルコール
オキシダーゼ遺伝子の位置でおこる場合、使用する第一
および第二の挿入可能なＤＮＡ７ラグメ／トはアルコー
ルオキシダーゼ遺伝子位置の分離された各部分と相同な
配列であるだろう。本発明によるゲノム修飾がおζるた
めには、２つの挿入可能なＤＮＡフラグメントハ、それ
らがピチアゲノム中に存在するのと同じ相対的方向で、
線状フラグメント中に互いに対して方向づけられねばな
らない。
本発明の実施に際して使用する形質転換ＤＮＡの３つの
最小成分は直列に配置され、それにより選択可能なマー
カー遺伝子が粥−および第二の挿入可能なフラグメント
の間に位置づけられた線状Ｄ Ｎ Ａフラグメントラ形
成する。選択可能なマーカー遺伝子の例にはピチア・パ
ストリスおよびサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）由来のＡ
ＲＧ４選伝子、転子チア・パストリスおよびＳ、セレビ
シェ由来のＲ工Ｓ４遺伝子、大腸菌転位因子Ｔｎ６０１
由来のＧ４１８ホスホトラ／スフエラ〜ゼ遺伝子など
が含まれる。当業者はまた多数の適当な側面配列（すな
わち第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント）
がピチア・バスト’Ｊスのゲノムから単離された遺伝子
より誘導され得ることを認めるであろう。その遺伝子の
例にはアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ］および
ＡＯＸ２ ；ピチアば２種のアルコールオキシダーゼ遺
伝子を含む）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子
（ＤＡＳ） 、アルギニノコハク醗リアーゼ遺伝子（Ａ
ＲＧ４ ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（
Ｈ工Ｓ４）などが含まれるが、これらに限定きれない。
最小成分は直列に配置され、それにより選択可能なマー
カー遺伝子が粥−および第二の挿入可能なフラグメント
の間に位置づけられた線状Ｄ Ｎ Ａフラグメントラ形
成する。選択可能なマーカー遺伝子の例にはピチア・パ
ストリスおよびサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）由来のＡ
ＲＧ４選伝子、転子チア・パストリスおよびＳ、セレビ
シェ由来のＲ工Ｓ４遺伝子、大腸菌転位因子Ｔｎ６０１
由来のＧ４１８ホスホトラ／スフエラ〜ゼ遺伝子など
が含まれる。当業者はまた多数の適当な側面配列（すな
わち第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント）
がピチア・バスト’Ｊスのゲノムから単離された遺伝子
より誘導され得ることを認めるであろう。その遺伝子の
例にはアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ］および
ＡＯＸ２ ；ピチアば２種のアルコールオキシダーゼ遺
伝子を含む）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子
（ＤＡＳ） 、アルギニノコハク醗リアーゼ遺伝子（Ａ
ＲＧ４ ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（
Ｈ工Ｓ４）などが含まれるが、これらに限定きれない。
形質転換用線状ＤＮＡフラグメントは種々の他のＤ Ｎ
Ａ配列、例えば異種遺伝子（すなわち宿主細胞内の挿
入がおこるゲノムのその位置に通常は存在しない遺伝子
またはその一部であって、ビチア・・ξストリス内での
その発現が望まれるもの）を含むことができる。一般に
０異種′”という用語は宿主のピチア細胞に本来存在し
ないＤＮＡＩ意味する。異種遺伝子は、場合により、そ
の異種遺伝子産物の生産全独立して制御する調節領域と
組物わされるか、または形質転換過程で破壊された遺伝
子の天然調節領域の影響下に形質転換細胞中でその異種
遺伝子全発現させることができる。
Ａ配列、例えば異種遺伝子（すなわち宿主細胞内の挿
入がおこるゲノムのその位置に通常は存在しない遺伝子
またはその一部であって、ビチア・・ξストリス内での
その発現が望まれるもの）を含むことができる。一般に
０異種′”という用語は宿主のピチア細胞に本来存在し
ないＤＮＡＩ意味する。異種遺伝子は、場合により、そ
の異種遺伝子産物の生産全独立して制御する調節領域と
組物わされるか、または形質転換過程で破壊された遺伝
子の天然調節領域の影響下に形質転換細胞中でその異種
遺伝子全発現させることができる。
さらに、本発明の実施に際して用いられる形質転換用線
状ＤＮＡフラグメントは、例えばｐＢＲ３２２やｐＢＲ
３２５配列のような細菌のプラスミドＤＮＡ１も含み得
る。この種の細菌配列はこれらのＤＮＡ配列の大腸菌内
での増幅によるｉｎ ＶｉｔｒＯ操作および生産のため
に有用である。
状ＤＮＡフラグメントは、例えばｐＢＲ３２２やｐＢＲ
３２５配列のような細菌のプラスミドＤＮＡ１も含み得
る。この種の細菌配列はこれらのＤＮＡ配列の大腸菌内
での増幅によるｉｎ ＶｉｔｒＯ操作および生産のため
に有用である。
形質転換用線状ＤＮＡとして特に有用な形は、第一の挿
入可能な１）ＮＡフラグメント、第二の挿入可能なＤＮ
Ａフラグメント、選択可能なマーカー遺伝子、お・よび 細菌のプラスミド？ＤＮＡ を含む閉環状プラスミドのようなものである。このプラ
スミドゝはまた先に述べたような追加のＩＪＮＡ配列を
含みうる。
入可能な１）ＮＡフラグメント、第二の挿入可能なＤＮ
Ａフラグメント、選択可能なマーカー遺伝子、お・よび 細菌のプラスミド？ＤＮＡ を含む閉環状プラスミドのようなものである。このプラ
スミドゝはまた先に述べたような追加のＩＪＮＡ配列を
含みうる。
好適な実施態様において、閉環状プラスミドは２つの部
分、すなわち”形質転換″部分と”細菌°゛部分ら構成
される。形質転換部分は直列に配置された第一の挿入可
能なＤＮＡフラグメント、選１択可能なマーカー遺伝子
、および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントから成り
、その際第−および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トはそれらがピチアゲノム内に存在するときと同じ向き
で互いに対して方向つけられ、そして選択可能なマーカ
ー遺伝子は第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメ
ントの間に位置づけられる。その後、細菌部分は第一の
挿入可能なＤＮＡフラグメントと第二の挿入可能なＤＮ
Ａフラグメントと全接続して閉環状（フタ−を形成する
ように位置づけられる。
分、すなわち”形質転換″部分と”細菌°゛部分ら構成
される。形質転換部分は直列に配置された第一の挿入可
能なＤＮＡフラグメント、選１択可能なマーカー遺伝子
、および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントから成り
、その際第−および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トはそれらがピチアゲノム内に存在するときと同じ向き
で互いに対して方向つけられ、そして選択可能なマーカ
ー遺伝子は第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメ
ントの間に位置づけられる。その後、細菌部分は第一の
挿入可能なＤＮＡフラグメントと第二の挿入可能なＤＮ
Ａフラグメントと全接続して閉環状（フタ−を形成する
ように位置づけられる。
上記のようにして作製された閉環状（フタ−は大腸菌内
で大量のプラスミドをつくるために使用され、その後こ
のプラスミドヲ単離し、適切な制限酵素で消化して形質
転換部分を細菌部分から切り離す。次に、酵母ＤＮＡの
線状形質転換部分を用いてビチア属の菌株を形質転換し
、それにより目的のゲノム修飾を行うことができる。
で大量のプラスミドをつくるために使用され、その後こ
のプラスミドヲ単離し、適切な制限酵素で消化して形質
転換部分を細菌部分から切り離す。次に、酵母ＤＮＡの
線状形質転換部分を用いてビチア属の菌株を形質転換し
、それにより目的のゲノム修飾を行うことができる。
もちろん、当分野で通常の知識を有する者は上記の閉環
状プラスミドの“形質転換”部分が追加のＤＮＡ配列を
含みうろことを認めるであろう。
状プラスミドの“形質転換”部分が追加のＤＮＡ配列を
含みうろことを認めるであろう。
例えば、大腸菌内での増幅によるＤＮＡの操作および生
産のためにｉｎ ｖｉｔｒｏ で使用される細菌配列
は形質転換り飼Ａの一部であり得、すなわち、細菌配列
は選択可能なマーカー遺伝子配列と同様に、第一および
第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づける
ことが可能である。ＤＮＡ成分のこのような構成配置を
用いろ場合は、その細菌配列も本発明のゲノム修飾法に
付される宿主酵母のゲノム内に組み込まれることになろ
う。
産のためにｉｎ ｖｉｔｒｏ で使用される細菌配列
は形質転換り飼Ａの一部であり得、すなわち、細菌配列
は選択可能なマーカー遺伝子配列と同様に、第一および
第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づける
ことが可能である。ＤＮＡ成分のこのような構成配置を
用いろ場合は、その細菌配列も本発明のゲノム修飾法に
付される宿主酵母のゲノム内に組み込まれることになろ
う。
ピチア・パス） ＩＪスの形質転換はストロ−マン（Ｓ
ｔｒｏｍａｎ ）らの係属中の特許出願第６６６５７９
号（フィリップス・ｋトロレウム・力／）ξニーに譲渡
）に開示されている。ピチア・・ξストリスの形質転換
のために用いられろ実験方法は以下に詳しく述べろ（実
施例１を参照）。ピチア属の酵母菌株はその細胞壁を酵
素によシ消化してセフェロブラストに得、そのスフエロ
ブラスｈｅ形質転換１）ＮＡと混合し、カルシウムイオ
ンおよびポリエチレングリコールの存在下でインキユヘ
ートシ、その後選択増殖培地で再生することにより形質
転換することができる。形質転換ＤＮＡは選択可能なマ
ーカー遺伝子を含み、この遺伝子は形質転換細胞のみが
用いた選択増殖条件（選択増殖条件は形質転換ＤＮＡの
一部として使用した選択可能なマーカー遺伝子に関係す
る）のもとで生き残って生長することができるので、形
質転換ＤＮＡを取り込んだ細胞の選択を可能にする。
ｔｒｏｍａｎ ）らの係属中の特許出願第６６６５７９
号（フィリップス・ｋトロレウム・力／）ξニーに譲渡
）に開示されている。ピチア・・ξストリスの形質転換
のために用いられろ実験方法は以下に詳しく述べろ（実
施例１を参照）。ピチア属の酵母菌株はその細胞壁を酵
素によシ消化してセフェロブラストに得、そのスフエロ
ブラスｈｅ形質転換１）ＮＡと混合し、カルシウムイオ
ンおよびポリエチレングリコールの存在下でインキユヘ
ートシ、その後選択増殖培地で再生することにより形質
転換することができる。形質転換ＤＮＡは選択可能なマ
ーカー遺伝子を含み、この遺伝子は形質転換細胞のみが
用いた選択増殖条件（選択増殖条件は形質転換ＤＮＡの
一部として使用した選択可能なマーカー遺伝子に関係す
る）のもとで生き残って生長することができるので、形
質転換ＤＮＡを取り込んだ細胞の選択を可能にする。
第一アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ １ ）が
破壊されたピチア菌株を異種遺伝子発現用の宿主として
使用する場合、爲いたことに、異種遺伝子産物の発現レ
ベルは、ある種のプロモーター（例えばＡＯＸＩまたは
ＤＡＳプロモーター）の制イ、１４１下ンであるとき、
完全なアルコールオキシダーゼ感応宿主全使用する場合
に得られろ発現レベルよりも数倍増加することが観察さ
れた。この観察およびこの現象のその後の研究の結果と
して、異種遺伝子の宿主生物内での発現レベルを高める
一般的方法が存在し、その方法は宿主菌株を栄養摂取制
限条件下に基′Ｖｆ、（強力な基質応答性プロモーター
領域が存在し、異種遺伝子はこのプロモーターの調節制
御下にある）上で増矯烙せることから成ることか判明し
た。
破壊されたピチア菌株を異種遺伝子発現用の宿主として
使用する場合、爲いたことに、異種遺伝子産物の発現レ
ベルは、ある種のプロモーター（例えばＡＯＸＩまたは
ＤＡＳプロモーター）の制イ、１４１下ンであるとき、
完全なアルコールオキシダーゼ感応宿主全使用する場合
に得られろ発現レベルよりも数倍増加することが観察さ
れた。この観察およびこの現象のその後の研究の結果と
して、異種遺伝子の宿主生物内での発現レベルを高める
一般的方法が存在し、その方法は宿主菌株を栄養摂取制
限条件下に基′Ｖｆ、（強力な基質応答性プロモーター
領域が存在し、異種遺伝子はこのプロモーターの調節制
御下にある）上で増矯烙せることから成ることか判明し
た。
本発明の高めしれた遺伝子発現にとって必要な゛栄養摂
取制限条件゛ば、細胞に限定量の栄養素全与えるか、ま
たは突然変異の結果としである種の増殖条件下で栄養摂
取を制限された変異株宿主を使用することによりもたら
される。従って、例えば強力なアルコールオキシダーゼ
プロモーターまたはジヒドロキシアセトンシンターゼプ
ロモーター（これらのプロモーターは両方とも生長培地
中のメタノールの存在に応答する）の制御下にある異種
遺伝子の発現レベルを高めたいと思う場合メタノール全
利用する能力が一部欠けている宿主を使用するか、また
は完全なアルコールオキシダーゼ感応宿主と共にメタノ
ール制限増殖条件全使用することにより、必要とする栄
養摂取制限条件が得られ、こうして高められた遺伝子発
現が達成でれるであろう。
取制限条件゛ば、細胞に限定量の栄養素全与えるか、ま
たは突然変異の結果としである種の増殖条件下で栄養摂
取を制限された変異株宿主を使用することによりもたら
される。従って、例えば強力なアルコールオキシダーゼ
プロモーターまたはジヒドロキシアセトンシンターゼプ
ロモーター（これらのプロモーターは両方とも生長培地
中のメタノールの存在に応答する）の制御下にある異種
遺伝子の発現レベルを高めたいと思う場合メタノール全
利用する能力が一部欠けている宿主を使用するか、また
は完全なアルコールオキシダーゼ感応宿主と共にメタノ
ール制限増殖条件全使用することにより、必要とする栄
養摂取制限条件が得られ、こうして高められた遺伝子発
現が達成でれるであろう。
ここに記載の異種遺伝子産物の発現増進方法は栄養摂取
制限に応答するプロモーターを含む全ての生物に有用な
一般的方法であると考えられる。
制限に応答するプロモーターを含む全ての生物に有用な
一般的方法であると考えられる。
従って、異種遺伝子をこのようなプロモーター領域の制
御下におき、次にその強力プロモーターを作動きせる栄
養素に関して栄養摂取制限条件下でその宿主生物を培養
することにより、増大した遺伝子発現が起こるであろう
。栄養摂取全制限された増殖条件を与える目下の好適な
手段は、非変異株宿主よりも一層高い発現しばルでプロ
モーターに発現させる栄養素を代謝する能力が一部欠損
している変異株宿主を使用することである。これは実施
例■に詳しく述べるようにビチアにおいて実証された。
御下におき、次にその強力プロモーターを作動きせる栄
養素に関して栄養摂取制限条件下でその宿主生物を培養
することにより、増大した遺伝子発現が起こるであろう
。栄養摂取全制限された増殖条件を与える目下の好適な
手段は、非変異株宿主よりも一層高い発現しばルでプロ
モーターに発現させる栄養素を代謝する能力が一部欠損
している変異株宿主を使用することである。これは実施
例■に詳しく述べるようにビチアにおいて実証された。
本発明のゲノム修飾法によって第一アルコールオキシダ
ーゼ遺伝子が破壊されたピチア・パストリスの１株を炭
素源としてのメタノールと共に培養すると、駕いたこと
に、第一アルコールオキシダーゼ遺伝子金欠いたこの稲
の菌株は野生型のビチア細胞に対して低下した速度とは
いえ、またメタノール上で生長できろことが観察された
。この観察はピチアのメタノール利用性菌株中に第二の
アルコールオキシダーゼ遺伝子が存在しうろことを示し
た。
ーゼ遺伝子が破壊されたピチア・パストリスの１株を炭
素源としてのメタノールと共に培養すると、駕いたこと
に、第一アルコールオキシダーゼ遺伝子金欠いたこの稲
の菌株は野生型のビチア細胞に対して低下した速度とは
いえ、またメタノール上で生長できろことが観察された
。この観察はピチアのメタノール利用性菌株中に第二の
アルコールオキシダーゼ遺伝子が存在しうろことを示し
た。
ビチア染色体ＤＮＡのライブラリーのスクリー二／グ１
ｄ３Ｋｂｐフラグメント（このフラグメントハ第ニアル
コールオキシダーゼ（ＡＯＸ２）の一部をコードすると
思われる）の単離へと導いた。このフラグメントはｐＢ
Ｒ３２２（唯一のＢａｍＨ工部位）に挿入吻として組み
入れた。このプラスミドはｐＰＧ３．０と命名され、大
腸菌宿主ＬＥ３９２によって保有される。この菌株はこ
の出願が特許として公布場れる際に一般の人々が利用で
きるように、イリノイ州ビオーリアの米国農業省、ノザ
ン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎＲｓｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅ
ｒ）に寄託番号ＮＲＲＬＢ−１８０２２として寄託され
た。
ｄ３Ｋｂｐフラグメント（このフラグメントハ第ニアル
コールオキシダーゼ（ＡＯＸ２）の一部をコードすると
思われる）の単離へと導いた。このフラグメントはｐＢ
Ｒ３２２（唯一のＢａｍＨ工部位）に挿入吻として組み
入れた。このプラスミドはｐＰＧ３．０と命名され、大
腸菌宿主ＬＥ３９２によって保有される。この菌株はこ
の出願が特許として公布場れる際に一般の人々が利用で
きるように、イリノイ州ビオーリアの米国農業省、ノザ
ン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎＲｓｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅ
ｒ）に寄託番号ＮＲＲＬＢ−１８０２２として寄託され
た。
ｐＰＧ３．０の制限地図は第１６ｂ図に示され、ここに
おいてそれは単一アルコールオキシダーゼ遺伝子のゲノ
ムフラグメント、ｐＰＧ４．Ｑと比較されろ。
おいてそれは単一アルコールオキシダーゼ遺伝子のゲノ
ムフラグメント、ｐＰＧ４．Ｑと比較されろ。
後者のフラグメントはストロ−マンらの係属中の特許出
願第６６６３９１号（フィリップス・ベトロレウム・カ
ンパニーに譲渡）に詳しく開示されている。２つのアル
コールオキシダーゼ遺伝子の比較（第１６図参照）は、
これら２つの７ラグメ／トが単に同一ゲツム位置の重複
部分でないこと全町らかにした。２つのフラグメントに
はいくつかの共通の制限部位が存在することから証明さ
れるように、２つのフラグメントの間に若干の相同が存
在することは明白である。２つの遺伝子（ＡＯＸＩおよ
びＡＯＸ２ ）に共通する制限部位には第１６図におい
て星印がつけられている。しかしながら、他方の７ラグ
メ／トに存在しない制限部位が各フラグメントに数個存
在することは、これらの２つのフラグメント間にヌクレ
オチビレベルでの差異が若干存在することを示している
。
願第６６６３９１号（フィリップス・ベトロレウム・カ
ンパニーに譲渡）に詳しく開示されている。２つのアル
コールオキシダーゼ遺伝子の比較（第１６図参照）は、
これら２つの７ラグメ／トが単に同一ゲツム位置の重複
部分でないこと全町らかにした。２つのフラグメントに
はいくつかの共通の制限部位が存在することから証明さ
れるように、２つのフラグメントの間に若干の相同が存
在することは明白である。２つの遺伝子（ＡＯＸＩおよ
びＡＯＸ２ ）に共通する制限部位には第１６図におい
て星印がつけられている。しかしながら、他方の７ラグ
メ／トに存在しない制限部位が各フラグメントに数個存
在することは、これらの２つのフラグメント間にヌクレ
オチビレベルでの差異が若干存在することを示している
。
本発明は今や以下の非限定的実施例によりさらに詳しく
説明されろであろう。
説明されろであろう。
実施例
以下の実施例で用いる緩衝液および溶液は下記の組成を
有する： ＩＦＡトリスＷ衝＃ Ｆ１２０８００ ｍｌｌ中ソ
リス塩基１２１１９；濃ＨＣｆｌ水溶液（３５％）を加 えてｐｉ（を所望の値に調整する； 最終ｐ１′１の調整前に溶ｒＬを室温 まで冷却させる； 希釈して最終容量を１立とする。
有する： ＩＦＡトリスＷ衝＃ Ｆ１２０８００ ｍｌｌ中ソ
リス塩基１２１１９；濃ＨＣｆｌ水溶液（３５％）を加 えてｐｉ（を所望の値に調整する； 最終ｐ１′１の調整前に溶ｒＬを室温 まで冷却させる； 希釈して最終容量を１立とする。
ＴＥ緩衝液 ０．０１ Ｍ （ｐＨ７，４） トリ
ス緩衝液中１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ＬＢ（ＩＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地バクトート
リプト１５９ バクトー酵母エキス ５９ Ｎａ（４２，５９ を水ＩＱ、に加え、Ｎ’ａＯＨｆ ｐＨ７５に調製する
。
ス緩衝液中１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ＬＢ（ＩＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地バクトート
リプト１５９ バクトー酵母エキス ５９ Ｎａ（４２，５９ を水ＩＱ、に加え、Ｎ’ａＯＨｆ ｐＨ７５に調製する
。
２Ｂ培地 ０．２％ ＮＨ４ＰＯ４１，２％ Ｎ
ａ ２ ＨＦＯ２ ０，０１３％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０、０７４％ Ｃａ Ｃｎ ２ ・２Ｈ２０２μ９／ｒ
ｎ１３ビオチン １μ９７ｍｌチアミ／ １００μｇ／ｒｒｔｌ！ ）リプトファン０４％ デ
キストロース ０．２チ カザミノ酸 ＹＰＤ培地 １係 バクトー酵母エキス２％ バ
クトーペブトン ２％ デキストロース ＳＤ培地 ６７５ｇ アミノ酸不含酵母窒素塩
基（ジフコ） 水１℃中の２％デキストロース ＳＥＤ ］ Ｍ ソルビトール２５ｍＭ
ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液 ９１９ ソルビトール１．４７ｇ
クエン酸ナトリウム ０．１６８９ ＥＤＴＡ ５０ｒｎｌ Ｈ２０ Ｈ（４でｐＨ５，８とする。
ａ ２ ＨＦＯ２ ０，０１３％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０、０７４％ Ｃａ Ｃｎ ２ ・２Ｈ２０２μ９／ｒ
ｎ１３ビオチン １μ９７ｍｌチアミ／ １００μｇ／ｒｒｔｌ！ ）リプトファン０４％ デ
キストロース ０．２チ カザミノ酸 ＹＰＤ培地 １係 バクトー酵母エキス２％ バ
クトーペブトン ２％ デキストロース ＳＤ培地 ６７５ｇ アミノ酸不含酵母窒素塩
基（ジフコ） 水１℃中の２％デキストロース ＳＥＤ ］ Ｍ ソルビトール２５ｍＭ
ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液 ９１９ ソルビトール１．４７ｇ
クエン酸ナトリウム ０．１６８９ ＥＤＴＡ ５０ｒｎｌ Ｈ２０ Ｈ（４でｐＨ５，８とする。
ＣａＳ Ｉ Ｍ ソルビトール１０
ｍＭ ＣａＣＮ２ 濾過滅菌する。
ｍＭ ＣａＣＮ２ 濾過滅菌する。
ＰＥＧ溶液 ２０％ポリエチレングリコール−
３３５０１ＱｍＭ ＣａＣＦ！２ １ＱｍＭ トリ、＜−Ｈ（４（ｐＨ７，４）濾過滅菌
する。
３３５０１ＱｍＭ ＣａＣＦ！２ １ＱｍＭ トリ、＜−Ｈ（４（ｐＨ７，４）濾過滅菌
する。
ｓｏｓ Ｉ Ｍ ソルビトールＱ、３
Ｘ ＹＰＤ 培地 １０ ｍ Ｍ ＣａＣｆ１２ 実施例において用いられる以下の略号は次の意味金有す
る： ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ
ト’デシル硫酸ナトリウムＤＴＴ ジテオトレ
イトール Ａ、細胞増殖 １、 ピチア・パストリスＧＳ１］５（ＮＲＲＬ Ｙ−
１５８５１）のコロニー全豹１０−〇ＹＰＤ培地に接種
し、培養物を３０℃で１２〜２０時間振とつする。
Ｘ ＹＰＤ 培地 １０ ｍ Ｍ ＣａＣｆ１２ 実施例において用いられる以下の略号は次の意味金有す
る： ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ
ト’デシル硫酸ナトリウムＤＴＴ ジテオトレ
イトール Ａ、細胞増殖 １、 ピチア・パストリスＧＳ１］５（ＮＲＲＬ Ｙ−
１５８５１）のコロニー全豹１０−〇ＹＰＤ培地に接種
し、培養物を３０℃で１２〜２０時間振とつする。
２５）約１２〜２０時間後、約０．０１〜ｏ１の０Ｄ６
ｏｏへ細胞を希釈し、対数増殖期の細胞２ ＹＰＤ培地
中に３０℃で約６〜８時間維持する。
ｏｏへ細胞を希釈し、対数増殖期の細胞２ ＹＰＤ培地
中に３０℃で約６〜８時間維持する。
３、約６〜８時間後、０Ｄ６ｏｏが約０．１の種培養物
０．５ ｍｌ （または等量）＝４ＹＰＤ培地１００ｍ
ＪＫ接種する。３０℃で約１２〜２０時間後とぅする。
０．５ ｍｌ （または等量）＝４ＹＰＤ培地１００ｍ
ＪＫ接種する。３０℃で約１２〜２０時間後とぅする。
４．０Ｄ６ｏｏが約０．２〜０．３になったとき（約１
６〜２０時間後）、１５００ｘｇで５分間遠心すること
によジ培養物を回収する。
６〜２０時間後）、１５００ｘｇで５分間遠心すること
によジ培養物を回収する。
Ｂ、スフェロプラストの調製
１ 細胞を滅菌水１０罰で１回洗う。（工程１〜５の遠
心は１５００に９で５分間行う。）２５）細胞を新しく
調製しり５Ｆ２Ｄ １０ ｒｎｌテ１ 回洗う。
心は１５００に９で５分間行う。）２５）細胞を新しく
調製しり５Ｆ２Ｄ １０ ｒｎｌテ１ 回洗う。
３４ 細胞を滅菌１Ｍソルビトール１０ｍｅｔ’２回
洗う。
洗う。
４ 細胞金ＳＣＥ緩衝液１０ｒｎｌ中に懸濁する。
５、 ４ ｍｑ ／ ｒｕｇテモリアーゼ６ Ｑ ００
０ （Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ；マイルズラボラトリーズ
）５〜１０μρ を加える。
０ （Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ；マイルズラボラトリーズ
）５〜１０μρ を加える。
細胞全３０℃で約３０〜６０分間インキユヘートする。
スフェロプラストの調製は形質転換法において重要な工
程でりるので、スフェロプラストの形成を次のようにし
て監視すべきである：テモリアーゼの添加前または添加
直後る・よびインキュベーションのいろいろな時期に細
胞の１００μＱアリコートを５％ＳＤＳ ９００μρ
およびＩＭソルビトール９００μ塁に加える、細胞がＳ
ＤＳに溶解するがソルビトールに溶解しない時点（通常
３０〜６０分のインキュベーショ／）でインキュ（−ジ
ョンｆ停止する。
程でりるので、スフェロプラストの形成を次のようにし
て監視すべきである：テモリアーゼの添加前または添加
直後る・よびインキュベーションのいろいろな時期に細
胞の１００μＱアリコートを５％ＳＤＳ ９００μρ
およびＩＭソルビトール９００μ塁に加える、細胞がＳ
ＤＳに溶解するがソルビトールに溶解しない時点（通常
３０〜６０分のインキュベーショ／）でインキュ（−ジ
ョンｆ停止する。
６ スフェロプラスト’！１１０００！９で５〜１゜分
遠心することにより滅菌１Ｍソルビトール１０ｍ１で２
回洗う。（遠心の時間および速度は変化しうる；スフェ
ロプラストヲ沈殿させるのに十分であるが、それらを遠
心力によって破裂させない程度に遠心する３ ） ７ 細胞を滅菌Ｃａ８１０ｍｌで１回洗う。
遠心することにより滅菌１Ｍソルビトール１０ｍ１で２
回洗う。（遠心の時間および速度は変化しうる；スフェ
ロプラストヲ沈殿させるのに十分であるが、それらを遠
心力によって破裂させない程度に遠心する３ ） ７ 細胞を滅菌Ｃａ８１０ｍｌで１回洗う。
８、 細胞ｆ Ｃａ８０．６ｍｌの全体に懸濁する。
Ｃ９形質転換
１、 ＤＮＡ試料（２０ｇ塁容量以下）全１２Ｘ７５
閾の滅菌ホリプロピレン管に加える。（ＤＮＡは水また
は゛ｌ’Ｅ緩衝液中に含まれるだろう；少量のＤＮＡで
最大の形質転換頻度を得ろために、５ ｙｎｑ／ ｍｌ
超音波処理大腸菌ＤＮＡ約１μｒｌヲ各試料に加えろこ
とが適切である。） ２５）スフェロプラスト１００μＱを各ＤＮＡ試料に加
えて、室温で約２０分間インキュベートする。
閾の滅菌ホリプロピレン管に加える。（ＤＮＡは水また
は゛ｌ’Ｅ緩衝液中に含まれるだろう；少量のＤＮＡで
最大の形質転換頻度を得ろために、５ ｙｎｑ／ ｍｌ
超音波処理大腸菌ＤＮＡ約１μｒｌヲ各試料に加えろこ
とが適切である。） ２５）スフェロプラスト１００μＱを各ＤＮＡ試料に加
えて、室温で約２０分間インキュベートする。
３、ＰＥＧ溶液１ｔｔｔｌｆ各試料に加えて、室温で約
１５分間インキュベートする。
１５分間インキュベートする。
４、試料ｅ１０００ｘ９で５〜１０分遠心し、ＰＥＧ溶
液をデカントする。
液をデカントする。
５、試料２ ＳＯ８１５０μ塁に再懸濁し、室温で３０
分間インキュベートする。
分間インキュベートする。
６ 滅ｉ１Ｍンルビトール８５０μ旦ヲ加え、試料のア
リニートヲ以下のようにして平板培養する。
リニートヲ以下のようにして平板培養する。
Ｄ、スフェロプラストの再生
１ 再生寒天培地の処方：
ａ、寒天−ＫＣ塁−バクトー寒天９ｇ、Ｋ（Ｊ１３．４
９、Ｈ２Ｏ２４０ｍｌ！、加圧滅菌。
９、Ｈ２Ｏ２４０ｍｌ！、加圧滅菌。
ｂ、ＩＱＸグルコース−デキストロース２０ｇ、Ｈ２Ｏ
１００ｙｔｌ、加圧滅菌。
１００ｙｔｌ、加圧滅菌。
ｃ、１０ｘＳＣ−アミノ酸不含の酵母窒素塩基６７５９
、Ｈ２Ｏ１００ｍｌ、加圧滅菌。（加圧滅菌前または後
に２００μｇ／ｍｌの濃度までの所望アミノ酸または核
酸を加える。） ｄ、溶融した寒天−ＫＣＱ溶液２４０尻ｌに１０×グル
：＋−ス３０ ｍｌ！および１０ ｘ Ｓ Ｃ３０ｒｔ
ｔｌｔ加する。０．２■／ ｒｎｌビオテア ０．６
ｍｌおよびその他の所望アミノ酸または核酸を２０μ９
／ｍ１３の濃度で加える。溶融した再生寒天を５５〜６
０℃に保持する。
、Ｈ２Ｏ１００ｍｌ、加圧滅菌。（加圧滅菌前または後
に２００μｇ／ｍｌの濃度までの所望アミノ酸または核
酸を加える。） ｄ、溶融した寒天−ＫＣＱ溶液２４０尻ｌに１０×グル
：＋−ス３０ ｍｌ！および１０ ｘ Ｓ Ｃ３０ｒｔ
ｔｌｔ加する。０．２■／ ｒｎｌビオテア ０．６
ｍｌおよびその他の所望アミノ酸または核酸を２０μ９
／ｍ１３の濃度で加える。溶融した再生寒天を５５〜６
０℃に保持する。
２５）形質転換試料の平板培養：
形質転換試料全用意する少なくとも３０分前にプレート
当た５１０＋！ｌ／の再生寒天の底部寒天層を注入する
。形質転換試料がＳＯ８中に存在する間に、４５〜５０
℃の浴中で試験管に再生寒天の１０＋＋＋Ａ！アリコ−
ｉ分注する。再生寒天を含む試験管に上記の形質転換試
料のアリコートヲ加え、プレートの底部寒天層の上に注
入する。
当た５１０＋！ｌ／の再生寒天の底部寒天層を注入する
。形質転換試料がＳＯ８中に存在する間に、４５〜５０
℃の浴中で試験管に再生寒天の１０＋＋＋Ａ！アリコ−
ｉ分注する。再生寒天を含む試験管に上記の形質転換試
料のアリコートヲ加え、プレートの底部寒天層の上に注
入する。
３、スフェロプラスト調製物の品質測定＝１つの試料】
ＯμＱ’ｒ取シ出し、１Ｍソルビトール９９０μ氾に加
えて１００倍に希釈する。その１００倍希釈物１０μａ
ｌ取り出し、ＩＭンルビトールの第二の９９０μΩアリ
コートに加えてさらに１００倍に希釈する。両方の希釈
物１００μＱをＹＰＤ培地を含む寒天平板上に塗り、調
製物中に残存する非スフェロプラスト化完全細胞の濃度
全測定する。４０μｇ／ｍｅヒスチジ／を補足した再生
寒天１０ｍ／に各希釈物１００μ旦を加え、再生可能な
完全スフ二ログラストヲ測定する。形質転換実験におい
て良好な値は再生可能な完全スフェロプラストが１〜３
×１０ 個／ ｒｔｔｌであり、完全細胞が約１×１０
個／ゴである。
ＯμＱ’ｒ取シ出し、１Ｍソルビトール９９０μ氾に加
えて１００倍に希釈する。その１００倍希釈物１０μａ
ｌ取り出し、ＩＭンルビトールの第二の９９０μΩアリ
コートに加えてさらに１００倍に希釈する。両方の希釈
物１００μＱをＹＰＤ培地を含む寒天平板上に塗り、調
製物中に残存する非スフェロプラスト化完全細胞の濃度
全測定する。４０μｇ／ｍｅヒスチジ／を補足した再生
寒天１０ｍ／に各希釈物１００μ旦を加え、再生可能な
完全スフ二ログラストヲ測定する。形質転換実験におい
て良好な値は再生可能な完全スフェロプラストが１〜３
×１０ 個／ ｒｔｔｌであり、完全細胞が約１×１０
個／ゴである。
４ 平板’ｉ３０℃で３〜５日間インキュベートする。
第１図はプラスミドｐＹＭＩ１を示し、第２図はＰ、・
ξストＩＪスのゲノム内へのプラスミドの部位特異的挿
入金もたらす現象の模式図である。ベクターはサツカロ
ミセスＡＲＧ４遺伝子とｐｉ３２２由来のＤＮＡ配列と
全ピチアＨ工Ｓ４位置へ挿入し、同時にピテアゲノムか
ら全Ｍ工Ｓ４遺伝子位置金欠失するようにテザイ／され
る。発現カセットのような他の配列もｐＹＭｌｌ内に容
易に挿入され、同様にＰ、バストリスゲノム内に組み込
まれるだろう・ グラスミＭｐＹＭ１１はピチアＨ工Ｓ４遺伝子の５′末
端にｉｎ ５ｉｔｕにおいて位置するＥｃｏＲニー Ｂ
ａｍＨエフラグメント、およびピチアｔｉ工Ｓ４遺伝子
の３′末端に位置するＥｃｏＲＩ−Ｃ，（ａＩ ７ラグ
メ／トヲ含む。
ξストＩＪスのゲノム内へのプラスミドの部位特異的挿
入金もたらす現象の模式図である。ベクターはサツカロ
ミセスＡＲＧ４遺伝子とｐｉ３２２由来のＤＮＡ配列と
全ピチアＨ工Ｓ４位置へ挿入し、同時にピテアゲノムか
ら全Ｍ工Ｓ４遺伝子位置金欠失するようにテザイ／され
る。発現カセットのような他の配列もｐＹＭｌｌ内に容
易に挿入され、同様にＰ、バストリスゲノム内に組み込
まれるだろう・ グラスミＭｐＹＭ１１はピチアＨ工Ｓ４遺伝子の５′末
端にｉｎ ５ｉｔｕにおいて位置するＥｃｏＲニー Ｂ
ａｍＨエフラグメント、およびピチアｔｉ工Ｓ４遺伝子
の３′末端に位置するＥｃｏＲＩ−Ｃ，（ａＩ ７ラグ
メ／トヲ含む。
両方の１−１工ｓ４遺伝子−側面フラグメントはグラス
ミ）’ｐＹＪ８（イリノイ州ビオーリアの米国農業省、
ノザン・リージョナル・リサーチ・センターからＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５８８９として大腸菌宿主より入手可能；第
３図参照）から得ることができ、約４００ｂｐの長さを
有し、そしてｐＹＭｌｌにおいてそれらのＥｃｏＲ工末
端で連結される。選択可能なマーカーとして、ｐＹＭ１
１ベクターはサツカロミセスアルギニノコハク酸リアー
ゼ（ＡＲＧ４遺伝子産物）をコート９するｐＹＭ２５（
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０１５として大腸菌宿主より入手可
能；第１７図参照）由来の２．６ Ｋｂｐ ＨｌｎｄＩ
ＩＩ−ＳａＲｒ ７ラグメ／ト全含む。
ミ）’ｐＹＪ８（イリノイ州ビオーリアの米国農業省、
ノザン・リージョナル・リサーチ・センターからＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５８８９として大腸菌宿主より入手可能；第
３図参照）から得ることができ、約４００ｂｐの長さを
有し、そしてｐＹＭｌｌにおいてそれらのＥｃｏＲ工末
端で連結される。選択可能なマーカーとして、ｐＹＭ１
１ベクターはサツカロミセスアルギニノコハク酸リアー
ゼ（ＡＲＧ４遺伝子産物）をコート９するｐＹＭ２５（
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０１５として大腸菌宿主より入手可
能；第１７図参照）由来の２．６ Ｋｂｐ ＨｌｎｄＩ
ＩＩ−ＳａＲｒ ７ラグメ／ト全含む。
ＥｃｏＲＩで切断すると、ｐＹＭｌｌ は線状になり、
その両末端にＩ（ＩＳ４遺伝子−側面フラグメントラ有
する。
その両末端にＩ（ＩＳ４遺伝子−側面フラグメントラ有
する。
Ｐ、 Ａストリスａｒｇ４菌株、Ｇ５１９０（ＮＲＲＬ
Ｙ−１８０１４）はＥｅｏＲ工切断ｐＹＭ１１でアルギ
ニ／原栄養株（Ａｒｇ）へと形質転換した。再生寒天培
地ｕ）ｉ工ｓ４遺伝子の欠失の結果としてヒスチジ／を
必要とする形質転換細胞に対し選択圧力が加わるのを避
けるために、４０μ９／ｒｐｔｌのヒスチジンを補足し
た。
Ｙ−１８０１４）はＥｅｏＲ工切断ｐＹＭ１１でアルギ
ニ／原栄養株（Ａｒｇ）へと形質転換した。再生寒天培
地ｕ）ｉ工ｓ４遺伝子の欠失の結果としてヒスチジ／を
必要とする形質転換細胞に対し選択圧力が加わるのを避
けるために、４０μ９／ｒｐｔｌのヒスチジンを補足し
た。
Ａｒｇ 形質転換細胞はその後ｆ（ＩＳ４遺伝子の欠
失の結果としてＨｉθになったものについてスクリーニ
ングした。Ｈｌｓ−形質転換細胞についてスクリーニン
グするために、Ａｒｇ コロニーを埋め込んだ再生寒
天を滅菌水２５ｍ１含有の５０ｍ１滅菌試験管に移した
。その後プリ／クツ／・インスツルメ／ソ・ポリトロン
・ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）
全５にセットして約１分間混合することにより寒天？微
粉砕した。３層の滅菌ガーゼを通して濾過することによ
り酵母細胞全寒天から分離した。その後、酵母！Ｂ短の
一部を超音波処理し、希釈し、そして４０μ９／ｒｎｌ
のヒスチジン全補足したＳＤ培地寒天平板上に塗り付け
た。
失の結果としてＨｉθになったものについてスクリーニ
ングした。Ｈｌｓ−形質転換細胞についてスクリーニン
グするために、Ａｒｇ コロニーを埋め込んだ再生寒
天を滅菌水２５ｍ１含有の５０ｍ１滅菌試験管に移した
。その後プリ／クツ／・インスツルメ／ソ・ポリトロン
・ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）
全５にセットして約１分間混合することにより寒天？微
粉砕した。３層の滅菌ガーゼを通して濾過することによ
り酵母細胞全寒天から分離した。その後、酵母！Ｂ短の
一部を超音波処理し、希釈し、そして４０μ９／ｒｎｌ
のヒスチジン全補足したＳＤ培地寒天平板上に塗り付け
た。
超音波処理のために、細胞試料” Ａ６００ ＝” １
へ希釈し、ノニファイアー・セル・ディスラブター３５
Ｑ （５ｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅ１ｌ Ｄｉｓｒｕｐｔ
ｅｒ ３５０ ：ブランノ／・ソニック・）々ワー・カ
ンノミニー） ｋ４ｔ／Ｃパワーセットして１０秒間超
音波処理した（この処理は細胞をばらばらに分離するの
に十分であるが、細胞の生存能力を低下させないもので
ある）。２〜３日後、ＳＤ＋ヒスチジン寒天平板上で増
殖したコロニーはヒスチジン含有およびヒスチジン不含
の数組のＳυ平板上でレプリカ培養した。
へ希釈し、ノニファイアー・セル・ディスラブター３５
Ｑ （５ｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅ１ｌ Ｄｉｓｒｕｐｔ
ｅｒ ３５０ ：ブランノ／・ソニック・）々ワー・カ
ンノミニー） ｋ４ｔ／Ｃパワーセットして１０秒間超
音波処理した（この処理は細胞をばらばらに分離するの
に十分であるが、細胞の生存能力を低下させないもので
ある）。２〜３日後、ＳＤ＋ヒスチジン寒天平板上で増
殖したコロニーはヒスチジン含有およびヒスチジン不含
の数組のＳυ平板上でレプリカ培養した。
Ａｒｇ ｔ（ｉｓ コロニーの割合はＡｒｇ 形質
転換細胞全体の平均０．７％であった。３つのＡｒｇ
Ｈｉｓ菌株由来のゲノムＤＮＡはサザ／ズロットハイプ
リダイゼーショ／により試験した。完全なＨ工Ｓ４遺伝
子は３つの菌株すべてにおいて欠失しており、そして第
２図の一番下に示すような線状プラスミドが挿入されて
いた。
転換細胞全体の平均０．７％であった。３つのＡｒｇ
Ｈｉｓ菌株由来のゲノムＤＮＡはサザ／ズロットハイプ
リダイゼーショ／により試験した。完全なＨ工Ｓ４遺伝
子は３つの菌株すべてにおいて欠失しており、そして第
２図の一番下に示すような線状プラスミドが挿入されて
いた。
ＧＳ１９０−ｐＹＭ１１菌株は生長のためにヒスチジン
を必要とするがもはやアルギニ／を必要としないという
事実のほかに、栄養摂取上の必要条件または生長速度に
おけるその他の変化は観察されなかった。
を必要とするがもはやアルギニ／を必要としないという
事実のほかに、栄養摂取上の必要条件または生長速度に
おけるその他の変化は観察されなかった。
第４図はプラスミドｐＹＭＩ３ａ を示し、第５図はＰ
、パストリス菌株ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０の１−ｆＩ
ｓ４位置へのプラスミドゞ由来７ラグメントの線状挿入
をもたらす現象を示している。上記ベクタ〜は選択可能
なマーカーとしてｐＢＰＧｌ−１（イリノイ州ビオーリ
アの米国農業省、ノザ／・リージョナル・リサーチ・セ
ンターから菌株［ｔＲＬ Ｂ−１８０２０として大腸菌
宿主より入手可能；第６図参照）に由来する０４１８耐
性遺伝子（Ｇ４１８ ）を含む。Ｇ４１８ 遺伝子は
約２．２ＫｂｐのＢａｍＨ工（ｐＢＲ３２２部位）／Ｂ
ｇｆｌｌｌ（ＰＡＲ３１部位）フラグメントとしてｐＢ
ＰＧＩ−１から移され、ピチアＨ工Ｓ４遺伝子を含む２
．７ Ｋｂｐ ＢｇＱロフラグメントの代わジにｐＹＪ
ｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８９；第３図参照）のＢｇρ
■部位へ挿入された。
、パストリス菌株ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０の１−ｆＩ
ｓ４位置へのプラスミドゞ由来７ラグメントの線状挿入
をもたらす現象を示している。上記ベクタ〜は選択可能
なマーカーとしてｐＢＰＧｌ−１（イリノイ州ビオーリ
アの米国農業省、ノザ／・リージョナル・リサーチ・セ
ンターから菌株［ｔＲＬ Ｂ−１８０２０として大腸菌
宿主より入手可能；第６図参照）に由来する０４１８耐
性遺伝子（Ｇ４１８ ）を含む。Ｇ４１８ 遺伝子は
約２．２ＫｂｐのＢａｍＨ工（ｐＢＲ３２２部位）／Ｂ
ｇｆｌｌｌ（ＰＡＲ３１部位）フラグメントとしてｐＢ
ＰＧＩ−１から移され、ピチアＨ工Ｓ４遺伝子を含む２
．７ Ｋｂｐ ＢｇＱロフラグメントの代わジにｐＹＪ
ｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８９；第３図参照）のＢｇρ
■部位へ挿入された。
ベクター ｐＹＭＩ ３ ａ ｆ ＥｃｏＲ工で消化し
て、Ｈ工Ｓ４遺伝子のちょうど５′末端と３′末端にそ
れぞれ位置する領域からの約４５０ｂｐＤＮＡと約２５
０ｂｐＤＮＡによってはさまれた０４１８ 遺伝子を含
ｊ） ２．９ Ｋｂｐフラグメントを生成した。このＥ
ｃｏＲ工切断プラスグラヲ用いてＰ、パストリス宿主全
形質転換した。
て、Ｈ工Ｓ４遺伝子のちょうど５′末端と３′末端にそ
れぞれ位置する領域からの約４５０ｂｐＤＮＡと約２５
０ｂｐＤＮＡによってはさまれた０４１８ 遺伝子を含
ｊ） ２．９ Ｋｂｐフラグメントを生成した。このＥ
ｃｏＲ工切断プラスグラヲ用いてＰ、パストリス宿主全
形質転換した。
形質転換細胞は３００μ９／ｒｎｌのＧ４１８抗生物質
の存在下で増殖するそれらの能力により選択した。
の存在下で増殖するそれらの能力により選択した。
０４１８選択のために、再生寒天培地は実施例Ｉのパー
トＤに記載のものから次のように変更した；１ 再生寒
天培地の処方： ａ、寒天−ソルビトールーバクトー寒天９９、ンルビト
ール５４６ｇ、 Ｈ２Ｏ２４０ｍｅ１加圧滅菌。
トＤに記載のものから次のように変更した；１ 再生寒
天培地の処方： ａ、寒天−ソルビトールーバクトー寒天９９、ンルビト
ール５４６ｇ、 Ｈ２Ｏ２４０ｍｅ１加圧滅菌。
ｂ、ＩＱＸグルコース−デキストロース２０ｇ、）１２
０１００妖加圧滅菌。
０１００妖加圧滅菌。
Ｃ，ｌ０ＸＹＰ−酵母エキ７．１］Ｊ、投ブト／２０９
、Ｈ２Ｏ１００罰、 加圧滅菌。
、Ｈ２Ｏ１００罰、 加圧滅菌。
ｄ、１０Ｘグルコース３０ｄおよびＩＯＸＹＰ３０ｍｌ
ｅ溶融した寒天−ンルビトール溶液２４０ＷＬｌに加え
ろ。溶融した再生寒天培地は５５〜６０℃に保持する。
ｅ溶融した寒天−ンルビトール溶液２４０ＷＬｌに加え
ろ。溶融した再生寒天培地は５５〜６０℃に保持する。
２５）形質転換試料の平板培養：
形質転換試料を用意する少なくとも３０分前に６００μ
９７ｍ１のＧ４１１−補足した再生寒天培地の底部寒天
層ｆｌＯｙｔｌ／プレートの量で注入した。
９７ｍ１のＧ４１１−補足した再生寒天培地の底部寒天
層ｆｌＯｙｔｌ／プレートの量で注入した。
形質転換試料がＳＯ８中に存在する間に、再生寒天培地
（０４１８を含まない）の１０ｍ１アリコートを４５〜
５０℃の浴中で試験管に分注した。形質転換試料が用意
されたとき、その試料のアリコートを再生寒天含有試験
管に加え、そして０４１８を含む１０ｍ１の底部寒天層
の上に注入した。平板は３０℃で３〜５日間インキュベ
ートした。
（０４１８を含まない）の１０ｍ１アリコートを４５〜
５０℃の浴中で試験管に分注した。形質転換試料が用意
されたとき、その試料のアリコートを再生寒天含有試験
管に加え、そして０４１８を含む１０ｍ１の底部寒天層
の上に注入した。平板は３０℃で３〜５日間インキュベ
ートした。
コロニーが０４１８ｉ含む再生寒天平板上に形成された
後、ヒステジ／なしで増殖するそれらの能力について細
胞をスクリーニングした。細胞を再生寒天から抽出し、
超音波処理し、そして実施例口に記載のように４０μｇ
ｉｎｇのヒスチジ／を補足したＳＤ培地基天平板上に塗
り付けた。３０℃で２〜３日間インキュベーショ／後、
コロニーはヒスチジン含有およびヒスチジン不含のＳＤ
培地寒天平板上でレプリカ培養した。
後、ヒステジ／なしで増殖するそれらの能力について細
胞をスクリーニングした。細胞を再生寒天から抽出し、
超音波処理し、そして実施例口に記載のように４０μｇ
ｉｎｇのヒスチジ／を補足したＳＤ培地基天平板上に塗
り付けた。３０℃で２〜３日間インキュベーショ／後、
コロニーはヒスチジン含有およびヒスチジン不含のＳＤ
培地寒天平板上でレプリカ培養した。
Ｇ４１８ コロニーの約０．１％がＨ１ｓ／’″であっ
た（スクリーニングした約２０００個のうち２個）。
た（スクリーニングした約２０００個のうち２個）。
サザ／プロットハイプリタイゼーショ／実験は、Ｈ工Ｓ
４遺伝子が両方のＭｉｓ−菌株のゲノムがら欠失され且
つ両方のゲノムが第５図に示すように０４１８ 遺伝子
を含有することを示した。これらのＨｌｓ−菌株の１つ
（実験室にてＫＭ３１と命名した；イリノイ州ビオーリ
アの米国農業省、ノザ／・リージョナル・リサーチ・セ
ンターからＮＲＩ（ＬＹ−１８０１８として入手可能）
はｐｓＡＯＨ５（エリＲＲＬ Ｂ−１５８６２として大
腸菌宿主より人手可能）のようなｈ工Ｓ４含有ピチアを
ベースとするプラスミドにより首尾よく形質転換され、
このことはＫＭ３］が特異的にＨ工Ｓ４遺伝子欠失生物
であることをさらに証明するものである。
４遺伝子が両方のＭｉｓ−菌株のゲノムがら欠失され且
つ両方のゲノムが第５図に示すように０４１８ 遺伝子
を含有することを示した。これらのＨｌｓ−菌株の１つ
（実験室にてＫＭ３１と命名した；イリノイ州ビオーリ
アの米国農業省、ノザ／・リージョナル・リサーチ・セ
ンターからＮＲＩ（ＬＹ−１８０１８として入手可能）
はｐｓＡＯＨ５（エリＲＲＬ Ｂ−１５８６２として大
腸菌宿主より人手可能）のようなｈ工Ｓ４含有ピチアを
ベースとするプラスミドにより首尾よく形質転換され、
このことはＫＭ３］が特異的にＨ工Ｓ４遺伝子欠失生物
であることをさらに証明するものである。
”野生型”Ｐ、パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０が
直接に（すなわち、初めに栄養要求変異誘導株金単離お
よび同定することなしに）形質転換されたのはこれが初
めてである。これらのｆ−［ＩＳ４変異株の利点は、そ
れらが部位特異的挿入／欠失法によって作られたので、
例えばＧ５１１５ （ＮＲＲＬＹ−１５８５１）やＧ５
１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４）のように化学的突
然変異誘発によって作られたピチア栄養要求変異株宿主
に起こりうる二次突然変異勿それらが受けないというこ
とである。
直接に（すなわち、初めに栄養要求変異誘導株金単離お
よび同定することなしに）形質転換されたのはこれが初
めてである。これらのｆ−［ＩＳ４変異株の利点は、そ
れらが部位特異的挿入／欠失法によって作られたので、
例えばＧ５１１５ （ＮＲＲＬＹ−１５８５１）やＧ５
１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４）のように化学的突
然変異誘発によって作られたピチア栄養要求変異株宿主
に起こりうる二次突然変異勿それらが受けないというこ
とである。
ｐＹＭＩ３ａ 由来のＥｃｏＲＩフラグメントの挿入に
よるピチアゲノムからのピチアＭＩ８４遺伝子の欠失は
ｐＢＲ３２２の主要部分が付加されない（ｐＹＭＩ１を
挿入した時には付加きれる；実施側口参照）ということ
に注意されたい。例えばｐｓＡｏ）Ｌ５ （第９図宿
照）のような大部分の自律的なＡＲ８をベースとするヒ
０チア発現ベクターは主にｐＢＲ３２２由来の配列とピ
テアｌ（工Ｓ４遺伝子から構成されるので、これらの自
律的ベクターはこれらのピチアｈ工Ｓ４欠失宿主のゲノ
ムとの相同性がほとんどなく、それ故にしばしば組込み
がおこらないであろう。
よるピチアゲノムからのピチアＭＩ８４遺伝子の欠失は
ｐＢＲ３２２の主要部分が付加されない（ｐＹＭＩ１を
挿入した時には付加きれる；実施側口参照）ということ
に注意されたい。例えばｐｓＡｏ）Ｌ５ （第９図宿
照）のような大部分の自律的なＡＲ８をベースとするヒ
０チア発現ベクターは主にｐＢＲ３２２由来の配列とピ
テアｌ（工Ｓ４遺伝子から構成されるので、これらの自
律的ベクターはこれらのピチアｈ工Ｓ４欠失宿主のゲノ
ムとの相同性がほとんどなく、それ故にしばしば組込み
がおこらないであろう。
アルコールオキシダーゼ遺伝子（ここでばＭ −アルコ
ールオキシダーゼ遺伝子１ＡＯＸ］と呼び、第二アルコ
ールオキシダーゼ遺伝子１ＡＯＸ２と呼ぶ）？欠くビチ
ア菌株は少なくとも２つの理由で興味が持たれる。第一
には、メタノールによる遺伝子発現の調節に関する研究
を助けろために。例えば、実施例■に詳述するような、
ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２遺伝子が欠失した変異株？用い
ることにより、メタノールまたはその他の中間代謝物（
ホルムアルデヒド、ホルメートなど）がメタノール調節
遺伝子の実際の誘発分子であるかどうかについて解明す
ることかでさる。ＡＯＸ欠損ビチア菌株における第二の
興味は、この種の菌株が実施例■および■に詳しく述べ
ろように異種遺伝子産物を高レイルで発現しうるという
可能性にある。
ールオキシダーゼ遺伝子１ＡＯＸ］と呼び、第二アルコ
ールオキシダーゼ遺伝子１ＡＯＸ２と呼ぶ）？欠くビチ
ア菌株は少なくとも２つの理由で興味が持たれる。第一
には、メタノールによる遺伝子発現の調節に関する研究
を助けろために。例えば、実施例■に詳述するような、
ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２遺伝子が欠失した変異株？用い
ることにより、メタノールまたはその他の中間代謝物（
ホルムアルデヒド、ホルメートなど）がメタノール調節
遺伝子の実際の誘発分子であるかどうかについて解明す
ることかでさる。ＡＯＸ欠損ビチア菌株における第二の
興味は、この種の菌株が実施例■および■に詳しく述べ
ろように異種遺伝子産物を高レイルで発現しうるという
可能性にある。
ＡＯ遺伝子全破壊するために、プラスミドｐＹＭＩ７
ｉ作った（第７図参照）。このプラスミドはサツカロミ
セスＡＲＧ４遺伝子を含むグラスミ）’ｐＹＭ２５ （
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０１５；第１７図参照）由来の２．
９ Ｋｂｐ ＢａｍＨニー５ａＱＩ７ラグメントヲｆｌ
ａｍ Ｈ工 切断ｐＰＧ４．０（ＮＲＲＬ Ｂ−１５
８６８；このプラスミドのピチア部分の制限地図につい
ては第１６ａ図参照）に挿入することによって作製した
。この挿入１ＡＯＸ１遺伝子の５′一部分から約６００
ｂｐ （この遺伝子の約′／／４）の欠失をもたらす。
ｉ作った（第７図参照）。このプラスミドはサツカロミ
セスＡＲＧ４遺伝子を含むグラスミ）’ｐＹＭ２５ （
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０１５；第１７図参照）由来の２．
９ Ｋｂｐ ＢａｍＨニー５ａＱＩ７ラグメントヲｆｌ
ａｍ Ｈ工 切断ｐＰＧ４．０（ＮＲＲＬ Ｂ−１５
８６８；このプラスミドのピチア部分の制限地図につい
ては第１６ａ図参照）に挿入することによって作製した
。この挿入１ＡＯＸ１遺伝子の５′一部分から約６００
ｂｐ （この遺伝子の約′／／４）の欠失をもたらす。
プラスミドｐＹＭＩ７はＰｖｕ口およびＥｃｏＲＩで消
化することによジ線状となし、Ａｒｇ 原栄養株につ
いて選択することによジＰＰＦ １ （ａｒｇ ４ｈｉ
ｓ４．ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７ンを形質転換した。形
質転換細胞を再生寒天から抽出し、実施例Ｈに記載のよ
うに超音波処理し、そして０．１％グルコース（２％の
代わり）および４０μ９／！ｌヒスチジ／を含むＳＬ）
培地寒天平板上に塗り付けた。その後得られたコロニー
は次の炭素源：１）炭素源なし；２）０．５％メタノー
ル；および３）２％グルコースを含む１組のＳＤ培地寒
天平板（ヒスチ′）／含有）上でレプリカ培養した。Ａ
ｒｇ コロニーの約８１．０％はメタノール上で通常
増殖できなかった。
化することによジ線状となし、Ａｒｇ 原栄養株につ
いて選択することによジＰＰＦ １ （ａｒｇ ４ｈｉ
ｓ４．ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７ンを形質転換した。形
質転換細胞を再生寒天から抽出し、実施例Ｈに記載のよ
うに超音波処理し、そして０．１％グルコース（２％の
代わり）および４０μ９／！ｌヒスチジ／を含むＳＬ）
培地寒天平板上に塗り付けた。その後得られたコロニー
は次の炭素源：１）炭素源なし；２）０．５％メタノー
ル；および３）２％グルコースを含む１組のＳＤ培地寒
天平板（ヒスチ′）／含有）上でレプリカ培養した。Ａ
ｒｇ コロニーの約８１．０％はメタノール上で通常
増殖できなかった。
これらのメタノール非利用株のうち２つの菌株（すなわ
ちＫＭ７１およびＫＭ７２）からのゲノム１）ＮＡのブ
ザ／プロット分析は、これらの菌株らおいてＡＯＸＩ遺
伝子が破壊されて、第８図の一番下に示すようにベクタ
ーが挿入されたことを示した。
ちＫＭ７１およびＫＭ７２）からのゲノム１）ＮＡのブ
ザ／プロット分析は、これらの菌株らおいてＡＯＸＩ遺
伝子が破壊されて、第８図の一番下に示すようにベクタ
ーが挿入されたことを示した。
遺伝子型＋ （ｈｉｓ４ ａｏｘｌ ：：５ＡＲＧ４）
ｆ有するＰＰＦｌ−ｐＹＭＩ７ アルコールオキシ
ダーゼ欠損構築物は非常に価値があると思われろ。例え
ば、この菌株はｈｉｓ４であるので、ｐｓＡＯＨ５（Ｎ
ＲＲＬＢ−１５８６２；第９図参照）のように選択可能
なマーカーとしてＭＩＳ４遺伝子を含むビチアベクター
は、下記の実施例■に詳述するように、この宿主を形質
転換することができろ。
ｆ有するＰＰＦｌ−ｐＹＭＩ７ アルコールオキシ
ダーゼ欠損構築物は非常に価値があると思われろ。例え
ば、この菌株はｈｉｓ４であるので、ｐｓＡＯＨ５（Ｎ
ＲＲＬＢ−１５８６２；第９図参照）のように選択可能
なマーカーとしてＭＩＳ４遺伝子を含むビチアベクター
は、下記の実施例■に詳述するように、この宿主を形質
転換することができろ。
欠損変異株によるＱａｃＺ遺伝子のメタノール調節発現
本実施例は実施例■に記載されるようにして作ったビチ
ア宿主ＫＭ７．１（ＰＰＰ’ｌ−ｐＹＭＩ７アルコール
オキシダーゼ欠損菌株）によるＱａｃ Ｚ遺伝子の発現
に関する実験を示す。
ア宿主ＫＭ７．１（ＰＰＰ’ｌ−ｐＹＭＩ７アルコール
オキシダーゼ欠損菌株）によるＱａｃ Ｚ遺伝子の発現
に関する実験を示す。
これらの比較実験のためのＡｏｘｌ−宿主はＫＭ７１（
ｈｉｓ４ ａｏｘｌ ：：５ＡＲＧ４ ）であジ、Ａｏ
ｘｌ 宿主はＰＰＦＩ （ａｒｇ４ ｈｉｓ４ ；
ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７）であった。両方の菌株を形
質転換したＡＯＸ１プロモーター４ａｃＺ発現カセット
はプラスミドｐＳＡＯＨ５（第９図参照； ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８６２）に含まれていた。いくつかのＨｌｓ
形質転換細胞を両菌株から単離した。それらのゲノムＤ
ＮＡ１サザ／プロット分祈により試験して、それぞれが
ＡＯＸＩプロモーター位置にｐＳＡＩＪＨ５ｉ組み込ん
だ１組の対抗した菌株′に得ｆＣ，，同様に、ＫＭ７１
および１３）ピチア・パストリス（ＰＰＦ １全プラス
ミドｐＴ７６Ｈ３（第１８図参照、ＮＲＲＬＢ−１８０
００）上のジヒドロキ７アセトンンンターゼ（１）ＡＳ
）プロモーター−ＱａｃＺ遺伝子融合物で形質転換し、
ヒスチジン原栄養株について選択した。
ｈｉｓ４ ａｏｘｌ ：：５ＡＲＧ４ ）であジ、Ａｏ
ｘｌ 宿主はＰＰＦＩ （ａｒｇ４ ｈｉｓ４ ；
ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７）であった。両方の菌株を形
質転換したＡＯＸ１プロモーター４ａｃＺ発現カセット
はプラスミドｐＳＡＯＨ５（第９図参照； ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８６２）に含まれていた。いくつかのＨｌｓ
形質転換細胞を両菌株から単離した。それらのゲノムＤ
ＮＡ１サザ／プロット分祈により試験して、それぞれが
ＡＯＸＩプロモーター位置にｐＳＡＩＪＨ５ｉ組み込ん
だ１組の対抗した菌株′に得ｆＣ，，同様に、ＫＭ７１
および１３）ピチア・パストリス（ＰＰＦ １全プラス
ミドｐＴ７６Ｈ３（第１８図参照、ＮＲＲＬＢ−１８０
００）上のジヒドロキ７アセトンンンターゼ（１）ＡＳ
）プロモーター−ＱａｃＺ遺伝子融合物で形質転換し、
ヒスチジン原栄養株について選択した。
４種の菌株のそれぞれは初めにＳＤ培地（但し２％グル
コースの代わりに唯一の炭素およびエネルギー源として
２％グリセロールを含む）で増殖させた。次に、各培養
物を遠心により集めて、別の培地（すなわち、唯一の炭
素源として０５％メタノールを含むＳＤ培地）に移した
。これらの培養物の試料はβ−ガラクトシダーゼについ
て検定した。その結果粕１に示す。
コースの代わりに唯一の炭素およびエネルギー源として
２％グリセロールを含む）で増殖させた。次に、各培養
物を遠心により集めて、別の培地（すなわち、唯一の炭
素源として０５％メタノールを含むＳＤ培地）に移した
。これらの培養物の試料はβ−ガラクトシダーゼについ
て検定した。その結果粕１に示す。
表 Ｉ
ＱＯＯＯＯ
Ｉ Ｚ−緩衝液
最終濃度
ｍａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２０１６，１９０，０６ＭＮ ａ
Ｈ２ＰＯ４ｓ、５９ ｏ、０４ ＭＫＣ４０，
７５１Ｊ Ｏ，０１ＭＭｇＳＯ４−７Ｈ２００
，２４６９０，００１Ｍ２−メルカプトエタノール
２．７耐 ０．０５Ｍ全量１！！とじてｐＨ７
に調整 ２．０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮ
ＰＧ） 蒸留水１００ｍ／に０ＮＰＧ（ングマＮ−Ｎ−１１２７
）４００を溶解して４７Ｎｉ ／ ｍｅ ＯＮ ＰＧ溶
液全調製する。
Ｈ２ＰＯ４ｓ、５９ ｏ、０４ ＭＫＣ４０，
７５１Ｊ Ｏ，０１ＭＭｇＳＯ４−７Ｈ２００
，２４６９０，００１Ｍ２−メルカプトエタノール
２．７耐 ０．０５Ｍ全量１！！とじてｐＨ７
に調整 ２．０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮ
ＰＧ） 蒸留水１００ｍ／に０ＮＰＧ（ングマＮ−Ｎ−１１２７
）４００を溶解して４７Ｎｉ ／ ｍｅ ＯＮ ＰＧ溶
液全調製する。
Ｂ、検定法：
１ 培地（○Ｄ６ｏｏが２０〜５ｏの酵母細胞）からア
リコートを採取し、遠心し、そして冷滅菌水で細胞沈殿
物金洗う。
リコートを採取し、遠心し、そして冷滅菌水で細胞沈殿
物金洗う。
２５）細胞沈殿物および酸洗浄した０、４５〜０．５０
ｙ＋＋ｍガラスピーズ０．２μ９に４０％Ｚ緩衝液１μ
υを加える。全ての試料を氷の上におく、その混合物を
ポルテックス混合機を最高にセットして１分間ずつ４回
混合する。ポルテックス混合の間少なくとも１分間試料
を氷の上におくべきである。
ｙ＋＋ｍガラスピーズ０．２μ９に４０％Ｚ緩衝液１μ
υを加える。全ての試料を氷の上におく、その混合物を
ポルテックス混合機を最高にセットして１分間ずつ４回
混合する。ポルテックス混合の間少なくとも１分間試料
を氷の上におくべきである。
３、溶菌液？ミクロ遠心管に移し、ミクロ遠心分離機を
用いて４℃で５分遠心する。上清を新しいミクロ遠心管
に移し、その抽出物を氷の上におく。
用いて４℃で５分遠心する。上清を新しいミクロ遠心管
に移し、その抽出物を氷の上におく。
４ 抽出物中に含まれる全夕／ノξり質の濃度はパイオ
ーラッド・ラボラトリーズ（ブラッドフォード）のタフ
バク質検定法を用いて評価した。このためにバイ−ラッ
ド色素試薬濃厚液（Ｂｉｏ −ＲａｄＪＪｙｅ ｌ（ｅ
ａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を４倍容量の脱
イオ／水で希釈し、ワットフッ３ＭＭＰ紙を通して濾過
した。その後、１組の１３Ｘ１００ｍｍガラス試験管（
各試験管は２．５ ｍｌ！の色素試薬を含む）にＺ緩衝
敵１００μρ中の３．１０．３０および１００μ９のつ
／血清アルブミ７（ＢＳＡ）を加えることにより標準濃
度曲線を作成した。試料を混合して室温で５分間保ち、
そして５９５ ｎｍでのそれらの光学密度を測定した。
ーラッド・ラボラトリーズ（ブラッドフォード）のタフ
バク質検定法を用いて評価した。このためにバイ−ラッ
ド色素試薬濃厚液（Ｂｉｏ −ＲａｄＪＪｙｅ ｌ（ｅ
ａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を４倍容量の脱
イオ／水で希釈し、ワットフッ３ＭＭＰ紙を通して濾過
した。その後、１組の１３Ｘ１００ｍｍガラス試験管（
各試験管は２．５ ｍｌ！の色素試薬を含む）にＺ緩衝
敵１００μρ中の３．１０．３０および１００μ９のつ
／血清アルブミ７（ＢＳＡ）を加えることにより標準濃
度曲線を作成した。試料を混合して室温で５分間保ち、
そして５９５ ｎｍでのそれらの光学密度を測定した。
抽出物については、３，１０および３０μＱの試料をＺ
緩衝液含有溶液で１００μＱとなし、上記のようにして
タンパク質含量を検定（また。各抽出物についてのタン
パク質濃度の値１ｔｉＢＳＡ濃度曲線を用いて内挿１．
た。
緩衝液含有溶液で１００μＱとなし、上記のようにして
タンパク質含量を検定（また。各抽出物についてのタン
パク質濃度の値１ｔｉＢＳＡ濃度曲線を用いて内挿１．
た。
５、 β−ガラクトシダーゼ検定については、抽出物の
１０倍希釈液］０μＱを１１１ＬｌのＺ緩衝液に加え、
その混合物を３０℃で５分間インキュベート １７た。
１０倍希釈液］０μＱを１１１ＬｌのＺ緩衝液に加え、
その混合物を３０℃で５分間インキュベート １７た。
６、 ０．２ ｍｌの０ＮＰＧ （４ｒｎｇ／／ＩＩＬ
ｇ） を加えることにより反応を開始させ、ポルテッ
クス混合する。
ｇ） を加えることにより反応を開始させ、ポルテッ
クス混合する。
７、 適当な時点（通常１〜３０分、Ａ４２０＜１）で
１ＭＮａ２ＣＯ３溶液０．５ ｒｎｅを加えることによ
り反応を停止させる。
１ＭＮａ２ＣＯ３溶液０．５ ｒｎｅを加えることによ
り反応を停止させる。
８．４２０ｎｍで上清の吸光度を読み取る。
Ｃ２β−ガラクトシダーゼ活性単位の計算：ＩＵは３０
℃、ｐＨ７において１分画たりに形成されたオルトニト
ロフェノール（ＯＮＰ）が１ｎｍｏ １ ｅ である
ことを衣わす。
℃、ｐＨ７において１分画たりに形成されたオルトニト
ロフェノール（ＯＮＰ）が１ｎｍｏ １ ｅ である
ことを衣わす。
ｌ ｎｍｏｌｅのＯＮＰは１ ｃｍの経路において４２
０ｎｍでの吸光度（Ａ４゜。）が０．００４５ である
。従って、４２０ ｎｍでの吸光度１は２２２ ｎｍｏ
１ｅＯＮ Ｐ／ｍｅを表わ（７、すなわち分析すべき上
清の総容量は１．７ ｒｎｌであるから３７８ｎｍｏｌ
ｅ ＯＮＰ／１，７ｍｌを表わす。それ故、表に示され
る単位は次式により計算される： ４種の培養物のそれぞれはグリセロール増殖期の間には
検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性ヲはとんど示さな
かった。メタノール培地に移行させて約１０〜２０時間
後に、Ａｏｘｌ 宿主内にＡＯＸ １− （ｌａｃ
ＺおよびｎＡｓ−，１ｉａｃＺ発現カセットを含む２種
の培養物は、タンパク質１μｇ当たりβ−ガラクト７ダ
ーゼ活性約２０単位で横ばい状態になるβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を示した。しかしながら、Ａｏｘｌ−宿主内
のＡＯＸ １−１ａｃ Ｚカセットハ約６０単位／μ９
に達する活性を示（７た。
０ｎｍでの吸光度（Ａ４゜。）が０．００４５ である
。従って、４２０ ｎｍでの吸光度１は２２２ ｎｍｏ
１ｅＯＮ Ｐ／ｍｅを表わ（７、すなわち分析すべき上
清の総容量は１．７ ｒｎｌであるから３７８ｎｍｏｌ
ｅ ＯＮＰ／１，７ｍｌを表わす。それ故、表に示され
る単位は次式により計算される： ４種の培養物のそれぞれはグリセロール増殖期の間には
検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性ヲはとんど示さな
かった。メタノール培地に移行させて約１０〜２０時間
後に、Ａｏｘｌ 宿主内にＡＯＸ １− （ｌａｃ
ＺおよびｎＡｓ−，１ｉａｃＺ発現カセットを含む２種
の培養物は、タンパク質１μｇ当たりβ−ガラクト７ダ
ーゼ活性約２０単位で横ばい状態になるβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を示した。しかしながら、Ａｏｘｌ−宿主内
のＡＯＸ １−１ａｃ Ｚカセットハ約６０単位／μ９
に達する活性を示（７た。
ＡＯＸ−宿主内のりＡｓ−、（ａｃＺカセットもβ−ガ
ラクトシダーゼ活性しくルの増加を示（７た。従って形
質転換されたＡｏｘｌ 宿主（ＫＭ７１）は形質転換
された同質遺伝子のＡｏｘｌ 菌株（１３）ピチア・パ
ストリス（ＰＰＦｌ）よりも２〜３倍高い発現し反ルで
β−ガラクトシダーゼを発現（７た。
ラクトシダーゼ活性しくルの増加を示（７た。従って形
質転換されたＡｏｘｌ 宿主（ＫＭ７１）は形質転換
された同質遺伝子のＡｏｘｌ 菌株（１３）ピチア・パ
ストリス（ＰＰＦｌ）よりも２〜３倍高い発現し反ルで
β−ガラクトシダーゼを発現（７た。
部位特異的挿入／欠失の本実施例では、ＡＯＸ１Ｏ伝子
の全コーディング配列が欠失され、Ｂ型肝炎表面抗原（
ＨＢｓＡｇ ）遺伝子がゲノムに残存するＡＯＸＩＯ伝
子プロモーターの制御下に挿入された。
の全コーディング配列が欠失され、Ｂ型肝炎表面抗原（
ＨＢｓＡｇ ）遺伝子がゲノムに残存するＡＯＸＩＯ伝
子プロモーターの制御下に挿入された。
このＰ、ハストリス宿主菌株のために、プラスミドｐＥ
ＳＡＧ工５１が作−製された（イリノイ州ビオーリア、
米国撫業省のノザ／・リージョナル・リサーチ・センタ
ーに寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８０２１と］〜て大腸菌
宿主内に寄託され、この出願から特許が公布される際に
制限なｊ７で一般の人々に利用可能である；第１２図参
照）。このプラスミドはＡＯ入入選遺伝子５′末端の側
面に位置する配列からの１．ＱＫｂｐフラグメント、そ
の後に続くＢ型肝炎表面抗原（Ｒｆ５ｓＡｇ ）配列お
よび３ Ｑ Ｑ ｂｐＡＯＸ１ターミネータ−フラグメ
ントを含み、これら全ては第９，１０および１１図に示
すように構築きれた。発現カセットの後にはビチアＨ工
Ｓ４遺伝子をコードする２５）７Ｋｂｐフラグメントが
存在【７、最後にＡＯＸ １遺伝子の３′側の配列を含
む１．５Ｋｂｐ Ｐｖｕロフラグメントが存在１．てい
た。
ＳＡＧ工５１が作−製された（イリノイ州ビオーリア、
米国撫業省のノザ／・リージョナル・リサーチ・センタ
ーに寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８０２１と］〜て大腸菌
宿主内に寄託され、この出願から特許が公布される際に
制限なｊ７で一般の人々に利用可能である；第１２図参
照）。このプラスミドはＡＯ入入選遺伝子５′末端の側
面に位置する配列からの１．ＱＫｂｐフラグメント、そ
の後に続くＢ型肝炎表面抗原（Ｒｆ５ｓＡｇ ）配列お
よび３ Ｑ Ｑ ｂｐＡＯＸ１ターミネータ−フラグメ
ントを含み、これら全ては第９，１０および１１図に示
すように構築きれた。発現カセットの後にはビチアＨ工
Ｓ４遺伝子をコードする２５）７Ｋｂｐフラグメントが
存在【７、最後にＡＯＸ １遺伝子の３′側の配列を含
む１．５Ｋｂｐ Ｐｖｕロフラグメントが存在１．てい
た。
Ｉ）ＢＳＡＧ工５ 工をＢｇＱｌｌで消化すると、７．
２ Ｋｂｐ線状ベクターが放出され、これは一方の末端
にｏ、８５Ｋｂｐの５’−ＡＯＸｌＯ伝子配列を、そ１
．て他方の末端に１． Ｉ Ｋｂｐの３’−ＡＯＸＩＯ
列を含んでいた。
２ Ｋｂｐ線状ベクターが放出され、これは一方の末端
にｏ、８５Ｋｂｐの５’−ＡＯＸｌＯ伝子配列を、そ１
．て他方の末端に１． Ｉ Ｋｂｐの３’−ＡＯＸＩＯ
列を含んでいた。
Ｂｇｆｌｌｌ切断ｐＢｓＡＧＩ５Ｉを用いて、ヒスチジ
ン原栄養株について選択することによりＧ５１１５を形
質転換（〜、形質転換細胞を再生寒天から抽圧（７て実
施例■のように超音波処理（７、そ［７て０１％グルコ
ース（２０％の代わり）を含むＳＤ培地寒天平板上に塗
り付けた。次いで、生じたコロニーは次の炭素源＝１）
炭素源な（７，２）０５％メタノール、および３）２％
グルコースを言む最少寒天乎＆上でしｉ’）力培養１．
た。試験］７たコＯ＝Ｑ平均３２％が通常メタノール上
で生長できなかった。
ン原栄養株について選択することによりＧ５１１５を形
質転換（〜、形質転換細胞を再生寒天から抽圧（７て実
施例■のように超音波処理（７、そ［７て０１％グルコ
ース（２０％の代わり）を含むＳＤ培地寒天平板上に塗
り付けた。次いで、生じたコロニーは次の炭素源＝１）
炭素源な（７，２）０５％メタノール、および３）２％
グルコースを言む最少寒天乎＆上でしｉ’）力培養１．
た。試験］７たコＯ＝Ｑ平均３２％が通常メタノール上
で生長できなかった。
２つのメタノール非利用株からのゲノムＤＮＡのサザン
プロット分析は、ＡＯｘ１遺伝子が欠失されて、ベクタ
ー配列が第１３図に示すように挿入されたことを立証１
．た。
プロット分析は、ＡＯｘ１遺伝子が欠失されて、ベクタ
ー配列が第１３図に示すように挿入されたことを立証１
．た。
メタノール中で増殖させると、Ｇ５１１５−ｐＢＳＡＧ
工５Ｉ菌株（ａｏｘｌ ： ： ＨＢｓＡｇ−Ｈ工Ｓ４
）は、同様に形質転換ちれた完全なアルコールオキシ
ダーゼ感応細胞よりも高いレベルでＨＢｓＡｇを発現（
。
工５Ｉ菌株（ａｏｘｌ ： ： ＨＢｓＡｇ−Ｈ工Ｓ４
）は、同様に形質転換ちれた完全なアルコールオキシ
ダーゼ感応細胞よりも高いレベルでＨＢｓＡｇを発現（
。
た。
第二アルコールオキシダーゼ遺伝子の存在ハ次の観察か
ら罹定することができる： １） ＡＯＸｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡに由来するプローブと限られたピチアグ
ノムＤＮＡとをハイブリダイズさせるサイ／プロット法
が少なくとも２つのバンドを常に示Ｉまた；２）類似す
るが互いに同一でない２種のピチアグノムＤＮＡフラグ
メントが初めに単離された（第１６図参照）；および３
）第−ＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸＩ）を欠失または破壊し７
たＫＭ７］およびＧ５１１５−ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ のよ
うなピチア変異株がそれでもなおメタノール上で生長す
ることがテき、アルコールオキシダーゼ活性を有１．て
いた。
ら罹定することができる： １） ＡＯＸｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡに由来するプローブと限られたピチアグ
ノムＤＮＡとをハイブリダイズさせるサイ／プロット法
が少なくとも２つのバンドを常に示Ｉまた；２）類似す
るが互いに同一でない２種のピチアグノムＤＮＡフラグ
メントが初めに単離された（第１６図参照）；および３
）第−ＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸＩ）を欠失または破壊し７
たＫＭ７］およびＧ５１１５−ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ のよ
うなピチア変異株がそれでもなおメタノール上で生長す
ることがテき、アルコールオキシダーゼ活性を有１．て
いた。
これらのＡｏｘｌ−株のメタノール生長細胞における生
長速度は同質遺伝子のＡｏｘｌ 株よりもかなり遅か
った。それゆえ、第二ＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ２）は比較
的低いレイルで発現されるか、あるいはその産物のメタ
ノールに対する活性がより少ないと考えられる。実施例
■において、ｐＰＧ４．Ｑ中のピチアＤＮＡフラグメン
トはＡＯＸ１遺伝子を含むことが立証された。
長速度は同質遺伝子のＡｏｘｌ 株よりもかなり遅か
った。それゆえ、第二ＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ２）は比較
的低いレイルで発現されるか、あるいはその産物のメタ
ノールに対する活性がより少ないと考えられる。実施例
■において、ｐＰＧ４．Ｑ中のピチアＤＮＡフラグメン
トはＡＯＸ１遺伝子を含むことが立証された。
ｐ）’Ｇ３．０由来のゲノムＤＮＡ７ラグメントがＡＯ
Ｘ２１を転子の少なくとも一部を含むということを立証
するだめの最も納得のいく方法は、この推定上のＡＯＸ
２遺伝子を破壊または欠失させた変異株を作ることであ
る。その几めに、部位特異的ベクターｐＹＭ１１２ａ
が作製された（第１４図参照）。
Ｘ２１を転子の少なくとも一部を含むということを立証
するだめの最も納得のいく方法は、この推定上のＡＯＸ
２遺伝子を破壊または欠失させた変異株を作ることであ
る。その几めに、部位特異的ベクターｐＹＭ１１２ａ
が作製された（第１４図参照）。
このプラスミドは推定上のＡＯＸ２遺伝子を３．０Ｋｂ
ｐ ＢａｍＨＩフラグメント上に含む１）ＰＯ２，０（
第１６１）図参照）から主に構成される。ピチアＨ工Ｓ
４遺伝子を含む２．７ Ｋｂｐ Ｂｇ氾１１フラグメン
トがｐＹＪ３（第３図； ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８９）
から単離され、そ［７てｐＰＧ３．ＱのＢｇＱ■部位と
一番左のＫｐｎ １部位の間に存在する配列の代わりに
挿入された。（Ｋｐｎ）部位は挿入に先立ってオリゴヌ
クレオチドアダプターによりＢｇＱ＃部位に変換され；
そして）ＬＩＳ４遺伝子のＢａｍ ）Ｉ Ｉ部位はｐＰ
Ｇ３．０に挿入する前に”修復”することにより破壊さ
れた。）ＡＯＸ１遺伝子と盾定上のＡＯＸ２遺伝子の比
較（第１６図参照）は、この作製がＡＯＸ２の中央部か
ら約８００ ｂｐを欠失δせることを示Ｉ７ている。
ｐ ＢａｍＨＩフラグメント上に含む１）ＰＯ２，０（
第１６１）図参照）から主に構成される。ピチアＨ工Ｓ
４遺伝子を含む２．７ Ｋｂｐ Ｂｇ氾１１フラグメン
トがｐＹＪ３（第３図； ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８９）
から単離され、そ［７てｐＰＧ３．ＱのＢｇＱ■部位と
一番左のＫｐｎ １部位の間に存在する配列の代わりに
挿入された。（Ｋｐｎ）部位は挿入に先立ってオリゴヌ
クレオチドアダプターによりＢｇＱ＃部位に変換され；
そして）ＬＩＳ４遺伝子のＢａｍ ）Ｉ Ｉ部位はｐＰ
Ｇ３．０に挿入する前に”修復”することにより破壊さ
れた。）ＡＯＸ１遺伝子と盾定上のＡＯＸ２遺伝子の比
較（第１６図参照）は、この作製がＡＯＸ２の中央部か
ら約８００ ｂｐを欠失δせることを示Ｉ７ている。
ｐＹＭＩ１２ａ をＢａｍＨ工で消化することにより、
そレソレ１． Ｉ Ｋｂｐ ト０．７ Ｋｂｐ ノ推定
上ノＡＯＸ２位置からの配列によってばざｌれたＨ工Ｓ
４遺伝子フラグメントを営む４．５Ｋｂｐ線状ベクター
が得られた。
そレソレ１． Ｉ Ｋｂｐ ト０．７ Ｋｂｐ ノ推定
上ノＡＯＸ２位置からの配列によってばざｌれたＨ工Ｓ
４遺伝子フラグメントを営む４．５Ｋｂｐ線状ベクター
が得られた。
この線状ベクターによりＡｏｘｌ−株、ＫＭ７１（ａｏ
ｘｌ ｈｉｓ４ ：： ５ＡＲＧ４ ） を形質転快し
、ヒスチジン原栄養株について選択することにより形質
転換細胞を単離（７た。その後形質転換細胞は数組の寒
天平板上でレプリカ培養することにより、メタノール利
用能力についてスクリーニング（また。
ｘｌ ｈｉｓ４ ：： ５ＡＲＧ４ ） を形質転快し
、ヒスチジン原栄養株について選択することにより形質
転換細胞を単離（７た。その後形質転換細胞は数組の寒
天平板上でレプリカ培養することにより、メタノール利
用能力についてスクリーニング（また。
非形質転換Ａｏｘ１−株ＫＭ７１Ｆｉメタノール平板上
で非常にゆっくり生長するので、たとえ寒天中にメタノ
ールが含まれたと［７ても有意な生長が観察される前に
それは蒸発（７てしまった。この問題は蒸気相中の細胞
にメタノールを供給することにより解決された。この方
法のために、１００％メタノール約０．２ ｒｔｔｌが
基天培地中に炭素源を含まないプレートのふたの下に加
えられた。このプレート全室温に放置ｊ７、そＩ２てふ
たを新１．いメタノール含有ふたと２〜４日おきに取り
かえた。約１〜２週間後に、野生型（Ａｏｘｌ Ａｏ
ｘ２ ）、および変異株（Ａｏｘｌ −Ａｏｘ２ ）
と（Ａｏｘｌ Ａｏｘ２）のメタノール生長における
差異がはっきり１．た。
で非常にゆっくり生長するので、たとえ寒天中にメタノ
ールが含まれたと［７ても有意な生長が観察される前に
それは蒸発（７てしまった。この問題は蒸気相中の細胞
にメタノールを供給することにより解決された。この方
法のために、１００％メタノール約０．２ ｒｔｔｌが
基天培地中に炭素源を含まないプレートのふたの下に加
えられた。このプレート全室温に放置ｊ７、そＩ２てふ
たを新１．いメタノール含有ふたと２〜４日おきに取り
かえた。約１〜２週間後に、野生型（Ａｏｘｌ Ａｏ
ｘ２ ）、および変異株（Ａｏｘｌ −Ａｏｘ２ ）
と（Ａｏｘｌ Ａｏｘ２）のメタノール生長における
差異がはっきり１．た。
蒸気相供給法に従って、Ａｏｘｌ−株からのＨｌｓ”形
質転換細胞の約０１％がメタノール上で生育できなかっ
た。８個のＡｏｘｌ”−Ａｏｘ２− Ｈ１ｓ＋形質転換
細胞からのＤｎ八をブザ／フィルターハイブリダイゼー
ション法により分子ｒ＋、た。これらのＤＮＡのうち３
個は第１５図のように挿入された線状ｐＹＭ１１２ａ
を含んでいた。Ａｏｘｌ″″Ａｏｘ２−二重変異株、Ｋ
Ｍ７１２１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１９）を用いた分桁
ば、この菌株がメタノール上で全く生育できず、また検
出可能なＡＯＸ活性をもたないことを示ｉ＆。ＫＭ７１
２１ に関するこれらの結果から、ｐｐｅ３．ｏ中のピ
チアフラグメントが第二ＡＯＸ遺伝子由来の配列を含み
、これらの２種のアルニールオキシタ゛−ゼ以外の他の
メタノール酸化活性がＰ、パストリスに存在（、ないこ
とは明らかである。
質転換細胞の約０１％がメタノール上で生育できなかっ
た。８個のＡｏｘｌ”−Ａｏｘ２− Ｈ１ｓ＋形質転換
細胞からのＤｎ八をブザ／フィルターハイブリダイゼー
ション法により分子ｒ＋、た。これらのＤＮＡのうち３
個は第１５図のように挿入された線状ｐＹＭ１１２ａ
を含んでいた。Ａｏｘｌ″″Ａｏｘ２−二重変異株、Ｋ
Ｍ７１２１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１９）を用いた分桁
ば、この菌株がメタノール上で全く生育できず、また検
出可能なＡＯＸ活性をもたないことを示ｉ＆。ＫＭ７１
２１ に関するこれらの結果から、ｐｐｅ３．ｏ中のピ
チアフラグメントが第二ＡＯＸ遺伝子由来の配列を含み
、これらの２種のアルニールオキシタ゛−ゼ以外の他の
メタノール酸化活性がＰ、パストリスに存在（、ないこ
とは明らかである。
第１図はプラスミドｐＹＭ１１ の制限地図であり；
第２図はプラスミドｐＹＭＩ１の一部をピチア染色体の
ＭＩ８４位八へ挿へすることを示１２；第３図はプラス
ミドｐＹＪ８の制限地図でろり；第４図はブラスミ）’
ｐＹＭＩ３ａの制限地図であり； 第５図はプラスミドｐＹＭＩ３ａの一部をピチア染色体
のＭ工Ｓ４位置へ押入することを示１２；第６図はプラ
ス６）’ｐＢＰＧ１−１の制限地図であり； 第７図はプラスミドｐＹＭＩ７の制限地図であり；第８
図はプラス６）’ｐＹＭＩ７の一部をピチア染色体のア
ルコールオキシダーゼ位置へ挿入することを示Ｅ７； 第９図はプラスミドｐｓＡｏ）１５およびｐＴＨＢｓ
３からのプラスミドｐＹＭ３９の作製を示し；第１０図
はプラスミドｐＹＭ３９およびｐＰＧ３．２からのプラ
スミドｐＹＭＩ５の作製ヲ示１．；第１１図はプラスミ
ドｐＹＭＩ６およびｐＢｓＡＧｓ工からのプラス６）’
ｐＢｓＡＧＩ５Ｈの作製を示し；第１２図は第１１図よ
りも詳細なプラスミドｐＢＳＡＧＩ５工を示す制限地図
であシ；第１３図はプラスミドｐＢｓＡＧＩ５Ｉの一部
をビチア染色体のアルコールオキシダ−ゼ位置へ挿入す
ることを示ｊ７； 第１４図はプラス６）’ｐＹＭＩ１２ａ の制限地図で
あり； 第１５図はプラスミドｐＹＭ１１２ａ の一部ヲ第ニピ
チアアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２）の位置
へ挿入することを示１．； 第１６図はｐＢＲ３２２を（−スとするプラスミド’ｐ
ＰＧ４．０およびｐＰＧ３．Ｑ中のビチア挿入物の制限
地図である。第１６ａ図に示す挿入物は第一ピチアアル
コールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ）の位置からのも
のであり、第１６ｂ図に示す挿入物は第二ピチアアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２）の位ｆｔからのも
のである。第１６ｅ図はＡＯＸ １遺伝子位置（第１６
ａ図と関連）の既知アルコールオキソダーゼ（ＡＯＸ）
コーディング部分を示す； 第１７図はプラスミドｐＹＭ２５の制限地図であり；
そして、 第１８図はブラスミ）’ｐＴ７６Ｈ３の制限地図である
。 （外５名） ＦＩＧ、 １ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ５ ＦＩＧ、 ６ ＦＩＧ、 ９ ＦＩＧ、 １０ ３’−ＡＯＸＩ ＦＩＧ、Ｉ３ ａ ＦＩＧ、 １４ ＦＩＧ、 １５ ＦＩＧ、１７
第２図はプラスミドｐＹＭＩ１の一部をピチア染色体の
ＭＩ８４位八へ挿へすることを示１２；第３図はプラス
ミドｐＹＪ８の制限地図でろり；第４図はブラスミ）’
ｐＹＭＩ３ａの制限地図であり； 第５図はプラスミドｐＹＭＩ３ａの一部をピチア染色体
のＭ工Ｓ４位置へ押入することを示１２；第６図はプラ
ス６）’ｐＢＰＧ１−１の制限地図であり； 第７図はプラスミドｐＹＭＩ７の制限地図であり；第８
図はプラス６）’ｐＹＭＩ７の一部をピチア染色体のア
ルコールオキシダーゼ位置へ挿入することを示Ｅ７； 第９図はプラスミドｐｓＡｏ）１５およびｐＴＨＢｓ
３からのプラスミドｐＹＭ３９の作製を示し；第１０図
はプラスミドｐＹＭ３９およびｐＰＧ３．２からのプラ
スミドｐＹＭＩ５の作製ヲ示１．；第１１図はプラスミ
ドｐＹＭＩ６およびｐＢｓＡＧｓ工からのプラス６）’
ｐＢｓＡＧＩ５Ｈの作製を示し；第１２図は第１１図よ
りも詳細なプラスミドｐＢＳＡＧＩ５工を示す制限地図
であシ；第１３図はプラスミドｐＢｓＡＧＩ５Ｉの一部
をビチア染色体のアルコールオキシダ−ゼ位置へ挿入す
ることを示ｊ７； 第１４図はプラス６）’ｐＹＭＩ１２ａ の制限地図で
あり； 第１５図はプラスミドｐＹＭ１１２ａ の一部ヲ第ニピ
チアアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２）の位置
へ挿入することを示１．； 第１６図はｐＢＲ３２２を（−スとするプラスミド’ｐ
ＰＧ４．０およびｐＰＧ３．Ｑ中のビチア挿入物の制限
地図である。第１６ａ図に示す挿入物は第一ピチアアル
コールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ）の位置からのも
のであり、第１６ｂ図に示す挿入物は第二ピチアアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２）の位ｆｔからのも
のである。第１６ｅ図はＡＯＸ １遺伝子位置（第１６
ａ図と関連）の既知アルコールオキソダーゼ（ＡＯＸ）
コーディング部分を示す； 第１７図はプラスミドｐＹＭ２５の制限地図であり；
そして、 第１８図はブラスミ）’ｐＴ７６Ｈ３の制限地図である
。 （外５名） ＦＩＧ、 １ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ５ ＦＩＧ、 ６ ＦＩＧ、 ９ ＦＩＧ、 １０ ３’−ＡＯＸＩ ＦＩＧ、Ｉ３ ａ ＦＩＧ、 １４ ＦＩＧ、 １５ ＦＩＧ、１７
Claims (29)
- （１）予め定められたゲノム部位でのピチア属酵母の部
位選択的ゲノム修飾法であつて、 第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント、 選択可能なマーカー遺伝子、および 第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント； を含む直列に配置された線状ＤＮＡフラグメントにより
ピチア属の宿主菌株を形質転換することから成り、その
際上記の第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トはそれぞれ長さが少なくとも約２００ヌクレオチドで
あり且つゲノム修飾がおこる天然ピチアゲノム部位の分
離された各部分と相同なヌクレオチド配列を有し；また
第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントはそれ
らがピチアゲノム内で方向づけられていたように線状Ｄ
ＮＡフラグメント内で互いに対して方向づけられ；そし
て上記のマーカー遺伝子は第一の挿入可能なＤＮＡフラ
グメントと第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に
位置づけられることを特徴とするゲノム修飾法。 - （２）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
はそれぞれ、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ジヒドロ
キシアセトンシンターゼ遺伝子、アルギニノコハク酸リ
アーゼ遺伝子またはヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺
伝子の約２００〜５０００塩基対の長さを有するフラグ
メントである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
は第１図に示す制限地図により特徴づけられる、特許請
求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - （４）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
は第４図に示す制限地図により特徴づけられる、特許請
求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - （５）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
は第７図に示す制限地図により特徴づけられる、特許請
求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - （６）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
は第１２図に示す制限地図により特徴づけられる、特許
請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - （７）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
は第１４図に示す制限地図により特徴づけられる、特許
請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - （８）線状ＤＮＡフラグメントは異種遺伝子をさらに含
み、その際異種遺伝子は選択可能なマーカー遺伝子と同
様に第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントと第二の挿入
可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づけられる、特許
請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載の方法。 - （９）線状ＤＮＡフラグメントは調節領域をさらに含み
、その際上記の異種遺伝子はその調節領域の制御下にあ
り、そして選択可能なマーカー遺伝子に加えて調節領域
−異種遺伝子構築物も第一の挿入可能なＤＮＡフラグメ
ントと第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に位置
づけられる、特許請求の範囲第８項記載の方法。 - （１０）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ；ＧＳ１１５−ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ）の本質的に
純粋な培養物。 - （１１）ピチア・パストリス（ＧＳ１９０−ｐＹＭＩ１
）の本質的に純粋な培養物。 - （１２）ピチア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１８０１８
（ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０−ｐＹＭＩ３ａ ＫＭ３１
）の本質的に純粋な培養物。 - （１３）ピチア・パストリス（ＰＰＦ１−ｐＹＭＩ７；
ＫＭ７１）の本質的に純粋な培養物。 - （１４）ピチア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１８０１９
（ＰＰＦ１−ｐＹＭＩ７−ｐＹＭＩ１２ａ；ＫＭ７１２
１）の本質的に純粋な培養物。 - （１５）第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント、選択可
能なマーカー遺伝子および第二の挿入可能なＤＮＡフラ
グメントを含む直列に配置された線状ＤＮＡフラグメン
トであつて、 上記の第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント
はそれぞれ長さが少なくとも約２００ヌクレオチドであ
り且つピチア属の菌種のゲノムＤＮＡの各部分と相同な
ヌクレオチド配列を有し；また第一および第二の挿入可
能なＤＮＡフラグメントはそれらがピチアゲノム内で方
向づけられていたように該線状ＤＮＡフラグメント内で
互いに対して方向づけられ；そして上記のマーカー遺伝
子は第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントと第二の挿入
可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づけられることを
特徴とする線状ＤＮＡフラグメント。 - （１６）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トはそれぞれ、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ジヒド
ロキシアセトンシンターゼ遺伝子、アルギニノコハク酸
リアーゼ遺伝子またはヒスチジノールデヒドロゲナーゼ
遺伝子の約２００〜５０００塩基対の長さを有するフラ
グメントである、特許請求の範囲第１５項記載の線状Ｄ
ＮＡフラグメント。 - （１７）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トは第１図に示す制限地図により特徴づけらる、特許請
求の範囲第１６項記載の線状ＤＮＡフラグメント。 - （１８）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トは第４図に示す制限地図により特徴づけられる、特許
請求の範囲第１６項記載の線状ＤＮＡフラグメント。 - （１９）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トは第７図に示す制限地図により特徴づけられる、特許
請求の範囲第１６項記載の線状ＤＮＡフラグメント。 - （２０）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トは第１２図に示す制限地図により特徴づけられる、特
許請求の範囲第１６項記載の線状ＤＮＡフラグメント。 - （２１）第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン
トは第１４図に示す制限地図により特徴づけられる、特
許請求の範囲第１６項記載の線状ＤＮＡフラグメント。 - （２２）線状ＤＮＡフラグメントはさらに異種遺伝子を
含み、その際異種遺伝子は選択可能なマーカ一遺伝子と
同様に第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントと第二の挿
入可能なＤＮＡフラグメントの間に位置づけられる、特
許請求の範囲第１５〜２１項のいずれか１つに記載の線
状ＤＮＡフラグメント。 - （２３）線状ＤＮＡフラグメントはさらに調節領域を含
み、その際上記の異種遺伝子はその調節領域の制御下に
あり、そして選択可能なマーカー遺伝子に加えて調節領
域−異種遺伝子構築物も第一の挿入可能なＤＮＡフラグ
メントと第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの間に位
置づけられる、特許請求の範囲第２２項記載の線状ＤＮ
Ａフラグメント。 - （２４）線状ＤＮＡフラグメントはさらに細菌のプラス
ミドＤＮＡを含む、特許請求の範囲第１５〜２３項のい
ずれか１つに記載の線状ＤＮＡフラグメント。 - （２５）特許請求の範囲第１５〜２３項のいずれか１つ
に記載の線状ＤＮＡフラグメント、および第一の挿入可
能なＤＮＡフラグメントと第二の挿入可能なＤＮＡフラ
グメントの間に位置づけられた細菌プラスミドＤＮＡを
含む閉環状プラスミド。 - （２６）強力な天然プロモーター−異種ＤＮＡポリペプ
チドコーディング配列の発現カセットにより形質転換さ
れた宿主酵母菌株を、栄養摂取制限条件下に該強力天然
プロモーターを誘発する基質上で培養することから成る
ポリペプチドの生産方法。 - （２７）栄養摂取制限条件は該基質上での非制限増殖に
必要な遺伝子産物が欠損した酵母を宿主酵母菌株として
使用することにより与えられる、特許請求の範囲第２６
項記載の方法。 - （２８）ピチア・パストリスまたはその変異株のＡＯＸ
＿２遺伝子をコードする実質的に純粋なＤＮＡフラグメ
ントまたはその機能的均等物。 - （２９）ＡＯＸ＿２遺伝子は第１６ｂ図に示す制限地図
を有する、特許請求の範囲第２８項記載のＤＮＡフラグ
メント。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/791,013 US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1985-10-25 | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US791013 | 1985-10-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62104585A true JPS62104585A (ja) | 1987-05-15 |
| JP2614215B2 JP2614215B2 (ja) | 1997-05-28 |
Family
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