JPS6043398A - Νａｄ（ｐ）ｈの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、新規な酵素法によるＮＡｎＨもしくはＮＡＤ
ＰＨ（以下、ｒＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，Ｊと表記する淀袖法に
関するものである。

生体内には、ＮＡＤにコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド）またはＮＡＤＰ　にコチンアミドアデニンジヌク
レオチドりん酸）を補酵素とする脱水素酵素反応が多数
あり、それを触録する酵素もまた多数分離精製されてい
る。したがって、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型ニコチンアミ
ｒアデニンジヌクレオチＰまたは還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリん１〜）を信号と１−で、脱
水素酵素反応に関与する反応基Ｊ−の定量もしくは脱水
素酵素の活性測定、さらにこの脱水素酵素反応系に連結
しうる他の酵素反応系の反応基質の定量もしくは酵素活
性測定が、これらと病態との関連において臨床化学分析
の分野で広く行われている。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを最終信号とする臨床化学分析の−例を
示せば、第１表のとおりである。

第１表 先行技術 ＮＡＤ（Ｐ）Ｉ（の定袖法の代表的な方法としては、酸
化還元酵素反応によって４１：、じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
増減を比色法（λ＝　：ＭＯｎｍ　）で測定する方法（
Ｕｖ法）、同じくけい九法（λ。Ｘ−３６５ｎｍ、λｅ
ｍ−４６０　ｎｍ　）　で測定する方法、ＮＡＤ　（Ｐ
　）系の反応にジアホラーゼまたはフェナジンメトサル
フェート（ＰＭＳ　）とテトラゾリウム塩を使用して可
視部で測定する方法などが知られている。ＴＪＶ法は、
ＮＡＤ　（Ｐ　）　）Ｉに、たとえば■α−ケトゲルタ
ール酸（以下、［α−Ｋ　Ｇ　ｊという）とアンモニア
の存在下でグルタミン酸脱水素酵素（以下、［ＧＬＤＩ
月という）を作用させたり、■ピルビン酸藝釡−専に醗
÷弔靜→の存在下で乳　孟 酸脱水素酵素を作用させたりして、３４０ｎｍ　におけ
るＮＡＤ　（Ｐ　）　Ｈの吸光度の減少をみる方法であ
るが、この方法はＮＡＤ（Ｐ）Ｔｌのモル吸光係数が低
いため感度が劣る欠点がある。叶い光法は、ＩＪｖ法よ
り感度は高いが、普及率の低いけい光光度計を使用しな
ければならない欠点がある。また、可視部測定法もＰＭ
Ｓが自動酸化されやすい、光に不安定であるなどの問題
を有している。

一方、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈな過酸化水素の信号に変換して定
量する方法として、メチレンゾル−を介して酸素を還元
して過酸化水素に導く方法があるが、この酸素のＭ元反
応が遅いという欠点を有している。

発明の概要 要旨 本発明は上記問題を解決することを目的とし、試料を酵
素的に処即して含有ＮＡＤ　（Ｐ　）　Ｈな過酸化水素
の信号により定検することによってこの目的を達成しよ
うとするものである。

本発明方法によるＮＡＤ（Ｐ））Ｉの電縫法は、下記の
（Ａ）〜（ＤＪ工程からｙ、（る。

（Ａ）　ＮＡＤ（Ｐ）１１を定１通すべき試料に、アン
モニアおよびα−Ｉ（Ｇの存在下、ＧＬＤＨを作用させ
て試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈｌに対応する楡のグルタミン
酸を生成させる］工程、 （Ｉ（）該試料に、酸素の存在下、グルタミン酸オキシ
ダーゼ（以下「ＧＬＸＤ」という）を作用させて試料中
のグルタミン酸世に対応して過酸化水素を生成させる工
程、 （Ｃ）　過酸化水素の生成値もしくは生成速度を測定す
る工程、 Ｑ））　測定された過酸化水素の生成量もしくは生成速
度からＮＡＤ（ｐ’）Ｔ（ｔを算出する工程。

本発明方法における酸素反応式を示せば、次のとおりで
ある。

Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡ、Ｄ　（Ｐ　）　”ＮＨａ　−
）（１−ＫＧ＋Ｈ２０２ 効果 このように、本発明方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ卸Ｔ、ＤＨ
によりすＬ−グルタミン酸に変換し、とのＬ−グルタミ
ン酸をＧＬＸＴ）により過酸化水素に変換することによ
り、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを過酸化水素の信号により定量する
ことに特徴を有するものである。

過酸化水素を信号とすることによって、化学発光法、分
光学的方法、電極法などの定曖操作が容易でかつ高感度
の定量が可能な検出系をＮＡＤ　（Ｐ　）Ｈの定量に容
易に応用することが可能となった。

従来、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを特異的な酵素反応により過酸化
水素の信号に変換して定量する方法は確立されておらず
、本発明によってはじめてこのような方法が確立された
のである。

本発明方法は、固定化酵素からなるリアクターを用いる
連続自動分析システムを採用して実施することができる
。したがって本発明によればこのような自動分析システ
ムによってＮＡＤ　（Ｐ　）　Ｈを高感度かつ短時間に
定量することが可能となった。

３、発明の詳細な説明 分析対象試料 本発明方法において分析対象試料とされるものは、定量
すべきＮＡＤ（Ｐ））Ｔを含有する水性試料であり、そ
のＮＡＤ（Ｐ）Ｈとしては、試料中に元来含有されてい
るものに加え、脱水素酵素反応によってＮＡＤ（ｐ）が
償元されて生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈをも包含する。しか
して、本発明の定量目的は、試料中のＮＡＤ（Ｐ））Ｔ
の存在ないし含量を測定すること酵素の酵素活性の測定
を行うことも含むものである。

素、グルコース−６−りん＃／グルコース−６−りん酸
脱水素酵素、グルコース／グルコース脱水素酵素、ＵＤ
ＰＧ／ＴＪｒ）ＰＧ脱水素酵素、ホスホグルコン酸／ホ
スホグリコン酸脱水素酵素、ガラクトース／ガラクトー
ス脱水素酵素、アルコール／アルコール脱水素酵素、グ
リセロール／グリセロール脱水素酵素、グリセロール−
３−りん酸／グリセロール−３−りん酸脱水素酵素、イ
ンクエン酸／イソクエン酸脱水素酵素、ステロイｒ／ス
テロイド脱水素酵素、アルデヒド／アルデヒド脱水素酵
素などの酵素番号［１，１，１，’１、［１，２゜１〕
、〔１，３，１〕、［１，４，１］または［１，５，１
３に属する種々の脱水素酵素系が例示される。

さらに、本発明の対象試料としては、上記のような脱水
素酵素系と連結しうる単一もしくは複数の工程からなる
反応系における反応基質もしくは反応試薬の測定を目的
とするものも含まれる。このような反応系の一例を示せ
ば、たとえば、グルコース−６−りん酸膜水素酵素系に
対してはグルコースおよびＡＴＰ　／ヘキソキナーゼ、
ならびにグ）ｖコ−、Ｘ−１−リ／ｕＨ／ホスホグルコ
ムターゼー無機りんおよびグリコーゲン／グリコーゲン
ホスホリラーゼ、グリセロール脱水素酵素系に対してハ
トリアシルグリセロール／ソノぞ−ゼ、グリセロール−
３−りん酸膜水素酵素系に対してはグリセロールおよび
ＡＴＰ　／グリセロース←＋−イートリアジルグリセロ
ール／リパーゼなどが挙げられ、さらにクレアチニン、
クレアチニンキナーゼ、α−アミラーゼなどの測定も行
うことができる（特公昭５７−３１４３９号公報参照）
。

本発明によるＮＡＤ（Ｐ））（の測定操作前の脱水素酵
素系の酵素反応もしくはそれに連結する反応系の反応に
おける工程操作は、それぞれの反応系に適した方法ない
し条件を採用Ｉ７て行うことができる。また、これらの
反応系が本発明の第一工程におけるＧＬＤ）Ｉの反応を
妨害しない場合には、第一工程と同時に並行的に反応を
進行させる構成を採用することができる。

ＧＬＤＴ（反応 本発明における第一工程であるＧＬＤＨによるＮＡＤ（
Ｐ）Ｈに対応するＬ−グルタミン酸の生成反応は、それ
自体公知の反応であり、本発明への応用において次のＧ
ＬＸＤ反応に対する技術的配慮を加える以外特に特別な
方法ないし条件は要求されない。この反応については、
公知の成書および総説などの記載、たとえば、ＨｏＩＴ
、ｌ（ｅｒｇｍｅｙｅｒ著、［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　
＆ｚｙ＋ｎａｔｌｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｊ　２　ｎｄ
、　ＥｎｇｌｉｓｈＦＪＩｔｌｏｎ、　Ｖｏｌ　、４．
　ｐ、２０５４−２０５５　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、（１９７４）などの記載を８照することができ
る。

すなわち、ＧＬＤＨとしては、特にその起掠、由来に制
限はなく、系統名Ｌ−グルタミン＃：ＮＡＤ＋オキシド
レダクタ−ぜ（デアミネーテイング）（ＥＣ１，４，１
，２）、Ｌ−グルタミン酸：ＮＡＤ　（Ｐ　）　オキシ
Ｐレダクターゼ（デアミネーテイング）（ＥＣ１，４，
１，３）、Ｌ−グルメミン酸：　ＮＡＤＰ＋オキシドレ
ダクターゼ（デアミネーテイング）（ＥＣ１、４，１，
４）の酵素が測定目的に従って選択され用いられる。

反応基質としてのアンモニアおよびα−ＫＧは過剰モル
用いられるが、その最適使用量は、反応条件、酵素けな
どに応じて実験的に容易に定めることができる。アンモ
ニアの反応β）添加は、反応系のｐ）Ｉへの影響を考慮
して、酵素反応を妨害しない水溶性の中性基、たとえば
（ＩＩｉＣ酸アンモニウム、ｌ′！￥酸アンモニウム、
炭酸アンモニウムなどを固体状でもしくは溶液状として
行えばよい。

反応は、通常ｐＨ７〜９．５で緩衝液としてりん化のた
めにＡＤＰを存在させてもよい。

ＧＬ、ＸＤ反応 本発明における第二工程であるＧＬＸＴ）によるグルタ
ミｙｒｅ、に対応する過酸化水素の生成反応は公知であ
る（　Ａｇｒｉｃ、　Ｉ（ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖ
ｏｌ、４７、Ｎ００１、ｐ、１７９〜１８２　（１９８
３）　）、また、この反応を利用したグルタミン酸の定
量法については、昭和５８年３月１０日、社団法人日本
農芸化学会発行、講演要旨集（昭和５８年度大会）、第
１８４頁、２Ｌ−１の記載、さらに詳細には特願昭５７
−１４５３４６号明細書の記載を参照することができる
。

すなわち、ＧＬＸＤとしては、Ｌ−グルタミン酸に基質
特異性の高いものがより好適に用いられる。

Ｇ　ＬＸＤとしては、従来ストレゾトマイセス・バイオ
レツセンスの生産するもの（特開昭５７−４３６８５号
公報参照）と、ストレゾトマイセス・エスピーＸ　−１
１９−６（微工研閘寄第６５６０号、ＡＴＣＣ’３９３
４３）の生産するもの（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、。

Ｖｏｌ、４７、Ｎｏ　、６、ｐ１３２３〜１３２８　（
１９８３））　が知られている。後者の方が前者に比べ
て基質特異性、安定性、特にＧ　Ｔ、Ｄ　Ｈの至適ｐＨ
におけるｐＨ安定性などにおいてすぐれており、本発明
において後者酵素の使用がより好ましく、以下後者酵素
をもってＧＬＸＤと称する。この酵素の調製法は後述す
る参考例に示されている。

ＧＬＸＤの＃素反応は、通常ｐＴＩ５〜１０において（
１］） 適当な緩衝液中で行われる。

過酸化水素の測定 過酸化水素の生成酸もしくは速度の測定法としては、化
学発光分析法、電気化学的分析法、け（・光分析法、分
光学的分析法などが知られて（葛る（たとえば、有機合
成化学協会誌、第３９巻、第７号、ｐ６５９〜６６６（
１９８１）参照）。本発明にお０ては、そのいずれもが
適用可能であるが、本発明の目的から迅速かつ高感度に
過酸化水素を検出するシステムを採用することが好まし
く・。

代表的な過酸化水素の測定法を（１くつ力・夕１ｊ挙す
れば下記のとおりである。

゛まず、化学発光分析法としては、ルミノールを赤血塩
の存在下で過酸化水素と反応させ、酸化に伴なう発光量
を測定する方法が挙げられる。ルミノールの代りにイソ
ルミノール、ピロガロール、ビス（２，４，６−）！ｊ
ジクロロェニル）オキザレートを、赤血塩の代りに・ξ
−オキシダーゼ、ヘマチン、ヘミン、塩化コノ９ルトを
使用する方法も知られている。

（Ｉｓ） （１２） 電気化学的分析法としては、クラーク型過酸化水素電極
を用いる方法が一般的である。過酸化水素をパーオキシ
ダーゼもしくはモリブデン酸塩などの触媒存在下でヨウ
素イオンと反応させてヨウ素イオン電極で測定する方法
も使用できる。

けい光分析法としては、ホモバニリン酸をノソーオキシ
ダーゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成スる２、
２′−ジヒドロキシ−３，３′−ジメトキシビフェニル
−５，５′−ジ酢酸のけい光強度を測定する方法が挙げ
られる。４−モノ々ニーリーン−［−１Ｌ−キキシ≠−
４功存在下℃過酸化、水−素−と灰トざ唇、−柊戒ド←
る一２丁２′−一一夛一ヒーｒ−ローキーシーー４丁３
！−一り４−ト崎ツゼ−）−ニー品ルー５．−５’−ジ
酢酸のけい光強度、を−−＃溌する方法が挙げろ中４ケ
ホモ・々ニリン酸の代りにｐ−ヒドロキシフェニル酢酸
、ジアセチルフルオレスシンｆＩ４体（ジアセチルフル
オレスシン、ジアセチルジクロロフルオレスシンなど）
などを用いることもできる。

分光学的分析法としては、・ソーオキシダーゼ法、カタ
ラーゼ法などが一般的である。バーオキシダｒ　１ａ＞ −ゼ法は、被酸化性発色剤をノミ−オキシダーゼ（ｐｏ
ｎ　）の存在下で過酸化水素と反応させ、生成すく）色
素な比色定量する方法である。発色剤と１−では、たと
えば０−ジアニシジン、４−メトキシ−１−ナフトール
、２，２′−アジノービス（３−エチルペンゾチアソリ
ン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ　）　７’ｃどの嗅独
試薬、４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）とフェノール
系化合物（たとえば、フェノール、ｐ−クロロフェノー
ル、２，４．６−ドリブロモフエノールなど）、アニリ
ン系化合物（たとえば、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン（Ｄ
ＭＡ）、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンなど）またはトルイ
ジン系化合物（たどえば、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トル
イジンなと）との組み合わせ試薬、３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾンとＮ、Ｎ−ジメチルアニリ
ンとの組み合わせ試薬などを使用することができる。カ
タラーゼ法としては、過酸化水系をカタラーゼの存在下
でアルコール（メタノールなど）と反応させ、生成する
アルデヒドを発色系に導いて色素の吸光度測定を行う方
法などが挙げられる。

これらの過酸化水素の検出系はいずれも公知の方法であ
り、その実施にあたってはそれぞれ公知の操作、条件を
参照すればよい。

定量システム 本発明は、基本的には、ＧＬＤＨ反応、ＧＬＸＤ反応、
過酸化水素検出の３工程からなる。これらの工程操作を
各工程毎に独立して回分的操作にて行うこともできるが
、固定化酵素からなるリアクターを用いた連続自動分析
システムを採用して行うとより効率的、短時間に定量を
行うことができる。

酵素の固定化法には、大別して吸着法、共有結合法、マ
トリックス法、マイクロカプセル法などの方法が知られ
ているが、固定化方法、固定化相体などの選択は、採用
する自動分析システムに応じて成書（たとえば、千畑一
部編、昭和筑）年３月加日、＠）講談社発行、「固定化
酵素」、〜’ｂｓｂａｃｈＫ、著、Ｊ　Ｍｅｔｈｏｄ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｎｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ　、　ＸＬ
ＴＶ　。

Ｉｍｍｏｂｉｌｌｚｅｄ　ｈＥｎｚｙｍｅｓ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９７６など
）または総説（たとえば、昭和５７年４月ｍ日、（相南
江堂発行、［バイオマテリアルサイエンス、１第１集（
化学の領域増刊１３４号）ｐ５５〜６７、ｐ６９〜７９
など）を参照して行うことができる。

また自動分析システムについても成誓Ｇｕｔ　１ｂａｕ
ｔ。

Ｇ、Ｇ、著［ＨＡＮＤＢ００ＫｏＦＥＮｚＹＭＡＴＩｃ
ＭＥＴＨ６ＤｓＯＦ　ＡＮＡＬＹＳＩＳＪ　ｐ４４５〜
６１２．　Ｍａｒｃｅｌ　Ｔ）ｅｋｋｅｒ。

Ｉｎｃ　、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７６、［Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　Ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ（前出）など
）を参照することができる。

本発明の実施に好適な自動分析システムとして特開昭５
６−４７４８４号公報に開委された方式が例示できる。

本システムによれば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量、または脱
水素酵素反応系もしくはそれに連結された反応系の反応
基質の定着もしくは酵素活性の測定を士数秒というごく
短時間に行うことができる。

本システムは、被験試料を固定化酵素カラムに供給し、
酵素反応により生成した過酸化水素を含むカラム通過液
にルミノール−赤血塩系発光剤を混合し、化学発光させ
てフローセルに導びキ、セルからの化学発光畦を受光器
を介したフォトンカウンターまたはフォトマルチシライ
ア−によって積算する方式である。その基本的な装置構
成を第１図に示す。第１図において、被験試料供給流路
１は、基質溶液供給路２、該供給路２に付設された試料
導入１］３、固定化酵素カラム４から構成されている。

一方発光剤供給流路５ば、並設されたルミノール溶液供
給路６および赤血塩供給路７、ならびに両流路６，７を
合流する螺ｊｌｂ；ＩＩ状ミキシングコイル８から構成
されている。緩衝液供給路２、ルミノ・−ル浴液供給路
６および赤血塩供給路７はべりスタルテイツクポンゾ９
によってそれぞれ所定ｎ、量で供給できるように調整さ
れている。

被験試料供給流路１と発光剤供給流路５は、両ｍ液が迅
速かつ均一に混合するような手段の配ｊｄのもとに連結
され、フローセル１（）に接続している。

フローセルは受光面を介してフォトマルチシライア−１
１に接続している。本発明においては、置屋化酵素カラ
ムは、少なくもＧＬＤＨとＧＬＸＤ１７１＾１定化酵素
カラムを連化酵素カラム用いられ、さらにＮＡＤ（Ｐ）
Ｈな生成させる脱水素酵素反応あるいはそれに連結しう
る反応系の反応基質を定値する場合には、脱水素酵素あ
るいはさらに連結する反応系の酵素の固定化酵素カラム
が連結される。このときの各固定化酵素の量は実験的に
定めればよい。

脱水素酵素反応もしくはそれに連結する反応に、反応基
質や補酵素が必要な場合には、適宜にそれらの供給路を
付設すればよい。

実施例 以下、本発明のより具体的な実施態様の一例を挙げて、
より詳細な説明とする。ただし、これらは、実施の態様
を示すものであって、本発明の技術思想を限定するもの
でない。

実施例１　（ＮＡＤ　Ｐ　Ｈの定量） 第１図に示したような構成の自動分析装置を作製し、Ｎ
ＡＤＰＨの定量を行った。

（］）　固定化＃素カラムの調製 酵素の固定化はＷｅｅｔａｌｌ　の方法に準じて行った
。

すなわち、多孔性アルキルアミンガラス粒子（孔径５ｏ
ｏＸ、粒子サイズ８０〜１２０メツシユ、ピアス社）　
２００　ｍｇ　に２．５　％グルタルアルデヒＰ溶液３
ｍｌを加え、脱気後、室温大気圧下で３０〜６０分間反
応を進行させる。グルタルアルデヒド液を除去し、蒸留
水で数回洗浄する。これに、ＧＬＤ）Ｉ％素液（８５０
０Ｕ　、東洋紡）１．０ｍｌ　またはＧ　ＬＸＤ酵素液
（１３０Ｕ、後述参考側参照）２．０ｍｌ　を加え、４
℃で一晩反応させる。反応液を除去し、適当な緩衝液で
３回以上洗浄し、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄する
。

得られた固定化酵素をそれぞれアクリル樹脂製カラム（
内径］　ｄｌｌ　）に詰め、固定化酵素カラムを調製す
る。それぞれのカラムの長さは２０　＋＋＋ａとし、Ｇ
ＬＤＨ−ＧＬＸＤの順に連結して装置ｄに紹み入れた。

（２）試薬の調製 ルミノール溶液ニルミノ−ルア　Ｘ　１０＝　Ｍ　、水
酸化カリウム０．１Ｍ、ホウ酸０．１　Ｍ７エリシアン
化カリウム溶液＝２×田−２Ｍ基質緩衝液：　ｐＨ７，
２，１０ｍＭリン酸緩価液、α−Ｋ　Ｇ　１．４　ｍ　
Ｍ　Ｎ硫酸アンモニウム３．ＯｍＭ　。

ＥＤＴＡφ２Ｎａ　０．５３　ｍＭ金含有３）定量操作 既知濃度のＮＡＤＰＨ水溶液１μｌを試料液と１゜てマ
イクロシリンジで注入して測定を行った。ルミノール溶
液、フェリシアン化カリウム溶液、基質緩衝液の送りは
、ペリスタルテイツクポンプを用いて０．６ｍｌ／分で
行った。

ＮＡＤ　Ｐ　Ｈ饋度と化学発光音の関係は第２図に示し
た検量線のとおりであった。

実施例２　（ＮＡＤＨの定量） ムをｐＨ７，’ｌ、１０ｍＭりん酸緩衝液１００　ｍｌ
　に溶解させたものを用いて、実施例１と同様にして既
知濃度のＮＡＤＨ溶液の試料について定量した。

ＮＡＤ）ｆ濃度と化学発光門の関係を示す検量線は第３
図のとおりであった。

実施例３（ＮＡＤＰＨの定１：、ン比色法）次の酵素呈
色液に既知濃度のＮＡＤＰＨＩＯμｌを加え、２７℃で
５分間反応させた後、６４０ｎｍの測定波長で比色測定
した。ＮＡＰ）ＰＨ濃度と吸光度の関係を示す検針線は
第４図のとおりであった。

酸素呈色液 ５０ｍＭ　ｐＨ７，５）リス塩酸緩衝液　１．４ｍ１１
０ｍＭα−ＫＧ、１０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液　０．
２ｍ１ＧＬＤＨ（１０３０Ｕ／ｍｌ）　５０　μＩＧＬ
ＸＤ（６，５Ｕ／ｍｌ　）　５０　μｍ計　３．３ｍｌ 実施例４（グルコースの定量） 第５図に示したフローダイアダラムのようにグルコース
およびＮＡＤ　Ｐ　Ｈ定量のための連続流動型自動分析
システムを作製した。第５図中、１２は試料供給路、１
３は基質溶液供給路、１４はシングルミキシングコイル
、１５は６インチ透析器、１６はへキソキナーゼ（ＨＫ
）・グルコース−６−りん酸膜水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）
の同時固定化酵素カラム、１７は０ＬＤＨ固定化酵素カ
ラム、１８はＧＬＸＤ固定化酵素カラム、１９は４ＡＡ
−ＤＭＡ供給路、加はダブルミキシングコイル、２１は
フローセル（１５ｍｎ５．５５０ｎｍ比色計）、２２は
記録計を示す。

）ＩＫ−０６ＰＤＨの同時固定化酵素カラムは、ＨＫ２
　ｍｇ　＠Ｇ６ＰＤＨ１ｍｇ／ｌ　ｍｌ、ｐＨ７，０，
５０ｍＭりん酸緩衝液を２００　ｍｇ　のガラス粒子に
実施例１と同様にグルタルアルデヒド法で同時固定（ｅ
Ｑ−ｉｍｍｏｈｌｌｉｚａｔｉｏｎ　）を行って調製し
た。ＧＬＤＨおよびＧＬＸＩ）の固定化酵素カラムも実
施例１と同様にして調製した。カラムサイズは、ＨＫ−
Ｇ６ＰＩ）Ｈカラム１．５　Ｘ２０ｍｍ５ＧＬＩ）Ｈカ
ラム１．５　Ｘ　２（１ｍｍ。

ＧＴ、ＸＩ）カラム１．５　Ｘ　Ｉｎ　ｍｍ　とした。

試薬の１１１は次のとおりである。

基質溶液：　ＡＴＰ　６２．６ｍｇ　、　ＮＡＤＰ　２
６．６　ｍｇ　、α−ＫＧ　５　ｍｇ　Ｘ硫酸アンモニ
ウム４．４ｍｇ。

塩化マグネシウム４８ｍｇを５０ｍＭ、　ｐＨ７，５り
ん酸緩衝液１００ｍｇに溶解 ４−ＡＡ−ＤＭＡ　：　４−ＡＡ　４２．５ｍｇ　、　
ＤＭＡ　１３０　μｍを０．３Ｎ酢酸に溶解 定財操作は、試料供給路から試料（既知濃度のＤ−グル
コース含有）を０．２３　ｍｌ　／分、生理食塩水を（
１，６ｍｌ／分、空気を０．６ｍｌ／分の供給せで、基
質溶液供給路から基質溶液を１．２　ｍ１７分、空気を
０．６　ｍ１７分の供給けで、４−ＡＡ−ＤＭＡ供給路
から４ＡＡ−ＤＭＡを０．１６ｍ１／分の供給縫で分析
システムに送液して行った。

かくして得られたグルコース定置のための検量線は第６
図のとおりであった。

実施例５（ピルビン酸の定′Ｉｊ１） ０〜８ｍＭピルビン酸−０，１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７
，４）溶液１　ｍｌ　Ｋ　ｌｌＯｍＭＮＡＤ）Ｉ溶液１
００・μｌおよび乳酸脱水素酵素（５００Ｕ／ｍｌ　）
シ）μｍを加え、室温に３分間放置して平衡にさせた後
、この得られた反応液のうちｌμｌを試料として実施例
２の装置を用いて測定を行った。基質緩衝液としては、
α−ＫＧ１．４ｍＭ、硫酸アンモニウム１．５ｍＭ、Ａ
ＤＰ・２Ｎａ１．８ｍＭ含有１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，１）を用いた。

ピルビン酸濃度と化学発光音との関係を示す検量線は第
７図のとおりである。

ちＩ櫃４ア士Ｍ去４６番ｄ番−ｍ４　”’　：参考例 ５００　ｍｌ　’Ｊ三角フラスコにフスマ２０ｇおよび
水１６＋ｎｌ　を入れ、１２０’Ｃ１３０分間加圧滅菌
し、これにストレプトマイセス・エスピーＸ　−１１９
−６（徹工研閉寄第６５６０号）を植菌し、２．８”Ｃ
１７日間培養して釉閘を調製した。

５リットル容三角フラスコ６本にそれぞれフスマ２０（
ｌ　ｇおよび水１６０ｍ１　を入れ、１２０℃、加分間
力旧−ピ滅関した後、前記の挿画を無菌的に接種し、２
８℃で２日間培養後、温度を２０℃にしてさらに２週間
培養１〜だ。

得られた培養物を水３７．５１Ｊツトルに浸漬し、沖過
後、けいそう土濾過して粗酵素液約３４リツトルを得た
。粗酵素液に＠Ｌｒ１ｌｉ！アンモニウムを５０４飽和
まで加え、生成した沈殿を採取して０．０２　Ｍ酢酸緩
衝液（ｐｉｌ　５．５　）　３．９　リットルに溶解さ
せ、５７℃で側分間加熱処理した。５℃以下に冷却した
後、２倍量の冷エタノールを加え、生成した沈殿を採取
して０．０２　Ｍりん酸緩衝液（Ｐ）Ｉ７．４）２リツ
トルに溶解し、同一緩衝液で一夜透析した。

透析中に生成した沈殿を除去し、上清液をｏ、０２Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したＤＥＡＥ−セル
ロースカラム（３，５Ｘ５０ｃｍ）に負荷し、０．３５
Ｍ塩化ナトリウム含有０．０２Ｍりん酸緩衡液で溶出し
た。溶出活性画分を集め、（１，０５Ｍ塩化ナトリウム
含有０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で−夜透析
した。この透析内液を同一緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファロースＣＩ、−６Ｂカラム（２Ｘ１０ｃｍ）に
負荷し、０．０５〜０．７５Ｍ塩化ナトリウム溶液で直
線勾配法により浴出した。溶出された活性画分を集め、
透析濃縮後、セファデックスＧ　−２００カラム（２５
Ｘ　１２０　ａｍ）を用いてゲル濾過を行った。活性画
分を集めて濃縮後、ｏ、０２Ｍりん酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，４）で透析し、透析内液を遠心分離して上清液
を精密濾過した後、凍結乾燥してＧ　ＬＸＴ）精製標品
（比活性５５　、Ｉ　Ｕ／／ｒｎｇ蛋白、収率１８．４
％）３０ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明を好適に実施するための連続自動分析
システムの装置構成例を示す。第２図は、本発明の実施
例において得られたＮＡＤＰＨの検量線を示ｌ〜、第３
図は同じ＜　ＮＡＤＨの検ｔＬｔ線、第４図は同じ＜Ｎ
Ａｒ）ＰＨの検量線を示す。第５図は、本発明の実施例
において使用されたグルコース定量用の連続流動型自動
分析システムのフローダイアダラムであり、第６図はそ
のシステムにより得られたグルコースの検量線である。 縞７図は本発明の実施例により得られたピルビン酸の検
量線である。 出願人代理人　猪　股　醪 （２７・） 第２図 ＮＡＤＰＨ（乳Ｍ） 第３図 ＡＤＨ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の（Ａ）〜（Ｄｌ工程からなるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定
   Ｉ法。 （Ａ）　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量すべき試料に、アンモニ
   アおよびα−ケトゲルタール酸の存在下、グルタミン酸
   デヒドロゲナーゼを作用させて試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
   ｉｌに対応する量のグルタミン酸を生成させる工程、 （Ｂ）該試料に、酸素の存在下、グルタミン酸オキシダ
   ーゼを作用させて試料中のグルタミンＶ−に対応して過
   酸化水素を生成させる工程、（Ｃ）　過酸化水素の生成
   量もしくは生成速度を測定する工程、 （Ｄ）　測定された過酸化水素の生成量もしくは生成速
   度からＮＡＤ（Ｐ）Ｈｉを算出する工程。