JPS6043384A - マ−カ−付き混成プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は１９８３年１月３１日出願の米国特許出願番
号第４６２，７３１号の一部継続出願である。

よく知られているように、原核生物（例をあげれば大腸
菌）であれ真核生物（例をあげれば酵母菌属）であれ、
プラスミドによる細胞の形質転換のひん度は比較的小さ
い。したがって、形質転換中のプラスミドのゲノムの内
部に、形質転換した細胞の識別に使えるようなおる種の
特性をもたせることがのぞまれる。かかる識別特性は同
業者間ではマーカーとして知られており、特定のヌクレ
オチド連鎖を含み、抗生物質耐性などの耐薬品性とか特
定の成長因子、たとえばアミノ酸の合成能力を有するも
のである。形質転換しなかった宿主の細胞はもともと合
成能力がない。

本発明は原核生物および真核生物のどちらの形質転換体
にも形質転換を示すのに適したプラスミドを担体とする
形質転換マーカーに関するものでおる。さらに、本発明
は真核生物または原核生物の形質転換体の内部で複製さ
るべきデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）連鎖のためにこのプ
ラスミドＥに特殊な挿入部位を創出させることに関する
ものである。さらに詳しく述べれば、そのなかにメソト
レキセート耐性のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｔＸｒ
Ｄ）ＴＦＲ）用のヌクレオチド連鎖暗号をもつ新しいプ
ラスミドが合成される。このヌクレオチド連鎖は二重に
消化されたプラスミドベクター、ｙＥｐ１３につなぎ合
わされる。このベクターは初期選択性でアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性のマーカーと、酵母菌属およ
び大腸菌起源のゲノム領域とをもっている。もつと具体
的に述べると、ＭｔＸｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗
号の挿入位置は、その一端でプラスミドベクターの酵母
部分に隣接し、その中に真核生物起源の複製体領域を含
むことが分かつているプラスミドベクターの酵母部分の
一部の下方にあり、他端でプラス（２３） ミドの細菌部分に隣接し、その中に原核生物起源の複製
体領域を含むことが分かっている細菌部分の一部のＬ方
にある。別の表現をすれば、そのなかにプロモーターを
含むことが分かつている追加ヌクレオチド連鎖がまた真
核生物起源の複製体領域の下方へ挿入されて、もう一つ
の新しいプラスミドをつくるといってもよい。プラスミ
ドは大腸菌種ＬＥ３９２中でクローニングされた。大腸
菌種ＬＥ３９２中でクローニングされたプラスミドＭＴ
Ｘ４はＡＴＣＣ３９２７６として寄託されている。大腸
菌種ＬＥ３９２中でクローニングされたプラスミドＭＴ
Ｘ５はＡＴＣＣ３９２７５として寄託されている。大腸
＃４種ＬＥ３９２中でクローニングされたプラスミドＭ
ＴＸ４／４２６９はＡＴＣＣ３９３９５として寄託され
ている。ＭＴＸ５／４２６９Ｃは大腸菌種ＬＥ３９２中
でクローニングされ、ＡＴＣＣ３９３９４として寄託さ
れている。

上記プラスミドは大腸菌種ＬＥ３９２中でり（２４） ローニングされ、米国メリーランド州ロックビルにある
アメリカタイプ培養収集センターに寄託されている。辷
記プラスミドはまた、主題出願の写しが提出されたそれ
ぞれの国の特許法の要請に従って寄託されている。Ｌ記
プラスミドの寄託はそれ自体では譲受人５ｔａｕｆｆｅ
ｒ　Ｃｈｅｍｌｅａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　に交付された
特許権または発明権証がいがなる政府指令によっても価
値を減することなく主題発明の実施許諾を構成するもの
ではない。

コレラのプラスミドが合成されるプロセスについても記
述すれば、要約して次のようにまとめられよう：　Ｂａ
ｍＨＩとＨｌｎｄ　ｍ制限エンドヌクレアーゼ（以後レ
ストリクターセという）を用いてｙＥｐプラスミドを徹
底的かつ特異的に消化する。ＭｔＸｒＤＨＦＲ用ヌクレ
オチド連鎖暗号がプラスミドｐ　ＥＥ３６４がら単離さ
れて、オクタヌクレオチドリンカーとつなぎ合わされ、
る。すなわちＭｔＸｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗号
を調製ずみのｙＥｐ１３断片にっなぎ合わせているいろ
な新しいプラスミドを生ずる。その中にはＭｔＸｒＤＨ
ＥＲ用ヌクレオチド連鎖暗号をもった混成プラスミドで
おるＭＴＸ４やＭＴＸ５も含まれている。ここでぃう１
混成“とは、一つ以りの供給からのＤＮＡを包含し、真
核生物の細胞中でも原核生物の細胞中でも複製しうると
いう意味である。

その中に植物プロモーターを含むことが分かつている付
加ヌクレオチド連鎖を含有するプラスミドの合成を簡単
に述べると次のようになる：　ＭＴＸ４プラスミドをＨ
ｌｎｄ　ｎＴレストリクターゼで特異的に消化する。約
４８０の基本対を有するヌクレオチド連鎖（以後４８０
−基本対断片という）がＨｌｎｄｍ及びＢａｍＨＩレス
トリクターゼを用いてプラスミドｐＲ４２６９から切り
出される。このヌクレオチド連鎖をオクタヌクレオチド
リンカーとつなぎ合わせ、さらにＭＴＸ４またはＭＴＸ
５プラスミド中でつなぎ合わせて混成プラスミドをつく
る。このプラスミドにはＭｔＸｒＤＨＥＲ用ヌクレオチ
ド連鎖暗号と植物プロモーターをもつ４８０−基本対断
片との両方を含んでいる。

本発明の目的は、その中にマーカーヌクレオチド連鎖を
有する混成プラスミドを合成することである。

本発明のもう一つの目的は、その中にメントレキセート
耐性のジヒドロ葉酸レダクターゼ用ヌクレオチド連鎖暗
号を有する混成プラスミドを合成することである。

本発明はさらに、その中に真核生物のプロモーター用ヌ
クレオチド連鎖暗号とマーカー用ヌクレオチド連鎖暗号
とを有するプラスミドを合成することを目的とする。

本発明のなおもう一つの目的は、その中に植物プロモー
ター用ヌクレオチド連鎖暗号とマーカー用ヌクレオチド
連鎖暗号とを有するプラスミドを合成することである。

本発明はさらに、プラスミドによって形質転換した真核
生物および原核生物のメソトレキセート耐性を増大した
プラスミドを合成す（２７） ることを目的とする。

本発明のなおもう一つの目的は、プラスミドを含有する
原核生物と原核生物の中にメソトレキセート耐性のジヒ
ドロ葉酸レダクターゼをつくるプラスミドを合成するこ
とである。

これらを含めその他の本発明の目的は同業者にとっては
欠配図面の説明により了解されよう。

実施例１ 以下に示す例は単なる例示であって、何らかの限定を加
える意図はない。同業者には明白なことでおるが、以下
に記載する各種のステップは、記述された発明の本質か
ら離れることなく成立しうるものである。たとえば、緩
衝液の強さ、遠心速度と時間、抽出操作、沈殿操作、洗
浄その他を、記述された発明の本質を変えることなく、
その範囲内で変えることができる。同様に、ヌクレオチ
ドリｆカ（２８） −、酵素および同種のものの入手源を、ここに記述した
発明の本質から離れることなく変えることができる。

ｙＥｐプラスミドはワシントン州シアトルにおるワシン
トン大学のＶ、ウィリアムスンから得た。ｙＥｐ１３は
Ｑｅｎｅ、　８巻、１２１−１３３（１９７９）にブロ
ーチ、ストラサーンおよびヒツクスによって報告された
。ｙＥｐプラスミドは混成種であって、真核微生物でお
るπにプーーー（盈二る　１と（ジー円に由来する酵母
ＤＮＡ領域をもっている。酵母ＤＮＡ領域の内部に真核
生物起源の複製本領域がある。

ｙＥｐ１３はまた原核微生物でおる大腸菌（ニーｃｈｅ
ｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌｌ　）由来の細菌性ＤＮＡ領域も
もっている。細菌性ＤＮＡ領域の内部に原核生物起源複
製体領域がある。）’ＥＰ　１３はアンピシリンおよび
テトラサイクリン耐性についての初期選択性マーカーと
、ロイシン生合成パスウェイのＬＥＵ２をもっている。

ｙＥｐ１３プラスミドはバーンボイムー塩化セシウムこ
う記法によって大腸菌から単離された。バーンボイム、
Ｈ，Ｃ，、トリ、Ｊ。

（１９７９）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、　７巻。

１５１３−１５２３゜６０ミリモル（ｍ　Ｍ　）の塩化
ナトリウム、７ｍＭのＴＲｌ５，７ｍＭの塩化マグネシ
ウムからなる約２ミリリツトル（−）中、３７℃、ｐＨ
７，５で、約５０マイクログラム（μｆ）のｙＥｐ１３
を約１５０単位のＨｌ　ｎｄ■レストリクターゼ（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ−ｏｒａｔｏ
ｒｉｅｉ製、以後ＢＩ’ＬＩ、と略記）で消化した。

この条件で約３時間後、消化混合物を３分間６５℃に加
熱し、次いで氷とに注いでＨｉｎｄｌ’ｌ’［レダクタ
ーゼを不活性化した。塩化ナトリウム、β−メルカプト
エタノールおよび最初のＢａｍレストリクターゼ（ＢＲ
Ｌ）をＬ記混合物に加えて、最終的にそれぞれ１００ｍ
Ｍ、１０ｍＭおよび１５０単位となるようにした。との
混合物を３７℃で３時間保温後、直ちに６５℃で３分間
加熱し氷Ｆに注いで急冷した。

次いで消化されたプラスミドＤＮＡを最終濃度０．３モ
ルの酢酸す）　ＩＪウムと２５倍容積の９５チエタノー
ル中で沈殿＃縮させた。濃厚ＤＮＡをエタノールに２度
懸濁後、ベレットを１ｍＭＥＤＴＡを含むｐ　Ｈ８，０
の１０ｍＭＴＲｌ５−クロリド８０マイクロリツトル（
μｔ）中で再溶解した。

Ｒａｍ　ＲＩ　／　Ｈｌｎｄ　ｌ’［で消化した）ｒＥ
ｐ１３は１ｏ、３キロベースの断片と０．４キロベース
の断片ヲ生じた。これは電気溶出により決定されたもの
で、４０　ｍＭ　ＴＲＩ　Ｓ、　１　ｍＭＥＤＴＡを用
い、氷酢酸でｐＨを８．２に調節し、０．８チアガロー
ス水平ゲルと１１５時間３ｏボルトを与えて溶出させた
。このようにしてえられた１０．３キロベ一ス断片は０
．５モルの塩化す）　ＩＪウムの存在で、フェノール／
クロロホルム（１：ｌｕ／ｕ）の混合溶媒で２回抽出し
、さらにエーテルで２回抽出した。この１０．３キロベ
ースの断片をエタノールで沈殿させ、次いでエタノール
洗浄後、ｐＨ８，０で４００　ａｔのＴＲｌ５ＥＤＴＡ
　緩衝液に再溶解した。再溶解ベレン（３１） トをエタノールで再沈殿、洗浄し、最後にｐＨ８，０に
調節した１０ｍＭのＴＲｌ５−クロリド緩衝液５０μｔ
に再懸濁させた。

このようにしてえたｙＥｐｔａベクターは１個の１粘着
性’　Ｂａｍ　ＨＩ　末端と１個の箪粘着性＃　）（Ｉ
ｎｄ　ｍ末端をもつ１０．３キロベースのプラスミドで
るって、その中にＭｔｘｒＤＨＦＲ遺伝子用ヌクレオチ
ド連鎖暗号をもつＤＮＡ断片のクローニングに適した純
度のものであった。

ｙＥｐ１３の制限地図の描写である第３図についてみる
と、第１のＨｌｎｄ［位置から時計回りにあるＥｃｏＲ
■位置と、Ｌ記ＥｃｏＲＩ位置から時計回りにある第２
のＨｌｎｄ　Ｉｆｆ位置を含む第１のＨｉｎｄｍ位置と
ＢａｍＨＩ位置の間の領域が、Ｅ述の方法によってもと
の７Ｅｐ１３プラスミドから除かれて、線状１０．３キ
ロベースのプラスミドをつくっていることが分かるはず
だ。

この切除の結果として、１０．３キロベースの断片はも
とのｙＥｐ１３プラスミドのＢａｍ　ＨＴ（３２） 位置の領域にあるテトラサイクリン耐性機能が失われて
いる。さらに、Ｈ１ｎｄｌ’ｌレストリクターゼによっ
て消化されたために、１０．３キロベースの断片の酵母
部分に隣接する挿入部をもつベタターになる。１０．３
キロベ一ス断片はまた大腸菌由来のアンピシリン耐性の
暗号をもつ遺伝子と、サツ力ロミヶス　セルビシエ（以
下酵毎菌属という）由来のロイシン生合成パスウェイ中
の酵素用暗号をもっＬＥＵ２遺伝子とを含んでいる。

原核生物性Ｍｔｘ’ＤＨＦＲヌクレオチド連鎖を含むプ
ラスミドｐｐＥ３６４の担体でおる大腸菌はノースカロ
ライナ州Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｌｅｓのＭＦｌｉｎｇからえたものである。

Ｆｌｉｎｇ、　Ｍ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｅｌｗｅｌｌ　、　
Ｌ、　Ｐ、　（１９８０）。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　、
　１４１巻、　７７９−７８５゜プラスミドはＢｉｒｎ
ｂｏｉｍ−塩化セシウムこう記法によって調製したが、
ｐＦＥ３６４を含む大（３３） 腸菌細胞を、アンピシリン１００μｆ／−ではなく、メ
ソトレキセート誘導体であるトリメトプリム（シグマ）
１０μｆ／−の存在で成長させた点が異なる。次の処方
でえられたｐＦＥ３６４プラスミドはＭｔｘｒＤＨＦＲ
用ヌクレオチド連鎖暗号の単離のためにだくわえられた
。

ｐＦＥ３６４プラスミド１００マイクログラム（ｐｆ）
をＴＲｌ８−クロリド２０　ｍＭ、　ｐＨ７，０゜塩化
マグネシウム　７ｍＭ、塩化ナトリウム１００ｍＭ、β
−メルカプトエタノール（シグマ）２ｍＭからなる溶液
１５０μを中３７℃で約１６時間、１６単位のＢａｍＨ
Ｉ（ＢＲＬ）と３６単位のＥｃｏＲＩ　（Ｂｌｏｐａｂ
ａ　）ｖストリクターセを用いて消化した。残ったプラ
スミドを１．２チ水平アガロ一スゲルＥ１３０ボルト１
６時間、さらに１５０ボルト、３〜４時間かけて電気溶
出を行い、２．５キロベースのＢａｍ　ＨＩ　／Ｅｅｏ
Ｒｉ断片（ＭｔｘｒＤＨＦＲ遺伝子を含む）を単離した
。電気溶出用緩衝液は丘述したのと同じである。Ｂａｍ
　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　ＭｔｘｒＤＨＦＲ（ｑ
ａ） 断片を集めて、フェノールで２回、クロロホルムで１回
抽出し、イソプロピルアルコールとエタノールで沈殿さ
せた。最終ＤＮＡ沈殿約１０　μｔ　を１０ｍＭＴＲｌ
５クロリド、ｐ　Ｈ８，０，ＥＤＴＡｏ、１ｍＭ緩衝液
１００μＭ中に再懸濁させた。この同じ方法は各バッチ
に用いられた。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ　Ｍｔｘ　ＤＨ
ＦＲ断片の３バッチ全部を一諸にしてエタノールで角沈
殿させ、以下に記するような方法でＨａｓ　ｍとＡｌｕ
　Ｉで消化した。

約３０μ２のＢａｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｅ　ｏ　ＲＩ断片
をＴＲｌ５クロリド５０ｍＭ、ｐＨ７，５，塩化マグネ
シウム５ｍＭ、ジチオスレイトール０．５　ｍ　Ｍを含
む溶液８０μｔに懸濁させ、これにストックＨａｅ■レ
ストリクターゼ（ＢＲＬ）４５単位を含む５μｔを加え
た。混合物を２時間３７℃に置いてから、ストックＡｌ
ｕ　Ｉレストリクターゼ（ＢＲＬ）４０単位を含む５μ
ｔと塩化すｌ・リウム５０ｍＭの１０μｔとを加えた。

この消化混合物をさらに３７℃で２時間熟成した。

（３５） その中にＭｔｘ　ＤＩＩＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗号を
もつ３７０塩基対のＨａｅ　ＩＩＩ／Ａｌｕ　Ｉ　ＤＮ
Ａ断片は、２チアガロース水平ゲルトで１５０ボルト、
２時間の電気溶出を行って単離された。溶出緩衝液はＬ
述したのと同じである。

Ｈａｅ　ＩＩＩ／Ａｌｕ　Ｉ　断片はフェノールで３回
、クロロホルムで２回抽出で精製し、０．３モルの酢酸
ソ・−ダーエタノールで２回沈殿させた。

生成溶液はその中にＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連
鎖暗号をもつ７．５μｍのＤＮＡ断片を含み、全容）ｔ
ＪＬ５０ｐＬの１０ｍＭＴＲｌ５−クロリド緩衝液で、
ｐ　Ｈ８，０、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｏ，１ｍ　Ｍを含むも
のであった。

Ｍ　ｔ　ｘ　ｒＤ　ＨＦ　Ｒ用ヌクレオチド連鎖暗号を
含む３７０塩基対ＤＮＡとつなぎ合わせるに先立って、
末端りん酸塩基をリンカ−分子に再生させた。適当なオ
クタヌクレオチドリンカー　（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ　Ｒｅ８ｅａｒｃｈ製）５マイクログ（３６） ラムをＴＲｌ５−クロリド７０ｍＭ、ｐＨ７゜５．塩化
マグネシウム１０ｍＭ、ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍ
ｍ）５　ｍ　Ｍ　、　”　ｐアデノシントリホスフェ−
）（ＡＴＰ）５０μｔを含む全容１０μを中に懸濁させ
た。混合物を２分間７０℃に加熱してから、Ｔ４ボリヌ
クレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）５．５単位を加えた。３
０℃テ３０分置いてから、混合物に５，５単位のキナー
ゼ酵素と１ｍＭの無標識ＡＴＰを補い、さらに３０分放
置した。次に１０分間６５℃に加熱して不活性化後−２
０℃で貯蔵した。ホスフオリル化リンカ−は自己連結性
であって、ホスフオリル化が有効に行われることが確か
められた。リンカ−のホスフォリル化は７チアクリルア
ミドゲルＥで、通常の自動放射グラフ法を使って可視化
することによって、自己連結性リンカ−の大きなラダー
（はしご形）形成が認められた。Ｈｌｎｄ　ｍやＢａｍ
　ＨＩ　を用いて適当な条件で自己連結性リンカ−を再
消化するとリンカ−モノマー（単量体）が再生（３７） した。

再生リンカ−でつなぎ合わせるまえに、その中にＭｔｘ
ｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗号をもつＤＮＡ断片は
末端塩基が対になっていないので、塩基対を完成させる
ためにデオキシヌクレオチダーゼの存在でＤＮＡポリメ
ラーゼｌで処理された。その中にＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌ
クレオチド連鎖暗号をもつ精製されたＤＮＡ断片約１μ
Ｖ　を、２単位のＤＮＡポリメラーゼＩ　（ＢＲＬ）、
１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、６０ｍＭのＴＲ
ｌ５−クロリド。

ｐＨ７，５，８ｍＭの塩化マグネシウム、および０、２
　ｍ　Ｍのデオキシアデノシントリホスフェート、デオ
キシシチジントリホスフェート、チオキシチミジントリ
ホスフェート、およびデオキシグアノシントリホスフェ
ート（Ｐ、　Ｌ。

Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌｍ　）を含む全２０　ｐＬ容積
の溶液中１６℃で６０分間放置した。次いで６５℃に１
０分間加熱後氷ｔに注いで反応を不活性化した。その中
にＭｔｘｒＤＴ（ＦＲ用ヌクレオチド（３８） 連鎖暗号をもつＤＮＡ断片はこうして、ＢａｍＨＩおよ
びＨｌｎｄ　ｍ　オクタヌクレオチドリンカーへのプラ
ントエンド（ｂｌｕｎｔ　−ｅｎｄ　）　リゲージョン
の準備ができたわけた。

−ジョン β−メルカプトエタノールを［記Ｍ　ｔ　ｘ　ｒＤＨＦ
Ｒ混合物に加えて、最終濃度を１０ｍＭとした。６約１
μｍのＳ　ｔ　ｐ−ホスフォリル化ＢａｍＨＩとＨｌｎ
ｄ　■　リンカ−も加えた。Ｍｔ　ｘ　ｒＤＨＦＲ１μ
２、リンカ−１Ｔ４ＤＮＡリガ一セ２００単位、ＴＲｌ
５クロリド６６ｍＭ、ｐＨ７，５，塩化マグネシウム６
．６ｍＭ、ＡＴＰｏ、２５ｍＭおよびジチオスレイトー
ル１０ｍＭを含む４０μｔの溶液中２０℃で２０時間か
けてプラントエンドリゲージョンを行った。ＡＴＰ混合
物を加熱して不活性化し、次いで塩化ナトリウムを加え
て最終濃度６０ｍＭとした。リゲージョン混合（３９） 物を６単位の川ｎｄｌ’（制限酵素で３７℃、２８５時
間消化した。上記混合物に８即位のＢａｍＨＩレストリ
クターゼ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび十
分量の塩化ナトリウムを直接加え、最終的に塩化ナトリ
ウム濃度を１００ｍＭにした。そこで３７℃、２．５時
間消化した。ＢａｍＨＩおよびＨｌｎｄ　ｍリンカ−に
つなぎ合わされ、その中にＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌクレオ
チド連鎖暗号をもつＴ′）ＮＡ断片をエタノールで沈殿
して濃縮し、２％アガロース水平ゲルｈ１５０ボルトで
約１．５時間、前述の緩衝液を用いて電気溶出してリン
カ−を除き精製した。電気溶出断片をフェノールで抽出
、さらにエーテルで抽出してからエタノールで沈殿、洗
浄した。その中にＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖
暗号をもつＤＮＡ断片はこうして１つ以りの末端Ｂａｍ
　ＨＩおよび／またけＨ１ｎｄ■オクタヌクレオチドリ
ンカーを含むものとなり、Ｂａｍ　ＨＩ　／　Ｈｌ　ｎ
ｄ　ｍ消化ｙＥｐ１３ベクター中でクローニングされる
壕でとなった。

（４０） ＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗号を中にもつＤ
ＮＡ［ｉ片の３’ｇｐ１３ベクターへのつなぎ合わせは
線状１０．３ｋｂ析片の形での４１ｆｉＢａｍＨＩ　お
よびＨｌｎｄｌｌ　消化ｙＥｐ１３の１．８μｐ％１ｌ
ｐ−ホスフオリル化ＢａｍＨＩおよび／またはＨ１ｎｄ
ｎｌリンカ−につなぎ合わされ、その中にＭｔｘｒＤＨ
ＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗号をもつｆＷ製ＤＮＡ０．０
６μｇ１牛の血清アルブミン（ＢＲＬ）２１μ、９ＳＡ
ＴＰ（Ｓｉｇｍａ）　１　ｍＭ、Ｔ　ＲＩ　Ｓ−クロリ
ド３０ｍＭ５　ｐＨ７，５、塩化マグネシウム１０ｍＭ
、塩化ナトリウム５０ｍＭ、およびβ−メルカゾトエタ
ノール１０ｍＭを一緒に加えて全容３０μｌの溶液中で
行われた。混合物を３７℃で２分間加熱してから、２０
０単位のＴ４ＤＮＡすが−ゼを加えた。つなぎ合わせは
４℃で２４時間かけて行われた。その結果見られた混合
物中には各種の遊離ＤＮＡ種と不完全および完全リダー
ジョン生成物ヲ含ンテいた。

ＭｔｘｒＤＨＦＲつなぎ合わせ生成物による大腸菌株Ｌ
Ｅ３９２は６００ナノメーターで、光学密度０．６で照
射され、２０　Ｏｒｐｍで回転スるインキュベーター中
で、１５−のＬ−ブロース（スーｆ）中３７℃で培養さ
れた。

細胞溶液を氷上で５分間冷却し、卓上遠心分離機にかけ
約５．０００　ｒｐｍで分離し、ペレットは１０ｍＭの
イｊｆ酸マグネシウム１〇−中に再懸濁させた。細胞を
硫酸マグネシウムで洗浄し、遠心分離機にかけ、次に冷
却した５０ｍＭの塩化カルシウム２．５　ｍｇに再懸濁
させた。

細胞を塩化カルシウム／氷中に約３０分保持し、次いで
再び遠心分離し５０ｍＭの塩化カルシウム１ｒｎｌ中に
再懸濁させた。懸濁大腸菌細胞１００マイクロリツトル
を殺菌した１、５ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れで
ある、前につくったりｒ−ジョン混合物３０μｌに加え
た。形質転換は０℃で４５分間行われた。次に細胞を再
び２−のＬ−ブロースに懸濁させ、３７℃で約１時間イ
ンキュベートシ、その後で培養液を遠心分離し、細胞ペ
レットを再び１０ｍＭの硫酸マグネシウム１ゴ中に懸濁
させた。

次いで、この溶液約１００μｌを１００μｙ／−のアン
ピシリン（Ｓｉｇｍａ）を含むＬ−寒天培地グレート上
でインキュベートした。プレートのインキュベートは３
７℃で１６時間行ったｃ、１７のアンピシリン耐性コロ
ニーかえられた。

上記の方法でえられ、２．３．４および５と命名された
４つの大腸菌をいろいろな方法で分析してＭｔｘ　ＤＨ
ＦＲ含有ＤＮＡ断片挿入部の存在を確認した。すなわち
、アガロースダル電気泳動法によるプラスミドサイズの
計算、アクリルアミドグル電気泳動を用いたＢａｍＨＩ
／Ｈ１ｎｄｕｌ制限酵素消化の評価、および３舅Ｐで標
識化した、中にＭｔｘ　Ｄ）ＩＦＲ用ヌジヌクレオチド
連鎖暗号むもとのＤＮＡ断片（４３） の、形質転換体から全細胞ＤＮＡのサウデンプロットへ
の混成化などがそれである。それぞれＭＴＸ２、ＭＴＸ
３、ＭＴＸ４およびＭＴＸ５とよばれるプラスミドは次
の方法で上記形質転換体から単離された。各形質転換体
細胞は別々に、細胞が１．１〜１．３の光学密度に達す
るまでアンピシリンの１００μｉ／ａｔを含むＬ−ブロ
ース５０−中、３７℃で２５゜ｒｐｍでかくはん（２イ
ンキユベートされた。次に１５ミリグラムのスペクチノ
マイシン（ＵｐＪｏｈｎ　）を添加した。同じ条件でさ
らに１５時間成長させて後、５ｏｒｖａｌｌ　Ｓ　Ｓ　
−３４０−ター付の殺菌した目？リノロビレンスクリュ
ーチューブ中遠心分離して細胞を取得した。細胞ペレッ
トをグルコース５ｍＭ、　ＥＤＴＡＩＯｍＭ、ＴＲｌ５
−クロリド緩衝液２５ｍＭ。

ｐＨ８，０、および卵黄リゾチーム、グレードエ（Ｓｉ
ｇｍａ　）　２１ダ／−を含む溶液２−に再懸濁させた
。細胞を０℃で３０分保持して後、０．２Ｎ水酸化ナト
リウムと１％デシル硫酸ナトリ（４４） ラムを含む溶液４−とよく混合して透明な溶解液をえた
。０℃に５分１斤いてから、溶解液を３モルの酢酸ナト
リウム３−で処理してｐＨを４．８とし、よく混合して
０℃で１時間インキュベートした。細胞片を遠心分離で
沈殿させた。プラスミドＤＮＡを含む上澄ｆｆｉ、８　
ｍｌを新しい試験管に移し、水冷エタノール２０Ｗｌｅ
中に入れ一３５℃、２０分かけてＤＮＡを沈殿させた。

遠心分離でグラスミドＤＮＡを果め、ＴＲＩ　Ｓ−クロ
リド５０ｍＭ、ｐＨ８、塩化リチウム０．２ＭＳＥＤＴ
Ａ２０ｍＭおよび０．２チドデシル硫酸ナトリウムを含
む浴液２−中に再懸濁させた。ＤＮＡを約１　：　１　
ｖ／ｖのクロロホルム−フェノール混液の等容積で抽出
した。フェーズ含有グラスミドは遠心分離でフェノール
から分けられた。約１．６−のＤＮＡ溶液を新しい試験
・ａに移し、エタノールで沈殿させ、０．３モルの酢酸
ナトリウム蒸留水溶液０．５ゴに再懸濁させ、エタノー
ルで再沈殿させた。このようにしてえたＤＮＡペレット
を１０モルＴＲｌ５−クロリド、ｐｉ８．０．０，２ゴ
に溶解し、３７℃、３０分間２０１ｔ９／−の１（Ｎａ
ｓｅで処理した。３番目のエタノール沈殿後、グラスミ
ドＤＮＡを５０μ）の蒸留水に再懸濁した。上述の方法
で調製したプラスミド各１マイクロリットルヲ０，７％
アガロース水平ダル上で、既知サイズの標準シラスミド
と一緒に２５ボルト、１８時間処理した。ＭＴＸプラス
ミドはそれぞれ約１０，７キロベースの大きさであった
。

各ＭＴＸｆラスミドはさらにアガロースダル上約０．３
μＩのシラスミドを含むプラスミド懸濁液５μｌを′電
気溶出して混在するりが核酸のないグラスミドにして特
性化した。次いで各グラスミドはすでに述べたとはとん
ど同じ方法で、４単位のＢａｍＨＩ　と８単位のＨｌｎ
ｄｌｌを用いて消化され、８９ｍＭＴＲｌ５−クロリ　
ド、ｐｉ　８．３．２．５ｍＭＥＤＴＡ、８９ｍＭはう
酸塩緩衝液中、４％アクリルアミドｒル上、１５０がル
ト、３時間処理して断片サイズを分析した。ＭＴＸノラ
ヌミドからえられたもつと小さいシラスミド断片はそれ
ぞれ既知サイズの標準と比較して０，３７から０、３８
　キロベース位のものであった。各ＭＴＸプラスばドの
もつと大きい断片は３ｍＪＴＲＩＳ−クロリ　ド、ｐｉ
　ｓ、　２、１ｍＭｇＤＴＡ、５ｍＭ酢酸ナトリウム中
、１％アガロースｒル上、５０デルト、９時間の処理で
測定し、約１Ｏ５５から１０．７キロベースであった。

これらの断片はＢａｍＨＩ／Ｈｉ　ｎｄｌ消化）ｒＥｐ
　１３中でクローニングされた、中にＭｔｘ　ＤＨＦＲ
用ヌクレオチＰ連鎖暗号をもつＤＮＡ断片に予想された
サイズと一致するものであった。

混成化研究による特性化 “コロニー混成化法”とよばれている技法を用いるニッ
ク翻訳によって、１７個の大腸菌形質転換体のそれぞれ
からのＤＮＡが、ｌａｐで標識化されたＭｔｘ　ＤＨＦ
Ｒを中にもつヌクレオチド連鎖暗号を有する３７０塩基
対ＤＮＡ＃ＦｆＴ片に混成化された。これらの技法は（
４７） ともに同業精通者には一般的に公知なものである。（５
ｏｕｔｈｅｒｎ　ＸＥ、（１９７５）、Ｍｏ１ａｃ、　
Ｂｉｏｌ、。

９８巻、５０３−５１７　；　Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎ、
　Ｍ、　ａｎｄＨｏｇｎｅｓｇ、　Ｄ、Ｓ、　（１９７
５）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｌ、Ａｅａｄ。

Ｓｅｔ、、７２巻、ｐｐ３９６１−３９６５　：Ｒｌｇ
ｂｙ。

Ｐ、　Ｍ、、　Ｄｒｉｃｋｍａｎｎ、　Ｍ、、　Ｒｏｄ
ａｓ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｂｕｇ、　Ｐ、　Ｊ。

（１９７７）、　Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、、　１１３巻、ｐ
、２３７゜混成化の検定はＫｏｄａｋ　ｘ−ＯＭＡＴ　
ＡＲ−５フィルム」二に自動放射グラフィーをかくこと
で行った。２．３．４および５を含む１４個の形質転換
体かもとのＭＴＸ　ＤＨＦＲ挿入部に一致するｌ）　Ｎ
　Ａを含んでいた。

の発現 ＭＴＸ３およびＭ　Ｔ　Ｘ　５．８らにＭｔｘ　ＤＨＦ
Ｒ挿入部を欠く３個の合計５個の大腸菌形質転換体は２
５μｇ／ｍｌトリメトプリム（８１ｇｍａ）を含むＬ−
寒天培地上の成長性が室温１５日でもよくなかった。こ
れらの形質転換体の成長は密度が希薄で不均一であった
。ＭＴＸ含（４８） Ｍグラスミドをもたない大腸菌ＬＥ３９２は同じ外観を
示した。

ＭＴＸ２とＭＴＸ４を含む１２個の大腸菌はトリメトノ
リムを含むＬ−寒天上同じ条件で密にびりしシ成長した
。これはＭＴＸ２とＭＴＸ４においてＭｔｘ　ＤＨＦＲ
が部分的または完全に発現したことを示している。

−内の配向 シラスミ　ドＭＴＸ２、ＭＴＸ　３、Ｍ　Ｔ　Ｘ　４お
よびＭＴＸ５を５ＡＵ３ＡＩとＢａｍＨＩによる消化に
よってさらに分析すると、ＭｔｘＤＨＦＲ挿入部が配向
しておｆｉ、ＭＴＸ２とＭＴＸ４のプラスミド中のＭｔ
ｘ　ＤＨＦＲ挿入部の転写はシラスミドのＨｉｎｄｌｌ
！領域からＢａｍＨＩ領域へと進行すること、これに対
しＭＴＸ３とＭＴＸ５の中のＭｔｘ　ＤＨＦＲ挿入部の
転写はベクター内を反対方向にＢａｍＨＩ部位からＨｉ
　ｎｄ　部位へ進むことが示される。この配向は第１図
および第２図でもつとはつきり説明される。第１図およ
び第２図から分るよう１１Ｃ１Ｍｔｘ　ＤＨＦＲ用ヌク
レオチド連鎖暗号はヌクレオチド連鎖内で中心から外れ
たところにＳａｕ　３　Ａ　Ｉ　１ｌｌＪ限位置をもっ
ている。ＢａｍＨＩとＳａｕ　３Ａ　Ｉを使って消化断
片の分析を行い、シラスミド内のＭｔｘ　ＤＨＦＲヌク
レオチド連鎖の配向を決定した。

シラスミド１所片の消化と分析を行う方法は同業の熟練
者には公知であシ、以下に簡単にまとめておく。各シラ
スミドはＢａｍＨＩで消化された。末端ホスフェートは
アルカリ性ホスファターゼ消化、次いでフェノール抽出
によりアルカリ性ホスファターゼを除去してとシさった
。残ったフェノールを繰り返しエーテル抽出して除いた
後、消化シラスミドＤＮＡをエタノール−酢酸塩で沈殿
させ、蒸留水に再溶解した。個々のシラスミドの末端ホ
スフェートの放射性標識化はＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ＢＲＬ）とＮＲｐ−標識化ＡＴＰを用い適当なキ
ナーゼ緩衝液中で行われ、次いで非（票識化入ＴＰを分
割添加した。放射性標識化後、混合物をフェノール、次
いでエーテルで抽出し、酢酸ナトリウム−エタノールで
沈殿させた（上述と同様）。５２ｐ−標識化末端ホスフ
ェート基をもつ各グラスミドは次いで適当な緩衝液中Ｓ
ａｕ　３　Ａエンストリクターゼ（旧ｏ１ａｂｓ）を用
いて、はぼ完全に消化されるまで十分時間をかけて処理
した。消化したプラスミドＤＮＡ断片はエタノールで沈
殿させて濃縮し、６％アクリルアミドｒル上適当な緩衝
液中で十分な時間をかけて処理し、移行してくるＤＮＡ
断片を分離した。ＢａｍＨＩ／５ａｕ３ＡＩ断片はＫｏ
ｄａｋ　Ｘ　−ＯＭＡＴ　ＡＲ−５フイルム上４．５日
間自動２ソオグラフイーにより可視化された。標準サイ
ズの対照ＤＮＡ断片を同じように処理してＢａｍ　ＨＩ
　／　５ａｕ３Ａ　ｌＤＮＡｌｌｉ片のサイズを計算し
た。

酵母菌真珠ＤＢｙ−７４６を１０μｙのノシスミＩ’Ｍ
ＴＸ２、ＭＴＸ３、ＭＴＸ４およびＭＴＸ５　（いずれ
もＭｔｘ　ＤＨＦＲ遺伝子をもっている）で形質転換し
た。（酵母菌真珠ＤＢＹ−７４６はカリホルニア州パー
クレー、カリホルモア大学、Ｒ，に、Ｍｏｒｔｉｍｅｒ
から人手した）。７ＥＰＤブロース５〇−中で成長させ
、最終光学密度６００ナノメーターで０．６〜０．７と
した酵母細胞を１０−の殺菌した１モルソルビトール溶
液で１回洗い、遠心分離して集めた。細胞ペレットを次
に４−ソルビトールプラス１０μｌβ−メルカプトエタ
ノール（Ｓｉｇｍｍ）中に３０℃で１５分間再懸濁させ
た。もう１回ソルビトール洗浄後、０，５ηソモリアー
−１！ｈ６０，０００酵素（Ｋｉｒｉｎ）で３０℃、６
０分間処理して細胞壁を除いた。細胞壁がなくなって球
状になったスフエログラスト酵母細胞は５０　ｍｌキャ
ップつきポリプロピレンチューブ中で無かくはんインキ
ュベーションを行い最高収率でえられた。スフェロプラ
ストは１０ｄソルビトールで洗浄し、４℃、１２（５１
） 分間１５００　ｒｐｍで遠心分離してえられた。

残ったりモリアーゼはさらに２０−のソルビトールで洗
浄することによって除去した。次いでスフェロプラスト
を１モル（Ｍ）ソルビトールを含む６７％ＹＥＰＤブロ
ース中で４５分間インキュベートし、次にソルビトール
洗浄、さらに１Ｍソルビトール、１０ｍＭＴＲｌ５緩衝
液、ｐｉ　７．５．１０ｍＭ塩化カルシウムの０．８−
溶液に再懸濁して形質転換させた。

酵母形質転換混合物は各プラスミドＤＮＡ約３〜５μｇ
１酵母スフエロプラス）　０．１　ｔｄと１０　ｍ　Ｍ
　Ｔ　ＲＩ　Ｓ　％ｐ）Ｉ　７．５．１０ｍＭ塩化カル
シウム中につくシ立てて無菌の４０チポリエチレングリ
コール４０００　（水性）ｌｔｎｌｄ液とを含んでいた
。グラスミドＤＮＡとスフェロプラストを室温で１５分
間予備的インキュベーション処理してから、１．５　ｍ
ｌ　Ｅｐｐｅｎｄ−ｏｒｆチューブ中で氷上少なくとも
１時間形質転換を行った。約０．１−の形質転換混合物
を（５２） １モルソルビトール、アミノ酸を含まない０．６７チ酵
母窒素塩基（Ｄｉｆａｏ）、２チグルコース（Ｂａｋｅ
ｒ　）、３％寒天（Ｄｉｆｃｏ　）、２０１１の硫酸ア
デニン、ウラシル、ヒスチジン、アルギニン、トリット
ファンおよびメチオニン、３０ＩＩｌ＆／Ｊのチロシン
、イソロイシン、およ上リンク、５０■／ｌのフェニル
アラニン、１１００１Ｒ／ｌのグルタミン酸とアスパラ
ギン酸、１５０１１９／ｌのバリン、２００〜／／のス
レオニンおよび３７５１１４９／ｌのセリンからなる再
生裸地１０−で希釈した。ヌクレオチドとアミノ酸はす
べてＳｌｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｇから購入した。再
生懸濁液を混合して、ソルビトール以外の全上記成分を
含む寒天上に注いだ。

形質転換体は３０℃で４日後にはみえるようになった。

酵１ひの形質転換体を再生グレートから集め、ロイシン
を含まない最小培地上に保持した。ロイシンなしで成長
する能力によって選択された酵母の形質転換体はグラス
ミドのＬＥＵ２遺伝子の存在を確認させるものであった
。このようにしてえもれだ酵母の形質転換体にはさらに
メントレギセート耐性のテストを行った。

メソトレキセート耐性をテストするために、酵母菌属の
成長に適しているが、ロイシンを欠いておす、シかも１
ｍＭのメソキセートを含有する最小培地を調製した。Ｙ
Ｅｐ１３、ＭＴＸ４またはＭＴＸ５７°２スミドのどれ
かをもつ３ｍの異なる酵母形質転換体をこの培地で成長
を確かめるに十分な時間をかけて培養した。ＹＥｐ１３
とＭＴＸ４含有酵母形質転換体の成育ははっきり禁止さ
れたが、ＭＴＸ５含有酵母形質転換体の成育は同じ禁止
状況を示さなかった。

実施例２ 調製 ＭＴＸ４ベクターＤＮＡの調・製 （５５） ＭＴＸ４プラスミドは上述のようにＢｉｒｎｂｏｉｒｎ
−塩化セシウムこう記法によって調製された。

約１５μｇのＭＴＸ４を７　ｍ　Ｍ　Ｔ　ＲＩ　Ｓ−ク
ロリド、Ｉ）Ｉ（７，５，７ｍＭ塩化マグネシウム、６
０ｍＭ塩化ナトリウムからなる５０μｌ溶液中、３７℃
で３．５時間Ｈ量ｎ　ｄ　ｌｌ　レストリクターゼ（Ｂ
ｌｏｌｍｂｇ　）　５単位で消化した。この反応混合物
に、２ＭＴＲｌ５−クロリド緩衝液１マイクロリツトル
、ｐ１１８．０を加えて、最終濃度４０ｍＭとし、さら
に子牛のアルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　３．３単位を含む１μぎを
加えた。この混合物を６５℃で２０分間インキュベート
し、あらかじめＴＲｌ５−塩化ナトリウム−ＥＤＴＡで
ｐＨ７，Ｑに保っておいたフェノールで１回抽出し、さ
らにクロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡを９５チ氷冷
エタノールノラス０．３モル酢酸ナトリウムで一３５℃
、４５〜６０分かけて２回沈殿させた。ＤＮＡを蒸留水
中に再懸濁させた。

（５６） 上のようにして見られたＭＴＸ４調製物１マイクロリッ
トルを全容２０μｌの適当な緩衝塩溶液中で２０〇単位
のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ（旧ｏ１ｍｂｍ）を用いて、室
温２時間処理してリダージョンのチェックを行った。最
終的に、すべてのホスファターゼ処理ＭＴＸ４は、適当
な標準物質とアガロースゲル電気透析を行って分析した
ところ、線状で残存していた。

しかし、未処理ＭＴＸ４調製物はほとんど全部がよシゆ
るやかな移行種への変換をしておシ、有効なリダージョ
ンが行われたことを示した。

最終のＭＴＸ４ベクターを１１μ！の蒸留水に再懸濁さ
せた。この点で、１０．７キロベースのベクターはＨｌ
ｎｄｌｌｌで切断された線状分子であシ、両端に非対塩
基をもち、末端ホスフェート基は除かれておシセルフリ
ｒ−ジョンができなくなっていた。

Ｈｌｎｄ　Ｉｌｌ　リンカ−による４８０塩基対断片の
調製 ４８〇−塩基対断片にもとはアグロバクテリウム　ツメ
ファシェンスしゅよう誘発ノラスミトＡ　６　（ｐＴｉ
Ａ６）ノ一部である。４８０−塩基対断片をつるために
、ｐＴｉＡ６を旧ｎｄｌｉレス）　ＩＪクターゼで消化
する。ＨＩｎｄ　ＩＩＩ末端をもつ２．７５ｋｂの断片
はアガロースゲル電気透析で単離される。２．７５ｋｂ
断片を電気溶出し、エタノール沈殿で濃縮し、蒸留水に
再懸濁する。２．７５ｋｂの断片ＤＮＡの一定量ＫＳａ
ｕ３ＡＩレストリクターゼ消化およびＳａｕ　３　Ａ　
Ｉレストリクターゼそのものに必要な塩類を補い、十分
な時間をかけて消化を完全に進める。２．７５ｋｂの断
片の消化混合物は多くの断片を含んでいるが、そのうち
わずか２ｓがＳａｕ　ａ　Ａ　Ｉおよび旧ｎｄｌｌ末端
をもっている。これら２４重の断片のうち１つが４８０
−塩基対断片である。

ｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩとＨｌｎｄｌｌで消化すると
ｐＲ４２６９がえられる。けん化すると、１個のＢａｍ
ＨＩ“粘着性”末端と１個のＨｌ　ｎｄｌｌ“粘着性”
末端とをもつ線状ＤＮＡ断片かえられる。この断片を適
当なリグ−ジョン用緩衝液中でＴ４りが−ゼとＡＴＰと
一緒に、前にえられた２、７５ｋｂ断片のＳａｕ　３　
Ａ　Ｉ消化混合物でインキュベートする。ＢａｍＨＩ“
粘着性”末端は５ａｕ３Ａ１末端と適合性があるから、
５ａｕ３ＡＩ末端と旧ｎｄｌ末端をもつ２つの断片はつ
なぎ合わされてＢａｍＨＩ　／　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ消化
性ｐ　Ｂ　Ｒ３２７になル、共有的に閉環した（ＣＣＣ
）ＤＮＡプラスミドを生ずる。２つのＣＣＣｆラスミド
のうち、４８〇−塩基対断片をつなぎ合わせたものをｐ
Ｒ４２６９とよんでいる。

同業の熟練者によく知られている技法（参照：　ＢＲＬ
　Ｕｓｅｒ　Ｍａｎｎａｌ、　Ｍ　１３クローニング／
ジデオキシ”連続マニュアル１９８０ＢＲＬＩｎｃ、、
　Ｇａｌｔｈａｒｂｕｒｇ％Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０７
６０　）を用いて４８０−塩基対断片の連続分析を行い
次の連続列をえた：式中ＪはＣまたはＧ、Ａはアデニン
、Ｔはチミン、Ｃはシトシン、そしてＧはグアニンであ
る。

（５９） ４８０塩基対断片は大腸菌プラスミドｐＲ４２６９から
切り取られたものである。Ｌ述のＢｉｒｎｂｏ１ｍ塩化
セシウム法で見られた、プラスミドＤＮＡ２５μｍを含
むｐＲ４２６９の１００マイクロリツトルを１０単位の
Ｈｌｎｄｌ［レストリクターゼで１５０μｌ　Ｉ（１ｎ
ｄ　ＩＩ緩衝塩中３７℃、約１１時間かけて消化した。

塩化ナトリウムとＴＲｌ５−クロリドをｐＨ７，０で追
加して最終濃度を各１００ｍＭおよび２０　ｍ　Ｍにし
て後、８単位のＢ、ａｍ　ＨＩ　レストリクターセを消
化液に加えた。３７℃で９時間反応させた後、さらにＢ
ｉｎｄｍ５単位とＢａｍ　ＨＩ　４単位を追加した。３
７℃で１２時間後、消化液にさらに５単位のＨｉｎｄ　
ｌ［と４単位のＢａｍ　ＨＴを補充し、３７℃で３時間
消化させた。４８０塩基対断片を０．７１アガロースゲ
ルを適当な緩衛液中で２時間１２５ボルトかけて電気溶
出した。４８０塩基対断片をフェノールで３回、クロロ
ホルムで３回抽出して精製し、実施例１（Ｊ：述）に用
いたのと同じ条件でエタ（ａＯ） ノールで２回沈殿させた。このようにして見られた精製
４８０塩基対断片は約０．２μｔ／ｍｔの濃度で蒸留水
５０μｔに再懸濁させた。

４８〇−塩基対断片は１個のＨｌｎｄ　ＩＩ’［カット
末端と１個のＢａｍ　ＨＩカット末端をもっていた。４
８〇−塩基対断片の端末非対塩基を補うために、約３μ
ｔ　の４８０−塩基対断片を各０．２ｍＭのデオキシア
デノシン−５′−トリホスフェート、デオキシフケジン
−５′−トリホスフエート、デオキシチミジ７−５’−
）リホスフエート、およびデオキシグアノシン−５′−
トリホスフェート（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｇ　）の２０ｍＭβ−メルカプトエタノール、６０ｍ
ＭＴＲｌ８−クロリド、ｐＨ７，５、および８ｍＭ塩化
マグネシウムを含む全反応容積約２２μを中で、約１０
単位のＫｌｅｎｏｗ　断片酵素（Ｂ　ＲＬ。

大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなサブユニット）で
インキュベートした。１６℃で６０分処理後、混合物を
１０〜１２分間６５℃に加熱して不活性化した。

４８〇−塩基対断片をＨｌｎｄ　Ｉｆ　リンカ−につな
ぎ合わせるまえに、実施例１に用いたのと同じ方法でリ
ンカ−分子に末端ホスフェート基を再生させた。ただし
、前例では！　！　ｐ−標識化ＡＴＰを用いたが、今回
はその代わりに未標識のＡＴＰを用いた。４８〇−塩基
対断片をつなぎ合わせるために、約３μｔの４８０−塩
基対断片を含むポリメラーゼ混合物２２μｔをリンカ−
の断片に対するモル比対１００：１でＨｌｎｄ　ｍ　リ
ンカ−混合物１０μｔに加えた。この溶液に６６ｍＭＴ
Ｒｌ５−クロリド、ｐ）ｉ７．５．６６ｍＭ塩化マグネ
シウム、１０ｍＭジチオスレイトール、０．６Ａｔの１
０ｍＭＡＴＰ。

１μｔの０．２ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１
００単位のＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼからなる４
μｔの溶液を加え全体を４０μｔにした。混合物を２０
〜２２℃で９時間インキュベートし、さらに１００単位
のりガーゼを補ってからもう４０時間インキュベートし
た。

Ｈｉｎｄｌｌｌ’粘着性′末端をもった４８〇−（６３
） 塩基対断片はすぐＬで見られたリゲージョン混合物を、
塩化ナトリウムを直接リゲージョン溶液に加えて減容を
蒸留水で５０μｔに調整した後、１０単位のＨｌｎｄＩ
ＩＩ　レストリクターセ酵素で３７℃、４時間処理して
えられた。

Ｈ１ｎｄｍ’粘着性“末端基をもつ４８〇−塩基対断片
は１００ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭスペルミン（シ
グマ）の存在で０℃、１５分間エタノールで沈殿させる
ことによってフリーリンカ−と分離された。１０分分間
時遠心分離してペレットを集め、２００ｍＭＴＲｌ５−
クロリド、ｐ）１７．５．７　ｍ　Ｍ塩化マグネシウム
、１モル塩化ナトリウムおよび２ｍＭβ−メルカプトエ
タノールの５μを中に再懸濁させた。

この溶液を蒸留水４５μｔで希釈し、５ｍＭスペルミン
で２回再沈殿させた。４８〇−塩基対断片を１５０ｍＭ
ＴＲｌＳ−クロリド、ｐＨ８，０゜５０ｍＭ塩化マグネ
シウム、２５６ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭβ−メル
カプトエタノールおよび２５０μ２／−の牛の血清アル
ブミン（６４） （ＢＲＬ）を含むリガーゼ緩衝液８μｔに再懸濁させた
。

このようにして見られた両端にＨｌｎｄ　ＩＩＩ　リン
カ−をもつ４８〇−塩基対断片を１ｍＭＡＴＰ中リガー
ゼアリガーゼ、断片から多量体が生じ、これをＨｉｎｄ
　ｍ消化すると単量体積になった。Ｂａｍ　ＨＩレスト
リクターゼも多量体を単量体に変えたが、これは断片の
末端Ｂａｍ　ＨＩ部位がリゲージョンでＨｉｎｄ　ｍ　
リンカーンに再構成されたことを示すものである。

４８〇−塩基対断片に用いたとはｔホ同じ方法でＨｌｎ
ｄ　ｌｌｌ制限酵素によってあらかじめ消化しておいた
約５μｔのＭＴＸ４プラスミドを、その両端にＨｌｎｄ
　■　リンカ−をも９４８０−塩基対断片０．４μ２に
加えた。３０ｍＭＴＲｌ５−クロリド、ｐＨ８，１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭβ−メルカプトエタノー
ル、５ｏｎｆ／−牛血清アルブミン、１　ｍ　Ｍ　Ａ　
Ｔ　Ｐ（６５）・ および２００単位の７４ＤＮＡリガーゼを含む全容積４
０μｔの中でリゲージョンを行った。

２０℃で２時間後、混合物を１ｏ分間６５℃に加熱１７
て不活性化した。リゲージョン混合物３０マイクロリッ
トルをその″！、マ用いて大腸菌細胞を形質転換させる
ことにした。

大腸菌細胞の形質Ｕ 菌種ＬＥ３９２の大腸菌に、大腸菌のＭ　ｔ　ｘ　ｒＤ
ＨＦＲリゲーション生ジョで形質転換することについて
、例１に記載しだのとほぼ同じ方法で、トにえたプラス
ミドを用いて形質転換を施した。ただし、形質転換に用
いた混合物には４８〇−塩基対断片をつなぎ合わせたＭ
ＴＸ４を含んでいることが違うところである。

クローン分析 形質転換でえられた２００のアンピシリン耐性コロニー
に対して１混成化研究による特性化“という項で実施例
１に既述したコロニー混成化法を用いて４８〇−塩基対
断片のス（６６） クリーニングを行った。ただし、ニック翻訳によって生
じたｌ１ｌｐ標識４８〇−塩基対断片を用いた点だけが
異なっている。

３！ｐ−標識４８〇−塩基対断片に混成化したＤＮＡを
含む１１のコロニーを挿入コピ一番号と配向について分
析した。プラスミドＤＮＡはＢｌｒｎｂｏｌｍ　ａｔ　
ａｌの修正法を用いてＬ−ブロースプラス１００μｍ／
−アンピシリン（Ｓｉｇｍａ　）中で成長した１、　５
１ｎｔの細胞から単離されたものである。修正法では、
透明なＥ澄液からのプラスミドＤＮＡはエタノールで沈
殿させ、１０ｍＭＴＲｌ５．ｐＨ８，１００マイクロリ
ツトル中に再懸濁させ、次いで塩化セシウムこう配で精
製する代わりに、３０分間３７℃で１００μｍ／−のり
ボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ　）で処理した。プラスミ
ドサイズの計算には２５μｔのプラスミド溶液をそのま
ま使って０，８チアガロースゲルにつけて行った。

９つのクローンが１０．７ｋｂより大きいプラスミド溶
液っていた。９つのクローンからの各（６７） プラスミドをエタノール沈殿に次いで脱イオン水１０マ
イクロリツトルに懸濁させてＢａｍＨＩ制限酵素で消化
した。３７℃、３時間のＢａｍ　ＨＩ消化に続いて、各
プラスミドサンプルの半量（容ｆ＊）をエタノールで沈
殿させ、脱イオン水４４μｔに溶かし、次いで適当な緩
衝塩中３７℃、３時間、３〜６単位のｐｓｔＩレストリ
クターゼ（Ｂｉｏｌａｌｌｓ　）　処理した。各プラス
ミドサンプルのＢａｍ　ＨＴおよびｐｓｔＩ消化物のエ
タノール沈殿物は１．０チアガロース中、７５ボルトで
５時間処理された。クローニングを行うベクター７Ｅｐ
１３の消化物により、既知の長さと数の断片を生じ、こ
れによって分子サイズの標準が与えられ、消化の完全進
行を確認できた。あらかじめＢｉｎｄ　■で消化したラ
ムダＤＮＡと同じくあらかじめＨｌｎｆ　Ｉ　で消化し
たｐＢＲ３２７プラスミドＤＮＡは断片サイズの標準と
して役に立った。

挿入体の配向は次の方法で４８０−塩基対断片の特定端
に起こる特異的再構成りａｍ　ＨＩ（６８） 部位の地図を描くことによって決定できた。

４８〇−塩基対断片のＢａｍ　’粘着性“端は５′ＧＡ
ＴＣＣ３’−等の連鎖列をもっている。この蟻粘着性ｌ
端は官能性Ｒａｍ制限部位となり、連鎖列５’ＣＡＡＧ
ＣＴＴＧ３’−等をもったＨｉｎｄｍリンカ−に連結す
ると、５’ＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣ３’等を与える
５′ＧＧＡＴＣＣ３′−等の連鎖列をもっている。Ｈ１
ｎｄＴＩＩリンカ−の３′−末端グアノシン残基がＢａ
ｍ　ＨＩ粘着端の５′−始発グアノシン残基として働き
、それによってＢａｍＩＩ制限部位を再構成するのであ
る。ベクター辷の第２　ｐａｔ）制限（制限）部位に関
するタンデム型Ｈ１ｎｄ　ｍ／　Ｂａｍ　ＨＩ部位の局
在化は挿入物の配向決定に用いられた。

ＭＸ４／４２６９プラスミドの分析 ＭＴＸ４プラスミドに４８０−塩基対断片をつなぎ合わ
せてえたＭＴＸ４／４２６９−５　というプラスミドを
ｐｓｔ　■およびＢａｍ　ＨＩレストリクターゼで消化
し、断片をＦ述したような方法で１．０チアガロースゲ
ルｔで展開した。次の大体のサイズの５つの断片に展開
された：　４．６ｋｂ、　３．５ｋｂ、　０．９ｋｂ、
　２．２ｋｂ、および０゜３８ｋｂ　０第４図はＭＴＸ
４／４２６９−５からえられた断片に対する制限地図で
ある。

２．２ｋｂ断片は４８〇−塩基対断片とベクターＤＮＡ
からなるものである。２．２　ｋ　ｂ断片は上述の再構
成りａｍ　ＨＩ部位のＢａｎ　ＨＩ消化と、ベクターＤ
　Ｎ　Ａ　ｐ　ｓ　ｔ　■部位の一つのｐｓｔＩ消化に
よって生じたものである。再構成りａｍＨＩ部位はその
中にＭｔｘｒＤＨＦＲヌクレオチド連鎖をもつ０．３８
ｋｂ断片の隣りにおる。

プラスミドＭＴＸ４／４２６９−２　をＭＴＸ４／４２
６９−５と同じ方法で処理した。次のサイズの５つの断
片が展開された：　４，６ｋｂ、　３．５ｋｂ、１．６
５ｋｂ、および０．８ｋｂ０第５図はこれらの結果を示
す制限地図である。１．６５ｋｂの断片はベクターＤＮ
ＡｐｓｔＩ部位の一つのｐａｔ　消化と、隣りの再構成
りａｍ　ＨＩ部位のＢａｍ　ＨＩ消化によって生じたも
のである。

０．８ｋｂの断片け４８〇−塩基対断片とその中にＭｔ
ｘｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖暗号をもつＤＮＡ断片
からなるものである。

もう一つのプラスミドＭＴＸ４／４２６９−１３をＭＴ
Ｘ４／４２６９−２と同じ方法で消化し、４．６ｋｂ。

３．５ｋｂ、　１．６５ｋｂ、　０．９ｋｂ、　０．８
ｋｂ、および０．４５ｋｂの６断片を生じた。第６図は
これらの結果を示す制限地回である。０．４５ｋｂの断
片はＭＴＸ／４２６９−２の単一４８０−塩基対断片と
同じ方向にタンデム挿入された少なくとも２つの４８０
−塩基対断片の存在を示唆している。

もう一つのプラスミドＭＴＸ４／４２６９−１　をＭＴ
Ｘ４／４２６９−１３と同じ方法で消化し、４，６ｋｂ
、　３．５ｋｂ、　０．９ｋｂ、　２．２ｋｂ、　０．
３Ｆ！ｋｂ、および０．４５ｋｂの６断片を生じた。第
７図はこれらの結果を示す制限地図である。１．５ｋｂ
の断片はＭＴＸ／４２６９−１３のタンデム挿入された
４８〇−塩基対断片と反対方向にタンデム挿入された４
８〇−塩基対断片の存在を示唆するものである。

（７１） 酵母ＤＢＶ−７４６のＭＴＸ／４２６９−５プラスミド
ＭＴＸ４／４２６９−５．　ＭＴＸ４．　ＭＴＸ５、お
よびｙＥｐ１３を用いたほかは、実施例１においてすで
に述べたと同じ方法を用いて酵母ＤＢ）’−７４６　の
形質転換を行った。

酵母スフェロプラスト５０　ｍｌからプラスミドＤ　Ｎ
　Ａ　ｆ：Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　ａｌの修正法で抽
出した。酵母はあらかじめロイシンを含まない最小培地
で成長させ、５℃で２０時間貯えておイタモのでおり、
スフェロプラストは既述の方法を改良してえられた。洗
浄細胞は１Ｍソルビトール、２５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍジチオスレイトール、　ｐＨ８，０，の１／２０容積
に、３０℃で１０分間再懸濁させた。細胞をンルビト−
ルで洗浄してから、１Ｍソルビトール、０．１Ｍくえん
酸ナトリウム、　ｐＨ５，０，１０ｍＭＥＤＴＡおよび
５　ｐｆ　／　ｍｌｌｌモジアーゼ６０，０００　（Ｋ
ｌｒｌｎ）（７２） からなる１／２０容積の溶液中、３０℃で２０分間部分
的に消化させた。５ｏｒｖａｌｌ　Ｓ　Ａ−６００ロー
ターに入れ０℃で３０分間１５，０００　ｒｐｍで遠心
分離して透明なし澄液をえた。ＤＮＡをエタノールで沈
殿し、次に３７℃で３０分間緩衝液プラス４０μｆ／ｒ
ｎ１．ＲＮａ５ｅ　Ｔ　（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した
。さらにエタノールで沈殿させ、ＤＮＡを含む部分をフ
ェノールで３回、クロロホルム／イソプロピルアルコー
ル（２４＝１）で１回抽出し、エタノールで再沈殿させ
た。

酵母スフェロプラストから抽出したプラスミドＤＮＡ含
有物を０．７チアガロースゲルＬ１２５ボルトで１．７
５時間処理し、次にニトロセルロースフィルターシート
ニ移シて５ｏｕｔｈｅｒｎ混成化を行った。酵母ＤＮＡ
濾過物をデキストランサルフェートホルムアミド法（Ｗ
ａｈｌ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、　Ｓ、ＵＳＡ　
（１９７９）７６：３６９３−３６８Ｆ）によって、別
々の実験で、■ｐ−放射性標識化ｐ　ＢＨ３２７，ＭＴ
Ｘ５゜およびＭｔｘ　ＤＨＦＲヌクレオチド連鎖の検体
に対して混成化を行った。放射性標識化検体は実施例１
に既述したようなニック翻訳法で見られたものである。

３２ｐ−標ｓｔ＆化ｐＢＲ３２７検体への混成化によっ
てｙＥｐｔａ、ＭＴＸ４．ＭＴＸ５およびＭＴＸ４／４
２６９−８　の全４プラスミドが検出された。標準とし
て用いたＨｉｎｄＩＩＴ−消化ラムダＤＮＡに対するプ
ラスミドの相対移行の分析により、酵母細胞中ではプラ
スミドサイズの変化が検出されなかったことが分かる。

予期した通り、ｙ　Ｅ　ｐ　１３を除（ＭＴＸ４．ＭＴ
Ｘ５およびＭＴＸ４／４２６９−５は放射性標識化Ｍｔ
ｘｒＤＨＦＲ検体による混成化で検出された。

形質転換酵母から抽出したプラスミドの放射性標識化Ｍ
ＴＸ５による混成化は同じ結果であった。さらに、４つ
のプラスミド含有物すべてにＭＴＸ５検体に強く混成す
る高度の易動性種があったことから、ｙＥｐ１３のプラ
スミドの内生２ミクロン部分であろうと推論された。

プラスミドＭＴＸ４．ＭＴＸ５．ＭＴＸ４／４２６９−
５または７Ｅｐ１３の一つで形質転換された酵母細胞を
ｔ記のように処理してスフェロプラストにした。スフェ
ロプラストをヌクレアーゼ活性の禁止剤を含む緩衝剤中
で分解した。分解緩衝液は５０ｍＭ　ＴＲｌ５．ｐＨ７
，５，５０ｍＭＮａｃＬ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ　β−メルカプトエタノール、１％ＳＤｓおよび１チ
ジエチルピロカーボ４−）（ＤＥＰＣ）を含むものであ
った。混合物をフェノールで抽出し、ＤＮＡ５ｅ　で処
理してＲＮＡの純サンプルをえた。

全酵母細胞ＲＮＡを各形質転換酵母から単離し、変性し
、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルｔで処理してか
ら、ニトロセルロースフィルターに移して、３！ｐをも
つＭ　ｔ　ｘ　ｒＤＨＦＲ用デオキタデオキシヌクレオ
チド連鎖暗号５） 酸化させた。３つのＭｔｘｒＤＨＦＲクローン、すなわ
ちＭＴＸ４．　ＭＴＸ５およびＭＴＸ４／４２６９−５
のＲＮＡへの完全な混成化が認められた。

検体とｙＥｐ１３または酵母のリポソームのＲＮＡとの
間の混成化はごくわずかしか認められなかった。

４つの形質転換体からのＲＮＡのゲルパターンも８ｔｐ
−標識化４８〇−塩基対断片ＤＮＡの検体で混成化され
た。完全な混成化が起こったのはＭＴＸ／４２６９−５
だけであった。さらに、不連続バンドは３１ｐ−標識化
４８〇−塩基対検体に強く混成化したＭＴＸ４／４２６
９−５ＲＮＡのゲルにのみ関係するものでおって、この
ことから、４８〇−塩基対断片の少なくとも一部は酵母
中に転写されることが分かる。

転写のストランド特性を決定する実験により、４８〇−
領域におけるかなりな量の転写が翳正しい！ストランド
からくるものであることが分かる。

（７６） ４８〇−塩基対１左（７）Ｍｊ−人）仝立ムヱーニング ＭＴＸ５ベクターＤＮＡの調製 ＭＴＸ５プラスミドはと述したような、Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ−塩化セシウム法で調製した。ＭＴＸ５プラスミドＤ
ＮＡ約１８．６μりを適当な塩２００マイクロリットル
中にＢａｍ　ＨＩ　（ＢＲＬ）２ｅ単位を含む液で、３
７℃、１６時間かけて消化した。消化が完全に行われた
ことは、０．８チアガロースゲルト単一１１．２ｋｂバ
ンドが出たことで示された。消化したＭ　Ｔ　Ｘ　５　
ＤＮＡを電気溶出し、エタノールで２回沈殿させ、２５
μｔの蒸留水に再懸濁させた。

再懸濁させた消化ＭＴＸ５の約１５μｔ　（１０１２μ
Ｆ）　を３０ｍＭ　ＴＲｌ５−クロリド、　ｐＨ７，８
中、子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ３．３単位で
６５℃、１５分間処理して末端ホスフェートを除いた。

混合物をＭＴＸ４について七に述べたような方法で抽出
、沈殿させた。ホスファターゼ処理ＭＴＸ５けアガロー
スゲル電気透析で分析して分かるように線状で残ってい
るが、未処理ベクターは標準的リゲージョン条件では運
行仲種を生じた。線状ＭＴＸ５調製物を１５μｔの蒸留
水に再懸させた。

Ｂａｍ　ＨＩリンカ−による４８〇−塩基対断片の調製 ４８〇−塩基対断片的３μｍを前述したようにして、Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片酵素を使って完全に二重らせん化した。

Ｂａｍ　ＨＩオクタヌクレオチドリンカー（Ｃｏ１１ａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）約５μ２を非
標識化ＡＴＰを用いてホスフォリル化した。

ホスフオリル化Ｂａｍ　ＨＩリンカ−をＭＴＸ４のとこ
ろで説明したようにして４８〇−塩基対断片につなぎ合
わせた。ただし、リゲージョンは室温（２０℃〜２２℃
）で１６時間行い、その後１０分間６５℃に加熱して不
活性化した点がちがう。

二重らせん４８〇−塩基対断片とホスフオリル化Ｂａｍ
　ＨＩリンカ−を含む混合物３５μｔに最終濃度塩化ナ
トリウム１００ｍ１００ｍＭＸＢａ単位になるように追
加し、次に蒸留水を加えて全容積を５０μｔにした。３
７℃、４０時間の処理でＢａｍ　ＨＩ端をもつ４８０−
塩基対挿入体がえられた。スペルミン沈殿法（Ｈｏｏｐ
ｅａ。

Ｂ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｗ、　Ｒ，ＭｃＣｌｕｒｅ　、　１
９８１．　Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄり叶。

９　、５４９３−５５０４）によって遊離リンカ−を除
いた。Ｂａｍ　ＨＩ末端をもつ精製４８〇−塩基対断片
を６μｔのリガーゼ緩衝塩に再懸濁させた。一定量の断
片調整物をＴ　４１ＪガーゼとＡＴＰで処理すると多量
体を生じた。１３ａｍ　ＨＩは多量体を単量体へ変えた
が、Ｈｌｎｄｍは変えなかった。このことから、４８０
１塩基対断片の末端Ｈ１ｎｄ　ｍ部位はリンカ−によっ
て再構成されないことが分かる。

Ｂｑｍ　ＨＩ一連結４８〇−塩基対挿入体２．５μＦを
リガーゼ緩衝塩、１．０ｍＭＡＴＰおよび２００単位の
Ｔ４リガーゼからなる３０μを溶液中、前述のようにし
て、ＭＴｘベクター５μｔ　につなぎ合わせた。

（７９） 大腸菌の形質転換 Ｅ記のリゲージョン混合物おのおの１５マイクロリツト
ルを使って、拮抗するＬＥ３９２大腸菌細胞２００　ｐ
Ｌの形質転換を行った。形質転換体を１００μＶ／−ア
ンピシリン含有Ｌ−寒天Ｅで選別した。

ＭＴＸ５／４２６９７クローンの分析 ９つのアンピシリン耐性大腸菌コロニーからとったプラ
スミドを前述のようにして、Ｂｉ　ｒｎｂｏ　ｉｍ法で
単離した。４８〇−塩基対断片の配向はベクターのｐｖ
ｕｌ’（部位に関して４８〇−塩基対断片の単一内部ｐ
　ｖ　ｕ　ｌｌ’［制限部位を地図に書くことによって
定性的に決定した。

４８〇−塩基対断片のｐｖｕ［部位は４８０−塩基対断
片の’　Ｂａｍ端“から１５０−塩基対位のところにあ
る。したがって、４８〇−塩基対断片の一つの配向は反
対向きの４８０−塩基対断片のｐｖｕ■断片より約３０
０−塩基対大きなｐｖｕｌｌ断片を生ずるものと予想さ
れた。ＭＴＸ５／４２６９プラスミドをＨｉｎｄ　ｌ’
［緩（８０） 衝塩中、３７℃、３時間、６単位のｐｖｕｌ’）で消化
し、次いで１％アガロースゲルｔで分離した。３つのプ
ラスミドが約９．２ｋｂと約１．９ｋｂの消化断片を与
えたが、これは４８０−塩基対断片がＭＴＸ５／４２６
９Ａ（第８図）に示すように配向していることを示すも
のである。

６つのクローンは約９．２ｋｂと約１．６ｋｂの断片を
もっていたが、これは４８０−塩基対断片がＭＴＸ５／
４２６９Ｃ（第９図）に示すように配向していることを
示している。６つのコロニーからのＤＮＡはすべて８ｔ
ｐ−標覚化４８０−塩基対断片に対する相同性を示すも
のであった。

すでに説明および例で示したことから、同業の熟練者に
は容易に分かることだが、Ｌ記のプラスミドはもっと一
般的な用途をもっている。たとえば、本発明ではマーカ
一連鎖としてメソトレキセート耐性のジヒドロ葉酸レダ
クターゼを用いたが、その他ののぞみの遺伝子生成物用
のヌクレオチド連鎖または連鎖暗号をもつＤＮＡ断片を
使うこともできる。

したがって、ヒ記ＭＴＸ’ＤＨＦＲヌクレオチド連鎖以
外のマーカ一連鎖を、形質転換すべき宿主の特性や利用
者の必要に応じて使えによいわけである。たとえば、宿
主に毒性を有する物質に対して耐性をもつＤＮＡ連鎖を
使うことができる。このような連鎖は同業者には公知の
もので、抗生物質耐性、重金属耐性、などいろいろある
。このようなマーカーは本発明の範囲内にあるものと考
えてよいものである。さらに、アンピシリン、テトラサ
イクリン耐性やＬＥＵ２用ｙＥｐ暗号の初期選択性マー
カ一連鎖が使われているが、その他の初期選択性マーカ
ー類も他の混成プラスミドに利用可能ならば使用してよ
いのでおる。

前述したことからまた、マーカー特性以外の所期の遺伝
子生成物用のヌクレオチド連鎖暗号をもつＤＮＡ断片を
場合によってはマーカーヌクレオチド連鎖と一緒に、あ
るいはマーカーヌクレオチド連鎖の代わりに使ってもよ
いことが明らかである。前者の場合、アミノ酸生産性の
増強というような選択の容易でない特性は、マーカーヌ
クレオチド連鎖と一緒に、またはその隣りにプラスミド
のなかへ入れて、形質転換宿主の選択はマーカーを利用
して行うのがよい。後者の場合は、所期の遺伝子生成物
用のヌクレオチド連鎖をもつＤＮＡ断片をマーカーでな
くプラスミドに入れるのがのぞましい。

これまで述べたベクター系の特にすぐれた点の一つは原
核生物宿主と真核生物宿主の間の往復可能性である。す
なわち、所期のヌクレオチド連鎖をもったベクターがイ
ンビトロで組み立てられ、原核生物の宿主に形質転換を
起こさせて複製させ、原核生物器官の世代循環のサイク
ルが短いために原核生物宿主中で急激に増殖する。この
ようにして増殖したベクターは次に原核生物の宿主から
高コピーナンバーで回収され、インビトロで真核生物の
宿主の形質転換に利用することができる。

したがって、原核生物の宿主を使ってベクターを増殖さ
せ、次に増殖したベクターを使って真核生物の宿主の形
質転換を行うことによって、短期間に大量の真核生物の
形質転換体をうろことが可能になる。

同業者にはよく知られていることだが、植物プロモータ
ーを含むヌクレオチド連鎖を他の真核生物または原核生
物起源あるいは機能をもつプロモーターで置換できるこ
とも明らかである。ここで電機能“なる用語について述
べると、これは真核生物の細胞から導かれたものではな
いが、しかも真核生物の細胞内においてＲＮＡの複製に
おけるプロモーターとして作用するようなプロモーター
のことである。たとえば、アグロバクテリウム　ツメフ
ァシェンスのＴＩ　プラスミドから導かれたプロモータ
ーなどがこれでおる。これらのプラスミドは宿主である
植物細胞の複製装置を使って各種のＲＮＡを直接合成し
ている。

（８３）

【図面の簡単な説明】

第１図はその中にＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌクレオチド連鎖
暗号を含むＭＴＸ４プラスミドの模式的制限地図であり
； 第２図はＭＴＸ４の変種であるＭＴＸ５の模式的制限地
図であり、この中にはやはりＭｔｘｒＤＨＦＲ用ヌクレ
オチド連鎖暗号をもっている。 第３図はｙＥｐ１３の模式的制限地図でアリ；第４図は
ＭＴＸ４／４２６９−５　の模式的制限地図であり； 第５図はＭＴＸ４／４２６９−２　の模式的制限地図で
めり； 第６図はＭＴＸ４／４２６９−１３の模式的制限地図で
あり； 第７図はＭＴＸ４／４２６９−１　の模式的制限地図で
あり； 第８図はＭＴＸ５／４２６９Ａの限定された制限地図で
あ秒；そして 第９図はＭＴＸ５／４２６９Ｃの限定された制（８４） 限地図である。 代理人　弁理士　桑　原　英　明 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　＠１９８３＊１月３田［相］米国（Ｕ　Ｓ　）＠４
６２７３１■発　明　者　ジョン・アントニー・　アメ
リカ合衆国　力ｌホワード　ビーチヴユ−２６２ ４８３− リフオルニア　９４０４４　パシフィ力、＃２ （０発）手続補正書（方式） 昭和ｇｑ年Δり−３日 特許庁長Ｍ　若杉札夫　殿 １、事件の表示 特願昭５９−１４５４２号 ３、補正をする者 事件ｉの関係　瞥肝出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１個のＤＮＡ断片および少なくとも１個
   の初期選択可能なマーカーの挿入部位を少なくとも１個
   有する、少なくとも１個の原核生物および真核生物の宿
   主に形質転換を行うに適した組み換えプラスミド。 ２、　さらに該挿入部位につなぎ合わされた少なくとも
   １個のＤＮＡを特徴する特許請求の範囲第１項記載のプ
   ラスミド。 ３、少なくとも１個の該ＤＮＡ断片が、所期の遺伝子生
   成物用の少なくとも１個のヌクレオチド連鎖暗号をもっ
   ている、特許請求の範囲第２項記載のプラスミド。 ４、該所期の遺伝子生成物がマーカーである、特許請求
   の範囲第３項記載のプラスミド。 ５、　該マーカーがメントレキセート耐性ジヒドロ葉酸
   レダクターゼである、特許請求の範囲第４項記載のプラ
   スミド。 ６、さらに、少なくとも１個の該ヌクレオチド連鎖の近
   傍にプロモーター用の暗号をその一部にもつヌクレオチ
   ド連鎖を特徴する特許請求の範囲第２項記載のプラスミ
   ド。 ７、　プロモーター用暗号をその一部にもり該ヌクレオ
   チド連鎖が、次の基本連鎖を有する、特許請求の範囲第
   ６項記載のプラスミド。 ８、該プロモーターが真核生物のプロモーターとしての
   機能を有する、特許請求の範囲第６項記載のプラスミド
   。 ９、該プロモーターが真核生物のプロモーターである、
   特許請求の範囲第６項記載のプラスミド。 １０、該プロモーターが植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第６項記載のプラスミド。 １１、さらに、メソトレキセート耐性のジヒドロ葉酸レ
   ダクターゼ用の少なくとも１個のヌクレオチド連鎖暗号
   の近傍に、その一部にプロモーター用暗号をもつ、ヌク
   レオチド連鎖を特徴する特許請求の範囲第５項記載のプ
   ラスミド。 １２、その一部にプロモーター用暗号をもつ該ヌクレオ
   チド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範囲第
   １１項記載のプラスミド。 １３、該プロモーターが真核生物のプロモーターとして
   機能する、特許請求の範囲第１１項記載のプラスミド。 １４、該プロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第１１項記載のプラスミ　ド。 １５、該プロモーターが植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第１１項記載のプラスミド。 １６、（ａ）真核生物起源複製体を含む第１　ＤＮＡ領
   域、と （ｂ）原核生物起源複製体を含む第２ＤＮＡ領域 とからなる、特許請求の範囲第１項記載の組み換えプラ
   スミド。 １７、該挿入部位が該第１　ＤＮＡ領域と該第２ＤＮＡ
   領域との間にある、特許請求の範囲第１６項記載のプラ
   スミド。 １８、さらに該挿入部位につなぎ合わせた少なくとも１
   個のＤＮＡ断片を特徴する特許請求の範囲第１７項記載
   のプラスミド。 １９．少なくとも１個の該ｒ）ＮＡ断片が所期の遺伝子
   生成物用の少なくとも１個のヌクレオチド連鎖からなる
   、特許請求の範囲第１８項記載のプラスミド。 ２０、該所期遺伝子生成物がマーカーである、特許請求
   の範囲第１９項記載のプラスミド。 ２１、該マーカーがメソトレキセート耐性のジヒドロ葉
   酸レダクターセである、特許請求の範囲第２０項記載の
   プラスミド。 ２２、さらに少なくとも１個の該ヌク、レオチド連鎖の
   近傍にプロモーター用暗号をその一部としてもつヌクし
   ・オチド連鎖を特徴する特許請求の範囲第１８項記載の
   プラスミド。 ２３、その一部にプロモーター用暗号をもつ該ヌクレオ
   チド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範囲第
   ２２項記載のプラスミド：２４、該プロモーターが真核
   生物のプロモーターとして機能する、特許請求の範囲第
   ２２項記載のプラスミド。 ２５、該プロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第２２項のプラスミ　ド。 ２６、該プロモーターが植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第２２項記載のプラスミド。 ２７、さらに少なくとも１個の該ヌクレオチド連鎖の近
   傍にプロモーター用の暗号をその一部としてもつヌクレ
   オチド連鎖を特徴する特許請求の範囲第２１項記載のプ
   ラスミド。 列、その一部がプロモーター用暗号である該ヌクレオチ
   ド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範囲第２
   １項記載のブラスミド：２９、該プロモーターが真核生
   物のプロモーターとして機能する、特許請求の範囲第２
   １項記載のプラスミド。 ３０、該プロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第２１項記載のプラスミド。 ３１、該プロモーターが植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第２１項記載のプラスミド。 ３２、該第１ＤＮＡ領域が真核生物起源で、かつ該第２
   ＤＮＡ領域が原核生物起源である、特許請求の範囲第１
   ６項記載のプラスミド。 ３３、該挿入部位が該第１　ＤＮＡ領域と該第２ＤＮＡ
   領域との間にある、特許請求の範囲第３２項記載のプラ
   スミド。 ３４、さらに該挿入部位につなぎ合わされた少なくとも
   １個のＤＮＡ断片を特徴する特許請求の範囲第３３項記
   載のプラスミド。 ３５、少なくとも１個の該ＤＮＡ断片が所期の遺伝子生
   成物用の少なくとも１個のヌクレオチド連鎖からなる、
   特許請求の範囲第３４項記載のプラスミド。 ３６、該所期遺伝子生成物がマーカーである、特許請求
   の範囲第３５項記載のプラスミド。 ３７、該マーカーがメソトレキセート耐性ジヒドロ葉酸
   レダクターゼである、特許請求の範囲第３６項記載のプ
   ラスミド。 ３８、さらに少なくとも１個の該ヌクレオチド連鎖近傍
   にプロモーター用暗号をその一部にもつヌクレオチド連
   鎖を特徴する特許請求の範囲第３４項記載のプラスミド
   。 ３９、その一部としてプロモーター用暗号をもつ該ヌク
   レオチド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範
   囲第３８項記載のプラスミド： （１１） （１２） ４０、該プロモーターが真核生物のプロモーターとして
   機能する、特許請求の範囲第３８項記載のプラスミド。 ４１、該フロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第３８項記載のプラスミド。 、４２．該プロモーターが植物プロモーターである、特
   許請求の範囲第３８項記載のプラスミド。 ４３、さらに少なくとも１個の該ヌクレオチド連鎖近傍
   にプロモーター用暗号をその一部にもつヌクレオチド連
   鎖を特徴する特許請求（ｒＮａ囲第３７項記載のプラス
   ミド。 ４４、その一部としてプロモーター用暗号をもつ該ヌク
   レオチド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範
   囲第４３項記載のプラスミ　ド　。 ４５、該プロモーターが真核生物のプロモーターとして
   機能する、特許請求の範囲第４３項記載のプラスミド。 ４６、該プロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第４３項記載のプラスミド。 ４７、該プロモーターが植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第４３項記載のプラスミド。 ４８、該真核生物が酵母菌属であり、かつ該原核生物が
   細菌である、特許請求の範囲第３２項記載のプラスミド
   。 ４９、該挿入部位が該第１　ＤＮＡ領域と該第２１）Ｎ
   Ａ領領域の間にある、特許請求の範囲第４８項記載のプ
   ラスミド。 ５０、該プラスミドがＢａｍ　ＨＩとＨｌｎｄ　ｍで消
   化されて該挿入部位を生ずる、特許請求の範囲第４９項
   記載のプラスミド。 ５１、さらに該挿入部位につなぎ合わされた少なくとも
   １個のＤＮＡ断片を特徴する特許（１５） 請求の範囲第５０項記載のプラスミド。 ５２、少なくとも１個の該ＤＮＡ断片が所期生成物用の
   少なくとも１個のヌクレオチド連鎖暗号からなる、特許
   請求の範囲第５１項記載のプラスミド。 ５３、該所期生成物がマーカーである、特許請求の範囲
   第５２項記載のプラスミド。 ５４、該マーカーがメソトレキセート耐性ジヒドロ葉酸
   レダクターゼである、特許請求の範囲第５３項記載のプ
   ラスミド。 ５５、さらに少なくとも１個の該ヌクレオチド連鎖の近
   傍にその一部としてプロモーター用暗号をもつヌクレオ
   チド連鎖を特徴する特許請求の範囲第５１項記載のプラ
   スミド。 ５６、その一部にプロモーター用暗号をもつ該ヌクレオ
   チド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範囲第
   ５５項記載のプラスミド：（１６） ５７、該プロモーターが真核生物のプロモーターとして
   機能する、特許請求の範囲第５５項記載のプラスミド。 ５８、該プロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第５５項記載のブラスミ　ド。 ５９、該プロモーターが植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第５５項記載のプラスミド。 ６０、さらに少なくとも１個のヌクレオチド連鎖の近傍
   にプロモーター用暗号をその一部としてもつヌクレオチ
   ド連鎖を特徴する特許請求の範囲第５４項記載のプラス
   ミド。 ６１、その一部にプロモーター用暗号をもつ該ヌクレオ
   チド連鎖が次の基本的連鎖を有する、特許請求の範囲第
   ５４項記載のプラスミド。 （１９） ６２、該プロモーターが真核生物のプロモーターとして
   機能する、特許請求の範囲第５４項記載のプラスミド。 ６３、該プロモーターが真核生物のプロモーターである
   、特許請求の範囲第５４項記載のプラスミド。 ６４、該プロモーター逅植物プロモーターである、特許
   請求の範囲第５４項記載のプラスミド。 ６５、プラスミドＭＴＸ４／４２６９　Ａ　ＴＣＣ３９
   ３９５゜６６、プラスミドＭＴＸ５／４２６９ＣＡＴＣ
   Ｃ３９３９４゜（２０）