JPH0133158B2 - - Google Patents
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Description
本発明はCu、Zn−スーパ−オキサイドデイス
ムターゼ（SOD）および随伴たん白を共に含む
水溶液からその酵素を単離する方法に関する。 スーパーオキサイドデイスムターゼはスーパー
オキサイド基O- 2の酵素および過酸化水素への不
均化反応： 2O2 -＋2H+→H2O2＋O2 を触媒する酵素である。1969年以来この性質を有
する酵素は多数の異る生物から単離されている。 その活性位置に銅および亜鉛を含むスーパーオ
キサイドデイスムターゼは真核生物の細胞質中に
見出される。これらの酵素はそのアミノ酸配列に
きわめて高度の相同（C.Petersonら、Carlsberg
Res.Commun.42巻、391〜395頁、1977）を示し、
関連する物理化学性（A.E.G.Cassら、Carlsberg
Res.Commun.43巻、439〜449頁、1978）を有す
るダイマー分子であることがわかつた。その活性
位置に鉄もしくはマンガンを含むスーパーオキサ
イドデイスムターゼの別の種類は原核生物および
真核生物のミトコンドリアに見出される。この種
類ではアミノ酸組成およびＮ−未端アミノ酸配列
に高い相似性を示す。しかし２種類のスーパーオ
キサイドデイスムターゼ間には有意の相同は存在
しない。 スーパーオキサイドデイスムターゼの機能は、
生物の酵素反応の副生物であるスーパーオキサイ
ド基の毒性作用に対し、明らかに好気生物の細胞
を保護することである。スーパーオキサイド基は
組織の各種炎症過程に含まれることおよび類リウ
マチ関節炎を起こすもとになることが信じられ
る。従つて炎症恐らく類リウマチ関節炎の治療に
スーパーオキサイドデイスムターゼを使用するこ
とが提案された。炎症に対するCu、Zn−スーパ
ーオキサイドデイスムターゼの治療作用は試験に
より確認された。従つて工業的規模の高収量の
Cu、Zn−スーパーオキサイドデイスムターゼの
回収方法を供することができるとすれば非常に重
要なものとなるであろう。 Cu、Zn−スーパーオキサイドデイスムターゼ
のうちではウシの酵素がもつとも研究されてい
る。従つてこの酵素の完全なアミノ酸配列および
Ｘ−線構造は既知である。また多種の分光方法に
より試験された。 肉牛および他の高等動物からのCu、Zn−スー
パーオキサイドデイスムターゼはたとえば器官お
よび組織、特に肝臓から冷緩衝溶液で細切組織を
抽出することにより、もしくは血液から赤血球の
溶血により、両者の場合次いで水溶性たん白の得
た溶液からSODを単離することにより回収され
た。単離はたとえば有機溶媒もしくは硫酸アンモ
ニウムにより、任意には２価金属の存在で加熱す
ることにより熱不安定性たん白の変性と合せて分
別沈澱することにより、もしくはジエチルアミノ
エチルセルロースもしくは他のイオン交換樹脂上
のクロマトグラフイにより行なわれた。一般に低
分子不純物は透析による、およびデキストランゲ
ル上のゲル過による精製溶液から除去される。 ウシの肝臓からスーパーオキサイドデイスムタ
ーゼの回収を扱うデンマーク特許第131091号明細
書から、10-2モル濃度までのイオン強度および
5.5〜８のPHの酵素溶液を、反対の極性イオンを
誘引する微アルカリもしくは微酸性基を有するイ
オン交換樹脂のカラム上を通すことにより酵素を
精製することが知られる。挙げた有用樹脂の一般
例の１つはカルボキシメチルセルロースである
が、PH5.5〜８では請求範囲で要求するように
SODの反対の極性を有しない。更にその特許は
カルボキシメチルセルロースの使用例を全く供し
ない。 GoscinおよびFridovich（Biochim.Biophys.
Acta289、276〜283頁、1972）は、いわゆる２相
法により酵母からCu、Zn−スーパーオキサイド
デイスムターゼを回収した。その方法では酵母ケ
ーキを５：３容量比のエタノールおよびクロロホ
ルム混合物の畧々同容量中で、しばらくの間25℃
で撹拌し、次いでその混合物を遠心分離し、透明
上澄液を固形K2HPO4と混合し、そして塩析有機
相を単離し、遠心分機により清澄化した。次にた
ん白は冷アセトンを添加して沈澱させ、その沈澱
をPH7.8の冷リン酸塩緩衝液に再溶解し、そして
微粒状ジエチルアミノエチルセルロース（「DE−
32」）により褐色不純物を精製し、そして淡緑色
液をPH7.8のリン酸塩緩衝液に対して透析し、
遠心分離による精澄化後「DE−32」カラム上で
クロマトグラフした。 上記各種方法におけるたん白水溶液の処理は十
分に純粋な生成物を供しなかつたか、もしくは非
常に複雑で余りにも低収量の純粋酵素を得たに過
ぎなかつた。 従つて本発明の目的は酵素および随伴たん白を
共に含む水溶液から、工業的規模で使用しても有
用で且非常に高収量の純粋SODを得るSODの単
離方法を供することである。 これはPH4.7〜5.5の溶液を使用PH範囲でSODと
同じ極性のカチオン交換樹脂上でクロマトグラフ
することを特徴とする本発明方法により達成され
る。 今日当業者に既知のこのタイプのカチオン交換
樹脂は主に各種カルボキシメチルセルロース、カ
ルボキシメチル基もしくはスルホプロピル基で置
換された架橋結合デキストランおよびカルボキシ
メチル基で置換された架橋結合アガロースであ
る。 本発明方法は各種原料から得た水溶液に含まれ
る他のたん白からSODの特に良好な分離を供す
ることがわかつた。このことはイオン交換樹脂が
反対の極性物質にのみ親和性を示すことからすれ
ば実際に理論と一致しない。しかし挙げたイオン
交換樹脂およびSODはここに使用するPH範囲で
は同じ極性を有し、従つて良い結果がこの方法で
得られることは驚くべきことである。 本発明方法で有用なカチオン交換樹脂の例は
「CM−32」および「CM−52」の名称で
Whatman Ltd.英国からおよび「CM−
Sephacel」の名称でPharmacia Fine Chemicals
AB.スエーデンから市販されるカルボキシメチル
セルロース、「CM−Sephadex」の名称で
Pharmacia Fine Chemicals ABから市販される
カルボキシメチル基で置換した架橋結合デキスト
ラン、「SP−Sephadex」の名称でPharmacia
Fine Chemicals ABから市販されるスルホプロ
ピル基で置換した架橋結合デキストランおよび
「CM−Sepharose CL6B」の名称でPharmacia
Fine Chemicals ABから市販されるカルボキシ
メチル基で置換した架橋結合アガロースを挙げる
ことができる。 カチオンイオン交換樹脂上の溶液のクロマトグ
ラフイは任意にはイオン交換粒子を溶液中に撹拌
することによりバツチ式で行なうことができる。
しかし、大規模で作業することがより容易で、且
すべての酵素がイオン交換剤上に吸着されること
を保証するカラム処理として行なうことがもつと
も有利である。 本発明によるイオン交換クロマトグラフイによ
る溶液の精製後、溶離物の活性フラクシヨンはゲ
ル過もしくは分別アルコールを沈澱による既知
方法で、そして既知方法の１つもしくはそれ以上
のクロマトグラフイにかけ、もしくは好ましくは
本発明方法により、更に精製することができ次い
で活性フラクシヨンを蒸溜水に対し透析し、好ま
しくは凍結乾燥により乾燥するまで濃縮する。 本発明方法は次例において更に十分に例示され
るであろう。 例 １ 2.5のジエチルエーテルを20Kgのパン酵母
〔サツカロミセスセレビシエー（Saccharomyces
cerevisiae）〕に加え、混合物は撹拌できるよう
に30分間そのままにした。約２時間25℃で撹拌
後、20の熱水を添加し、PHを7.5に調整し、４
時間45℃で撹拌を継続した。25℃まで温度を下げ
ながら別の16時間撹拌後PHを4.8に調整し、サス
ペンジヨンを30分間2000Gで遠心分離して清澄化
した。 低分子量化合物を除去するために上澄液はPH
4.8の0.01M酢酸ソーダ緩衝液で５倍に稀釈し、
限外過により10に濃縮した。後者の処理は２
回行なつた。 0.025Mの酢酸ソーダ緩衝液でPH4.8に平衡化し
た１の微粒状カルボキシメチルセルロース
（「CM−52」の名称でWhatman Ltd.から市販）
を濃縮液に加え、混合物は１時間撹拌した。カル
ボキシメチルセルロースを30cm直径のカラム上に
集め、PH4.8の0.025M酢酸ソーダ緩衝液10で洗
滌し、10cm直径のカラムに移した。カラムは６
の全容量のPH4.8の酢酸ソーダ緩衝液の直線状勾
配（0.025→0.200M）で溶離した。流速は400
ml／時間で、30mlのフラクシヨンを集めた。強い
赤色の活性フラクシヨンを集め、プールしたもの
を限外過して濃縮し凍結乾燥した。 凍結乾燥試料はPH4.8の0.025M酢酸ソーダ緩衝
液50mlに再溶解し、アセテート緩衝液に対し平衡
化したデキストランゲル（「Sephadex Ｇ−
50superfine」の名称でPharmacia Fine
Chemicals ABから市販）の５×40cmカラムに適
用した。カラムはPH4.8の0.025M酢酸ソーダ溶液
１により容離し、５mlのフラクシヨンを集め
た。流速は110ml／時間であつた。グルクロマト
グラフイの明らかな結果は２個のバンドが非常に
近接していたが、緑色Cu、Zn−スーパーオキサ
イドデイスムターゼを赤色ヘムたん白から分離し
たことであつた。 活性フラクシヨンをプールし、PH4.8の0.025M
酢酸ソーダ溶液で平衡化した「CM−52」の５×
10cmカラムに適用した。カラムはPH4.8の酢酸ソ
ーダの直線状勾配（0.025→0.200M）で溶離し
た。1200mlの全容量を流速200ml／時間で適用し、
６mlのフラクシヨンを集めた。活性フラクシヨン
をプールし、蒸溜水に対し透析し、凍結乾燥し
た。 ゲル過工程はアルコール沈澱工程で置き換え
ることができる。「CM−52」バツチ工程からの
凍結乾燥試料はPH7.0の0.005Mリン酸カリ緩衝液
100mlに溶解し、60mlのエタノールをゆつくり添
加した。13000rpmで10分間遠心分離後別の166ml
のエタノールを上澄液に添加した。沈澱は
13000rpmで15分間遠心分離して集め、PH4.8の
0.025M酢酸ソーダ緩衝液50mlに再溶解した。次
に試料は上記「CM−52」カラムに適用し、活性
フラクシヨンは蒸溜水に対し透析し、凍結乾燥し
た。精製処理の結果は以下の表１に要約する。
ムターゼ（SOD）および随伴たん白を共に含む
水溶液からその酵素を単離する方法に関する。 スーパーオキサイドデイスムターゼはスーパー
オキサイド基O- 2の酵素および過酸化水素への不
均化反応： 2O2 -＋2H+→H2O2＋O2 を触媒する酵素である。1969年以来この性質を有
する酵素は多数の異る生物から単離されている。 その活性位置に銅および亜鉛を含むスーパーオ
キサイドデイスムターゼは真核生物の細胞質中に
見出される。これらの酵素はそのアミノ酸配列に
きわめて高度の相同（C.Petersonら、Carlsberg
Res.Commun.42巻、391〜395頁、1977）を示し、
関連する物理化学性（A.E.G.Cassら、Carlsberg
Res.Commun.43巻、439〜449頁、1978）を有す
るダイマー分子であることがわかつた。その活性
位置に鉄もしくはマンガンを含むスーパーオキサ
イドデイスムターゼの別の種類は原核生物および
真核生物のミトコンドリアに見出される。この種
類ではアミノ酸組成およびＮ−未端アミノ酸配列
に高い相似性を示す。しかし２種類のスーパーオ
キサイドデイスムターゼ間には有意の相同は存在
しない。 スーパーオキサイドデイスムターゼの機能は、
生物の酵素反応の副生物であるスーパーオキサイ
ド基の毒性作用に対し、明らかに好気生物の細胞
を保護することである。スーパーオキサイド基は
組織の各種炎症過程に含まれることおよび類リウ
マチ関節炎を起こすもとになることが信じられ
る。従つて炎症恐らく類リウマチ関節炎の治療に
スーパーオキサイドデイスムターゼを使用するこ
とが提案された。炎症に対するCu、Zn−スーパ
ーオキサイドデイスムターゼの治療作用は試験に
より確認された。従つて工業的規模の高収量の
Cu、Zn−スーパーオキサイドデイスムターゼの
回収方法を供することができるとすれば非常に重
要なものとなるであろう。 Cu、Zn−スーパーオキサイドデイスムターゼ
のうちではウシの酵素がもつとも研究されてい
る。従つてこの酵素の完全なアミノ酸配列および
Ｘ−線構造は既知である。また多種の分光方法に
より試験された。 肉牛および他の高等動物からのCu、Zn−スー
パーオキサイドデイスムターゼはたとえば器官お
よび組織、特に肝臓から冷緩衝溶液で細切組織を
抽出することにより、もしくは血液から赤血球の
溶血により、両者の場合次いで水溶性たん白の得
た溶液からSODを単離することにより回収され
た。単離はたとえば有機溶媒もしくは硫酸アンモ
ニウムにより、任意には２価金属の存在で加熱す
ることにより熱不安定性たん白の変性と合せて分
別沈澱することにより、もしくはジエチルアミノ
エチルセルロースもしくは他のイオン交換樹脂上
のクロマトグラフイにより行なわれた。一般に低
分子不純物は透析による、およびデキストランゲ
ル上のゲル過による精製溶液から除去される。 ウシの肝臓からスーパーオキサイドデイスムタ
ーゼの回収を扱うデンマーク特許第131091号明細
書から、10-2モル濃度までのイオン強度および
5.5〜８のPHの酵素溶液を、反対の極性イオンを
誘引する微アルカリもしくは微酸性基を有するイ
オン交換樹脂のカラム上を通すことにより酵素を
精製することが知られる。挙げた有用樹脂の一般
例の１つはカルボキシメチルセルロースである
が、PH5.5〜８では請求範囲で要求するように
SODの反対の極性を有しない。更にその特許は
カルボキシメチルセルロースの使用例を全く供し
ない。 GoscinおよびFridovich（Biochim.Biophys.
Acta289、276〜283頁、1972）は、いわゆる２相
法により酵母からCu、Zn−スーパーオキサイド
デイスムターゼを回収した。その方法では酵母ケ
ーキを５：３容量比のエタノールおよびクロロホ
ルム混合物の畧々同容量中で、しばらくの間25℃
で撹拌し、次いでその混合物を遠心分離し、透明
上澄液を固形K2HPO4と混合し、そして塩析有機
相を単離し、遠心分機により清澄化した。次にた
ん白は冷アセトンを添加して沈澱させ、その沈澱
をPH7.8の冷リン酸塩緩衝液に再溶解し、そして
微粒状ジエチルアミノエチルセルロース（「DE−
32」）により褐色不純物を精製し、そして淡緑色
液をPH7.8のリン酸塩緩衝液に対して透析し、
遠心分離による精澄化後「DE−32」カラム上で
クロマトグラフした。 上記各種方法におけるたん白水溶液の処理は十
分に純粋な生成物を供しなかつたか、もしくは非
常に複雑で余りにも低収量の純粋酵素を得たに過
ぎなかつた。 従つて本発明の目的は酵素および随伴たん白を
共に含む水溶液から、工業的規模で使用しても有
用で且非常に高収量の純粋SODを得るSODの単
離方法を供することである。 これはPH4.7〜5.5の溶液を使用PH範囲でSODと
同じ極性のカチオン交換樹脂上でクロマトグラフ
することを特徴とする本発明方法により達成され
る。 今日当業者に既知のこのタイプのカチオン交換
樹脂は主に各種カルボキシメチルセルロース、カ
ルボキシメチル基もしくはスルホプロピル基で置
換された架橋結合デキストランおよびカルボキシ
メチル基で置換された架橋結合アガロースであ
る。 本発明方法は各種原料から得た水溶液に含まれ
る他のたん白からSODの特に良好な分離を供す
ることがわかつた。このことはイオン交換樹脂が
反対の極性物質にのみ親和性を示すことからすれ
ば実際に理論と一致しない。しかし挙げたイオン
交換樹脂およびSODはここに使用するPH範囲で
は同じ極性を有し、従つて良い結果がこの方法で
得られることは驚くべきことである。 本発明方法で有用なカチオン交換樹脂の例は
「CM−32」および「CM−52」の名称で
Whatman Ltd.英国からおよび「CM−
Sephacel」の名称でPharmacia Fine Chemicals
AB.スエーデンから市販されるカルボキシメチル
セルロース、「CM−Sephadex」の名称で
Pharmacia Fine Chemicals ABから市販される
カルボキシメチル基で置換した架橋結合デキスト
ラン、「SP−Sephadex」の名称でPharmacia
Fine Chemicals ABから市販されるスルホプロ
ピル基で置換した架橋結合デキストランおよび
「CM−Sepharose CL6B」の名称でPharmacia
Fine Chemicals ABから市販されるカルボキシ
メチル基で置換した架橋結合アガロースを挙げる
ことができる。 カチオンイオン交換樹脂上の溶液のクロマトグ
ラフイは任意にはイオン交換粒子を溶液中に撹拌
することによりバツチ式で行なうことができる。
しかし、大規模で作業することがより容易で、且
すべての酵素がイオン交換剤上に吸着されること
を保証するカラム処理として行なうことがもつと
も有利である。 本発明によるイオン交換クロマトグラフイによ
る溶液の精製後、溶離物の活性フラクシヨンはゲ
ル過もしくは分別アルコールを沈澱による既知
方法で、そして既知方法の１つもしくはそれ以上
のクロマトグラフイにかけ、もしくは好ましくは
本発明方法により、更に精製することができ次い
で活性フラクシヨンを蒸溜水に対し透析し、好ま
しくは凍結乾燥により乾燥するまで濃縮する。 本発明方法は次例において更に十分に例示され
るであろう。 例 １ 2.5のジエチルエーテルを20Kgのパン酵母
〔サツカロミセスセレビシエー（Saccharomyces
cerevisiae）〕に加え、混合物は撹拌できるよう
に30分間そのままにした。約２時間25℃で撹拌
後、20の熱水を添加し、PHを7.5に調整し、４
時間45℃で撹拌を継続した。25℃まで温度を下げ
ながら別の16時間撹拌後PHを4.8に調整し、サス
ペンジヨンを30分間2000Gで遠心分離して清澄化
した。 低分子量化合物を除去するために上澄液はPH
4.8の0.01M酢酸ソーダ緩衝液で５倍に稀釈し、
限外過により10に濃縮した。後者の処理は２
回行なつた。 0.025Mの酢酸ソーダ緩衝液でPH4.8に平衡化し
た１の微粒状カルボキシメチルセルロース
（「CM−52」の名称でWhatman Ltd.から市販）
を濃縮液に加え、混合物は１時間撹拌した。カル
ボキシメチルセルロースを30cm直径のカラム上に
集め、PH4.8の0.025M酢酸ソーダ緩衝液10で洗
滌し、10cm直径のカラムに移した。カラムは６
の全容量のPH4.8の酢酸ソーダ緩衝液の直線状勾
配（0.025→0.200M）で溶離した。流速は400
ml／時間で、30mlのフラクシヨンを集めた。強い
赤色の活性フラクシヨンを集め、プールしたもの
を限外過して濃縮し凍結乾燥した。 凍結乾燥試料はPH4.8の0.025M酢酸ソーダ緩衝
液50mlに再溶解し、アセテート緩衝液に対し平衡
化したデキストランゲル（「Sephadex Ｇ−
50superfine」の名称でPharmacia Fine
Chemicals ABから市販）の５×40cmカラムに適
用した。カラムはPH4.8の0.025M酢酸ソーダ溶液
１により容離し、５mlのフラクシヨンを集め
た。流速は110ml／時間であつた。グルクロマト
グラフイの明らかな結果は２個のバンドが非常に
近接していたが、緑色Cu、Zn−スーパーオキサ
イドデイスムターゼを赤色ヘムたん白から分離し
たことであつた。 活性フラクシヨンをプールし、PH4.8の0.025M
酢酸ソーダ溶液で平衡化した「CM−52」の５×
10cmカラムに適用した。カラムはPH4.8の酢酸ソ
ーダの直線状勾配（0.025→0.200M）で溶離し
た。1200mlの全容量を流速200ml／時間で適用し、
６mlのフラクシヨンを集めた。活性フラクシヨン
をプールし、蒸溜水に対し透析し、凍結乾燥し
た。 ゲル過工程はアルコール沈澱工程で置き換え
ることができる。「CM−52」バツチ工程からの
凍結乾燥試料はPH7.0の0.005Mリン酸カリ緩衝液
100mlに溶解し、60mlのエタノールをゆつくり添
加した。13000rpmで10分間遠心分離後別の166ml
のエタノールを上澄液に添加した。沈澱は
13000rpmで15分間遠心分離して集め、PH4.8の
0.025M酢酸ソーダ緩衝液50mlに再溶解した。次
に試料は上記「CM−52」カラムに適用し、活性
フラクシヨンは蒸溜水に対し透析し、凍結乾燥し
た。精製処理の結果は以下の表１に要約する。
【表】
ヨン
限外過からの濃縮物に比し115倍の純度を供
する「CM−52」分別物の収量は濃縮物の全単位
数の75％であつた。カチオン交換クロマトグラフ
イを所望の性質を有する多数の他のカチオン交換
樹脂を使用して同じ方法で行つた場合、表にリ
ストした収量を得た。 表 カチオン交換樹脂 SODの収量 「CM−52」 75％ 「CM−23」 61％ 「CM−Sephadex−C50」 75％ 「CM−Sephadex−Cl−6B」 85％ 「SP−Sephadex」 64％ 例 ２ ヘモグロビンの溶血および沈澱 約２の血漿を尚含み、約５の充填血球に相
当する７のデカントした血液を烈しく撹拌しな
がら７の96％エタノールと混合した。１時間後
15のイオン除去水を加え、30分間撹拌を継続し
た。 サスペンジヨンは約2000rpmのMSEバスケツ
ト遠心機で遠心分離し、ヘモグロビンのケーキを
２の水で洗滌後遠心機を空にした。29.5の上
澄液を得た。 カルボン酸アンヒドラーゼの単離 上澄液はカルボン酸アンヒドラーゼを特異的に
吸着するが、SODおよびカタラーゼを吸着しな
い「Sepharose」−グリシル−チロシン−アゾベ
ンゼンスルホンアミドの親和マトリツクス10×12
cmカラムに適用した。親和マトリツクスを洗滌
後、カルボン酸アンヒドラーゼは0.05M「トリス」
サルフエートを含み、6.5のPHを有する0.2Mチオ
シアン酸カリ水溶液で溶離した。 SODおよびカタラーゼの単離 SODおよびカタラーゼを含む溶液は1M酢酸で
PH4.75に調整し、20ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液でPH
4.8に平衡化した２の「CM−23」を詰めた20cm
直径カラムを通した。流速は１時間につき約15
であつた。次にイオン交換剤はPH4.8の20ｍＭ酢
酸ソーダ緩衝液15で洗滌した。 カラムは流速1.5／時間でPH4.8の３100ｍ
Ｍおよび３200ｍＭ酢酸ソーダの直線状勾配で
溶離した。 カタラーゼはPH7.0の0.1Mリン酸ソーダ緩衝液
で溶離した。 SODおよびカタラーゼ含有フラクシヨンは
別々にプールし、両者共De danske
Sukkerbabviker Ａ／Ｓから市販される「DDS
MF cell」内の「DDS600」膜上で限外過した。 SODの精製 SOD溶液はPH7.5の10ｍＭリン酸ソーダ緩衝液
を使用し透析過し、10ｍＭリン酸塩でPH7.5に
平衡化した「DE−52」カラム（５×８cm）上の
クロマトグラフイにより精製した。カラムは０→
0.125M NaClを含むPH7.5の10ｍＭリン酸ソーダ
緩衝液２×600mlの直線状勾配で展開した。流速
は110ml／時間で、10mlのフラクシヨンを集めた。 SOD含有フラクシヨンはプールした。比活性
および吸収スペクトルは酵素が純粋であることを
示した。 カタラーゼの精製 限外過からのカタラーゼ溶液は（NH4）2SO4
分別により精製した。 「CM−23」カラムの再生 カタラーゼの溶離後３の0.5M NaOH溶液を
カラムを通し次いで３の水を通した。次に３
の0.5M塩酸、次いで３の水および３の0.2M
酢酸ソーダ緩衝液、PH4.8をカラムを通した。 次にカラムは溶離物の伝導度およびPHが緩衝液
のものと同じになるまで20ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液
で処理した。これでカラムは再使用の用意ができ
た。 結 果 行なつた精製工程の調査およびSOD、カタラ
ーゼおよびカルボン酸アンヒドラーゼの収量は以
下の表に示す。
限外過からの濃縮物に比し115倍の純度を供
する「CM−52」分別物の収量は濃縮物の全単位
数の75％であつた。カチオン交換クロマトグラフ
イを所望の性質を有する多数の他のカチオン交換
樹脂を使用して同じ方法で行つた場合、表にリ
ストした収量を得た。 表 カチオン交換樹脂 SODの収量 「CM−52」 75％ 「CM−23」 61％ 「CM−Sephadex−C50」 75％ 「CM−Sephadex−Cl−6B」 85％ 「SP−Sephadex」 64％ 例 ２ ヘモグロビンの溶血および沈澱 約２の血漿を尚含み、約５の充填血球に相
当する７のデカントした血液を烈しく撹拌しな
がら７の96％エタノールと混合した。１時間後
15のイオン除去水を加え、30分間撹拌を継続し
た。 サスペンジヨンは約2000rpmのMSEバスケツ
ト遠心機で遠心分離し、ヘモグロビンのケーキを
２の水で洗滌後遠心機を空にした。29.5の上
澄液を得た。 カルボン酸アンヒドラーゼの単離 上澄液はカルボン酸アンヒドラーゼを特異的に
吸着するが、SODおよびカタラーゼを吸着しな
い「Sepharose」−グリシル−チロシン−アゾベ
ンゼンスルホンアミドの親和マトリツクス10×12
cmカラムに適用した。親和マトリツクスを洗滌
後、カルボン酸アンヒドラーゼは0.05M「トリス」
サルフエートを含み、6.5のPHを有する0.2Mチオ
シアン酸カリ水溶液で溶離した。 SODおよびカタラーゼの単離 SODおよびカタラーゼを含む溶液は1M酢酸で
PH4.75に調整し、20ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液でPH
4.8に平衡化した２の「CM−23」を詰めた20cm
直径カラムを通した。流速は１時間につき約15
であつた。次にイオン交換剤はPH4.8の20ｍＭ酢
酸ソーダ緩衝液15で洗滌した。 カラムは流速1.5／時間でPH4.8の３100ｍ
Ｍおよび３200ｍＭ酢酸ソーダの直線状勾配で
溶離した。 カタラーゼはPH7.0の0.1Mリン酸ソーダ緩衝液
で溶離した。 SODおよびカタラーゼ含有フラクシヨンは
別々にプールし、両者共De danske
Sukkerbabviker Ａ／Ｓから市販される「DDS
MF cell」内の「DDS600」膜上で限外過した。 SODの精製 SOD溶液はPH7.5の10ｍＭリン酸ソーダ緩衝液
を使用し透析過し、10ｍＭリン酸塩でPH7.5に
平衡化した「DE−52」カラム（５×８cm）上の
クロマトグラフイにより精製した。カラムは０→
0.125M NaClを含むPH7.5の10ｍＭリン酸ソーダ
緩衝液２×600mlの直線状勾配で展開した。流速
は110ml／時間で、10mlのフラクシヨンを集めた。 SOD含有フラクシヨンはプールした。比活性
および吸収スペクトルは酵素が純粋であることを
示した。 カタラーゼの精製 限外過からのカタラーゼ溶液は（NH4）2SO4
分別により精製した。 「CM−23」カラムの再生 カタラーゼの溶離後３の0.5M NaOH溶液を
カラムを通し次いで３の水を通した。次に３
の0.5M塩酸、次いで３の水および３の0.2M
酢酸ソーダ緩衝液、PH4.8をカラムを通した。 次にカラムは溶離物の伝導度およびPHが緩衝液
のものと同じになるまで20ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液
で処理した。これでカラムは再使用の用意ができ
た。 結 果 行なつた精製工程の調査およびSOD、カタラ
ーゼおよびカルボン酸アンヒドラーゼの収量は以
下の表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Cu、Zn−スーパーオキサイドデイスムター
ゼ（SOD）および随伴たん白を共に含む水溶液
からその酵素を単離する方法において、PH4.7〜
5.5の溶液を使用PH範囲でSODと同じ極性のカチ
オン交換樹脂上でクロマトグラフすることを特徴
とする、上記方法。 ２ カチオン交換樹脂として、カルボキシメチル
セルロース、もしくはカルボキシメチル基もしく
はスルホプロピル基で置換した架橋結合デキスト
ラン、もしくはカルボキシメチル基で置換した架
橋結合アガロースを使用することを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK203379A DK143412C (da) | 1979-05-17 | 1979-05-17 | Fremgangsmaade til udvinding af cu,zn-superoxid-dismutase fra gaer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5635984A JPS5635984A (en) | 1981-04-08 |
| JPH0133158B2 true JPH0133158B2 (ja) | 1989-07-12 |
Family
ID=8109603
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6515880A Granted JPS5635983A (en) | 1979-05-17 | 1980-05-16 | Recovery of cu*znn superoxide deisumutase from yeast |
| JP6515980A Granted JPS5635984A (en) | 1979-05-17 | 1980-05-16 | Isolation of enzyme from aqueous solution containing cu*znnsureroxide deisumutase and accompanying protein |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6515880A Granted JPS5635983A (en) | 1979-05-17 | 1980-05-16 | Recovery of cu*znn superoxide deisumutase from yeast |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4340675A (ja) |
| EP (1) | EP0019474B1 (ja) |
| JP (2) | JPS5635983A (ja) |
| AT (1) | ATE5976T1 (ja) |
| DE (1) | DE3066251D1 (ja) |
| DK (1) | DK143412C (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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