JPS6042768B2

JPS6042768B2 - ブタの膵臓から新規活性成分を取得する方法

Info

Publication number: JPS6042768B2
Application number: JP52113591A
Authority: JP
Inventors: 善人高岡; 允一ノ瀬
Original assignee: Funai Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Funai Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1977-09-21
Filing date: 1977-09-21
Publication date: 1985-09-25
Also published as: JPS5446814A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ブタの膵臓から血清カルシウム低下作用、血
清尿素窒素低下作用を有する新規活性成分を抽出する方
法に関する。

膵臓から血清カルシウム低下作用、血清尿素窒素低下作
用等の生理活性を有する物質を抽出する方法としては、
既に本発明者によつて、特公昭４２−１０９２時、同４
２−１０９３０号、同４４−１８３１１号及び同４８−
４４号の方法が報告されている。

しカルながら、これらの方法は、反覆実施する毎に、目
的物の生理活性が、その力価において大きく変動し、均
一な目的物を恒常的に製造し難い欠点を有し、また生理
活性の強度自体も不満足なものであつた。

そこで、本発明者らは、この欠点を解決すべく鋭意研究
を重ねた結果、抽出工程の初期の段階において蛋白質分
解酵素の活性を阻害することにより、上記従来法によつ
て得られる物質と異なる比較的低分子量の力価の高い生
理活性成分が恒常時に得られることを見出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明は、ブタの膵臓脱脂脱水物及び塩化ナ
トリウム、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（
以下ＤＦＰと略記する）をＰＨ５〜１０の水性溶媒に加
え、６０〜８０℃に加温して可溶性区分を採取し、これ
をＰＨ４〜５．４次いでＰＨ０．７〜２にＪ調整して不
溶性の各区分を順次除去し、次いで斯くして得られる可
溶性区分を限外ろ過に付し分子量１０００〜１００００
の区分を採取して新規活性成分を得る第１の発明と、更
に第１の発明によつて得られる物質をイオン交換性物質
に吸着せしめ、ｐＨ６ｉ〜８で溶出させる区分又はｐＨ
１〜３で溶出させる区分を採取して新規活性成分と得る
第２の発明との係るものである。本発明方法によつて得
られる新規活性成分は、ＰＨ４〜５．４で水に可溶の分
子量１０００〜１００００の物質で、蛋白質分解酵素活
性を有しないものであり、ＰＨ４付近で沈澱する比較的
分子量の大きい蛋白質である前掲各公報に記載の物質と
は明らかに相違する。

すなわち、特公昭４２−１０９２９号、同４２−１０９
３吋及び同４４−１８３１１号に記載の生理活性物質は
、硫安飽和度０．２〜１．０で塩析沈澱する如き巨大分
子量のアルブミン、シユードグロプリン、オイグロプリ
ンであり、また特公昭４８−４４号に記載の生理活性物
質は分子量６５５００吻質であつて、且つ蛋白質分解酵
素活性を有している点で、本発明方法で得られる活性成
分とは全く異るものである。本発明方法をフローチャー
トで示せば次の如くである。以下本発明を更に詳細に説
明する。

原料のプタの膵臓脱脂脱水物は、既に公知の方法よつて
製造するか、あるいは市販のプタ膵臓ア３セトン粉末を
用いることもできる。

本発明方法はます水性溶媒中にプタ膵臓脱脂脱水物及び
塩化ナトリウム、ＤＦＰを添加して加温する。

この操作はプタ膵臓脱脂脱水物中に存在する蛋白質分解
酵素活性を阻害するためのものであ４る。プタ膵臓アセ
トン粉末を種々の濃度（０〜１．０モル）の塩化ナトリ
ウム又は種々の濃度（１〜４０μモル）のＤＦＰを含む
燐酸緩衝液に懸濁させ、攪拌後遠心分離して得られる可
溶性区分につき、その蛋白質分解酵素活性を測定して検
討した結果、塩化ナトリウムの濃度は０．１５モル以上
、ＤＦＰの濃度は１ミリモル以上にするのが望ましいこ
とが判明した。加温は６０〜８０℃で３〜１紛間行うの
が好ましく、例えば６０℃で約１紛間、７０℃で約１紛
間加温すれば所期の効果が得られ、また８０℃で約３分
間加温した場合、蛋白質分解酵素活性はほぼ零となる。
本発明の以下の操作は全て低温下で実施され・る。

水性溶媒による抽出操作は３扮ないし１時間程度攪拌す
ることにより、また可溶性区分と不溶性区分との分離操
作は、８０００〜１００００ｙで２０〜４０分間遠心分
離するのが好ましい。限外枦過操作は市販の装置を用い
て、４０〜９０プサイの加圧下で、また吸着分画操作は
ＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ一２＼ＤＥＡＥ−セルロー
ス等の陰イオン交換体を用いて行うのが好ましい。以上
の如くして本発明で得られる新規活性成分は血清カルシ
ウム低下作用、血清尿素窒素低下作用を有し、高カルシ
ウム血症、骨粗しよう症、再生不良性貧血、重症筋無力
症、進行性筋ジストロフイー症、筋萎縮性側索硬化症、
神経原性筋萎縮症等の治療に有効であり、また低血圧症
、胃下垂、創傷、未熟児等にも奏効することが期待され
る。

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１（１）塩化ナトリウム１３ｙ１ジイソプロピルフルオロ
フォスフェート２７６ｍ９を１１１５モルの燐酸緩衝液
（ＰＨ９．Ｏ）１５００ｍ１にとかし、これに、プタ膵
臓アセトン粉末（ミクニ化学産業製）１００ｇを懸濁し
、８０℃まで加温後３分間同温度に保つ。

次いでそれをドライアイスーアルコール浴中で５℃まで
急冷し、氷上で３紛間攪拌する。これを久保田製作所製
冷凍遠心分離機、モデルＫＲ−２００Ａにより、４℃で
ローターＲＡ−８を用い７５００ｒ′Ｐｍで２紛間遠心
分離し、上清（可溶性区分１）を採取する。この上清に
塩酸を滴下してＰＨ４．Ｏに調整し、直ちに上記と同様
に遠心分離を行ない上清（可溶性区分■）を採取する。
これに塩酸を滴下してＰＨ２．Ｏに調整し、一夜放置後
、上記と同様に遠心分離を行ない上清（可溶性区分■）
を採取する。次いでこの上清に濃アンモニア水を滴下し
てＰＨ７．Ｏに調整し、分子量１０００以下の物質を枦
過する泊過膜（アミコン社製、ＵＭ−２）を装着した限
外洒過装置（アミコン社製、ダイアフロ、モデル２００
０）を用いて窒素加圧下（７０プサイ）に枦過脱塩を行
なう。得られた脱塩溶液は、次に分子量１００００以下
のｂ物質をろ過するろ過膜（アミコン社製、ＰＭ−＊１
０）を装着した限外淵過装置を用い、窒素加圧下（７０
プサイ）に枦過し、枦液を採取し、凍結乾燥して淡黄褐
色の無晶形粉末１０．５ｇ（粗活性成分）を得た。１）
斯くして得られた粗活性成分の組成及び物理化学的性状
は第１表の如くであ。

（１１１）粗活性成分の血清カルシウム低下作用及び血
清尿素窒素低下作用を試験した結果は次のとおりである
。

試験方法：比時間絶食させた体重２〜２．５ｋ９の雄性ウキギを１
群５匹として用い、粗活性成分の０．１％生理食塩水溶
液を１ｍｇＩｋｇ宛耳静脈に注射した。

対照群として、上記と同様のウサギ１４匹を用い、生理
食塩水１ｍ１Ｉｋｇを耳静脈に注射した。注射前、注射
３時間及び６時間後に約２ｍｔ宛採血し、血清カルシユ
ウム濃度をクロールアニレート沈殿法（アメリカン●ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー、３７巻、３
３０〜３３３頁、１９６舒（ニ）により、血清尿素窒素
濃度をチオセミカルバジドージアセチルモノオキシム法
（日常臨床化学超微量定量法、２３９〜２４５頁、１９
６師、金芳堂発行）により夫々測定した。

試験結果：判定：対照群において血清カルシウム値は注射前の約３％低下
し、血清尿素値は注射前の約１０％上昇する。

血清カルシウム値については５％以上低下する場合を血
清尿素窒素値については注射前より４低下した場合を夫
々有効と判定した。

実施例２原料としてプタ膵臓アセトン粉末１００ｆを用い、実施
例１の（１）と同様に処理して、粗活性成分１０．６ｇ
を得た。

得られた粗活性成分につき、実施例１の（Ｉｉｉ）と同
様の試験を行なつてその生理活性を確かめた。結果を第
３表に示す。得た数値は全て、実施例１の（Ｉｉｉ）に
示した対照群の値に比し、危険率１％で統計的に有意で
ある。

実施例３（１）実施例１で得た粗活性成分１ｙを蒸留水
１００ｍ１に溶解し、これに、活性化したＤＥＡＥ−セ
フアデツクスＡ−２５（湿重量で２５ｙ）を懸濁させた
。

この懸濁液に濃濁液に濃塩酸を滴下してＰＨ６に調整し
、氷上で１時間攪拌した後、ブフナーロート・、東洋炉
紙社製枦紙ＮＯ．５３を２枚用い、水流ポンプで吸引枦
過を行ないＰＨ６〜８で溶出される区分を？液とし得る
。次いでロード上のＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ−２５
のケーキをかき集め蒸留水１００ｍ１に懸濁させ、上記
と同様にしてＰＨ３に調整し、氷上で１時間攪拌後、吸
引ろ過を行なう。ＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ−２５の
ケーキを同様にして１００ｍ１の蒸留水に懸濁し、ＰＨ
ｌに調整した後、吸引淵過を行ないＰＨｌで溶出される
区分を戸液として得る。この様にして得たＰＨ６で溶出
される区分及びＰＨｌ〜３で溶出される区分は脱塩処理
後、凍結乾燥させ、クリーム色無色形粉末３３０ｍ９（
活性成分１）及び淡黄色無晶形粉末２８０ｍ９（活性成
分■）を得た。１）斯くして得られた活性成分１及び活
性成分■の組成及び物理化学的性状は、第４表の如くで
ある。

なお、活性成分１セフアデツクスＧ−５０（ファイン）
の下降法カラムクロマトグラフィーによりゲル沖過を行
うと単一のピークを示した。

第４図は活性成分１及び分子量既知蛋白質のセフアデツ
クスＧ−５０（ファイン）による分子量−分配係数（Ｋ
ａｖ）プロット曲線を示すもので、このＫａｖは式Ｋａ
ｖ＝（Ｖｅ−ＶＯ）／（■ｔ−ＶＯ）〔Ｖｅ：溶出容積
、■ｏ：間隙容積、■ｔ：全容積〕によつて算出した。
この結果活性成分１の推定分子量は約２５００であつた
。また、活性成分■はＥＣＴＥＯＬＡ−セルローズカラ
ムクロマトグラフィーによる分析を行うと第６図に示す
ように５つのピークを示す。

（Ｉｉｉ）実施例１の（Ｉｉｉ）と同様にして活性成分
１及び活性成分■の血清カルシウム低下作用及び血清尿
素窒素低下作用を試験した結果は第５表の如くである。
この結果より、ＰＨ６〜８溶出区分（活性成分５１）は
血清尿素窒素低下作用を有し、ＰＨｌ〜３溶出区分（活
性成分■）は血清カルシウム低下作用を有することが明
らかである。

実施例４実施例１て得た粗活性成分１０ｙを実施例３と同様に処
理し、活性成分１３．３３ｇ、活性成分■２．３８ダを
得た。

これら成分につき、実施例１の（Ｉｉｉ）と同様の試験
を行なつて、その生理活性を確かめた。結果を次表に示
す。得た数値は全て、実施例１の（Ｉｉ）に示した対照
群の値に比し、危険率１％で統計学的に有意である。

【図面の簡単な説明】

第１図は粗活性成分の紫外部吸収曲線を、第２図は同成
分の等電点分画曲線を、第３図は活性成分１の紫外部吸
収曲線を、第４図は同成分及び分子量既知蛋白質のセフ
アデツクスＧ−５０による分子量一分配係数プロット曲
線を、第５図は活性成分■の紫外部吸収曲線を、第６図
は同成分のＥＣＴＥＯＬＡ−セルローズによるカラムク
ロマトグラフィーの溶出曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ブタの膵臓脱脂脱水物及び塩化ナトリウム、ジイソ
プロピルフルオロフォスフェートをｐＨ５〜１０の水性
溶媒に加え、６０〜８０℃に加温して可溶性区分を採取
し、これをｐＨ４〜５．４次いでｐＨ０．７〜２に調整
して不溶性の各区分を順次除去し、次いで斯くして得ら
れる可溶性区分を限外濾過に付し分子量１０００〜１０
０００の区分を採取することを特徴とするブタの膵臓か
ら新規活性成分を取得する方法。２ブタの膵臓脱脂脱水物及び塩化ナトリウム、ジイソ
プロピルフルオロフォスフェートをｐＨ５〜１０の水性
溶媒に加え、６０〜８０℃に加温して可溶性区分を採取
し、これをｐＨ４〜５．４次いでｐＨ０．７〜２に調整
して不活性の各区分を順次除去し、次いで斯くして得ら
れる可溶性区分を限外濾過に付し分子量１０００〜１０
０００の区分を採取し、更にこれをイオン交換性物質に
吸着せしめ、ｐＨ６〜８で溶出される区分又はｐＨ１〜
３で溶出させる区分を採取することを特徴とするブタの
膵臓から新規活性成分を取得する方法。