JPS603836B2 - 酵素の活性測定法 - Google Patents
酵素の活性測定法Info
- Publication number
- JPS603836B2 JPS603836B2 JP56022252A JP2225281A JPS603836B2 JP S603836 B2 JPS603836 B2 JP S603836B2 JP 56022252 A JP56022252 A JP 56022252A JP 2225281 A JP2225281 A JP 2225281A JP S603836 B2 JPS603836 B2 JP S603836B2
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- formulas
- tables
- enzyme activity
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- enzyme
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素の活性測定法に関する。
本発明の酵素の活性測定法は、一般式（１）（式中、Ｘ
はＨＯ−または（Ｒ，、Ｒ２は水素またはＣ，〜Ｃ５の
アルキル基もしくは日○（ＣＨ２）ｎ一、ｎは１〜４の
整数）であり、ＹはＱ−ＮＨ−１−アミノ酸、またはア
ルコール残基である）を有する化合物を基質として用い
、酵素の作用によって基質より遊離する、一般式（０）
（式中、 Ｘは上記と同じである）を有する安息香酸誘導体を、酸
化剤の存在下において４−アミノアンチピリンまたはそ
の議導体と結合させ、生成するキノンィミン色素の濃度
を比色定量することを特徴とするものである。
はＨＯ−または（Ｒ，、Ｒ２は水素またはＣ，〜Ｃ５の
アルキル基もしくは日○（ＣＨ２）ｎ一、ｎは１〜４の
整数）であり、ＹはＱ−ＮＨ−１−アミノ酸、またはア
ルコール残基である）を有する化合物を基質として用い
、酵素の作用によって基質より遊離する、一般式（０）
（式中、 Ｘは上記と同じである）を有する安息香酸誘導体を、酸
化剤の存在下において４−アミノアンチピリンまたはそ
の議導体と結合させ、生成するキノンィミン色素の濃度
を比色定量することを特徴とするものである。
近年、臨床検査分野において血清などの生体体液中の酵
素活性の測定は、疾病診断の手段として重要視されてい
るが、従来の、酵素特にアシラーゼ、ヱステラーゼの活
性を測定する方法は、いずれも検査手法が複雑であり、
精度も低く実用上満足すべきものではなかった。
素活性の測定は、疾病診断の手段として重要視されてい
るが、従来の、酵素特にアシラーゼ、ヱステラーゼの活
性を測定する方法は、いずれも検査手法が複雑であり、
精度も低く実用上満足すべきものではなかった。
本発明者らは酵素、特にアシラーゼ、ェステラーゼの簡
易にして高精度の検査法を開発すべく種々研究の結果、
一般式を 有する基質を用い、酵素作用により を遊離させれば、これを酸 化剤の存在下で、４−アミノアンチピリンと結合させる
ことによってキノンイミン色素に変換させ、生成した色
素を比色定量することによって、容易に酵素活性を測定
し得ることを知り、本発明を完成した。
易にして高精度の検査法を開発すべく種々研究の結果、
一般式を 有する基質を用い、酵素作用により を遊離させれば、これを酸 化剤の存在下で、４−アミノアンチピリンと結合させる
ことによってキノンイミン色素に変換させ、生成した色
素を比色定量することによって、容易に酵素活性を測定
し得ることを知り、本発明を完成した。
本発明において用いられる基質は、
とＹに相当するアミノ酸ま
たはアルコールとを常法により、それぞれアシル化また
はェステル化すれば容易に得られる。
はェステル化すれば容易に得られる。
本発明において基質の１例として用いられるｐ−ジメチ
ルアミノベンゾイルコリンおよびｐージメチルアミ／馬
尿酸の製造例を下記に示す。‘１）ｐージメチルアミノ
ベンゾィルコリンの製造：ｐ−ジメチルアミノ安息香酸
２０夕と塩化チオニル１５０夕を混合して６０ｑ０で６
時間加熱し、未反応の塩化チオニルを減圧下で除去し、
ェーブルー石油エーテルによって再結晶し、ｐージメチ
ルアミノベンゾィルクロラィドを得た。
ルアミノベンゾイルコリンおよびｐージメチルアミ／馬
尿酸の製造例を下記に示す。‘１）ｐージメチルアミノ
ベンゾィルコリンの製造：ｐ−ジメチルアミノ安息香酸
２０夕と塩化チオニル１５０夕を混合して６０ｑ０で６
時間加熱し、未反応の塩化チオニルを減圧下で除去し、
ェーブルー石油エーテルによって再結晶し、ｐージメチ
ルアミノベンゾィルクロラィドを得た。
ｐージメチルアミノベンゾイルクロライド１０のｍｏｌ
と塩化コリンｌｏｗｍｏｌを混合し、１２０℃において
６時間加熱還流した。反応液を室温にまで冷却し、淡黄
色の沈殿をエーテルおよびｎーヘキサンで洗浄し、シリ
カゲルクロマトグラフィーによって分離精製し、ｐ−ジ
メチルアミノベンゾィルコリンを得た。‘２１ ｐ−ジ
メチルアミノ馬尿酸の製造：ｐ−ジメチルァミ／安息香
酸ｌ０ｗｍｏｌとグリシンヱチルヱステルｌｏｗｍｏｌ
をクロロホルム１００の‘に懸濁し、これにジェチルア
ミノプロピルカルボジィミドｌｏｗｍｏｌを加え、３時
間かきまぜを行ない、この反応液を水および０．１ＮＨ
ＣＩで十分に洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥
した後、クロロホルムを減圧下で留去し、残澄をメタノ
ール２０の‘に溶解し、これに０．１ＮＮａＯＨ２０の
‘を加え、室温で１時間かきまぜた後、ｐＨを４．７に
調整し、水分を減圧下で除去した。
と塩化コリンｌｏｗｍｏｌを混合し、１２０℃において
６時間加熱還流した。反応液を室温にまで冷却し、淡黄
色の沈殿をエーテルおよびｎーヘキサンで洗浄し、シリ
カゲルクロマトグラフィーによって分離精製し、ｐ−ジ
メチルアミノベンゾィルコリンを得た。‘２１ ｐ−ジ
メチルアミノ馬尿酸の製造：ｐ−ジメチルァミ／安息香
酸ｌ０ｗｍｏｌとグリシンヱチルヱステルｌｏｗｍｏｌ
をクロロホルム１００の‘に懸濁し、これにジェチルア
ミノプロピルカルボジィミドｌｏｗｍｏｌを加え、３時
間かきまぜを行ない、この反応液を水および０．１ＮＨ
ＣＩで十分に洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥
した後、クロロホルムを減圧下で留去し、残澄をメタノ
ール２０の‘に溶解し、これに０．１ＮＮａＯＨ２０の
‘を加え、室温で１時間かきまぜた後、ｐＨを４．７に
調整し、水分を減圧下で除去した。
残簿をシリカゲルクロマトグラフィーによって分離精製
し、ｐ−ジメチルァミ／馬尿酸を得た。‘３１ ｏ−、
ｍ一、ｐーヒドロキシ馬尿酸の製造：上記【２｝‘こお
いて用いたｐージメチルアミノ安息香酸の代りに、ｏ−
、ｍ−、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を用いることにより、
上記と類似の手順によってｏ一、ｍＨ、ｐーヒドロキシ
馬尿酸を製造することができる。
し、ｐ−ジメチルァミ／馬尿酸を得た。‘３１ ｏ−、
ｍ一、ｐーヒドロキシ馬尿酸の製造：上記【２｝‘こお
いて用いたｐージメチルアミノ安息香酸の代りに、ｏ−
、ｍ−、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を用いることにより、
上記と類似の手順によってｏ一、ｍＨ、ｐーヒドロキシ
馬尿酸を製造することができる。
本発明に用いられる酸化剤としてはクロラミンＴ、クロ
ラミンＢ、フェリシアン化カリウム、過ヨウ素酸、過ヨ
ウ素酸塩などが適当であるが、特に過ヨウ素酸およびそ
の塩類が実用上好ましい。
ラミンＢ、フェリシアン化カリウム、過ヨウ素酸、過ヨ
ウ素酸塩などが適当であるが、特に過ヨウ素酸およびそ
の塩類が実用上好ましい。
次に本発明の測定手法を下記の実施例によって説明する
。ｐージメチルアミノベンゾイルコリン を基質として用い、血清中のコリンェステラーゼの活性
を測定する具体例を下記に示す。
。ｐージメチルアミノベンゾイルコリン を基質として用い、血清中のコリンェステラーゼの活性
を測定する具体例を下記に示す。
ｐージメチルアミノベンゾイルコリン５のＭ、４ーアミ
ノアンチピリン２．５ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭを
含有する基質溶液（Ａ液、ｐＨ７．５）１の‘に対して
、血清０．０２叫を加え、３７０に加温した。
ノアンチピリン２．５ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭを
含有する基質溶液（Ａ液、ｐＨ７．５）１の‘に対して
、血清０．０２叫を加え、３７０に加温した。
１０分後、上記反応液に、反応停止液（Ｂ液、メタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム１７ｍＭ、ネオスチグミン７のＭ）１
枕を加え、３７０に２分間加溢し、波長５５仇肌の光で
吸光度を測定した。
ウ素酸ナトリウム１７ｍＭ、ネオスチグミン７のＭ）１
枕を加え、３７０に２分間加溢し、波長５５仇肌の光で
吸光度を測定した。
この吸光度をＣとする。ブランクテストとして、上記Ａ
液１の‘にＢ液１の‘を加えた後に、血清０．０２の‘
を加え、波長５５仇のの光で吸光度を測定した。
液１の‘にＢ液１の‘を加えた後に、血清０．０２の‘
を加え、波長５５仇のの光で吸光度を測定した。
この吸光度をＤとする。血清中のコリンェステラーゼの
活性単位Ｕは、下記式によって求めた。
活性単位Ｕは、下記式によって求めた。
Ｕ＝麦毒×毒×毒…髭Ｘ１ｏｏｏ
同一の血清を用い３の重美験を繰返して、求めた活性単
位Ｕと変動係数ＣＶは次の通りであった。
位Ｕと変動係数ＣＶは次の通りであった。
Ｕ；２土０．０１（Ａｍｏｌ／ｗＺ／ｍｉｎ）ＣＶ＝０
．５％次にｐ−ジメチルアミノ馬尿酸 を基質として用い、ヒプリカーゼの活性を測定する具体
例を下記に示す。
．５％次にｐ−ジメチルアミノ馬尿酸 を基質として用い、ヒプリカーゼの活性を測定する具体
例を下記に示す。
ｐ−ジメチルアミノ馬尿酸１５ｍＭ、４ーアミノアンチ
ピリン２．５ｍＭを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２の‘に対してヒプリカーゼを含有する液体
１００ムクを加え、３７０において１０分間、反応せし
め、この反応液に、反応停止液（メタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム２０ＭＭ、２−メルカプトェタノール５ｍＭ）１の
‘を加え、３７０に２分間加溢した後、波長５５仇仇の
光で吸光度を測定した。
ピリン２．５ｍＭを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２の‘に対してヒプリカーゼを含有する液体
１００ムクを加え、３７０において１０分間、反応せし
め、この反応液に、反応停止液（メタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム２０ＭＭ、２−メルカプトェタノール５ｍＭ）１の
‘を加え、３７０に２分間加溢した後、波長５５仇仇の
光で吸光度を測定した。
その吸光度をＡとする。ブランクテストとして上記リン
酸緩衝液２の‘に、反応停止液１の‘を加え、これに上
記ヒプリカーゼ含有液体１００仏そを加えて、３７℃に
２分間放置した後、上記同様、５５仇仇の光で吸光度を
測定した。
酸緩衝液２の‘に、反応停止液１の‘を加え、これに上
記ヒプリカーゼ含有液体１００仏そを加えて、３７℃に
２分間放置した後、上記同様、５５仇仇の光で吸光度を
測定した。
その吸光度をＢとする。ヒプリカーゼの活性単位Ｕは下
記式によって求めた。
記式によって求めた。
Ｕ＝２参考Ｘ旨…章×三。
Ｘｍｏｏ同一のヒプリカーゼ含有液体を用い、３０回実
験を繰返して、求めた活性単位Ｕと変動係数ＣＶは次の
通りであった。
験を繰返して、求めた活性単位Ｕと変動係数ＣＶは次の
通りであった。
Ｕニ２．５±０．０６（山ｍ○１／の【／ｍｉｎ）ＣＶ
＝２．４％さらにｐ−ヒドロキシ馬尿酸 〈肌〈〇ン側肌肌日憾質 として用い、ヒプリカーゼの活性を測定する具体例を下
記に示す。
＝２．４％さらにｐ−ヒドロキシ馬尿酸 〈肌〈〇ン側肌肌日憾質 として用い、ヒプリカーゼの活性を測定する具体例を下
記に示す。
ｐ−ヒドロキシ馬尿酸１２机Ｍ、４ーアミノアンチピリ
ン２肌Ｍを含有する、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２の【に対してヒプリカーゼを含有する液体１００
の‘を加え、３７つ０において１０分間反応せしめ、こ
の反応液に、反応停止液（メタ過ヨウ素酸ナトリウム２
０のＭ、２一メルカプトエタノール５ｍＭ）１の‘を加
え３７℃に２分間加熱した後、波長５０軌のの光で吸光
度を測定した。
ン２肌Ｍを含有する、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２の【に対してヒプリカーゼを含有する液体１００
の‘を加え、３７つ０において１０分間反応せしめ、こ
の反応液に、反応停止液（メタ過ヨウ素酸ナトリウム２
０のＭ、２一メルカプトエタノール５ｍＭ）１の‘を加
え３７℃に２分間加熱した後、波長５０軌のの光で吸光
度を測定した。
その吸光度をＡとする。ブランクテストとして、上記リ
ン酸緩衝液２の‘に、反応停止液１の‘を加え、これに
上記ヒプリカーゼ含有液体１００Ａ夕を加えて、３７℃
に２分間放置した後、波長５０則机の光で吸光度を測定
した。
ン酸緩衝液２の‘に、反応停止液１の‘を加え、これに
上記ヒプリカーゼ含有液体１００Ａ夕を加えて、３７℃
に２分間放置した後、波長５０則机の光で吸光度を測定
した。
その吸光度をＢとする。ヒプリカーゼの活性単位Ｕは、
下記式によって求めた。
下記式によって求めた。
Ｕ＝声煮×旨…三×三。Ｘｍｏｏ同一のヒプリカーゼ含
有液体を用い、３０回実験を繰返して求めた活性単位Ｕ
と変動係数ＣＶは次の通りであった。
有液体を用い、３０回実験を繰返して求めた活性単位Ｕ
と変動係数ＣＶは次の通りであった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の一般式（I）を有する化合物を基質として用
い、酵素の作用によって基質より遊離する。 下記一般式（II）の安息香酸誘導体を酸化剤の存在下に
おいて、４−アミノアンチピリンまたはその誘導体と結
合させ、生成するキノンイミン色素を比色定量すること
を特徴とする酵素の活性測定法。▲数式、化学式、表等
があります▼ 上記式（I）および（II）において、ＸはＨＯ−また
は▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒ＿１、Ｒ＿２
は水素またはＣ＿１〜 Ｃ＿５のアルキル基もしくはＨＯ（ＣＨ＿２）＿ｎ−、
ｎは１〜４の整数）であり、Ｙはα−ＮＨ−１−アミノ
酸またはアルコール残基を示す。 ２ 上記一般式（I） ▲数式、化学式、表等があります▼ を有す る化合物が、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは ＨＯ−、ＮＨ＿２−、（ＣＨ＿３）＿２Ｎ−、（Ｃ＿２
Ｈ＿５）＿２Ｎ−または▲数式、化学式、表等がありま
す▼であり、Ｙは−ＮＨ− ＣＨ＿２−ＣＯＯＨ、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｚは −Ｈ、−ＣＨ＿３または−ＣＨ＿２−ＣＨ＿３）、▲数
式、化学式、表等があります▼である）を有する化合 物であり、上記一般式（II）の安息香酸誘導体が、一般
式Ｘ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは上記と同 じである）を有する安息香酸誘導体であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の酵素の活性測定法。 ３ 上記酵素がアシラーゼまたはエステラーゼであるこ
とを特徴とする前記特許請求の範囲第１項または第２項
記載の酵素の活性測定法。 ４ 上記酸化剤が過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩およびフエ
リシアン化カリウムのうちの一つまたは二つ以上である
ことを特徴とする前記特許請求の範囲第１項または第２
項記載の酵素の活性測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022252A JPS603836B2 (ja) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | 酵素の活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022252A JPS603836B2 (ja) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | 酵素の活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57138399A JPS57138399A (en) | 1982-08-26 |
| JPS603836B2 true JPS603836B2 (ja) | 1985-01-30 |
Family
ID=12077590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56022252A Expired JPS603836B2 (ja) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | 酵素の活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS603836B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5985299A (ja) * | 1982-11-05 | 1984-05-17 | Fujirebio Inc | カルボキシペプチダ−ゼａの活性測定方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5721352A (en) * | 1980-07-11 | 1982-02-04 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | Novel substance for measuring cholineesterase activity and method thereof |
-
1981
- 1981-02-19 JP JP56022252A patent/JPS603836B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57138399A (en) | 1982-08-26 |
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