JPS60500413A - コラーゲン溶解活性の高い薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 高いコラーゲン溶解活性をもつ調製物及びこのような陶製物を含有する薬剤組成 物 本発明は、コラーゲン溶解活性をもつ調製物、より詳細には、コラーゲンに富む 構造の無制御変質（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｃｏｎｔｒｏｌｅｅ）が現われ るヒト又は動物の病気の治療に特に使用するために薬剤ベヒクルと配合さ′ｔ１ ．た前記調製物を含む薬剤組成物に係る。

コラ−ケン溶解酵素即ち゛コラゲナーゼ”を産生ずる複数種の微生物は文献に既 に記載されている０しかし乍らこれらの調製物中の活性成分含量の詞整はしばし は難しい。更にこれらの調製物は常に成る程度の有毒成分例えば神経毒を含むの で薬剤用の組成物中で使用するのは適当でない。

本発明の目的は、コラ−ケンの無制御変質が現わｎる傷に適用さｎるとａｍ性コ ラ−ケン構造（５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｃｏｌｌａｇｅｎｉｑｕｅｓｐａｔｈｏ ｇｅｎｅａ　）に対して選択的な酵素的洗浄（ｄｅｔｅｒｓｉｏｎ　ｅわｚｙｒ ｒａｔｉ　ｑｕｅ　）を行ない得る薬剤組成物を提供することでめる０本発明の 目的は更に、当該組成物に含ｉｎたコラーゲン浴触性調製物の主成分の相対比が 所望の治療効果の＠度に従って所定の割合で釣合っているようｌ＼組成物の製造 に係る０本発明の業剤組敗物の特徴は、ペプチド配列Ｘ−グリシル−に結合した 天然アミノ酸残基である〕を特異的に認識し、Ｘ−グリシル結合の処で特異的に 切断することができ更にミオシンによって少くとも部分的に阻害さ扛ている高い 特異的活性のコラゲナーゼを肩効量含むことである。

本発明の薬剤組成物に含まｎる好ましいコラゲナーゼとしては、μ竺臼ａ１ｇｉ ｎｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｃｂｅｍｏＶｙ　ｉｏｐｈａｇｕｓ培養ｑ勿から侍られる コラゲナーゼ、又は前記細菌から誘導さ扛た、微生物もしくは前記細菌同様にコ ラゲナーゼを派生し得る微生物の培養物から僧らｎるコラゲナーゼが挙けらｎる 。前記細菌の主たる分類学的特性については後述する。更により一般的には、不 発明の薬剤組成物で使用し得るコラゲナーゼとして、コラゲナーゼすなわち”　 Ｅｎｚｙｍｅ　Ｎｏｍｅｎｃｈｔｕｒｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ 　（１９７８）中にＥＣ。

３．４．２４．８として収載さｎている所謂’　Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒコ ラケナーゼ”に対して調製された選択的抗体と反応し得るコラゲナーゼがりる。

このコラゲナーゼは、■慰詔肪匝夾用犯ｃｈｅｍｏｖａｒ座抽凹株から伶らｎる 。この餡株はｎ’ｌ−０２９としてｌＮ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲのＣｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄｅ　Ｍｉｃｒｏ 　−Ｏｒｇａｎｉｓｍｅａ　（Ｃ，Ｎ、　Ｃ，Ｍ、　）に寄託さｎている。

このコラゲナーゼに別のコラゲナーゼに比較して特異的活性イクロカタルユニッ ト（μｋａｔ／ｍｑ）にも達する。このことは例えば、Ｂｉｏｃｈｉｒｎ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　５２２．２１８−２２８（１９７８）に収載のＶ、 　ＫＥＩＬ−ＤＬＯＵＨＡ及びＢ、　ＫＥＩＬの論文”　５ｕｂｕｎｉｔ　５ｔ ｒｕｃｔｕｒｅｏｆ　Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ＣｏｌｌａｇＣｏｌｌａ　 ”に記載さｎている。

この酵素及びこの酵素を産生ずる微生物の化学的特性付けに関しては１更に、Ｂ ｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　４２９　（１ ９７６）２３９−２５１に収載のＶｅｒａ　ＫＥＩＬ−ＤＬＯＵＨＡのＣｈｅｍ ｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ａｕ ｔｏｄｉｇｅｓｔｉｏ　ｏｆ　ｐｕｒｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ１ 月２６日、１９７９．２３巻、　ｎｒ、　２に収載のＢｏｒｉｙｏｊ　ＫＥＩＬ の”　Ｓｏｍｅ　ｎｅｗｌｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｓｅｓｆｒｏｍ　ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ　ａｎｄｌｏｗｅｒ　ｅｕｃａｒｙ ｏｔｅｓ″全参照し得る。

より詳細には本発明は、組成物の総重量に対するコラゲナーゼの活性で示すと、 一エマルジョン、軟膏、粉末又は常用の語の意床で真の液体ではない全ての組成 物の場合は薬剤組成物当ｔ）　Ｏ−０５Ａ　ｋａｔ　／り、及び 一局所使用すべく構成でｎだ溶液の場合には薬剤組成物当り０．０５　Ａ　ｋａ ｔ　／ｍｌ に少くとも等しい童ヲ含む薬剤組成物に係る。

本発明の好ましい軟骨は特に、駄賃り当９０．１乃至２、よシ好’Ｅ［、＜は０ ．５乃至１μｋａｔのコラゲナーゼを含有する。

局Ｐｋ適用するための本発明の好ましい溶液は、浴液−当９０．１乃至２好まし くは０．５乃至１μｋａｔのコラゲナーゼを含有する。

本発明の好ましい組成物は更に、一方で中性グロテアーゼ他方でエンドヌクレア ーゼを含有する。

好ましくは、０．３５０μｋａｔのコラゲナーゼに対するグロテアーゼとエンド ヌクレアーゼとの割合は、グロテアーゼでは２００カゼイン翁解ユニツト（ｕｎ ｉｔ≦９　ｅａ１９≦１ｎｏｌｙｔｉｑｕｅｓ　）以下であシ、エンドヌクレア ーゼでは５００ヌクレアーゼユニツト（ｕｎｉｔｅｓ　ｎｕｃｌｊａｓｉｑｕｅ ｓ　）以下である○本発明の適当な組成物は、３種の成分を好ましくは、−コラ ゲナーゼ０．３５０　／！１ｋａｔ以上、−中性グロチアーゼ含量については２ ０乃至２００カゼイン洛かユニット、 一エンドヌクレアーゼについでは３０乃至５００ヌクＬ／７−セユニツト に対応する相対比で含背する。

より好ｌしいＭｉ仮物では、前記成分の互いの相対比が夫々、−コラゲナーゼに ついては０３５０μｋａｔ以上、−中性グロチアーゼについては２０乃至５０カ ゼイン溶解ユニツ　ト、 一エンドヌクレアーゼについては３０乃至６０ヌクレアーゼユニツト に対応する。

本発明の組成物は、前記の如き性質の傷（例えは火傷、潰瘍。

−皮（ｅｓｅａｒｒｅｓ人コラーゲンベースの白色硬６（６８ｅａｒｒｅ尋ｄｕ ｒｅｓｏｕ　ｂｌａｎｃｈｅｓ　）　、例えば外科手術後に残るケロイド）の処 理に特に有効でりることか判明した０ 本発明組成物は、治療作用の逆程で結合組織のコラーゲン全後先的に分解する。

組成物に、筋閃質特に筋閃の筋原線維を攻撃しない。組成物中のコラーゲン溶解 性化合物が筋肉のミオシンＶＣよって阻害さ扛るからである０不発明組成物を以 後“Ａｃｈｒｏｍａｓｅ　”としばしば指称する。特に組成物かコラゲナーゼ以 外にグロテアーゼとエンドヌクレアーゼとケ特に前記割合で含有するとぎこの名 称を用いる。

ある。特にこの定性作用によってマクロファージと白血球とかＡｃｈｒｏｍａｓ ｅ　の作用ゾーンの周縁に蓄積てｎる。血液成分のこのような蓄積が組織再生プ ロセス（例えば、潰瘍、火傷による損傷組織に於ける再生）にＭ利に作用する０ 憤死性変質組織に対するＡｃｈｒｏｍａｓｅの作用の別の特徴は、この作用が生 きた組織の処では止まることである。Ａｃｈｒｏｍａｓｅの作用は、死組織が生 組織との境界まで分解さ扛た佼に停止するＯＡ、ｃｈｒｏｍａｓｅのタンパク分 解化合物の作用によって生組織が傷害を受けることはない。イム」故なら生組織 中に阻害系が存在するからである。特に以下の３つの阻菩系即ち１°）　非損傷 組織中に存在するポリペンテド性コラゲナーゼ阻讐因子、 ２°）　筋肉組織中に存在するミオシン、及び、３°）　血液循環系に存在する コラゲナーゼおよびグロテアーゼの阻止因子特にα−マクログロブリン が関与する。

ここで指摘すべさは、系沖」Ｍｉ成物が筒いコラーゲン浴凄活性、特に前記Ｖこ 示した１１１のオーダーのコラーゲン溶解活性を刊していｌけ′ｎはならないこ とである０例数なら、予想さＣた懸念にに対する不発明のコラーゲン浴解性調製 物の作用の選択性はコラケナーゼの配合量が多くなっても変わらなかった。即ち 、健康な組織が有する自然のコラゲナーゼ遮断特性と健康な組織に含ま扛るコラ ゲナーゼ活性調整因子の特性とが完全に有効に発揮さｎｌこのことは、予想され た酵素の１過剰投与”の懸念を否定した。

Ａｃｈｒｏｍａｓｅの第２活性成分を形成する中性グロテアーゼは、分子状のコ ラーゲン溶解性出発基質の断片を更に細分することによってコラゲナーゼの作用 を補完する。本発明の薬剤組成物中に使用さｎる調製物が、■ｂｒｉｏ　４　ｃ ｈｅｍｏｖａｒ　ｉｏｐｈａｇｕｓに油米するとき、前記グロテアーゼは好まし くない成分を含まない。

最後に、主としてエンドヌクレアーゼから成るＡｃｈｒｏｍａｓｅの第３取分は 、感染ズロセスで細胞から遊離さｎ得るＤＮＡの破壊に役立ち、従って、遊離Ｄ 　Ｎ　Ａから主として構成された膿を破壊すべく機能する０ 好１しくに、コラゲナーゼに結合されるグロテアーゼとエンドヌクレアーゼとは 同じ微生物に白米し、微生物の培地中でコ＼ ラゲナーゼと同時に得らｎる。

こｔらの成分の相互比の調整条件については後述する。

本発明は更に、前記コラゲナーゼがコラ−ケン加水分所産物特にコラーゲンの酵 素加水分＄＝物の有効な調製物と配合さ扛た好ましいコラーゲン溶解性組成物に 係る。０これらの加水分解産物は主として、例えば仔牛皮７Ｎから採取さｎた平 均分子量ｉｏ、ｏｏｏドルトン未満特に６，０００乃至ｓ、ｏｏｏドルトンのベ グチド分子から成るコラーゲン断片から構成されている。こｔらの加水分解並物 は更に、いくつかの構成アミノ酸に特徴をＭしており、特に、ヒドロキシ−プロ リンが存在すること全特徴とする。例えば特徴的なコラーゲン加水分解産物は、 （コラーゲン由来の）以下のアミノ酸を以下の割−プロリン　：８．４％ −ヒドロキシプロリン：１１．４％ こｎらのコラーゲン加水分解産物は、変性又は匪変性コラゲナーゼを適宜分割す る任意の方法で得らｎる。１加水分解履物”なる用語は、変性又は非変性コラー ゲンの化学的加水分解によって倚ら扛る産生物に限定さｎない０例えば、セラテ ンＣ嵌藁嫡ｉ浩計 も対応するタイプの加水分解産物が倚らする。

注目すべきは、こ扛ら°コラーゲン加水分解産物が、傷の中に存在するｗ雄性又 は壊死性コラーゲンの分解によって生成し本発明のコラーゲン溶解性組成物によ る加水分触の対象となる生成物と同じ性質を有することである。

本発明のコラゲナーゼに前記の如きコラ＝　−／１゛奇１、＝加水分解産物をか なりの割合で添加すると本発明ｍ放物の治療的活性の同上が現わｎることか判明 した０ 本発明のコラゲナーゼ組成物にこｎらコラーゲン加水分解産物を添加して得ら扛 る極めて重要な別の利点は、不発明のコラ−ケン溶解性組成物の貯蔵安定度が極 めて良くなることである。

コラーゲン加水分解産物を、調製最終段階でコラゲナーゼ調製物に配合するのか 特に廟オＩ」であろう。％に、こ扛らコラーゲン加水分解産物は産生微生物培地 から抽出さ扛たコラゲナーゼ溶液に直接冷加することができ、添加時期は、抽出 培地に含まｎた好ましくない不溶及び可溶の取分全除去するための抽出溶液の限 外濾過及び所安の付加的祠製処理以後で且つ得ら′ｎたコラーグンレ句製物の最 終凍結処理以前である０本発明の好ましい薬剤組成物は、コラーゲン加水分解産 物とコラゲナーゼとを、コラゲナーゼ１■当シ１乃至２５■好ｌしくは２乃至Ｉ Ｑｍ９のコラ−ケン加水分解並物の割合で含Ｍしている。好普しい割合ケ以下の 如く表現してもよい。好ましい組成物は、コラーゲン１マイクロタール当、！ｌ １１乃至２５Ｎ、％に言う迄もなくこ扛らの割合の上記に示した範囲は、前記ツ ーロチアーゼとエンドヌクレアーゼとがコラーゲンと配合さ牡ているか否かに関 わシ無く有効である。

従って不発明の桑Ｈ＋ｉａｍ物の主たる磯籠は、前記の性質の傷の領域に蓄積ζ ｎ易い組織廃果物を破壊することに存する。自然的４痕化又は例えば移植によっ て誘発式れる薮痕化か開始さ扛るには前記の如き組紐破壊（洗浄）が必す先行す る必要かめる。

不発明は更に、特に前記の３裡の取分を含有する本発明の活性調製物の農法に係 る０よシ詳細にはこの方法は、好気性細劇凹垣凹独凹士胆ツｃｈｅｍｏｖａｒ乃 助■翌を使用している。本発明方法では、前記微生物をそｎ自体公知の条件下で 培養し、特にコラ−ケン又はコラーゲンのらぜん鎖特性をもつ二次構造を形成す るに十分な分子童全維狩したコラ−ケン断片の適当７１ｉ：誘発因子を培地に離 別して同じくそｎ自体公知の方法でコラゲナーゼの厘生奮＠発し、培地中での前 記中性グロテアーゼの産生の誘発後までこの培養＊＝＝し、コラゲナーゼとプロ テイナーゼ光士を凸玄分稟喜字＃との相対比が前記の各範囲内の所望の値に達す ると培養を中断し、次に、それ自体公知の方法で活性調製物を培地から回収し得 る。特に、細胞の除去後、例えば溶液中の塩の略本ＪＫの６０％に達し得る十分 な濃度の伐酸アンモニ中に導入されたイオンを除去する。変法として、活性成分 を限外濾過によって精製してもよい。

前記では、コラゲナーゼ又はグロテアーゼ（又はプロテイナーゼ）の相対比を調 整するために培養期間全調整することを提案した。ぼた、外部オリジンの７０テ イナーゼ戻Ｖ゛エンドヌクレアーゼによってコラゲナーゼを補完してもよく、又 は逆に、この浴液の精製かｂ］能な場合には、培養期間を延長させてコラゲナー ゼの収量を増すために余剰の７０テイナーゼとエンドヌクレアーゼとを除去して もよい。

この最後の処理には、コラゲナーゼの分子童とプロテイナーゼの分子童とが極度 に違うこと全オリ用するとよい。よｐ詳細には、コラゲナーゼの分子童は３０， ０００よシ大きくグロテアーゼの分子童は３０，０００よジ小さいので、例えは 適描な限外濾過膜を用いると双方全容易に分離し得る。特に、培養の中断と細菌 の分離とを行なった後に得らｎだ培地には、３種の限外沖過金順次行なうことが 可能である。最初の限外濾過では残留細菌を除去しコラゲナーゼとグロテアーゼ とを含有する清澄液全得る。第２の限外濾過では３０．０００よρ犬さい分子量 のタンパク特にコラゲナーゼ全限外濾過膜で分離する。第３の限外沖過では、１ ０，０００より大きい分子量を分離し得る限外濾過膜を用いグロテアーゼ全回収 し倫る。こ扛らコラゲナーゼとグロテアーゼとを以後所望の割合に再度混合する ことができる。

既に記載した本発明の付加的特徴によｎば、コラゲナーゼと場合によってはプロ テアーゼ及びエンドヌクレアーゼとを任意に更に精製した後に、特にとわらの酵 素溶液を凍結乾燥によって回収する前に、こ扛ら浴液にコラーゲン加水分解産物 を好ましくは前記の割合で予め添加するのか有オリである。言い換えると、前記 浴液はコラ−ケン加水分所産物で補完さｌｎ、た後、凍結乾燥で処理される。

コラゲナーゼを浴液から回収する前に溶解コラゲナーゼに前記コラーゲン加水分 解産物を添加する処理はまた、前記コラゲナーゼの安定化を目指す方法の主要ス テップであることが判明した。従ってこの安定化方法は、好逢しくにコラゲナー ゼに対して前記軛曲の相対比で前記コラーゲン加水分解産物全存在させてコラゲ ナーゼ含有浴液を凍結乾燥するステップを含むこと全特徴とする。

組成物の種々の成分を定量するために、以下に記載の技術を使用する。こ扛らの 技術で使用される基質、反応体及び算出法についても以下に説明する。

Ｚ、　ｆ’ｕｒ　Ｐｈ）ｒｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３３３．１４９−１５１　 ）基質 使用基質は、Ｓｏｃ＋≦ＬＪＦｌｕｌａＩ製の４−フェニルアゾ−ベンジルオキ シ−カルボニル−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｄ　−Ａｒｇ、 　ＨＣｔ（ＰＺ−ＰＬＧＰＲ）でちる０反応体 使用反応体は以下の通りであるＯ Ａ、バッファ： バッファは以下の３溶液から成る。

−浴液Ａ１：１６０ｍＭのベロナール（５＋５−ジエチル）くルビター２、准ナ トリウム塩）と１４３ｍＭの酢酸ナトリウム、３Ｈ！０とから成るニ 一浴ｉＡ２　：　ＩＮ　ＨＣｌ　； −浴液ｈ　ａ　：　ｓ、ｓ％ＮａＣ６：バツファ′（ｉ：調製するには、２００ −の溶層Ａ１と８０−の溶液Ａ３とを混合し、溶液Ａ２全用いてｐｌ（を８．５ に調整する。水を加えて１ｔにしＣａＣｌ２　、２　Ｈ２Ｏを終濃度４ｍＭまで 添加する。

Ｂ、基質の溶液： この溶液を調製するには、１０■のＰＺ−ＰＬＧＰＲをｉｏｏμｔのメタノール に溶解する。バッファを加えて１０−にする。このように得らｎた基質溶液は一 週曲安定である。

Ｃ１コラゲナーゼのサンプル： １〜の溶液を１−のバッファ中に維持してコラゲナーゼサンプルを得る。未知の 特異的活性を有するサンプルを用い、予備読取に従って希釈するＣ最適希釈度は 、３２０ｎｍの光学濃度の比色値が０．１乃至１．０の範囲になる値である（後 出）。

Ｄ、　クエン酸： これは０．５％水溶液である。

Ｅ、酢酸エチル。

定型法 以下の＋ｊ＠で処理する。

１、　溶液Ｂを３７℃に予へする。

２　（正確に希釈した）０．１−のコラゲナーゼ溶液と予熱した０、４１ｎｔの 浴液Ｂとを混合し３７℃で１５分間インキュベートする０ λ　１−の浴液Ｄｔ１″加えて混合する。

４．５ｔｄの酢酸エチルを加えて激しく攪拌する０５、　次に、上部有磯相を除 去し、無水Ｎａ２５Ｏ訛加えて乾燥させる。

６、基質（浴液Ｂ）の代シにバッファを用い上記１から５の手順に従ってテスト サンフルと同じ条件でコントロールを調製し、テストサンプルの３２０℃ｍでの 光学濃度をコントロールとの比較によって測定する０ 係ａｍ、ペプチドを切断する物質（ＰＺ　Ｐｒｏ−Ｌｅｕ）　（Ｆｌｕｋａ社製 の化合物Ｂ）によって得らｎる標準曲線から演鐸さｎる。

ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ　ｎ、　３２　：　Ｋｕｎｉｔｚ　Ｍ、　（１９４７）　Ｊ 、　Ｇｅｎ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３０．２９１）基質 使用基質は、生化学用カゼイン（Ｍｅｒｃｋ社の商品第２２４４使用反応体は以 下の通りである。

一溶液Ａ： この溶液は、 Ａａ：０．２Ｍホウ酸（ＩＺ４ｇ／１０００７）とＡｂ：０．０５Ｍホウ砂（１ ９，０５９／ｉ　０００ｍ）トから成る。溶液Ａを得るには、１００ｒｎｔの溶 液Ａａを浴液Ａ　ｂ（約４ゴ）で肯７．６に調整する。

−溶液Ｂ： １９のカゼインを１００ｆｆｉ７！の浴液Ａに懸濁させる０１０゜℃の湯浴中で 完全溶解まで（約１５分間）加熱する０こ扛によって得られたタンパク濁の溶ｇ を４℃で一週間維持し得る。

−溶液Ｃニ トリクロロ酢酸の５％水溶液。

グロテイナーゼサン１ル グロテイナーゼを含有するサンプルの希釈を予備定量にょって２−１０μｑトリ フシン／ｒｎＩ！と等価になるまで調整する。

定霊法 こｆ′Ｌは以下の手順で行なわれる。

１、各サンノル全夫々のコントロールに対応させるためにサンプル数の２倍の数 の管を用意する（　ｖｉｄａｌ　１１　Ｘ　７０プラスチツク管）。

２　容管に０．５−の浴液Ｂを入ｎ１３７℃で５分間ブレインキュベートする。

＆　１サンプル用”の容管に０．５　ｄのサンプルを加える。攪拌下３７℃で２ ０分間インキュベートする。１．５−の溶液ｃ６加える。

４、′コントロール用”容管に１，５−の溶液ｃ２加える０３７℃で５分間イン キュベートし、５ｍｌのサンプルを加える。

５、全部の管？４℃で一晩静直する０ ６、呈温で８０００回転／分で１０分間遠心する０７、対応コントロールに比較 してサンプルの上滑の２８０での光学濃度（Ｄ０２８０　）を読む０ 計算 １、　標準曲線 純粋トリプシンの珠存浴液（０−１ｍ９／ｍｃ！ＨＣ２，１０Ｍ）を希釈し一当 勺のトリプシンの終濃度全夫々、１，２，４，６゜８μりにする。次に、前記の １乃至７のステップを実施する。

２　活性ユニットは１μｑのトリプシンに対応する。比活性ユニットは、タンパ クη当９１μシのトリプシンに対応する。

■　チオキシリボヌクレアーゼの定量（Ｋｕｎｉｔｚ　Ｍ、　（１９５０）　Ｊ 。

Ｇｅｎ、　Ｐｈｙａｉｏｌ、　３３．３４９−３６３　）反応体 以下の反応体を使用するニ ー　（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ社製品たる）クレードロのチオキシリボヌクレアー ゼＩ（２０００Ｕ／ｍ９） −（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ社製品たる）チオキシリボ核酸（３ゴ／バツフアは以 下の如く構成てｎる。１００ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ：４ｍＭのＭ７ＳＯ４：　 ７　＆Ｏ：　１．８　ｍ　ＭのＣａＣｌ２　、２　Ｈ２Ｏ：塩酸でｐＨ７，５に 調整する。

溶液 一酵索標準＝１■のチオキシリボヌクレアーゼＩ？！−１ｒｎｔのバッファに溶 解する。

一基質：１５０μｔを５０ｆｎｌのバッファに希釈する。

足型法 以下の手順で行なう。

１．３ｍ７！の基質溶液の２６０ｎｍでの吸光度を０に調整する。

２１００μｔの標準酵素を加えてかき混ぜる。

３、１０分間の吸光度変化全記碌する。

４、比ΔＡｚａｏ　（２６０ｎｍでの吸光度変化）７分を決定する。

５、新しい基質溶液と未知の酵素サンプルとを用いて１から４のステップを再現 しΔＡ２６゜７分の値を決定する。

計算 ｍ９／　ｒｄ＝　２８０　ｎＴＱでの光学濃Ｋ　（ＤＯｔｓｏ　）　Ｘ　０．９ ΔＡ／分Ｘ１０００Ｘ６ ＬＪ、　（１９５１）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９３．２６５）反応体 以下の反応体を使用する。

ｆｆＪ　液Ａ　：　ＮａＯＨ０，Ｉ　Ｍ中の２％Ｎａ１ＣＯ３ニー浴液Ｂ二２％ Ｎａ、酒石酸カリウム；−浴液Ｃ：１％ＣｕＳＯ４； 一溶液り＝１−の溶液Ｂ＋１−の溶液Ｃ：溶液Ａで１００−に希釈する。

１、ＩＴｎ９のウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ、　Ｓｉｇｍａ社製）を２−の 水に入ｎて参照タンパク溶液を調製する。

２　水で希釈し、最終量４００μを中に１０乃至８０μを含まれた一連の希′Ｐ ！、度の参照溶液ヲ調製する。

３．２−の溶液りを加え、かき混ぜて、実数室温度で１０分間靜装する。

４、　２００μｔの浴液Ｅｔ−加え、暗い中で５０℃で１０分間インキュベート する。

＆　コントロール（ステップ２でＢ５Ａｌ液の代シに水を使用したもの）に比較 して７５０　ｎＭでの光学濃度を読取９、標準白ｉ全作厄する。

定量 未知サンフ゛ル′（ｉ一種々の希釈Ｋ（最終量４００μｔ、ステップ２）で処理 する。

計算 未知サンプルのタンパク分で参照ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１１Ｌ童当量 で示す。

本発明の別の％徴な、Ｖｉｂｒｉｏ　ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃすｃｈｅｍｏｖａ ｒ　ｉｏｐｈａｇｕｓの培養条件に関する以下の記載より明らかにされるでろろ う。

−第１図は、前記細菌の培養中に産生が誘発さｎた種々の酵素の相対濃度を時間 の関数として示すグラフである。

−第２図は、コラゲナーゼに対するミオシンの阻害特性を示によって運動する。

この細菌は、チオ硫酸塩−クエン酸塩−胆汁−ショｆｉ（ＴＣＢＳ）培地で３０ ℃で１晩インキユベートスルと、直径２−３割の円形黄色コロニーを形成する○ インドール産生、リシンデカルボキシラーゼ、ゼラチナーゼ（薄膜テス）　）、 ＴＷＥＥＮ８０なる名称の市販湿潤剤のエステラーゼ、テトラチオネートレダク ターゼ、硝敵塩還元、グルコース、マルトース、マンニトール、ショ糖、トレノ １０−ス、マンノース、グリセロールからの酸産生、クエン酸塩の使用（Ｓｉｍ ｍｏｎｓ　）。この細菌に、アミノグリコシド抗生物質の作用、クロラムフェニ コール、テトラサイクリン、コリスチン、リファンピシン、スルホンアミド類、 ナリキシド酸（１’ａｃｉｄｅ　ｎａｌｉｘｉｄｅ）、この細菌は以下のテスト に陰性反応を示す。メチルレッド、アルキニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、フ ェニルアラニンデアミナーゼ、０ＮＰＧテスト、＆Ｓ産生（寒天　鉄　ＩＧｉｇ ｌｅｒ　）、グルコースガス発生、キシロース、アラビノース、アドニトール、 ラムノース、ンルボース、ソルビトール、ズルシット、ラクトース、イノシトー ル、サリシン、ラフィノース、メジビオース、α−メチルグルコシド、ムカート からの酸の産生。この細菌は、マロネー１ｆ利用しない。

菌株ｌ−０２９は極めて好塩性でｓＤ、ｉａ％の塩化ナトリウム中で至適増殖を 示し１５％の塩化ナトリウムに対して明らかに耐性である。ｌた、アンピシリン 、カルベニシリンにも完全に耐性でメジ、セファロテンには部分耐性である。オ ルニテンテカルボキシラーゼテスト及びセロビオース発酵テストで陽性反応を示 す。

培養条件 Ｔｒｉｓ、Ｈ（Ｊ　Ｏ，Ｉ　ＭとＮａｃＺｏ、　４　Ｍと２ｍＭのＣａＣｌ２　 、　ｐ＋１７　。

とに例えば２５％カサミノ酸（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、＋　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　 Ｍｉｃｈ、　）　ｆ加えた培地を用い３０℃で攪拌及び踵制通気（１，４気圧） を維持して細胞を培養する。培養開始の２時間後に、培地に商品名ＡＳＦなる市 販ｍ酸物（仔牛皮膚のコラーゲンのペプチド断片：童％１で加える。増殖全コン トロールするために、１時間毎に抽出したサンプルについて６００ｎｍでの１　 当ジの吸光度によって混濁産を測定する。

コラゲナーゼ、プロテイナーゼ及びヌクレアーゼの産生菌株は細胞外ヌクレアー ゼｈｙカゼイン渇解性プロテイナーゼ金並生し、ＡＳＦの添加以後、コラゲナー ゼを産生ずる。このとき、コラゲナーゼの活性レベルは６０　ｎｋａｔ　／−に 達する。

第１図のグラフに於いて、 一曲組見は細胞増殖、 一曲線互はコラゲナーゼの活性、 一曲線二はカセイン浴解性 ン”ロテイナーゼの活程、 一曲Ｍｄはヌクレアーゼの活性 の夫々全時間の関数として示ア０ 好ましくは、コラゲナーゼの活性が最大１丘を過さたとき、特に図示の場合は５ 時間後に培養を中止する。コラゲナーゼ全この培地から濃縮し回収する。更にこ のコラゲナーゼを精製してもよい。この精製に使用し得る方法は、ＫＥＩＬ−Ｄ ＬＯＵＨＡ、　Ｖ、　１９７６゜”　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ ｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｕｔｏｄｊｇｅｓｔｉｏ ｎｏｆ　ｐｕｒｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｃｈｒｏｒｎｏｂａ ｃｔｅｒ　４　Ｂｉｏｅｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ａｃｔａ、　４２９．２３９−３０５−ｈ’、、Ｆ、ｌ’Ｌ ＥＣＲＯＩＳＥＹん。

Ｖ、　ＫＥＩＬ−ＤＬＯＵＨＡ、　Ｄ、　Ｌ　ＷＯＯＤＳ、　Ｄ、　ＰＥＲＲＩ Ｎ　ｅｔ　Ｂ、　ＫＥＩＬ。

１９７５、　”　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　５ｔａｂｉｌｊｔｙ　ａｎｄ　 １ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｃ ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　＄　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ５９、１６７−１７２ ゜ に記載さ扛ている。

Ａｃｈｒｏｍａｓｅ型調製物は、全産生物η当シ０．３１２りのタンパク（乾重 量）を含む。この調製物は、“タンパク乾重量η轟り以下の相対活性によって定 性妊ｎる。

−コラゲナーゼ：　０．５５４　／ｊｋａｔ−ノロテア−セ二重４５カセイン浴 解ユニット−エンドヌクレアーゼ：４７７ヌクレアーゼユニツトコラーゲン溶屏 活性の安定化 調製物全凍結乾燥するときにコラーゲン溶解活性を安定化するためにコラゲナー ゼ俗散にコラーゲン加水分解ｉｗ全ｓ人する。この安定化効果は、凍結乾燥の前 後でのコラゲナーゼ調製物の酵素活性の維持率（％）で示すことができ、所定量 のコラゲナーゼに対してコラーゲン加水分解産物を棟々の割合で加えるテストに よって測定した。コラーゲン加水分解産物としては、フランスで販売さ扛ている Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｒｒｌ：ｎｔｓ　Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ　Ｓ、　Ａ、社の商品 ＡＳＦｉ使用した。こｎは、冷水に可溶な微粉セラチンである０ 得ら扛た結果を次表に示す。使用したＡｃｈｒｏｍａｓｅ　とＡＳＦとの相対比 を表の左欄に示す。

この表の検討によって以下の争央が判明するニーＡＳＦを存在させないでＡｃｈ ｒｏｒｎａｓｅ浴ｇ、を凍結乾燥すると、コラーゲン浴″Ｉｙ＋活性が５０％失 なわｎる。

−ＡＳＦの添加は宿性低下全顕著に鈍化する。

特に有利な結果は、Ａｅｈｒｏｍａｓｅ　ｌ　ｉｔ部に対してＡＳＦ２乃至１０ 重量部の割合のときに侍ら扛るｏ　Ａｃｈｒｏｍａｓｅ　１部に対してＡＳＦ５ 部の割合の場合、出発浴液の酵素活性がほぼ光全に維持されることが判明した。

凍結乾燥中に酵素活性か維持さｆる上に、凍結乾燥コラゲナーゼＦＪＩｔｒ！コ ラーゲン加水分解産物添加によって顕著な貯蔵安定性を得る。即ち、コラーゲン 加水分等産物全会１ないコラゲナーゼは７力月後に４℃で２５タロのコラーゲン 浴落活性低下を示した。コラゲナーゼｌｌ童部当ｐ１乃至１０重扉部のコラ−ケ ン加水分解産物ケ含むコラゲナーゼ調製物の同じ時期、同じ温度のコラーゲン電 解活性は１００％維持さｎていた。

温度４℃全２０℃に代えたとき同じ７力月後の安定化効果は、コラーケン消化加 水分解圧物金言’Ｆ７ｆｆｉいコラゲナーゼ調製物では３０％の活性化低下がめ ったが前記と同じ割付のコラーケン拍化加水分解座物を含ｔｒ調製物では５％の 活性へ低下しかながった。

同僚の安定化は、コラゲナーゼ（又はＡｃｈｒｏｍａｓｅ）を主成分とする別の タイプの調製物特に、後述する如き既製形脚製物についても観祭妊ｔた。

生物学的特性 得られたコラゲナーゼ調製物は前記の如きコラーゲン溶解活性を有する上に、ミ オシンによって阻害さ；勘名′という特性を有する。ミオシンはコラゲナーゼに 対し非競合的阻止因子の機能て証明される。゛ コラゲナーゼによるコラーゲンの分解は、消化されて可溶化したコラーデン断片 の加水分解後に遊離されたヒドロキシプロリンの定量によって追跡できる。

ヒドロキシプロリンはコラーゲンｌ（特４ｈアミノ酸であり、定量の際に反応混 合物に含まｎる別のタンパクは関与しない。

バッファＴｒｉｓ、　ＨＣＩ　０．０２Ｍ、　ＮａＣｌ　０．２３Ｍ、　ＣａＣ ４５，１０−３Ｍ。

ｐＨ，７，４中で 一筋肉稙維コラーゲン５乃至３０ｍｇと、−ＣａＣＪ、　１０−’中にＱ、ｌ＋ ｙ／ｍのコラ２ナーゼｌゴと、−インキュベーションバッファ又は −該バッファ中に５■／ゴのミオシン懸濁液５ゴとの混合物を３７℃で１時間イ ンキュベートする。

インキュベーション後、反応混合物’ｉ１２，００（ｌで５分間遠心し、０，５ ゴの上清を０．５プのＨ（Ｊ１２Ｎと共に１１０℃で１晩加水分解する。次にサ ンプルを真空乾燥し、ヒドロキシプロリンが定量できるように等容の水に入れる 。

濃度０．０９８μｋａｔ／ｍＡ’のコラゲナーゼを用いた前記テストの結果を第 ２図のグラフで示す。第２図で曲線見は、ミオシンを存在させずにコラゲナーゼ が存在するときの比１／ｖ（ｖは３７℃で１時間当りのコラーゲンの消化モル数 ）の変化を比１／ｓ（ｓはコラーゲンの使用モル数）の関数として示す（ＬＩＮ ＷＥＡＶＥＲＢＵＲＫによる解釈）。

曲線工は５■のミオシンを存在させたときの同じ調製物の消化状態の変化を示す 。

これらのグラフを検討すると、当該コラゲナーゼ調製物のコラーゲンに対する活 性が極めて顕著に阻害されることが判明する。

本発明で使用されるコライむり゛は毒性を全く含まない。このことは、Ｊ、Ｔ、 ＬＩＣＨＴＦＩＥＬＤ及びＦ、ＷＬ　ＷＩＬＣＯＸＯＮの方法によるマウスの致 死量テストによって証明し得る。

本発明の調製物を、タンパクη当り０．１７μｋａｔのコラーゲン溶解活性で静 注して測定したしｐ−５０は以下の値であった。

−マウスゆ当９８．５８■。

この致死量を調製物のコラーゲン溶解活性ユニットに換算すると。

一マウスｋｇ当り１．４６μｋａｔ ラーゲン溶解活性を示した。

これらのテストでは、ブタの皮膚を予め火傷させ本発明のコラゲナーゼ含有調製 物で治療した。火傷を生じさせるために、ブタの背中の幾つかの場所に温度８０ ℃の熱湯全１５分間塗布した（ブタの右側に６つ、左側に６つの傷をつけた）。

熱湯で火傷した表面から死表皮を取除き、傷を４８時間空気に曝した。

各偶は直径約３．８　ｃｍであった。コラ２ナーゼを含有する軟膏とコラゲナー ゼ全含有しない同様の軟膏との二重テストを実施した。後者はコントロールであ る。

これらの軟骨の組５１ｍ以下に示す： コントロール軟膏は 一ホリオキシエチレン化アルコール　１３２−ｐＨ７ＶＣ調整するための水酸化 ナトリウム。

−ル軟膏を左側の傷に塗布した。

火傷発生の夫々３．４．６．１３日後に軟膏塗布を繰返した。

火傷発生の６日後と１３日後とに以下の観察をした。

６日後の火傷の状態 火傷の深さと残存した組織の厚みとは、軟膏で処理した火傷とコントロール組成 物で処理した火傷とでほぼ同じである。

コントロール軟膏で処理した火傷のうちの６つに於いて完全形コラーゲン繊維を 含む伽皮の存在が確認されたが、本発明のコラゲナーゼ含有軟膏で処理した火傷 では痴皮が全く存在しなかった。

コラゲナーゼ含有軟膏で治療した６つの火傷に於いては真皮の上部に炎症細胞が 侵入していることが確認された。コントロール火傷では、その３つだけが同じ現 象を示した。炎症細胞の侵入は、このような侵入が生じていない火傷の場合より も廠疲形成が進んでいることを証明する。

しかし乍ら、表皮と結合組織との治癒程度について処理火傷とコントロール火傷 との間に大した差はない。但し、治癒程度は処理火傷の方が少し早い。

１３日後の火傷の状態 処理動物に於いては火傷が退化組織の薄膜で被覆されていた。

この薄膜の直下とより深い真皮中とで新しい結合組織が火傷全面に発達していた 。表皮は退化組織膜の直下で傷の周縁から肉芽組織の形状で発達していた。

処理火傷では伽皮のコラーゲン部がコラゲナーゼによって溶解され従って結合組 織の再生が切り傷の場合と同じ状態で表面にも及ぶ。形成された表皮は前記肉芽 組織の表面に移行し得る。

これに反してコントロール火傷は緻密なコラーゲンの深い伽皮で覆われており、 このコラーゲンは組織に付着して組織を覆ってｂる。新しい結合組織は、火傷の 周縁だけに形成される新しめ表皮層の下にしか形成されない。前記伽皮の下方で は表皮が火傷の周縁から移行して真皮を貫通する。このため修皮が５ｊ層−組織 から分離される。従って、新しい表皮源は傷の周縁にしか見られない。これらの 瘍の完全なｇｌｉ痕化を確保するためには、存組織との正しいバランスを自動的 に達成することである。外科的方法によってこのようなバランス全再現するのは 極めて難しいと考えられる。

本発明の製剤は、外用薬として使用できるいがなる形状を有していてもよい。例 えば、ゲル、エマルジョン、特に軟膏、クリーム、又は溶液、又は、ｒＩＮ霧可 能形（粉末エアゾール）がある。各製剤中でコラゲナーゼは、前記の各剤形次第 で適当な付形剤と配合して使用される。局所適用される溶液の場合、等張媒体、 好ましくは、生理的に許容される好ましくは無菌のｐＨ７−８，５のバッファを 用いてコラゲナーゼ浴液全調製するのが有利である。

注射可能な無菌ベヒクルを用いた溶液形コラゲナーゼ製剤は、治療すべき傷跡即 ちケロイドの近傍で皮下注射されてもよい。

また、このような注射可能溶液全深部投与に用いてもよい。特に、例えば椎間板 の如きＭ社内のコラーゲンの病的蓄積を破壊するために深部投与し得る。

従って本発明の薬剤組成物は、コラーゲンに冨む構造の無制御な変質が生じるよ うないかなる種類の傷にも使用され得る。

治療できる傷の例として、火傷、潰瘍、伽皮、コラーゲンベースの白色硬伽、ケ ロイド例えば外科手術後に生じるケロイド、壊死特に臥位又は潰瘍にょる象死が ある。本発明の薬剤Ｍｉ成物はまた、予防処置に使用され得る。特に、プラスチ ックもしくは別の移植を行なう外科手術、又は、整形外科手術及び一般的本発明 のコラゲナーゼ溶液はまた、虫歯の治療にも使用され得る。即ち、よく知られて いるように歯髄は主として緻密な石灰質コラーゲンから成る。虫歯では、歯にヒ ビが入るが又は穴が開きそこからカルシウムが漏出する。このため、石灰質が除 ベニジ 去されて残ったコラーゲンのフレームは多孔性になり、細菌感染の温床になり易 い。

本発明のコラゲナーゼ濃溶液全前記フレームに導入すると多孔性コラーゲンの溶 解が誘発され、これを水洗して除去し得る。

健康な石灰質コラーゲンの処ではコラゲナーゼの作用は自然に停止する。

特にホウ酸塩ノζツファでｐＨ７−８，５に緩衝した使用コラーゲン溶液は、好 ましくは溶液ゴ当り少くとも１μｋａｔのコラゲナーゼを含むのが好ましい。こ の濃度及び更により高い濃度では多孔性コラーゲンが急速に溶解する。

洗浄及び消毒後に、当業者に公知の技術を用いて治療した歯を塞ぐ。歯の中に残 存する可能性のある微量のコラゲナーゼは、歯髄中に回復される主として酸性の ｐＨによって徐々に阻害される。

本発明が前記に述べたような場合に全く限定されないことは、当然であシまた前 記の記載からも明らかである。逆に本発明は全ての変形を包含する。変形として 特に、薬剤の成分として使用することが可能な全ての別のコラゲナーゼに対して コラーゲン加水分解産物の安定化特性を利用したものがある。薬剤の成分として 使用さｎ得るコラゲナーゼとは、前記の如き選択的活性を有しておシ且っ同時に 選択的コラーゲン溶解活性全発揮するに十分な用量で望ましい無害性を示すコラ ゲナーゼである。

このため、本発明は、コラゲナーゼのソースの如何に関わり無く、特にコラゲナ ーゼがどの微生物の培養物から得られたかに関わり無く、前記条件に対応する全 てのコラゲナーゼとコラーゲン加水分解産物との配合物を含む。これらの組成物 に於いては２種の成分が、特に前記の好ましい割合の範囲と向等の割合で配合さ れておシ、特に以後の請求の範囲のいくつかに請求された配合の等価物を構成す る。

同様に、コラゲナーゼ特にＡｃｈｒｏｍａｓｅ　５安定化するためにこれらの溶 液をコラーゲン加水分解産物の存在中で凍結乾燥する方法は、特にコラーゲン加 水分解産物が前記に定義された相対比の範囲内で同様に使用される限り、特に全 てのコラーゲンの溶液を凍結乾燥によって安定化する効果を有する。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特にコラーゲンに富む構造の無制御変質が現われるヒト又は動物の病気の治 療に使用するために、有効量のコラゲナーゼを薬剤ベヒクルと共に含んでおり、 前記コラゲナーゼがペプチド配列Ｘ−グリシル一旦−プロリル〔式中、Ｘはグリ シル残基のＮ−ターミナル末端に連結されたメ天然アミノ酸残基〕を特異的に認 識し前記配列をＸ−グリシル結合の処で特異的に切断しまたミオシンによって少 くとも部分的に阻害されていることを特徴とする薬剤組成物。 ２、　コラゲナーゼがＶｉｂｒｉｏ　ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｃｈｅｍｏ ｖａｒ　１ｏｐｈａメｇｕｓの培養物から得られることを特徴とする請求の範囲 １に記載の組成物。 ３、　コラゲナーゼがＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。に受託番号Ｉ　−０２９で寄託された菌 株から得られることを特徴とする請求の範囲２に記載の組成物。 ４、コラゲナーゼの含有量が、組成物の総重量に対するコラゲナーゼの活性で示 すと、１少くとも 一エマルジョン、軟膏、粉末、又は、通常の意味での液体の範囲には実際には含 まれない全ての組成物の場合に薬剤組成物当り０．０５　μｋａｔ　／　１１、 −局所使用すべく構成された溶液の場合には薬剤組成物当り０．０５μｋａｔ／ ｍｊ！に等しい量であることを特徴とする請求の範囲１乃至３のいずれかに記載 の薬剤組成物。 ５、エマルジョ／、軟膏、粉末又は真に液体でない組成物幽夛０．１乃至２好ま しくは０．５乃至１μｋａｔ／ｇのコラゲナーゼを含むか、又は溶液当、！ｌ） ０．１乃至２好ましくは０．５乃至１μｋａｔ／ゴのコラゲナーゼを含むことを 特徴とする請求の範囲４に記載の組成物。 ６、更にプロテアーゼとエンドヌクレアーゼとを含んでおり、０．３５０μｋａ ｔのコラゲナーゼに対するプロテアーゼとエンドヌクレアーゼとの割合は、プロ テアーゼに関しては２００カゼイン浴鮮ユニツト以下、エンドヌクレアーゼに関 しては５００ヌクレアーゼユニツト以下であることを特徴とする請求の範囲ｌ乃 至５のいずれかに記載の薬剤組成物。 ７、前記３種の成分が −コラゲナーゼが０．３５０μｋａｔ以上、−中性プロテアーゼが２０乃至２０ ０カゼイン溶解ユニツト、−エンドヌクレアーゼが３０乃至５００ヌクレアーゼ ユニツトに対応する相対比で含まれていることを特徴とする請求の範囲６に記載 の組成物。 ８．前記成分が 一コラゲナーゼ活性が０．３５０μｋａｔ以上、−中性プロチアーゼ活性が２０ 乃至５０カゼイン溶解ユニツト、 一エンドヌクレアーゼ活性が３０乃至６０ヌクレアーゼユニツト に夫々対応する相対比で含まれていることを特徴とする請求の範囲７に記載の組 成物。 ９、更に、コラブナ−４１重量部車力１乃至２５重量部好ましくは２乃至１０重 量部の割合でコラーゲ／の加水分解産物を含有していることを特徴とする請求の 範囲１乃至８のいずれかに記載の薬剤組成物。 １０、コラゲナーゼ１重量部当カニ乃至２５重量部好ましくは２乃至１０重量部 のコラーゲン加水分解産物を前記コラゲナーゼと共に含有することを特徴とする コラゲナーゼベースの凍結乾燥安定組成物。 １１、前記組成物に含まれるコラゲナーゼが請求の範囲１乃至３のいずれかに記 載のコラゲナーゼであることを特徴とする請求の範囲１０に記載の組成物。 ■、コラーゲン溶解活性を低下させることなくコラゲナーゼの水溶液からコラゲ ナーゼの凍結乾燥調製物を得るために、溶液中に予め導入された有効な割合のコ ラーゲン加水分解産物の存在中で前記溶液を凍結乾燥させることを特徴とする躊 京９　方法。 １３、溶液中に予め導入されたコラ−モノ梢イ乙加水分解産物のコラゲナーゼ濃 度に対する割合が、コラブナ−４１重重部当シコラーゲン＝、１ｘｔ加水分解産 物１乃至２５重量部好ましくは２乃至１０重量部であることを特徴とする請求の 範囲１２に記載の方法。 １４、ヒト又は動物の虫歯それ以外の歯髄の変質の治療に使用するだめの溶液の 形状を有する請求の範囲ｌ乃至１０のいずれかに記載の組成物。