JPS604155A - Ｌ−ロイシンおよびｌ−イソロイシンの分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、そオｔぞれ乾燥物質に対して、Ｌ　−ロイシ
ン５０〜６５ｆｉ［％、Ｌ−イソロイシン３５〜７０重
量％および他のアミノ酸最高６５重量％を含有するアミ
ノ酸混合物中のＬ−ロイシンおよびＬ−インロイシンを
分離する方法に関する。

従来の技術 アミノ酸ロイシンおよびイソロイシンは同じ分子式Ｃ６
Ｈ工、ＮＯ２を有し、１こんに分枝脂肪族側鎖Ｒの構造
によってＡ１違するに丁ぎない：この非常に類似する構
造特徴によって、これらのアミノ酸は物理的および化学
的挙動（（お（＼ても非常に類似の性質を示し、分離は
大きな困轄（ゲ伴なう。

ロイシンおよびイソロイシンの最初の分離は、銅錯体を
経て実施された。この場合には、乾燥し１こアミノ酸の
銅錯体をメタノールで抽出し。

その際インロイシンの銅塩が溶解′１−ろ。類似の方法
でアミノ酸のコバルト錯体もアルコールでの抽出により
分離される。しかしながらこの方法では、金属の回収お
よびアミノ酸をさらに精製する問題が生じろ。

他の？ｉｌＦ究者により、芳香族スルホン酸を用いてロ
イシンおよびインロイシンに分ｌ１ｌＩＩＴる牛“が記
載されている。それで、ロイシンを沈殿きせるのに２−
ブロムトルオ−／Ｉ／−５−スルボン酸丑りはナフタリ
ン−２−スルホン酸、およびインロイシンを沈殿させる
のに１−クロ／１／−４−ナフタリンスルホン酸または
２−ナフト−ル−６−スルホン酸を使用する事が提案さ
れ１こ。ペンゾールスルホン酸ならびＫＰ−１−ルオー
ルスルホン酸モ、ロイシン／イソロイシンの分ｋｌｌｌ
Ｉ　□）ために使用され１こ。これらの方法では、沈殿
物は数多くの再結晶により精製しなければならず、しば
しば強毒性沈殿剤の公庫がｌ特別な問題を生じる。

他の公知の方法では、インロイシン、ロイシンおよびバ
リンから成る混合物７　ＰＨ領域１．５〜２．０でのＬ
−ロイシンの多工程結晶化により分離し、引続き濃塩酸
からの結晶化によりＬ−イソロイシン塩酸塩を得、その
場合残余ロイシンが母液中で、富化する。しかしこの方
法によれば、Ｌ−ロイシンは薬学的用途に十分な純度で
得られない。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよ
び他のアミノ酸を含有１−ろアミノ酸混合物中のＬ−ロ
イシンおよびＬ−インロイシンを、公知の方法の欠点を
さけて分離し、純粋なＬ−ロイシンおよび純粋なＬ−イ
ンロイシンを得る半のできる方法を提供する事である。

問題点を解決するための手段 本発明による方法は、 ａ）アミノ酸混合物化自体公知の方法でアセチル化し、 ｂ）アセチル化生成物の粗製混合物から鉱酸で。

酸１生にする事によって、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン
およびＮ−アセチｔＬｉ−Ｌ−イソロイシンに冨むＮ−
ア七チルアミノ酸混合物を沈殿させ、 Ｃ）この富化されγこ混合物を全Ｎ−アセチルアミノ酸
０．１〜１．５モＪＶ／ｌの濃度を有する水溶液で６〜
８のＰｌ−１，１０〜４０°Ｃの温度でエフェクターの
存在においてＬ−アミノ酸アシラーゼによろケン化な、
使用されたＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンの２５〜９５％
が遊ｆｉｌｌアミノ酸にケン化される１で実施し、 ｄ）粗製ケン化混合物から純粋なＬ−ロイシンを晶出さ
せ、分離し、 ｅ）　Ｌ−ロイシンを分離した後に残留する母液からＮ
−アセチル−Ｌ−イソロイシン塩酸塩し、 ｆ）　Ｎ−アセチ／Ｌ’　−Ｌ−インロイシンを自体公
知の方法でケン化して遊１馳アミノ酸にする早を特徴と
する。

本発明による方法の出発物質としては、ロイシンおよび
インロイシンのみから成るアミノ酸混合物を使用する事
ができる。同様に、その他になお他のアミノ酸も含有１
−ろアミノ酸混合物も使用できろ。このようなアミノ酸
混合物は、脱糖された糖蜜、穀物−またはと５もろこし
胚、オリーブ油のしぼりか丁、微生物、殊に酵母、また
はカゼイン、ならびにケラチン（毛髪、剛毛、羽、角片
）および皮のような蛋白質源を処理する際に生じる。

このような蛋白質源の加水分解の際、しばしばロイシン
およびイソロイシンに冨む難溶性残渣が生じる。同様に
、加水分解物からクロマトダラフイ一方法（イオン交換
、イオン排除および／またはモレキュラーシーブ効果）
によってロイシンおよびインロイシンに富む画分が得ら
れろ。さらに、このような山分はなお、不純物、殊に塩
化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム丑た
は硫酸アンモニウムのような無機塩を含有し５ろ。

本発明による方法には、ロイシン４０〜６５重１仕チ、
イソロイシン６５〜６０重量％おＪ二び他のアミノ酸最
高２０重量％を含有するアミノ酸混合物が特に適してい
る。

アミノ酸混合物を丑ず自体公知の方法でアセチル化１−
る。アセチル化は塩化アセチ／Ｉ／″！、ｆこ【Ｊ、無
水酢酸な用いるか寸１こは西ドイツ国特許出願公開第２
７４１［］８１号明和１■から公知の方法にまりケテン
ケ用いて行なう事ができる。

引続き、アセチル化生成物の粗製混合物から鉱酸、たと
えば塩酸−または硫酸で酸性にする串によりＮ−アセチ
ルアミノ酸の混合物が沈殿Ｊ−る。この場合、望壕しく
はｐＨ０，５〜２の酸性にする。この場合、既ＫＮ−ア
十チルーＬ−ロイシンおよびＮ−アセチル−Ｌ−イソロ
イシンの富化が起きる。場合によりＮ−アセチル−Ｌ−
ロイシンおムびＮ−アセチ／ｌ’−Ｌ−イソロイシン以
外のＮ−アセチルアミノ酸の含量はあに少する。引続キ
、水、メタノール、エタノール、ｎ−７０ロバノール、
イソプロピルアルコ−−ブタノール、イソプロルアルコ
ール丑たはｔｅｒｔ　、ブチルアルコールのような１〜
４の炭紫原子を有する水と混合可能な脂肪族アルコール
、才γこは水とこのようなアルコールとの混合物からの
再結晶により、他のＮ−アセチルアミノ酸の含量は、乾
燥物質に対して通常４重量係より少なく、多くの場合１
重量係より少ない値に減少させる卆ができる。

Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシンおよびＮ−アセチル−Ｌ−
イソロイシンで富化された混合物に、Ｌ−アミノ酸アシ
ラーゼにょるケン化をイ１なう。

ＰＨを６〜８の範囲に調節するのは、たとえばアンモニ
ア、しかし有利に力性ソーダ溶液により行なう件ができ
る。エフェクターとしては、通常Ｌーアミノ酸アシラー
ゼを用いるＮ−アセチ／Ｌ’　−　ＤＬ−α−アミノカ
ルボン酸のラセミ体分割の際に添加されるーもの、たと
えばイオンＣａ　２　＋、Ｆｅ　２　＋、Ｍｎ”、Ｍｇ
”、Ｚｎ２＋および特にＣ　Ｏ　２　＋が使用できる。

これらは望甘しくに、Ｉ　Ｘ　１０−５〜Ｉ　Ｘ　１　
０−１モル／ｌの濃度で、たとえは＋１１当する塩化物
の形で添加されろ。多（の場合、反応混合物にイ」方向
に少量の殺菌剤、たとえばｐ−ヒドロギシ安息香酸ーｎ
ープロピルエステルを添加するのが有利である。

Ｌ−アミノ酸アシラーゼとしては、有利に腎アシラーゼ
が使用される。これは市販の天然形で適用Ｊ−るか、寸
たは橋かけさオｔたアがロース、デキス１ーランヶゞル
、セルロース、ヒドロキシコニチルセルロース コモノマーとの共重合体のような有機相持物質上かまた
け種々の多孔性酸化物型材和凍たは殊にガラス小球のよ
うな無機担持物質上の１−１１定層として適用する４）
ができる。

Ｌ−アミノ酸アシラーゼを比較的大量に適用する場合、
ケン化に必要な反応時間を短網する律ができる。より長
い反応時間を甘受てれは、Ｌ−アミノ酸アシラーゼの使
用量ヲ著しく減少させる沖ができる。従って、反応時間
とＬ−アミノ酸アシラーゼの使用量との間には、顕著な
相互従属関係が生じろ。

ケン化、つ１り反応工程Ｃ）は、始めに存在していたＮ
−アセチル−Ｌ−ロイシンの２５〜９５％、特に６０〜
８５％、殊に５０〜８０％が遊離り一ロイシンにケン化
さオｔたときに中断される。ケン化反応は、１ことえば
高圧液体クロマトグラフィーを用いろか一！１こはアミ
ノ酸分析器を用いて分析ＫＪ、り追跡する。

ケン化反応は非連続的育たば連続的に実施丁７）串がで
きろ。非連続的反応実施のムニめに、かくはん釜または
循環系を有するタンク中で作業する。連続的反応実施は
、たとえば酵素−膜反応器を用いて実施する串ができろ
。

ケン化反応に使用される混合物がたとえは１．０〜１６
５モ／Ｉ／／ｌの比較的高いＮ−アセチル−Ｌ−ロイシ
ン濃度を有する場合には、既に短時間後、純粋なＬ−ロ
イシンから成る無色沈殿が晶出しはじめる。混合物を低
い濃度で使用する場合には、望ましくは粗製ケン化混合
物な穏和な条件下で濃縮するのが有利であり、この場合
にも同様に純粋なＬ−ロイン／が晶出する。

いずれの場合にも、純粋なＬ−ロイシンを、場合により
あらかじめ、１こ１だ１使用され、固定されたＬ−アミ
ノ酸アシラーゼ乞分離■る定めに分別しムニ後、濾過寸
たは遠心分離により単離する。

天然のし一アミノ酸アシラーゼによろケン化を行なう場
合には、該アミノ酸アシラーゼケＩＪ−ロイシンの分離
後たとえば中空繊維膜の限外濾過によって回収し、新１
こに使用する半ができる。

場合によっては、Ｌ−ロイシンを多くの両分で単離する
、即ち最初の画分の分離後ケン化を続け、Ｌ−ロイシン
の他の自分を得るのが有利である。場合により望捷しい
、分離さｔ′ｔ、たＬ−ロイシンの個々の両分または全
１−をさらにｌ’＋Ｉｉ製するのは、水からの再結晶に
より行な５沖ができる。

Ｌ−ロイシンおよび場合によりＬ−アミノ酸アシラーゼ
の分離後に残留１〜る母液中では、Ｎ−アセチル−し−
イソロイシンはかなり富化されている。該イソロイシン
は自体公知の方法で、たとえは酢酸エチルを用いる抽出
、分別結晶化により１１こはイオン交換体を用いて単離
する事ができろ。母液中に通常同様になお含有されてい
る遊離アミノ酸り一ロイシンおよびＬ−イソロイシンは
回収し、再びアセチル化工程に戻丁肩１ができろ。

最後に、Ｎ−アセチル−Ｌ−インロイシンを自体公知の
方法で、ちとえは塩酸でケン化して遊離アミノ酸にする
。これは結晶化により、塩酸塩としてさらに精製１−る
事ができろ。その後、精製された塩酸塩は、弱塩基性の
イオン交換体を用いろかまたはエタノールに溶解し、第
三アミン、たとえばトリエチルアミンで中和１−る沖に
よって純粋なＬ−ロイシンに変える。

本発明による方法は、ロイシンおよびインロイシンの分
離のための公知の方法に対してもう１つの著しい利点を
有する。工業的規模で作業１−ろ蛋白質の加水分解の際
、部分的にＬ−ロイシンのラセミ化が生じる。

Ｌ−ロイシンを本発明による方法により得る場合、得ら
ｆｌ、る生成物は、アシラーゼが鏡像時Ｊ％　的にＮ−
アセチル−Ｌ−アミノ酸の加水分解のみを接触し、Ｎ−
アセチｆｉｙ−［）−アミノ酸は不変の１″！、である
ので、生成物は商い光学的純度を有する。

実施例 本発明を次側により詳述する。こオｔらの例には次の月
４がいえる： Ｌ−アミノ酸アシラーゼの活性は単位（Ｕ）で記載する
。１Ｕは、ＰＩ（７，０および２５℃で毎時Ｎ−アセチ
ｔｂ−Ｌ−メチオニン１μＭｏｌ　’＜ケン化する。

Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロイシンにつき記載された
旋光度〔α〕６５は６Ｎ塩酸中ｃ　＝　４でＬ−ロイシ
ン〔α〕計＝　＋１４．９°〜＋１７．６゜Ｌ−インロ
イシン〔α）２５　：　＋３８り〜＋４１０゜Ｄ である。

使用されたアミノ酸混合物の組成の測定は、アミノ酸分
析器を用いて行なわれろ。

酵素によろケン化のために使用され１こ、Ｎ−アセチル
アミノ酸混合物の組成の測定は旋光度によりイテなわれ
る。

パーセント表示は別記しないかぎり重ＩＦ−係ケ表わ丁
。

例　１ ケラチンのクロマトグラフィー分則から褐色粉末として
得られる中１生アミノ酸画分は、次のアミノ酸組成を倚
する： Ｌｅｕ　４９−８％ １１ｅ　、５７５１％ Ｖａｌ　３．５チ Ｍｅｔ　３．５係 Ｔｙｒ　２．５％ Ａｌａ　２．１％ ｐｈｅ　１．６チ （ｕｙ　Ｏ，９チ この混合物５２５ｇを２Ｎ力性ソーダ溶液２１に溶解し
、０°Ｃに冷却し１こ。１（時間内に、無水酢酸４１０
ｍ１および同時に５Ｎ力性ソーダ溶液８５０　ｍ、ｌを
かくはん混入し、その場合ＰＨ１１ＩｌｌがＰＨ１０〜
１２の範囲内にあり、温度が＋５°Ｃを越えないように
注意した。添加終了後、５°Ｃでさらに１時間かくはん
した。

褐色の溶液をＰＨ１，５に達する甘で、濃塩酸とかくは
んした。

吸引濾過し、水で洗浄し、乾燥した後、弱褐色粉末とし
てアセチル化合物５ろＯｇが生じた。

この粗生成物ｆｚｎ−ブタノールから再結晶し、その場
合Ｎ−アセチル−ロイシフ６５％およびＮ−アセチル−
イソロイシン６５％から成る無色の混合物６６５ｇが得
られた。

Ｎ−アセチルロイシンおよびＮ−アセチルイソロイ２シ
ンから成るこの混合物８６６ｇｆｘ、１Ｎ力性ソータ゛
溶液５００　ｍ１３に溶解した。数滴の力性ソーダ液の
添加によりｐＨ価を７５にした。

触媒として、豚腎臓からのアシラーゼ（１２００Ｕ／７
’１ｇ）５００ｍｇおよびＣｏＣｌ２　ｘ　６Ｈ２０６
０ｍ９を添加した。

澄明な溶液を６８°Ｃｖｃ加熱し１こ。６時間後に、最
初の結晶が形成した。９時間後、２００Ｃに１光度を有
する純粋なＬ−ロイシン１９．５　、？が生じ１こ。濾
液を２０°Ｃでさらに２４時間放置し、その場合新たに
結晶が分離する。旋光度〔α〕。

＝＋１７．４°を有するこの混合画分１４．６　！；ｌ
を分離し、新たに工程に供給した。

濾液を濃塩酸でＰＨ１’ｉでの酸性にし、酢酸エチ／Ｉ
／６００ｍ１で２回抽出した。有機相を減圧下に蒸発乾
個し、Ｎ−アセチル−イソロイシン１５．３　ｇから成
る無色の残渣が得られた。

この残渣な、脱アセチル化のために濃塩酸２５ｍ１およ
び水１５ｍ１とと’１１００°Ｃで６時間かくはんした
。その後、１０°Ｃに冷却し、結晶したイソロイシン−
塩＃塩を吸引濾過により単離し１こ。この塩酸塩を水２
００ｍ１に溶解し、弱塩基性の陰イオン交換体（Ｌｅｗ
ａｔｉｔ　ＭＩ）　６２　）７　Ｑ　ｍ１５有するカラ
ムに通した。水で洗浄し、溶離液を濃稠な晶泥になる１
で減圧で濃翻し、吸引濾過し１こ後、旋光度〔α）５”
　＝　＋４０．３°を有する純粋なＬ−イソロイシン９
．３ｇが７４％う２ｔたＯ 例　２ 蛋白質加水分解物をクロマトダラフィー分ｐ４１し、引
続き分別結晶化により得られた、中１生アミノ酸の両分
は次の組成を有する： Ｊ＝ｅｕ４３係 ■ｌｅ　５６％ Ｖａｌ　１％ この混合物５２５，９を２Ｎ力性ソーダ溶腋２１に溶解
し、ＯｏＣに冷却した。１時間内に、無水酢酸４１０ｍ
１および同時に５Ｎ力性ソーダ溶液８５０　ｍｌをかく
はん混入し、その場合ｐＨ価がｐＨ１０〜１２の範囲内
にあり、温ルが斗−５°Ｃを越えないように注意した。

添加の終了後、＋５０Ｃでさらに１時間かくはんし１こ
。

１：１の硫酸で１．６のＰＨをＧｊｉ節した。吸引１．
８過し、水で洗浄し、乾燥づ−る沖により固形物５５３
ｇが生じ１こ。これケ含水メタノールから再結晶し、そ
の場合Ｎ−アセチル−ロイシン５０係およびＮ−アセチ
ル−イソロイシン５０％から成る無色の混合物Ａ　８０
．１９が牛した。

等部のＮ−アセチル−ロイシンおよびＮ〜ルアセチルイ
ソロイシンから成るこの混合物８６．６　＆を水４０Ｑ
　ｍｌ　Ｋ懸濁させ、５０チの力性ソーダ溶液でＰＨ７
，０にＪ＾１節した。ＣＯＣｌ２×６Ｈ２０５Ｑ　１ｎ
９および市販の豚腎臓アシラーゼ（１２００Ｕ／＋１１
！９）５（Ｍｌ添加し、水で５００ｍ１にし１こ。澄明
な溶液を６６°Ｃで６時間か（はんした。吸引源〕尚し
、洗面し、乾燥した後、旋光度〔α〕召５−＋１５．９
°を有１−ろ純粋なＬ−ロイシン１７．９ｇを得γこ〇 濾液を２０℃で一１鹿中放置し、その場合さらに結晶９
．０．９が分離した。旋光度は〔α〕っ　−２１，０°
であつ１こ。この混合画分を分則し、新たに工程に供給
し１こ。得られた濾液に、ｐｌｌｌに達する盪で塩酸を
加え、酢酸エチルで抽出した。

有機イ゛目を蒸発濃縮し、残渣（２４，６，！９）を濃
塩酸４Ｑｒｎｌおよび水２５ｍ１とともに６時間１００
０Ｃに加熱した。その後、澄明な溶液ケ１０°ＣＫ冷却
し、結晶し１こＬ−イソロイシン−塩酸塩を吸引濾過し
た。

この塩酸塩をエタノールに溶解し、トリエチルアミンで
中和する」１により、旋光度〔α〕も５″４０．２°を
有する純粋なＬ−イソロイシン１５９ｇが得られ１こ。

発明の効果

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　それぞれ乾燥物質に対して、Ｌ−ロイシン３０〜
   ６５重量俤、Ｌ−インロイシン３５〜７０重＠チおよび
   他のアミノ酸最高６５重量％を含有するアミノ酸混合物
   中のＬ−ロイシンおよびＬ−イソロイシンを分１ｌＩｌ
   ＋する方法において、 ａ）アミノ酸混合物を自体公知の方法でアセチル化し、 ｂ）アセチル化生成物の粗製混合物から鉱酸で酸性にす
   る事によりＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンおよびＮ−アセ
   チル−Ｌ−イソロイシンで冨化されたＮ−アセチルアミ
   ノ酸混合物を沈殿させ、 Ｃ）この冨化された混合物を、全Ｎ−アセチルアミノ酸
   ０．１〜１．５モル／ｌの濃度を有する水溶液で、６〜
   ８のＰＨ１１０〜４０°Ｃの温度で、エフェクターの存
   在においてＬ−アミノ酸アシラーゼによろケン化を、使
   用され１こＮ−アセチ／Ｌｙ−Ｌ−ロイシンの２５〜９
   ５チが遊離アミノ酸にケン化されろ丑で実施し、 ｄ）わ４製ケン化混合物から純粋なＬ−ロイシンを晶出
   させ、分離し、 ｅ）　Ｌ＝ロイシンの分離後に残留する母液からＮ−ア
   セチル−し−イソロイシンｗ　単ＫＶし、 ｆ）　Ｎ−アセチル−Ｌ−インロイシンヲ自体公知の方
   法でケン化して遊離アミノ酸Ｋｊる事を特徴とする、Ｌ
   −ロイシンおよびＬ−インロイシンの分離法。　。 ２、工程ｂ）で沈殿したＮ−アセチルアミノ酸混合物を
   、工程Ｃ）の実１ｊｌｌｘ前に、水、１〜４の炭素原子
   を有する、水と混合可能な脂肪族アルコ−７しまたは水
   とこのようなアルコールとの混合物から再結晶する、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。