JPS6038398A - 安定な蛋白質水性溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質の界面における吸着、変性および沈殿
に対して防護された分子量８，５００ダルトン以上の蛋
白質の水溶液ならびにそのような溶液の調製法に関する
。本発明はまたこのような安定化された溶液の治療上の
目的への好適には薬剤の投与量調整への適用に関する。

溶解された蛋白質が疎水性の界面（水溶液／空気の界面
もこれに属する）に吸着されることが知られている［　
Ｉ　Ｉｒａｎｓ、　Ｆａｒａｄａｙ　Ｓｏｃ、Ｊ第４６
巻第２３５頁（１９５０年）参照］。蛋白質は両性　５
− であり、すなわち親水性領域をも疎水性領域をも有する
。疎水性領域が疎水性界面との接触を形成する。

界面における蛋白質の吸着の結果、各種の二次的反応が
観察される。それは例えばＵ変性コすなわち吸着された
蛋白質分子の形状変化（三次および／または二次構造の
変化）をきたす。

その結果吸着された蛋白質の可溶性または不溶性の重合
体の形状への凝集が起る。そのように多くの蛋白質につ
いて、例えば溶液の混濁または攪拌あるいは振盪による
蛋白質の生物的活性喪失として顕著となる界面凝集が知
られている［　［Ｊ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆ
ａｃｅ　Ｓｃｉ、Ｊ第３２巻第１６２頁（１９７０年）
参照］。この表面吸着および表面凝集は例えば医薬品の
自動薬量調整のような蛋白質溶液の輸送装置にとって特
に不利である。

いくつかの場合には吸着された蛋白質と溶解さ−６〜 れている物質との化学反応も起９得る〔［Ｊ。

ｌＪａｃｒｏｍｏｌ、　Ｓｃｉ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ第４
巻第１１６９頁（１９７０年）参照〕。

上記の界面処坤法はさらに蛋白質に免疫原性能（す力わ
ち生物体に免疫学的防禦反応の能力な訪発する）を付方
するか、または既存の免疫原性能を強化する。そのほか
に、酵素的、血清学的またはホルモン的活性のような生
物学的特性が変えられるかまたは破壊される。

疎水性界面の特別な形状は例えば蛋白質の凍結乾燥のよ
うな水溶液の凍結の際に形成される。

この界面においては同様にまた前記の通りの蛋白質の変
性が起る［　［Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、Ｊ
第２２巻第４８３頁（１９６８年）参照］。

欧州特許第Ａ−１−１８６０９号によれば、水性の蛋白
質溶液でそこに存在する蛋白質が界面において変性され
るのを避けるために、鎖状構造中の構成員が少なくとも
半分までメチルまたはエチル置換されたオキシエチレン
単位体である鎖状の基本構造を有する界面活性物質を含
有するものが知られている。さらにそのような界面活性
物質を用いる界面処理および蛋白質の保持ならびにＮ製
への使用が記述されている。

さらにまたＷＯ−ＡＩ−８３１００２８８号によシ、イ
ンシュリンの薬量調整装置に用いるためのポリオキシエ
チレン−（０８〜ｃ１５）−アルキルフェニルヲ含有す
る安定な水性インシュリン製剤が知られている。

驚くべきことに、分子量８，５００ダルトン以上の蛋白
質の水性溶液は下記の式Ｉを特徴とする物質を混合する
ことにより良好に安定化されることが見出された。

Ｒ２０−Ｘｎ−１（５（１） 本発明は、下記式■の化合物を含有することを特徴とす
る分子ｉ８，５００ダルトン以上の蛋白゛　質の水性溶
液に関する。

Ｒ２ｏ−ｘｎ−ｐ５　（１） ただし式中、Ｘｎは式■または式■ （Ｉｔ）　（２） を有する構成員のｎ個の任意の順序よりなる鎖であり、
ｎは２〜２００、好適には４〜１００そして特に８〜５
０であシ、Ｒ１は水素原子、メチルまたはエチルを意味
し、その際残基Ｒ１は同一または異なりていてよいがた
だし鎖の構成員中少な（とも半数はＲ１が水素原子であ
ｐｌそしてＲ２とＲ３とは同一または異なシて水素原子
または有機の残基である。そのような化合物は式Ｉ中残
基Ｒ２またはＲ５のいずれか一方が水素原子を表わすこ
とが好ましい。残基Ｒ２あるいはＲ６が有機残基を表わ
す場合には好適には炭素原子１〜２０９− 個を有する脂肪族残基、炭素原子３〜１０個を有する脂
環式残基、炭素原子４〜２０個を有する脂環式脂肪族残
基、炭素原子２〜２０個を有する脂肪族エステル基、炭
素原子７〜２０個を有するアリール脂肪族残基、または
炭素原子６〜２０個を有するアリール残基、そして特に
は炭素原子１〜２０個を有するアルキル、炭素原子２〜
２０個を有するアルカノイルまたはアルキル炭素原子１
〜１０個を有するアルキルフェニルを表わすと理解され
る。

Ｒ２およびＲ６の例としてはメチル、エチル、プロピル
、ブチルまたはラウリルアルコールあるいはミリスタル
アルコールより誘導される残基、酢酸、プロピオン酸、
酪酸、バルミチン酸またはステアリン酸から誘導される
カルボキシアルキル基あるいはノニルフェノキシ残基で
ある。

１０− この種の安定化添加物はポリオキシエチレン（Ｒ１＝Ｈ
）の鎖が長いために水性の媒液−＼の溶解度が高いとい
う点で、欧州特許第Ａ１−１８４５０９号において知ら
れた添加物よシも有利性を有する。

さらにまた上記のような安定剤の添加は特に大分子量の
蛋白質すなわち分子量が８，５００ダルトンよりも多い
蛋白質を界面現象過程に対して防謹し得ることを示した
。

本発明による蛋白質溶液は多種類の異なる式■の化合物
の混合物を含有し得る。さらにまたこれらの溶液にはグ
リセリン、塩化ナトリウム、グルコースまたは類似の炭
水化物のように等張性な調整するためフェノール、クレ
ゾールまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルの
ように保存料として、燐酸ナトリウム、酢酸塩、クエン
酸塩、バルビタールまたはトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンのようにｐＨ値の緩衝のため、そしてまた
貯蔵効果を達成するための慣用の物質が添加され得る。

本発明はまたさらに、蛋白質の水性溶液に式Ｉの界面活
性物質を添加することを特徴とするこの安定な蛋白質溶
液の調製のための方法に関する。

本発明による界面活性物質は界面においてブロック重合
体の疎水性領域が界面との接触を形成し、また親水性の
ポリオキシエチレン領域が水相中に突出して、その結果
溶解された蛋白質と界面との間の直接の交流を妨害する
ような配列を生ずるものと推定される。

おそらく水相中に突出する安定剤の比較的大きな親水性
ポリオキシエチレン領域は界面の粗い網目状の負荷しか
達成しないので小さな蛋白質分子は界面への吸着が妨害
されないような働ぎをすると考えられる。

従って本発明による物質は特に高分子蛋白質の水性溶液
の安定化に適している。これらの蛋白質は１個またはそ
れ以上のポリペプチド鎖からなり、アミノ酸以外になお
他の構成分（糖、脂質その他）を含有し得る。

本発明による界面活性物質は一般に分子量が８．５００
ダルトン以上であり、例えばポリにゾチド、球状蛋白質
および複合蛋白質特に糖蛋白質のように疎水性の界面に
吸着され得るような溶解された蛋白質の安定化に適して
いる。

そのような蛋白質の例としては、プロインシュリン、プ
レゾロインシュリンのような蛋白質性ホルモン、ノイラ
ミニダーゼ、ガラクトシダー七、グリコジルトランスフ
ェラーゼ類、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、ストレプ
トキナーゼ、ミオグロビンのような酵素類ならびに各級
および各種の免疫グロブリン、アルブミン、血＝１３− 液凝固因子、インターフェロン、インターロイキン、生
長因子および分化因子のように他の機能を有する蛋白質
が列挙されるであろう。分子量が約３０．［１１］０以
上の蛋白質が好適である。

本発明はさらにまた上記に定義された安定化された蛋白
質溶液の蛋白質の結晶化、クロマトグラフィーまたは限
外濾過による１′ｐ！製の際の使用ならびに治療目的特
に埋め込みまたは外部取付けの自動ポンプのような薬量
調整装置への使用に関する。

蛋白質との接触にもたらされた疎水性界面を蛋白質の吸
着または変性を避けるために式夏の界面活性物質を用い
て前処理するのが有利である。本発明において使用され
るべき界面活性物質の調製は、それ自体既知の方法によ
るアルキレンオキシドのアルキレンジグリコール（また
は対応するヒドロキシ化合物）への制御された１４− 付加により行われる。末端ヒドロキシル官能基は場合に
よシ最終的にエステル化またはエーテル化され得る。適
当なブロック重合体の調製のための一般的処方は実施例
１δ中に記述されている。

実施例　１ ａ）攪拌機、加熱浴、還流冷却器および窒素中でのアル
キレンオキシドの薬量調整装置を備えた３０を容ガラス
フラスコ中にプロピレングリコール１５２．１９および
４９チの苛性カリ１２５２が入れられる。真空蒸留によ
シこの混合物は脱水される。最後に１２０℃において徐
々に攪拌しつつプロピレンオキシド４．１４１ｆとエチ
レンオキシド１．７１０　ｔとを順次に加える。反応終
了後に水酸化カリウムは乳酸の添加によシ中和される。

容易に揮発する成分は真空蒸留により分離され、そして
生成物は脱水される。生成物の平均分子量はポリオキシ
エチレンの含蓄が分子中８０重蓋チの場合に８，７５０
ダルトンに達する。

ｂ）　ｐ）１７の燐酸緩衝液（０，０１モル）に溶解さ
れた０、１％の卵アルブミン溶液７−ずつの試料５本と
、同様な試料でただしポリプロピレングリコールの直鎖
よりなり、平均分子量１７５０ダルトンを有し、両側で
それぞれ４０チのポリエチレングリコールと重合しブロ
ック重合体の安定剤０．１　％　（溶液の重量基準）を
添加したもの５本とが１０−のガラスアンプルに熔封さ
れた。

被検液は試験管旋回器上で回転軸から２０ｃｒｎの距離
に装着され恒温器内で６７℃において毎分６０回転され
た。安定剤なしの試料は５日後に変性された蛋白質に起
因する強い混濁を示した。

これと反対に安定剤を含有する試料は数カ月の後でもな
お澄明であった。

実施例　２ ５襲のヒト免疫グロブリン溶液、０．５％のミオグロビ
ン溶液（ウマ）および０．１優のβ−ガラクトシダーゼ
溶液それぞれ７Ｉｌ＋／ずつの試料と同様な試料でただ
し平均分子量１．７５０ダルトンのポリプロピレングリ
フールの直鎖よりなり両側でそれぞれ５０チのポリエチ
レングリコールと重合したブロック重合体のｌｏ、、１
％（溶液の重量基準）添加したものとが１０−ずつのガ
ラスアンプルに熔封された。

それらの試料は実施例１ｂにおけるように６７℃におい
て振盪された。安定剤なしの試料は数日後に混濁し、β
−ガラクトシダーゼの場合には酵素活性が最初の値の３
チ以下に低減した。

こねと反対に、安定剤を含有する試料は数週間後までも
なお澄明であった。酵素活性は実質上完全に保持された
。

実施例　３ ＝１１− ０．０１モル濃度の燐酸緩衝液中にヒト免役グロブリン
１％を含有する溶液が調製され、安定化のために平均分
子ｉ１，７５０ダルトンのポリプロピレングリコールの
直鎖よシなシ、両側で４０多のポリエチレングリコール
と重合しブロック重合体を０．２　％　（溶液の重量基
準）を含有する溶液が調製された。

溶液は自動調節の薬量調整装置に満たされた。

保温４中の作動シミュレーターによル、３７℃において
薬量調整装置は数週間にわた９澄明な溶液を搬送した。

搬送された溶液中において免疫グ四プリンの含量が測定
された含蓄は最初の値と一致した。

実験は安定剤を含有しない１チ免疫グロブリン溶液を用
いて反復された。薬量調整装置の搬送ホースには数日後
に沈殿が生じた。澄明な上澄液はもはや免疫グロブリン
をほとんど全（含１８− 有しなかった。

実施例　４ ヒトの繊維芽細胞インターフェロン３５万単位のｐ）１
７の燐酸塩緩衝液溶液７−ずつの試料５本と、同様な試
料でただし添加物として下記式（１５ ％式％） の化合物０．０１％（溶液の重量基準）を含有する試料
５本とが１０ｍｅのガラスアンプル中に溶封された。被
検溶液は実施例１ｂにおけるように３７℃において回転
せしめられた。安定化されていない試料５本においては
、２日後に生物学的活性の９５％以上の喪失が測定され
た。安定剤を含有する試料５本中のインターフェロンの
生物学的活性は数週間後にも変化はなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式■ Ｒ２０−Ｘｎ−Ｒ３（１） （ただし式中、ｘｎは式■または式■ （ＩＩ）　（２） を有する構成員ｎ個の任意の順序よりなる鎖であり、ｎ
   は２〜２００そして好適には４〜１００であり、Ｒ１は
   水素、メチルまたはエチルを表わし、その際残基Ｒ１は
   同一または異なりてもよく、ただし鎖の構成員中央なく
   とも半数はＲ１−水素であｌ）、Ｒ２およびＲ３は同一
   または異なシて水素または有機残基な表わす）の化合物
   を含有することを特徴とする、８，５００ダルトン以上
   の分子量を有する蛋白質の水性溶液。 ２）式中、Ｒ２およびＲ５が互いに独立してそれぞれ水
   素、炭素原子１〜２０個を有する脂肪族残基、炭素原子
   ３〜１０個を有する脂環式残基、炭素原子４〜２０個を
   有する脂環式脂肪族残基、炭素原子２〜２０個を有する
   脂肪族エステル基、炭素原子７〜２０個を有するアリー
   ル脂肪族残基、または炭素原子６〜２０個を有するアリ
   ール残基を表わすことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の蛋白質水性溶液。 ３）式中　Ｒ２およびＲ３が互いに独立してそれぞれ水
   素、炭素原子１〜２０個を有するアルキル、炭素原子２
   〜２０個を有するアルカノイルまたは炭素原子１〜１０
   個を有するアルキルフェニルを表わすことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項または第２項に記載の蛋白質水性
   溶液。 ４）溶液が少なくとも２種類の異なる式Ｉを有する化合
   物の混合物を含有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１〜６項のいずれかに記載の蛋白質水性溶液。 ５）溶液が等張性の調整、保存、緩衝および／または貯
   蔵作用の達成のための慣用の添加物を含有することを特
   徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の
   蛋白質水性溶液。 ６）溶液が少なくとも２種類の異なる蛋白質を含有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１〜５項のいずれか
   に記載の蛋白質水性溶液。 ７）特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の界面
   活性物質が蛋白質水性溶液に添加されることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の安定な
   蛋白質溶液の製法。 ８）界面が特許請求の範囲第１項記載の一般式の界面活
   性物質の水性溶液によ多処理されることを特徴とする、
   蛋白質に対する吸着および変性作用を除くための疎水性
   界面を処理する方法。 ９）結晶化、クロマトグラフィーまたは限外濾過による
   蛋白質の精製における特許請求の範囲第１〜６項のいず
   れかに記載の溶液の使用。 １０）疎水性の界面における蛋白質の吸着を避けるだめ
   の特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の溶液の
   使用。 １１）治療目的に使用するための、特許請求の範囲第１
   〜６項のいずれかに記載の蛋白質水性溶液。 １２）薬量調整装置に利用するための特許請求の範囲第
   １〜６項のいずれかに記載の蛋白質水性溶液。 １３）蛋白質の吸着または変性を避けるために疎水性界
   面の前処理における特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   かに記載の界面活性物質の使用。