JPS60500427A - 特異性ｃｅａファミリ−抗原、それに対し特異性の抗体およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

特異性ＣＥＡファミリー抗原、それに対し特異１重の抗体およびそれらの使用方 法 木発凱■實呈 腫瘍特異性の化学的特徴化および決定と、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）の臨床応用 における大きな問題は、ポリクロナール抗血／Ｆｔ試薬の使用である。何故なら ばＣＥＡは厄介な、そして大部分不正確で不完全な抗体吸着技術によっである程 度限定および特徴化できる多数の抗原性部位を含んでいることが示されているか らである。このように、“精製したＣＥＡ”と称するものに対して調製された抗 血清の使用により、少なくとも１２種の交差反応性抗原が記載されている。しか しながらそのような“精製したＣＥＡ”はなおこれら交差反応性抗原決定基の変 化量を含有していた。例えば抗血液グループＡ抗血清はＣＥＡおよびＣＥＡのグ リコペプチドフラグノントを結合し得る。 ＣＥＡ分子はまた、胃がん患者の胃液中にしばしば発見される胎児スルホグリコ タンパクと交差反応性である決定基を持つことがある。消化管がん、正常結腸、 正常肺、正常肺臓中に、そしである種の白血球、例えばがん性を含む顆粒球に多 量に存在する非特異的交差反応性抗原は、最も豊富なＣＥＡ交差反応性決定基で ある。 これら既知のＣＢＡの交差反応性決定基のほかに、ＣＥＡを検出するためのアッ セイ、例えば生体外イムノアッセイ、生体内ラジオイムノ検出および療法、およ び°生体外免疫組織化学的検出の特異性を妨害し得る他のものが存在する可能性 がある。従って、そのような交差反応性物質の特徴化および単離は関心がある。 一つの有用な派生は精密な特異性、例えば密接に関連し、そして交差反応性の抗 原群中の一つの抗原にのみに発見されるエピトープに対する特異性、またはその ような抗原の２種以上に共通なエピトープに対する特異性ををする抗血清の製造 である。これら抗血清は数多くの臨床および研究室設備において有用である。エ ピトープとは、その特異性に影響する抗原または免疫原の単一決定基と定義され る（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉ ｃａｌ　Ｔｅｒｍｓ、　ＭｃＧｒａｌｌ−Ｈｉｌｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｕｒｋ。 １９７６）。 過去において、モノ特異性抗ＣＥＡ抗血清を製造する試みは、圧密組織抽出液ま たは他の物質による徹底的吸着を採用していたが、しかしこれら方法は厄介であ り、コントロールが困難で、精密でなく、そしてなおポリクロナール抗血清中に 存在する交差反応性免疫グロブリンを有するという問題がつきまとっていた。 最近モノクロナール抗体の使用により前記問題を克服する試みがなされている。 しかしながらＣＥＡに対するモノクロナール抗体を製造するいくつかの試みでさ えも、それらが反応性であるＣＥＡのエピトープの力゛テゴリー化を基にして抗 ＣＥＡモノクロナール抗体の異なるスペシスを解明できなかった。このように、 真のＣＥＡ特異性の範囲は、ＣＥＡ抗原ファミリー中に発見されるエピトープの 精密な特徴化および／またはＣＥＡと交差反応性の抗原に発見されるエピトープ の解明をなお待たなければならない。ＣＥＡファミリー抗原とは、ＣＥＡと共通 するいくつかの物理化学的および免疫学的性質を有するグリコタンパクまたはタ ンパク物質のグループと定義される。 イムノアッセイにおいて抗原と特異性抗体の両者７．使用することは既知である 。しかしながらそのようなアッセイはしばしば誤って規定されたエピトープ特異 性を持った抗原および抗体の使用に限られていた。従って本発明の一部を構成す るいくつかの応用はこれまで可能でなかった。 免疫組織化学、生体内造影および腫瘍治療の分野における同様の制限は本発明に よって克服される。 生金■坐且剪 本発明の一目的は、ＣＥＡおよび／またはＣＥＡと交差反応性の抗原の精密に限 定されたエピトープに対する実質上モノ特異性の抗体を提供することである。 本発明の他の一目的は、精密に限定されたエピトープおよび免疫反応性を有する 精製した抗原および／または抗原フラグメントを提供することである。 本発明のさらに他の目的は、ＣＥＡファミリー中の抗原上の特定エピトープの存 在を検出する方法を提供することである。 本発明のなお他の一目的は、同一抗原上または２種の異なる交差反応性抗原上に 存在する少なくとも２種の異なるエピトープの相対的割合を決定する方法を提供 することである。 本発明のなお他の一目的は、病原的状態の診断および／または鑑別診断方法、お よび／または密接に関連した抗体および／または抗原の精密な識別、特徴化およ び滴定のための方法を提供することである。 本発明のなお他の一目的は、がんの検出、同定、位置測定ｅ特徴化およびステー ジング方法と、腫瘍治療方法を提供することである。 明細書および請求の範囲のそれ以」二の検討により、当業者には本発明のそれ以 上の目的および利益は明らかになるであろう。 本会朋二ヱ且 以下の説明を読む時もっと容易に明らかになるであろうこれらおよび他の目的は 本発明によって達成することができる。組成物面においては、本発明は、少なく とも一つのＣＥＡ交差反応性決定基、例えば実質上純粋な胎便抗原に対する実質 上モノ特異性抗体に関する。 方法面においては、本発明は、ＣＥＡ上またはＣＥＡと交差反応性の抗原」二に 存在する、少なくとも一つの抗原上の特定エピトープの存在を検出する方法に関 し、該方法は前記抗原を前記エピトープに対し特異性の抗体と接触させることよ りなる。本発明はさらに、同一または異なる抗原上に存在する少なくとも二つの 異なるエピトープの相対的比率を測定する方法を提供し、該方法は、前記少なく とも二つの異なるエピトープを含む被分析物を前記少なくとも二つのエピトープ を有するスペシスを結合することができる少なくとも一つの捕獲抗体と接触させ る工程、生成する結合したスペシスを前記二つのエピトープと一方を結合するこ とができるプローブ抗体を含むプローブと接触させる工程、および前記結合した プローブの濃度を測定する工程とよりなる。本発明はまたイムノアッセイ方法、 免疫組織化学方法、生体内検出、位置測定および治療方法、および精密な抗体、 抗原および抗原フラグメントの単離および精製方法を提供する。 杵胤広議羞− ＣＥＡの発見以来、この抗原の定義はある物理化学的、免疫化学的、および生物 化学的基準を充足する分子に基ついている。最初に記載されたように、ＣＥＡは 胎児およびがん性質腸組織へ限定され、そして過塩素酸に可溶で、特定のアミノ 酸および炭水化物組成を有する分子量２００，０００のβ−グリコタンパクであ った。この物質の同定は、抗血ｌｎが該クリコタンパク上の免疫支配基をもとの 抗ＣＥＡ抗血清によって検出されるのもと同しであると認識する能力にもっばら 依存していた。後にＣＥＡはその物理化学的および免疫学的性質において広い不 均一性を示すことが示された。ＣＥＡの特徴は、”　Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏ ｓｉｓ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｐａｒｔ　Ｉ　”　、　Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ　 ｅｔａｌ、、　Ｅｄｓ、、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｂａｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｂａ５ｅｌ　１９７９　と・”　Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂ ｒｙｏｎｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　＋　 Ｎｏｒｇａａｄ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　ａｎｄ　Ａｘｅｌｓｅｎ、　Ｅｄｓ、　Ｂ ｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。 Ｌｏｎｄｏｎ、　１９７８に記載されている。これら参照文献およびそれに引用 されている参照文献のすべてを参照としてここに取り入れる。 その臨床的応用を含むＣＥＡの多数の研究に浸透している大きい問題は、この抗 原を検出するために用いる各種方法の特異性であった。ＣＥＡに対して上昇させ た慣用の抗血清は、ＣＥＡに密接に関連した物質のグループと反応する抗体を特 徴的に含有する。後者の抗原のうち、最初に記載すべきは正常ヒト組織、特に肺 および牌臓中にＣＥＡより高いレベルで存在する６０．０００分子サイすのグリ コタンパクである、非特異性交差反応性抗原（ＮＣＡ）である。 それらの免疫化学的類似性に基づいてＮＣＡらしいい（っがの他の物質が記載さ れ、そしにこれらは正常グリコタンパク、ＣＥＡ関連タンパク、結腸ＣＥＡ−２ ．結腸カルシノーマ抗原−■、および腫ゝ瘍関連抗原を含む。ＮＣＡとＣＥＡと は、それらが個々に区別される決定基を表現するので免疫学的に区別することが できる。胎便および成人側中のＣＥＡ様抗原の第２のグループも同定された。 Ｂｕｒｔｉｎおよび協力者によって特徴化されたＮＣＡ−２は分子サイズがＣＥ Ａより少し低く、そしてＮＣＡまたはＣＥＡのどれも持たない決定基を表現した 。三つの抗原間に共通の決定基に加え、第２の決定基はＮＣＡ−２とＣＥＡとの 間にだけ共通しているので、ＮＣＡ−２はＮＣＡよりもＣ，ＥＡへもっと密接に 関連しているように見える。成人側中の正常側抗原（Ｎ　Ｆ　Ａ）は最近三つの 分子スペシスに分離され、そのすべては免疫化学的にＮＣＡ−２，ＮＣＡおよび ＣＥＡとは異なる。胎便中のＣＥＡ様抗原とＣＥＡとの間の化学的、抗原的、お よび発生的相互関係の解明が必要であった。これら抗原の一部の臨床的有用性は 未知であり、そしてそれらはＣＥＡの開裂生成物か、ＣＥＡ前駆体分子か、また は本当に異なる遺伝子生成物を代表するかどうかは未解明であったが、ポリクロ ナール抗体によるそれらの同定は関連する抗原間に等しく共有されない少なくと も三つのＣ，Ｅ　Ａ上のエピトープの決定をもたらした。例えば、Ｂｕｒｔｉｎ 。 Ｐ、　Ｒｏｕｂ６ｒｔｉｅ、　Ｐ、、　Ｃｈａｖａｎｅｌ、　Ｇ、、　５ａｂｉ ｎｅ、　Ｍ、Ｃ，、およびＨｉｒｓｃｈ−Ｍａｒｉｅ、　Ｈ，”ＣＥＡ　ａｎｄ 　ｒｅｌａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　：　Ａ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ＮＣＡ−２ ”；Ｗ、Ｉｌ、　Ｆｉｓｈｍａｎ　およびＳ、　５ｅｌｌ　（ｅｄｓ、）　、、 “Ｏｎｃｏ−ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＧａｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　＋ 　Ｉ）ｐ、　６０９−６１１．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ。 Ｉｎｃ、、　１９７６；Ｋｕｒｏｋｉ、　Ｍ、、　Ｋｏｇａ、　Ｙ、、およびＭ ａｔｓｕｏｋａ　Ｙ、“Ｐｕｒｉ−ｆｉｃａｔｉｏｎ−ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔ ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｒｇｅ ｎ−ｒｅｌａｔｃｄ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｄｕｌｔ　ｆ ｅｃｅｓ”、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４１　ニア１３−７２０＋　１９８ １　ｉ　Ｐｒｉｍｕｓ　Ｆ、Ｊ、、　Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｒ，Ｗ、　ｍ、および Ｂｌｕｅ。 Ａ、　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ、　ｌｌＩｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉ ｎｇ、ａｎｄ　ｍｅｃｏｎｉｕｍ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　、Ｐｒｏｃ、Ｒｔｎ、ｅ ｌ−Ａｓ５−Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　２２　：２９８．１９８１参照。 ＣＥＡの免疫組織化学的位置決定は、ポリクロナール抗体を使用して多種類の上 皮がんにおいて広く研究されている。それ↓ま正常および非がん性病的組織、良 性腫瘍、および種々の器官の異型上皮中に種々の程度に存在するので、組織片中 のこの抗原の投出ハ正常または良性細胞をがん性細胞から区別するのに使用でき な・い。大部分の研究は、血中抗原レベルの測定は治療の予後およびモニタ１ノ ングを助けることができるが、大部分の研究は一次腫瘍のＣＥＡ染色と病的段階 もしくは予後との間の相関関係を見出していない。 いくつかの研究はＣＥＡに対するモノクロナール抗体の開発を記載したが、しか し組織片中のこの抗原の免疫組織化学的検出に対するそれらの使用は適切に探究 されなかった。同様に、・ＧｏＭｅｎ’ｂｅｒｇの米国特許第４，３４８，３７ ６号および米国特許出願第４　］、　４　、７２９号に開示された方法を採用す るがんの生体内造影に本発明による。ＣＥ　Ｒファミリー抗原に対する限定され たモノクロナールの応用が今や追求され、そしていくつかのがんのタイプの検出 および位置決定りこいくっがの利益を提供する。同様に、ＣＥＡファミリー抗原 上のエピトープに対するそのような抗体は、抗体フラグメントについてのＧｏＬ ｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，３４８，３７６号および第４．３３Ｌ６４７号 に記載されているような、単一抗体もしくは抗体組合せと、ラジオアイソトープ 、薬剤、トキシン、または同様な有毒剤でラヘルした抗体とを含むがん免疫療法 のための、および中性子捕獲篭法に使用する好ましい試薬である。 ＣＥＡ検出および生体外イムノアッセイの免疫特異性を改良するだめの最近の協 力は、ＣＥＡに対するモノクロナール抗体の開発および慣用アッセイとの比較に 集中している。しかしながら、ＣＥＡ関連抗原との交差反応性がＣＥＡに対する モノクロナール抗体でもそれらの慣用の対応物と同様に遭遇すること、およびそ れらのエピトープが適切に限定されていないＣＥＡファミリー抗原に対するモノ クロナール抗体の使用はこの応用を重大に制限することが予期される。 結腸腫瘍ＣＥＡに対し発生させたモノクロナール抗体は、抗原決定基の三つの一 般的クラスをそれらのＣＥＡ様抗原、ＮＣＡおよびＭＡとの反応性に基づいて分 化することが今や示された（第１図）。 クローンの最小パーセントは三つのすべての抗原が共通して持ち、そしてクラス Ｉのカテゴリーに属するエピトープを認識する抗体を産生ずる。クラス■モノク ロナール抗体はＣＥＡおよびＭＡ間に共通する部位と反応するが、クラス■タイ プのそれらはＣＥＡのみを結合し、明らかにこの分子に特有な決定基を認識する 。われわれはＮＣＡ交差反応生モノクロナール抗体Ｎｌ”　１のＮＣＡ対する親 和性は、そのＣＥＡに対する親和性に比較して著しく低いことを発見した。それ でＣＥＡに対するモノクロナール抗体のＮＣＡ交差反応性質は、抗体またはＮＣ Ａの適切な量を直接標識抗体結合または競合的阻止アッセイに使用しない限り顕 在化しない可能性がある。ＮＰ−１の匹敵する量はＣＥＡおよびＭＡの両方を結 合するのに有効であり、そしてＭＡはＮＰ−１とＣＥＡとの反応を阻止するのに ＣＥＡと類イ以であるので、こればＭＡについてはそのようではないらしい。わ れわれは、好中球がそれらのＣＥＡではなく　ＮＣＡの既知の合成から予期され るようにＮＰＩで陽性に染色されることを示した。このように、好中球の免疫細 胞学的染色反応はＣＥＡに対するモノクロナール抗体のＮＣＡ交差反応性の代替 評価方法を提供する。 モノクロナール抗体により限定されるＣＥＡエピトープのレバ一体それぞれＮＰ −１およびＮＰ−２は相互に阻止可能であるが、そのどれもがクラスＨの抗体Ｎ Ｐ−３を阻止できず、またはＮＰ−３によって阻止できないことを明らかにした 。ＮＰ−１とＮＰ−２との間の相互阻止特性は、それらによって認識されるそれ ぞれのエピトープは部分的に重複または相互に非常に近いことを示唆する。しか しながら、ＮＰ’−２とＮＰ−３との間の相互阻止の欠如は、それらはクラス■ カテゴリー内の二つの別のエピトープを認識することを指示している。このよう に、われわれはわれわれのモノクロナール抗体は結腸腫瘍ＣＥＡ上の少なくとも 四つの抗原性部位を区別することができることを発見した。その−っはＣＥＡ、 ＭＡおよびＮＣＡによって共に保有され（第１図α１）、他の二つはＣＥＡとＭ Ａとによって共に保有され（β１およびβ２）、そして４番目はＣＥＡに対し特 異性であることが覚られ（γ１）、そしてそれ以外のＣＥＡ決定子は第１図に図 示した３クラスの全部の内に同定されることが予期される。 ＮＰ−４モノクロナ一ル抗体および他のクラス■抗体は、典型的にはＣＥＡに対 して特異的なりギ抗体によって認識されるＣＥＡ分子の５０％未満を結合する。 クラス■抗体の部分的反応性に対する基礎は、ＣＥＡ分子の部分個数の識別に関 係している。 ＣＥＡに対する免疫特異性モノクロナール抗体の開発のための一つの主要目標は 、ＣＥＡ検出の精巧な応用の発達を促進することである。もしＣＥＡの種々の免 疫形が異なる個体または異なる病状段階で産生されるのであれば、このアプロー チの究極的利益性は限定された特異性を持ったモノクロナール抗体の複合体の創 製に依存するであろう。モノクロナール抗体エピトープ特異性の決定にＣＥＡ関 連抗原の取り入れは、ＣＥＡ検出に対して診断および予後適切性を有する抗体の 境界化を容易にするに違いない。これはＮＣＡ−２゜ＮＦＡ−２，またはＭＡと ＣＥＡとの間の生物学的相互関係と、腫瘍マーカーとしての前者の抗原の役割を 解明することによってさらに強化されるであろう。最後に、ＣＥＡに対するモノ クロナール抗体の研究に免疫組織化学のような他の方法の使用は、他に知り得な い予後可能性を有する分子決定基を明らかにすることができる。 本発明のこの開示は、本発明者Ｐｒｉｍｕｓ　らによる、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ ａｒｃｈ、　４３　（１９８３年２月発行、印刷中）三つの論文の完全な開示を 含み、該論文を参照として取り入れる。 胎硬−中−Φノ史ｑ−△−走関連よ−」ン旦Ｊ！交」［反ｌＪ生訪ＪＬΩ１虚む ＮＣＡ中和抗ＣＥＡ抗血清を二重免疫拡散法で個々の胎便サンプルに対して試験 する時、はぼ同数の標本が通常相互に非常に近似した一つまたは二つの沈降素ハ ンドを与える。二つのハンドが存在する大部分の標本においては、両者はＣＥＡ と部分的に一致する反応を生成するか、未抽出またはＰＣＡ抽出標本の１０％未 満において、第２のハントはＣＥＡと一致する反応を与える。この二つのＣＥＡ と交差反応性の沈降素ハンドは、同様に胎便中に存在するＣＥＡと融合しない。 これらゲル拡散ハターンは、ＮＣＡ中和抗血清中にＣＥＡおよびＮＣＡが共有す るエピトープへ関連し７ないＣＥＡ上の二つの共通決定基を認識する二つの追加 の抗体特異４ヂの存在を示している。 ＣＥＡ抗血清中のＮＣＡ非関連ＣＥＡ交差反応性抗体がラジオイムノアッセイ　 （ＲＩＡ）による胎便中のＣＥＡの測定に寄与したがどうかを決定するため、Ｎ ＣＡ中和抗血清は二重拡散法によってＣＥＡとの一致反応を与えない胎便サンプ ルによってさらに吸収される。この胎便吸収抗血清はＧＥＡに対する沈降活性を 保有し、そしてその標識したＣＥＡの最大結合は吸収しない抗血清のそれに比較 して約１０％低下する。しかしながら、ＮＣＡ中和抗血清中に当初存在した抗体 活性の８０％以上か胎便による吸収によって除去される。ロシュ社のキットＣＥ Ａ、ＮｃＡ−中和抗血清、または特異性抗ＣＥＡ抗血清とＣＥＡとを標識したト レーサーおよびインヒビターとして使用し、ＲＩＡによって胎便中のＣＥＡｉ度 を比較した。 ３種のすべての抗血清はＣＥＡによる阻止に対し同し感度を得る濃度に調節され た。１２の胎便サンプルの分析は、ロシ１およびＮＣＡ中和抗血清により測定し たＣＥＡ含量は、特異性抗ＣＥ入坑血清によって得られる値よりも３ないし１０ 倍大きい（ｐ＜０．００１；スチュデントｔ−テスト）ことを示した（表１）。 台　か゛のＭＡの− ＭＡの精製中の種々のステップにおいて、抗原活性は、胎便中の種としてＮＣＡ 非関連ＣＥＡ交差反応性物質を測定するものと嵩えてロソユ社のキ・２ト抗体を 使用するＲＩＡにより、そしてＣＥＡ活性を追跡するために特異性抗ＣＥＡ抗血 清によってモニターされた。 単離操作中の各種段階におけるこれら抗原活性と、特異性ＮｃＡａ度とは表２に 示されててる。ｐ　Ｈ８，０において４０％エタノール中への胎便の抽出はエタ ノール上清中に当初のＭＡ活性の約７５％を与えた。大きい沈澱がエタノール分 画によって生成したが、上清Ｇよ粘性でそして高度に着色されたままであった。 ＤＥ八へセルロース」二のエタノール抽出液のクロマトグラフィーは色素の大部 分を除去したが、しかし全体のクロマトグラムを通しＭＡのサブ分画を生した。 セファクリルＳ−３００上の０．１ＭＮａα分画のクロマトグラフィーの後、Ｍ Ａ活性の出現は少し小さいサイズで放射標識したＣＥＡマーカーの溶離と重複し た。２２５ないし２７０ｄの溶離容積間に出現するＭＡをプールし、そして二つ のアフィニティークロマトグラフィーのステップへかけた。最初のものはＭＡと 複合して残ってしＡる少量のＣＥＡを除去するため、特異性抗ＣＥＡ抗体を含ん でシヘる免疫吸着剤上の通過を含んでいた。この操作はＣＥＡの９５％を除去し たが、ＭＡの４５％が失われ、そして吸着した分画中Ｇこ番ま発見されなかった （表２）。第２のステップのため、胎便中のＮＣＡ非関連ＣＥＡ交差反応性物質 の少な（とも一つのグループと交差反応性の不スミモノクロナールＣＥＡ抗体、 ＮＰ−３を含有する免疫吸着剤がＭＡを選択しそしてさらに精製するために用も １られた。通用されたＭＡ活性の８０％以上かこの免疫吸着剤によって保持され た。 胎便５０ｇから出発したＭＡ７ｆ３性の全収率は４％であり、また４ま０゜ＩＭ ＮａｌＪ　ＤＥＡＥ分画中に存在したそれの２０％であった。 （以下余白） 一表一」− 市販および抗原中和抗血清を使用した ＲＩＡによる胎便中のＣＥＡ当量の比較抗　血　清 Ｎｌ１（ａｌｔ：ｌシュＮＣＡ中和　特異性抗ＣＥＡ　ＮＣＡ　（ｂｌｌ　１４ ］Ｃｌ　１８０　１５　！１４２　１４４　１８８　３９　８８ ３　１９６　２４４　７３　１０９ ４　２６０　３２８　５６　１０６ ５　１０２　１３８　１３　７８ ６　６２　６６　１０　５８ ７　１４０　５９　２９　９１ ８　７６　９４　１８　７（１ ９１３６１７６３５９６ １０１７，６２２８５４，９９ １１３３４５７４１ １２２７３４８５７ 平均±Ｓ、Ｅ、　１２４．３±１９．８　１４８．３　±’２６．５　２０．８ ±６−３　８２．２±６．２ｆａｌ　未抽出胎便ザンブルは最初ＰＢＳ中１　、 ：　４　（ｗ　／、ｖ　：）　８に＝ｓニーｂ、次にアッセイ前０．０１Ｍホウ 酸緩衝液ｐ　Ｈ８，５中に希釈した。 Ｆｂｌ　値はＮＣＡ　ＲＩＡにおいて測定したＮＣＡの特異性レベル胎便からの ＭＡ精製時のＮＣＡ、ＣＥＡおよびＭＡの比較分布および回収 抗原の量（■）（ａ） 単離ステ、プ　□ ＮＣＡ　ＣＥＡ　ＭＡ 出発胎便　６．５　０．６　１４．５ １９　／　−）Ｉ／ｋｌ＊　３．６　０．３　１１．０ＤＥＡＥ、　０．１Ｍ　 Ｎａ（！、　０．２　０．３　３．Ｏ５−３０００，０２０，２１，５ アフイニテイークロマトグラフイー ヤギ特異性抗ＣＥ八　（未吸着分画）　０．００６　０．０１　０．８モノクロ ナ一ルＣＥＡ抗体ＮＰ−３（吸着分画）　０．００５　０．００４　０．６ｆａ ｌＮｃＡについてはＮＣＡ特異性アッセイを使用するＲＩＡ、ＣＥＡについては ヤギ特異性抗ＣＥＡ抗血清を、またはＭＡについて」よロシュ社キット抗体を使 用するＣＥＡ　ＲＩＡで測定した。 皿梨Ｍ人り免佼揖上 ＲＩＡにおける中和活性を基にして、最終的に精製されたＭＡはＣＥＡまたはＮ 　ＣＡ　１．０％未満を含有していたく表２）、ＮＣＡ中和抗ＣＥＡ抗血清に対 するＭＡの二重免疫拡散はＣＥＡとの部分的一致反応を形成す−る単一沈降素ハ ンドを与えた。未抽出胎便および後者の抗血清との間に現れる二つのハンドは両 方とも精製されたＭＡにより形成された単一ラインに融合した。精製したＭＡｆ より１本のみの沈降素ハンドの出現は、それが第２のＮＣＡ非舅連ＣＥＡ関連抗 原を含んでいないことを示唆する。精製したＭＡは二重拡散において特異性抗Ｃ ＥＡ抗血清と反応しなかったが、この抗血清はＣＥＡを沈澱するその能力は保有 していた。ＭＡは免疫電気泳動においても血清タンパクに関しアルファグロブリ ンとして移動する、ＮＣＡ中和中和Ｃ抗Ａ抗血清する単一沈降素バンドを与えた 。 放射標識したＭＡの抗体結合特性をＲＩＡにおいて評価した。表３に示すように 、ロシュ社のキットＣＥＡ抗体およびモノクロナールＣＥＡ抗体ＮＰ−３の両者 は、これら抗体による標識ＣＥＡの結合に比肩し得る、類似量のＭＡを結合した 。ＭＡの８ＩＪ％以上は標識後短時間にテストする時免疫反応性であった。ヤギ 特異性抗ＣＥＡ抗血清のみが標識したＭＡと限界的に免疫反応性であったが、ヤ ギ抗ＣＥ抗体は非反応性であった。前者の抗血清およびロシュ社のキット抗体は それらの標識したＣＥＡとの反応性においてイ９でぃた。過剰の特異性抗ＣＥＡ とロシュ社のキット抗体との併用はロソユ社のキット抗体自体によるもの以上に ＣＥＡの最高結合を増加せず、標識したＣＥＡの同し主個数が両方の抗血清によ って認識されたことを示している。阻止アッセイおよび二重拡散はＭＡ中のＣＥ てはなく、この抗血清中の残存交差反応性抗体の存在のためである可能性が最も 大であった。 一表　３ ヤギおよびモノクロナール抗体に対する放射標識ＮＣＡ、ＣＥＡおよびＭＡの比 較結合活性結合した標識抗原の最高パーセン）　（ａｌ抗体　ＮＣＡ　ＣＥＡ　 ＭＡ ヤギ特異性抗ＣＥＡ　Ｏ６２８ ０シュ社キット　６　６９　６３ モノクロナールＣＥ八（ＮＰ−３）　０　６６　６６ヤギ抗ＮＣＡ　６７　０　 ０ （ａ）４時間４５℃でインキュヘート後抗体過剰で測定した。固相ヤギ抗マウス ＩｇＧまたはロバ抗ヤギＩｇＧを遊離抗原から結合抗原を分離するために用いた 。 呈Ｌ−匁至１サイズ リン酸緩衝化食塩水で平衡化したセファクリルＳ−３００上の標識ＭＡのクロマ トグラフィーは、ＣＥＡよりも少し大きい溶離容積においてのみ溶離する単一の 対称ピークを与えた。ＭＡおよびＣＥＡの溶離パターンにおけるこの関係は、６ ．０ＭグアニジンＨＣｌ２で平衡化し溶離されるセファクリルＳ−３００上の通 過の後にも維持された。ＭＡとＣＥＡとの間のサイズ分布の重複は、校正したゲ ル上の還元したサンプルの５０５−ＰＡＧＥ電気泳動の後にも観察された。標準 の移動度に対する対数分子ザイズブロノトからの補内法による、ＭＡに対する分 子サイズの推定は、ＣＥＡについて２００．０００に対し、１８５，０００の値 を与えた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーまたは周期的酸性ノソフ試薬 による５ＤＳ−ＰＡＧＥ中の還元したＩｔ／ｌＡの染色は、ＣＥＡと似た位置へ 移動する単一拡散ハンドを示した。 コンク　ハＩンーＡへのＭＡのＩＬ合 コンカナバリン−Ａセファローズへの放射標識ＭＡの結合をＣＥＡおよびＮＣＡ のそれと比較した。ＣＥＡおよびＮＣＡの９％以上がこのレクチンへ結合したが 、ＭＡの２０％未満が反応性であった。 ＣＥＡおよびＭＡのプロナーセ１訛 プロナーゼＥによるＣＥＡの消化はヤギ特異性抗ＣＥＡ抗血清とのその反応性を 完全に除去し、そしてＮＰ−３モノクロナ一ル抗体またはロシュ社キットヤギ抗 体へのその結合力の５０％低下をもたらした。この抗体結合活性の損失または低 下は酵素の不存在下の同様な処理の後には観察されなかった。６．０Ｍグアニジ ンＨ（Ｊ、で平衡化したセファクリルＳ−３００上の酵素消化液のクロマトグラ フィーは、ＣＥＡの大部分が小さいフラグメントへ分解されたことを示した。 対照的に、ＭＡの酵素消化はＮＰ−３およびロシュ社キット抗体へのその結合力 を２０％減らし、そしてその分子サイズにほんの少しの減少をもたらした。胎便 抗原ＭＡと命名された、胎便中のＮＣＡ非関連ＣＥＡ関連分子スペシスの一つの ための我々の単離操作は、初期段階における免疫分離ステップの適用を避ける。 これは、アフる可溶化に失敗したためである。テストした異なるアルコール濃度 およびｐＨ範囲の中で、ｐ　Ｈ８，５における４０％アルコールが最良のＭＡ可 溶化および最大の不適切タンパクの沈澱を得た。その後のＤＥＡＥセルロース上 のクロマトクラフィーは色素の大部分を残す望ましい特徴を持つが、不適切なタ ンパクおよびＮＣＡＯ大量は吸着されなかった。これらの利益はイオン交換体上 に観察されるＭＡ活性のサブ分画に重きを置かせた。最終段階において、ＭＡは ＣＥＡに対する交差反応性モノクロナール抗体ＮＰ−３を含存する免疫吸着剤へ 特異的に吸着された。モノクロナール抗体の使用は、他の決定基に関しては差が 存在し得るけれども、該抗体によって認識されるエピトープの表現において均一 である分子スペシスを選択する利益を有する。 ＭＡは、ＮＣＡ−２と、そして成人便中のＣＥＡ様抗原のＮＦＡファミリー、特 にＮＦＡ−２から区別される。ＮＣＡ−２およびＮＦＡ−２は分子サイズ、およ び炭水化物およびアミノ酸組成においてＣＥＡと類似である。免疫学的には、Ｎ ＣＡ−２はＣＥＡと二つのエピトープを共有し、一方ＮＦＡ−２上には三つの交 差反応部位が示された。我々はＣＥＡに対するモノクロナール抗体について、胎 便中の二つのＮＣＡ−非関連ＣＥＡ交差反応性物質の一つを代表するＭＡはＣＥ Ａと少なくとも三つのエピトープを共有することを発見した。胎便中の第２のＣ ＥＡ関連抗原は、ＣＥＡおよびＭＡの両方に存在する少なくとも一つの交差反応 部位を欠いている。 ＭＡは前に記載した胎便中の他のＣＥＡ関連抗原から識別し得る。 ＭＡはＣＥＡと類似の分子サイスを有するが、しかし我々が使用した慣用の抗血 清によってＣＥＡ上に区別される少な（とも一つの決定基を欠くことにおいて抗 原的には異なり、そしてこの相違はＣＥＡに対するモノクロナール抗体でも認め られ葛。さらに、ＭＡはＣＥＡまたはＮＣＡのどちらよりもコンカナバリンＡに 対しもっと低い親和性を有する。このレクチンに対するＭＡの低親和性は、ＣＥ ＡおよびＮＣＡからＭＡの分離のための、特異性免疫吸着剤を必要としない他の 可能性ある方法を提供する。ＭＡおよび他のＮＣＡ非関連ＣＥＡ関連抗体は合体 して胎便中ＣＥＡよりも約６倍高い濃度で現れるとの我々の観察は、これら抗原 はＣＥＡよりも分化の早期マーカーであることを指示するかも知れない。精製し たＭＡの供給はＣＥＡに対するモノクロナール抗体のエピトープ特異性と、そし てＣＥＡ、ＭＡおよびＮＣＡ間のこれらエピトープの分布の境界分けを容易にし た。 正蛮藉■猪股勿染亘 形態学的に正Ｔ：；な結腸粘膜の染色はすべての４種のモノクロナール抗体をも って可視化できた。これはホルマリンでなく、エタノール／酢酸（ＥＡ）中に固 定した標本中に最良に観察された。止宿および腫瘍上皮の陽性染色は、抗原中和 ポリクロナール抗血清および腹水と反応させたものを含む対照片には現れなかっ た。ホルマリンではなくＥＡ中に固定した標本はしばしは試験片および対照片中 に結合組織の可変非特異性染色を示した。 ヤギ抗血清およびモノクロナール抗体ＮＰ１．．２および４による正常粘膜の染 色は、陽性染色か主として陰窩の一ヒ方しベルを覆う円柱細胞の細胞質および粘 膜表面に局在した。腺または消化管腔内の分泌物質も染色されたが、°コフレノ ト細胞の粘液は抗原陰性であった。これら抗体のすべてによる染色反応の強度お よび存在は陰窩間て全く様々であったか、しかしヤギ抗ＣＥＡおよびＮＣＡ抗血 清およびＮＰ−１モノクロナ一ル抗体により最も顕著であった。ＮＰ−４モノク ロナ一ル抗体は不変的に他の抗体のとれよりも−Ｎ罪著でない弱い染色反応を与 えた。 正常結腸上皮細胞のほかに、標識した抗原結合を基にじでＮ　ＣＡと交差反応す ることが既知のクラスＩモノクロナール抗体ＮＰ−１も、血管内および血管外組 織中の好中球を染色した。この染色反応はＥＡ中に固定した標本中では容易に明 らかであったが、・ホルマリン中ではそうではなかった。好中球局在化はイムノ ペルオキシターセ操作によって可視化できたが、それは好中球中の内在ベルオキ シターゼ活性の阻止を必要とせず、このためハソクグラウンドレベル以」−の陽 性抗原染色の認識を容易にするイムノグルコースオキシターゼ法によって容易に 識別された。ＮＰ−１に加え、研究した他の抗体の中でヤギ抗ＮＣＡ抗血清のみ が好中球を染色した。 結」易」幻１剣袋色 ヤギ抗ＣＥＡおよびＮＣＡ抗体、それにＮＰ−１，２および３モノクロナ一ル抗 体は中程度に分化した結腸腺かんの２２例のすべてをそれらの結腸中の発生部位 に関係なく染色した。これら結腸腺かんの約７０％（１５／２２）はクラス■モ ノクロナール抗体ＮＩ”４と陽性染色反応を与えた。ホルマリン中に固定した標 本に得られた支配的染色パターンは腫瘍細胞および線内沈着物の尖端表面の標識 であった。ＮＰ−４抗体を除き、腫瘍標本の同じ面積が他の抗体により類僚した 強度へ染色されたが、細胞局在化において絶対的な対応性は確立されなかった。 モノクロナール抗体のうち、ＮＰ−１はその強度および範囲において一貫してよ り強い染色を与え、いくつかのケースにおいてはヤギ抗ＣＥＡまたはＮＣＡ抗血 清により得たものよりも大であった。ＮＰ−４染色の強度は６ケースにおいて他 の抗体により得たものよりも少し低かったが、それは残りの９標本においては著 しく低下した。腫瘍腺の大部分は１２例においてＮＰ−４によって染色されたが 、他の３標本においては腫瘍組織の３０ないし５０％がこの抗体と反応した。こ れらの例のすべてにおいて、腫瘍組織の８０％以上が他の抗体と反応した。Ｎｌ ”４陰性と分離された２例は、腫瘍腺の１０％未満に弱い病巣反応を与えた。 −次腫瘍の６標本については、ＥＡ中の別の固定に十分な材料か利用可能であっ た。抗体のすべてによる染色の強度は各別についてホルマリン固定後に観察され たちの以上にＥＡ固定標本で高められた。腫瘍細胞の細胞質染色はＥＡ固定標本 中では非常に明瞭であったが、ホルマリン固定後はそれは存在しないかまたは弱 くなった。 ＥＡ固定組織における細胞質染色の増強はヤギ抗血清のそれと比較してＮＰ−４ 抗体ではそれほど大きくなかったが、前者の抗体によって得られた全体の染色反 応はポルマリン固定標本と比較するときＥＡ固定組織ではかなり大であった。 退行性がんの一例たけか研究され、そしてこれはヤギおよびモノクロナール抗体 のすべてについて完全に陰性であった。 −亡のＮＰ−４人色 検査した中程度に分化した腺がんの２２例のうち、Ｄｕｋｅの段階Ａ。 Ｂ、ＣおよびＤ患者からの一次腫瘍の１／１．５／７．３／４および６／１０が それぞれＮｌ”−４と反応した。患者数が少なくてＮＰ−４反応性と臨床的段階 イビとの間の正確な相関関係に到達できないけれども、これら予備的結果は絶対 的な関係は確立されないであろうということを示唆する。ＮＰ４反応性と結腸ま たは直腸中の腫瘍の位置との間の関係も明らかでなかった。上記患者８人から、 それぞれＤｕｋｅのＣおよびＤ段階の２例および６例からホルマリン固定標本と して領域リンパ節および／または肝臓転移が研究のため得られた。これら標本は 、ヤギ抗ＣＥＡおよびＮＣＡ抗体、そしてＮＰ−３およびＮＰ−４モノクロナ一 ル抗体で染色されたく表４）。ＮＩ”４抗体は、この抗体で陽性に染色される単 −片中に可視化されたそれらの一次腫瘍組織を８０％以上有する患者においてさ えも、転移ＩＩｔ瘍においては僅かの陽性染色反応を与えたのみであった。これ ら転移の大部分はヤギ抗体およびＮＰ−３モノクロナ一ル抗体との反応性を残し ていた。 ２人の患者Ｃ−２およびＤ−３の領域リンパ節および肝臓転移はそれらの染色表 現型においてさらに相違を示した（表４）。患者Ｃ−２からの二つの結節は抗体 のすべてと反応しなかったか、第３の結節はＮｌ”４抗体のみと陰性反応を与え た。患者Ｄ−３からの一つの結節は抗体のどれによっても染色されず、加えて他 の一つの結節および肝臓転移はヤギ抗ＣＥＡ抗血清と、ＮＰ−３およびＮＰ−４ モノクロナ一ル抗体で染色されなかった。対照的に、残りの４結節および肝臓転 移はＮＣＡ陽性であった。患者Ｄ−３からのこれらの標本をＮＣＡ交差反応性モ ノクロナール抗体ＮＰ−１に対してテストンた時、その染色パターンはヤギ抗Ｎ ＣＡ抗体で得られたものと同じであった。 （以下余白） ｆａ］　＝　Ｎ　Ｐ−４で陽性に染色される一次腺腫瘍のパーセント（ｂ）−文 字はＤｕｋｅの段階を示す。数字は個々の患者を特定する。 ＋ｃ＋−試験した全数中の陽性数の比 形態学的に類似したＩｔ瘍の究極的な攻撃的行動はそれらが生成するいくつかの 抗原マーカーの検出によって確かめることができる可能性は、いくつかのがんタ イプの免疫組織化学的研究から出現した。 他のマーカーでは、ある抗原の分子または微妙な決定基変化の識別はポリクロナ ール抗体によって本来認識されるエピ）・−ブの多様性のために見落とされたで あろう。これらの分子変化の同定は、もしそれらかがん細胞の生物学的表現にお ける付随した変化に本当に結びつくのであれば有意義であろう。モノクロナール 抗体の精密な免疫特異性は、これらの抗原修飾を探究することがそれによって可 能な道具を提供し、そしてこの態様において我々はポリクロナール抗体と、ＣＥ Ａに対して誘導された４種のモノクロナール抗体とを用いて、結腸線がんの染色 特性を比較した。 慣用の抗血清を使用した免疫組織化学により正常結腸にＣＥＡの存在を示した以 前の実験から予期されたように、この組織は３種の交差反応性モノクロナール抗 体によって染色された。これは、ＮＣＡおよびＭＡとの交差反応性を欠くがしか し標識した抗原結合性に基づいてＣＥＡ分子の少数個数を認識するように見える ＮＰ−４についても真理である。これら抗体による染色は個々の抗体と反応させ た別々の組織片に可視化されるように、同し細胞内において局在化されるように 見えた。モノクロナール抗体しま結腸ゴブレット細胞の粘液を染色しなかった。 モルフナール抗体のうち、ＮＰ−１だけがそれらによる既知のＮ’　ＣＡ合成か ら予見し得るように、ヤギ抗ＣＥ抗体とも同様に反応する好中球を染色した。こ のように、免疫組繊化学的操作は他の方法によって゛決定されたＣＥＡに対する モノクロナール抗体の特異性を確認することができ、そして他の方法か容易に利 用できない時それらのＮＣＡ交差反応性を同定するのに有抗血清は一次の中程度 分化結腸腫瘍のすべてと、そしてこの研究において検査した領域リンパ節および 肝臓転移の大部分を染色した。 ＮＰ−４からは、−次腫瘍の約３０％が非反応性であり、そしてＮＰ−４陽性− 次腫瘍から発生し転移の大部分はこの抗体で染色されなかった点で相違する染色 パターンが出現した。 我々は、ＮＰ−４モノクロナ一ル抗体で得られた染色強度は、ホルマリンでなく ＥＡ中に固定した一次腫瘍標本において相当に改善されることを発見した。その 代わりに、陽性−次腫瘍を持つ患者の転移のＮＰ−４染色の殆ど実質上の不存在 は、転移腫瘍からの認識された決定基もしくは抗原のもし定量的でなくても定性 的欠失か、または抗原陰性腫瘍細胞のクローニンクを示唆する。 我々は組織中の決定基表現を循環中のそれと未だ比較していないが、組織ＣＥＡ 決定基不均−性の存在は、モノクロナール抗体で測定したこの抗原の血中濃度と 疾病活性との間の相関関係に潜在的問題で発生することを示唆する。ここに提供 した免疫組織化学的研究を基にして、我々は様々の部位における腫瘍による循環 抗原への相対的寄与およびイムノアッセイに使用されるモノクロナール抗体の特 異性に依存してぜ多様なアッセイ結果および疾病活性との貧弱な相関関係を予想 する。 抗体特異性と、組織および血中の反応性抗原の存在に関して基本的疑問が未解答 であるが慣用の組織病理学標本について便利に適用し得る免疫組織化学は、予後 および診断価値を有するＣＥＡ変種または決定基と反応するモノクロナール抗体 を識別するのに大きい役割を持つであろう。これは結腸腫瘍のラジオイムノ検出 および抗体利用療法に対するモノクロナール抗体の適切な選択にもあてはまる。 ＣＥＡハイブリトーマクローンのクラス抗原結合プロフィルは、ＣＥＡハイブリ ドーマクローンはそれらのＣＥＡ、ＭＡおよびＮＣＡとの比較免疫反応性（表５ ）を基にして三つの別のクラスに分化できることを明らかにした。第１の融合か らのクローンの大部分はＣＥＡおよびＭＡ（クラス■）を結合する抗体を産生じ 、第２の融合からのクローンはクラス■と、そしてＣＥＡ反応性のみを示すもの （クラス■）との間に大体等しく分布した。三つの抗原すべてとの反応性（クラ ス■）は、第１および第２の融合からのクローンのそれ゛ぞれ１６％および２％ に見られた。 表１に記載した結果は希釈培養物上清の５０μ１部分標本をアッセイすることに よって得られた。クラス■およびＨのクローンによる標識ＣＥＡの結合パーセン トは似ていたが、クラス■のクローンには一貫して低い値を与えた。ＭＡに対す るクラス■および■のクローンの反応性はそれらのＣＥＡの結合に似ていたが、 クラス■のクローンの培養物上清は標識ＮＣＡを平均して９．９％（ｆ２．４　 Ｓ、Ｅ、）結合した。この低いＮＣＡの結合は、ＣＥＡおよびＭＡ結合に必要な 抗体の量に比較して、高いＮＣＡ結合を得るため抗体の高濃度が必要であること に帰せられる。ＮＣＡの最適結合もＣＥＡおよびＭＡに比較してより長いインキ ュヘーション時間を要した。 ＣＥＡ反応性培養物のどれも、分泌者および非分泌者個人の両者から得たヒト赤 血球へ結合しなかった。。 ′　したクローンのＲＩＡにおけるル

【症會仕クラス■からの１種（ＮＰ−１） 、クラス■がらの２種（ＮＰ　−２およびＮＰ−３）−およびクラス■がらの１ 種（ＮＰ−４）の４種のハイブリドーマクローンが選択され、そしてそれ以上の 特徴化のために再クローンされた。ＮＰ−１，２および３抗体は無ガンマウマ血 清を含有する培地から精製され、ＮＰ−４は腹水として使用された。ＮＰ−１， ２および３クローンはｒｇｃ　１　（に）サブクラスを産生じたが、ＮＰ−４ク ローンはＩｇＧ１（Ｊ）アイソタイプを産生した。これら４種のモノクロナール 抗体は二重免疫拡散においてＣＥＡを沈澱しなかった。ＮＰ−１，２および３は 、ヤギ抗ＣＥＡ抗体のＣＥＡおよびＭＡとの反応性と同様に、これら抗体の６０ ないし７０％を結合した。ＮＰ−４はＭＰを結合セす、そして放射標識ＣＥＡの 最高約３０％のみを結合した。正常ネズミ腹水または血清はＣＥＡと反応せず、 そしてＮＰ−４について観察された最高ＣＥＡ結合レヘしベ他のクラス■ハイブ リトーマの特性である。ＣＥＡおよびＭＡの結合に加えて、クラス■モノクロナ ール抗体Ｎ　Ｐ　−１はヤギ抗ＣＥ抗体と同程度に標識したＮＣＡと反応した。 しかしながらＮＰ−１の２６００ｎｇが標識ＮＣＡの３０％を結合するのに必要 であったが、同しレベルのＣＥＡおよびＭＡを結合するのにこの抗体１．１およ び２．５　ｎ　ｇが必要であった。ＣＥＡに比較して少し多い量のＮＰ−２がＭ Ａを結合するのに必要であったが、ＮＰ−３については反対であった。 クラス■ハイブリトーマクローンＮ　Ｐ−４はヤギ抗ＣＥＡ抗体による７０％の 結合と対照に標識ＣＥＡを最高３０％だけ結合するので、ＮＩ”４はヤギ抗体に よっても検出されるＣＥＡ分子の母集団を認識することを示すために二つの実験 が計画された。第１の実験は、ＮＰ−４とヤギ抗血清とをそれぞれについて最高 抗原結合レベルの量において混合し、次にＺ−ゲルにより遊離抗原から結合抗原 を分離することにより、ＣＥＡの添加結合について試験した。この試験の結果は 、併用抗原混合物によるＣＥＡの結合はヤギ抗血清単独で得られるものよりも大 きくないことを示した。もしＮＰ−４がヤギ抗血清と反応したものとは別の標識 分子の個数を認識したのであれば、二つの抗体の混合物は個々の結合パーセント の合計にほぼ等しい抗原結合パーセントを与えた筈である。第２の実験は、標識 抗原をヤギ抗体と、次いでＮＰ−４と順次にインキュベートし、次に同相ヤギ抗 マウス抗体により遊離抗原から結合抗原を分離することにより、ヤギ抗体がＮＰ −４と標識抗原との反応を阻止する能力を評価した。添加実験を基にして予期さ れたように、ヤギ抗ＣＥＡ抗血清はＮＰ−４の標識抗原への結合を完全に阻止し た。正常ヤギ血清または不適切なＮＣＡに対するヤギ抗体は効果がなかった。 （以下余白） ＣＥＡ抗体を含有するハイブリドーマ培養上清−とＣＥＡ、ＭＡおよびＮＣＡと の比較ＲＩＡ（ａ）標識抗原反応性 融合陶 ＣＥＡ、ＭＡおよびＮＣＡ　ＣＥＡおよびＭＡ　ＣＥＡのめ１、　６／３７ｆｂ ｌ　（１，６）　２６／３７　（７３）　５／３７　（１４）２、　１１５０　 （２）　２７１５０　（５４）　２２１５０　（４４）合計　７／８７　（８） 　５３／８７　’（６１）　２７／８７　（３１）パーセフ）ＣＥＡ結合（ｃｌ 　３７．０　±９．６　３７．７±２．４　２０．４　＋　１．７クラス名称　 Ｉ　Ｕ　ＩＩＩ （ａｌ　ハイプリドーマ培！５０μｌを個々に放射標識抗原への結合についてア ッセイした。 （ｂ）　抗ＣＥＡ活性を示すクローンの合計数中の特定クラスへ属するクローン の数。カッコ内の数字は各クラスへ属するクローンのパーセントを指示する。 （Ｃ）　平均±Ｓ、Ｅ。 唱・　および　、 未標識ＣＥＡが４種のハイブリドーマモノクロナール抗体の標識したＣＥＡとの 反応を阻止する能力を競合的ＲＩＡで試験した。この操作において、使用したモ ノクロナールまたはヤギ抗体の量は、未標識抗原の不存在下標識抗原の５０％結 合を与えるように調節した。これら条件下において、４種のモノクロナール抗体 は著しく異なった抗原阻止感度を発生した。ＮＰ−１抗体は抗原阻止感度におい てロシュ社キットヤギ抗体へ似ていないが、ＮＰ−２，３および４モノクロナ一 ル抗体は阻止のためもっと多量の抗原を必要とした。 ＣＥＡの分子ザイズとしてＭ　２００，０００を用い、得られたデータをミュー ラーの方法によって平均アフィニティ一定数の決定に変換した（表６）。この処 理によって得られたに値と、結合を５０％阻止するのにｌ・要なＣＦ、　Ａのｎ ｇ／ｍは、ＮＰ−１とヤギ抗ＣＥＡ活性との間の抗体親和性との却似性と、そし てＮＰ−２，３および４の減少する抗体親和性を例証する。 標識したＣＥＡまたはＭＡよりも標識したＮＣＡを結合するのに著しく高いレベ ルのＮＰ−１モノクロナ一ル抗体を要するため、Ｎ１”ｌの標識ＣＥＡとの反応 をＣＥＡ、ＭＡおよびＮＣＡが阻止する能力を比較した。結果は、ＭＡおよびＮ ９Ａはこの反応と競合することができるか、しがしＣＥＡに比較して、結合を５ ０％減らすのにＭＡおよびＮＣＡをそれぞれ約２および８倍必要とした。ＭＡお よびＮＣＡの阻止は、ヤギ特異性抗ＣＥＡ抗体にょるＲＩＡでｉ＋［ｌＪ定して これら製剤はＣＥＡ］、０％未満を含有していたので、ＣＥＡ混入によるもので はなかった。試験したＮＣＡの最高濃度においてのみ、ＣＥＡ夾雑物がＮＣＡに よって誘発される阻止へ寄与し始める。ＣＥＡ、ＭＡおよびＮｃＡに対しぞれぞ れ２００．０００．１８５，０００および６０．０００の分子量を使用して、Ｎ Ｐ−１はそのＣＥＡに対する親和性に比較して、ＭＡに対しては少し低く、そし てＮＣＡに対しては１０倍低かった。 ｉ−１− ＣＥＡに対するモノクロナール抗体のアフィニティ一定数定数ロシュ社キット抗 体およびモノクロナール抗体の平均アフィニティ一定数は競合的ＣＥＡ　ＲｒＡ により決定した。 （Ｉｔ）　（Ｍ　）　ｎｇ／ｍ　Ｋ　（Ｍ　’）ヤギ　３．５Ｘ１０唾　０．６ ３　１．６　Ｘ　１０１２ＮＰ−１６，６ｘｌ　０−１２１．２　５．３ｘｌ　 ０ｕＮｐ−２４，３ｘｌＯ”　７．８　１．９ｘｌＯ月ＮＰ−３６，０Ｘ１０− １ｎ　１０８　４．５Ｘ１０９ＮＰ−４３，０Ｘ１０−９　５４０　８．９Ｘ１ ０８（ａｌ　標識ＣＥＡの抗体結合を５０％阻止するのに要する未標識ＣＥＡの モル濃度またはｎｇ／戴 モノクロナール　±六の ２種のモノクロナール抗体ＮＰ−２およびＮＰ−３をＣＥＡ結合に対するインキ ュヘーション緩衝液イオン強度の影響を基にして研究のために最初に選択した。 標識ＣＥＡの３０％結合を得るため、０．０１Ｍ酢酸アンモニウムに比較して０ ．１　Ｍでは、ヤギ、ＮＰ−１およびＮＰ−２のがなりの多量、ＮＰ−２では３ ６倍が必要であることが発見された。対照的に、ゆれら２種の緩衝液中のＮＰ− ３およびＮＰ−４による抗原結合は非常に僚てぃた。ＮＰ−２およびＮＰ−３が クラスカテゴリー内の別々のエピトープを認識する可能性は相互阻止実験によっ て分析された。これら研究において、ＣＥＡで増感された固相ポリクロナールヤ ギ抗ＣＥＡを放射標識モノクロナール抗体プローブを使用するサンドウィッチ系 に使用した。未標識モノクロナール抗体が放射標識抗体の結合を阻止する能力を 相互交差阻止実験において評価した。別々のクラスカテゴリーへ属するが、ＮＰ −１およびＮＰ−２は相互を阻止するのに非常に効率的であった。ＮＰ−３は試 験した最高濃度においてＮＰ−１およびＮＰ−２結合を阻止できす、後者のモノ クロナール抗体をＮＰ’−３のＣＥＡへの結合を阻止できなかった。 本発明は、同じまたは異なる抗原上に存在する少なくとも二つの異なるエピトー プの相対的割合をそれによって決定することができる一般的イムノアソセイ方法 を含む。該方法は、−プを含有する被分析物をこれら二つのエピトープを担持す るスペシスを結合し得る少なくとも一つの捕獲抗体と接触させるステップ、ｔｂ ＋　生成する結合したスペシスを二つのエピトープの一つを結合し得るプローブ 抗体を含むプローブと接触させるステップ、およびｆｃ）　結合したプローブの 濃度を測定するステップとよりなる。 捕獲抗体は、結合される、結合されることができる、もしくは固相を形成するよ うに沈澱し得る、および／または任意の方法で被分析物から分離し得る抗体また は抗体混合物であろう。例えば捕獲抗体は前記二つの異なるエピトープを含んで いる二つの異なる抗原を結合し得るポリクロナール抗体、測定すべき二つの異な るエピトープに対し特異性のポリクロナール、またはモノクロナールまたは実例 えばポリスチレン、ポリエチレン、ガラスその他へ結合させることができ、また は例えば捕獲抗体に対し特異性な他の抗体との反応により、または沈イ殿その他 によって後で分離し得る相を形成するように結合する能力を持つことができる。 その代わりに、捕獲抗体は例えば磁化もしくは他の公知のプロセスによって分離 することができる材料へ結合させることができる。 に限定された抗原および／または抗原フラグメントが、そのような操作に適した 別のブローブスペソスを使用し、イムノアッセイによって抗体を検出するための 捕獲スペシスとして使用できることが認識されるであろう。 生体外液体標本中の抗原検出に基づくイムノアッセイは、固相担体へ結合した抗 体または抗原のどちらも同様に使用できる競合的および非競合的操作に大別され る。選ばれるアッセイの特定のタイプは、精製した抗体および抗原の入手可能性 、反応を定量するために使用するマーカーでこれら試薬を標識できる容易性、望 まれる感度レベル、アッセイの企図する目的、それにアッセイのオートメーショ ンへの適応可能性に依存する。 酵素標識抗体を使用する固相非競合的イムノアッセイが、それらの簡単さと実施 容易性のために多数抗原および／またはエピトープ決定によく適している。この タイプ分操作には二つの主要ステップが含まれる。抗原溶液が不活性担体上へ固 定化された抗体へ露出される。この抗原捕獲段階の間、固定化抗体は抗原と反応 し、その後全体の複合体が不活性担体を１３ｔ　ｉＥ液で洗浄することによって 余計な物質から分離される。次に過剰の酵素標識遊離抗体が固定化抗体担体抗原 複合体へ添加される。この抗体プローブ段階の間、遊離抗体は捕獲抗体によって 担体へ二次的に結合した抗原と相互反応する。 次に担体を洗浄し、酵素基質溶液とインキュベートし、そして検出された酵素標 識抗体の量はテスト標本中に抗原および／またはエピトープの濃度に正比例する 。 本発明において同定されたモノクロナール抗体は、限定されたエピトープ特異性 と、そして高められた結合定数とを基にして選択される。例として、共通のＣＥ Ａ−ＭＡ−ＮＣＡエピトープを認識するモノクロナール抗体は５．３　ｘ　１０ 　ＨＭ−１の親和定数を有し、そしてこの値はポリクロナール抗体の１．６　Ｘ 　１０１２　Ｍ−１の定数より少し小さいだけである。イムノアッセイは二つの タイプに構成される。 第１のものは、疏水性結合によってポリスチレンホールへ結合された捕獲抗体と して、ＣＥＡファミリーのすべてを認識する広スペクトルモノクロナール抗体を 有する。アガロース、セルロース、アクリルアミド、ポリカーボネートおよび鉄 粉のような他の、不活性担体も使用することができる。ボールは次に血清のよう な生物学的標本か、または遊離担体プローブの結合をステト標本中の抗原の濃度 と関連させるために使用される既知量の抗原ＣＥＡ、ＭＡもしくはＮＣＡへ露出 される。インキュベーションおよび洗浄後、結合した捕獲された抗原を持つ個々 のポールは、特異性または共通のエピトープ認識能を有する酵素標識モノクロナ ールおよびポリクロナール抗体プローブへ露出される。抗体標識に適当なマーカ ー酵素は、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性フォスフブ ターゼまたはβ−ガラクトシダーゼを含む。その代わりに、酵素の代わりに螢光 または放射活性化合物を抗体標識のために使用することができる。インキュベー ションおよび洗浄後、ホールへ結合した酵素活性を適切な酵素基質溶液とインキ ュベーションによって測定Ｌ、そして生成した着色生成物のレベルを分光分析に よって決定する。 この方法により、各抗原の特異レベルが決定され、そして個々に同様なまたは異 なる病気を有する患者間で比較され、または全体として特異性抗原の比として比 較される。特異性抗体レベル、それらの凝集比、および部分的または全体の共通 エピトープ表現は、がん性対非がん性疾病を持つ患者間で、そして疾病活動また は退化の異なる段階によって変化することが予期される。 固相アッセイの第２のタイプは第１のタイプと同じ態様に構成されるが、主な例 外はモノ特異性モノクロナールおよびポリクロナール抗体が別々にボールへ結合 され、そして抗原捕獲のために使用されることである。捕獲抗体のそれとは異な る、適当な抗体上の第２の特異性エピトープに対する特異性を有するモノクロナ ール抗体、または共通エピトープ抗体か抗体プローブとして使用される。 これらのイムノアッセイ技術は、被分析物中の特異性抗原および／または抗体を 検出するため、不均質抗原および／または抗体混合物の純度および／または交差 反応性を評価するため、酵素、標識もしくはトキシンのような薬剤もしくはマー カーで標識した抗原または抗体を含む、抗原および／または抗体の純度および力 価を決定するため、または密接に関連する抗原の混合物、例えばＣＥＡファミリ ー中に存在する抗原の比、酵素抽出液中のイソ酵素、リンパ腫細胞によって産生 される抗体のに／Ｉ−光チェーンの比、血液もしくは羊膜液中の胎便抗原の相対 的上昇度等を測定するために用いることができる。 密接に関連する抗原および／またはそのエピトープ特徴の存在および／または相 対的上昇度の定性的および／まはた定量的測定をなし得る能力は、種々の診断状 況において有用であり得る。例えば、ＮＣＡに対するＣＥＡＯ比は、非がん性消 化管病、例えば潰瘍性結腸炎に対する消化器がん、特に結腸がんの識別診断を助 けるために使用することができる。他の例は、のう飽性線維症の診断および／ま たは予後インディケータ−として、血中胎便抗原の存在を検出するだめの前記） 桑作の使用である。毛膜液中の上昇したＭＡレレベ、および／または毛膜液中の ＣＥＡ以上のＭＡの上昇゛した相対的比率は、便／母性問題、特に難便のインデ ィケータ−である。ヒト絨毛ゴナンＩ”　）ロビンのα−ザブユニットおよびβ −サブユニットの相対比率の検出は、腫瘍の特定タイプ、例えば栄養肝葉腫瘍の 診断を助けることができる。 前述の方法は循環しているリンパ球の部分母集団の比の決定に適合させることが できる。これは感染症、例えばインフルエンザおよび肝炎の診断に、そしてリン パがんのタイプ化のために有用である。 イソ酵素の存在および／または相対比率の測定のためこのイムノアッセイの洗練 の使用は、イソ酵素の異常レベルを特徴とする種々の病変、例えば血流中へ高レ ベルにおいてタレアチンキナーゼ＝ＭＢの放出によって特徴化される心筋梗塞、 およびある種の肝臓テヒドロゲナーゼイソ酵素の異常レベルを特徴とする種々の 病変の検出および管理を助けることができる。 特定の腫瘍関連決定基の検出のためのイムノアッセイ技術および／または免疫細 胞化学的技術の使用は診断に有用である。例えば、特定の決定衣の存在はがんの 支持証拠であろうし、そして推定的がんが異所的部位にある場合は、これは転移 腫瘍の存在の協力な指示であろう。ＣＥＡの決定基特徴の存在を示すが、しがし 移所的である、すなわち発生した器管とは異なる層管中にそして多分悪性腫瘍細 胞中に発見されるＣＥＡ産生腫瘍の転移の検出は腫瘍転移の強力な確認証拠であ る。 がんの早期からもっと進行したｌへの腫瘍の進行はいくつかの決定基の表現また はそれらのそう失によって決定することができる。 これば好ましくは特異性エピトープに対するモノクロナール抗体の使用により、 ラジオイムノアッセイおよび／または免疫細胞化学的方法によって検出すること ができる。ある決定基の存在または不存在は、このように腫瘍進行指示または特 定段階と相関し、また予後インディケータ−としても役立つ。 この方法の使用の他の例は、骨髄法白血病において腫瘍負担のインディケータ− として白血病患者中のＮＣＡの検出である。 本発明は、ＣＥＡファミリー抗原上の層管特異性エピトープをこれらエピトープ に特異性の抗体を使用して検出することを許容する。 前述した操作と同様に、これら抗体は免疫細胞化学的、生体外イムノアッセイお よび生体内造影操作によって新生物の組織形成源の決定のために、そしてまたそ のような腫瘍の一層選択的免疫療法のために使用することができる。すべて参照 とりでここに取り入れる米国特許第４．３３Ｌ６４７号、第４，３４８，３７６ 号および第４，３６１，５４４号に記載されている腫瘍位置測定、検出および治 療方法は、以前に指示したように本発明の方法および組成物と組み合わせること ができる。 例えば、ＣＥＡ上の特定エピトープに特異性のモノクロナール抗体は、腫瘍位置 測定および／または治療のため米国特許第４．３４８．３７６号の方法に従って 使用することができる。ＣＥＡファミリー抗原に対して特異性な二つの異なる抗 体からのＦ　（ａｂ）２フラグメントの混合物は、米国特許第４．３３１６４７ 号の方法に従って使用するための二価ハイブリット抗体フラグメントの製造に使 用することができる。 ＣＥＡの精密なエピトープに特異性の抗体と結腸特異性抗原−ｐ（Ｃ３Ａｐ）と は、適当な放射性標識と共に、特定の腫瘍タイプ、特に結直腸がんのための増加 した結合性を有する抗体製剤を製造するために協力的に使用することができる。 本発明の新しいモノクロナール抗体を免疫組織化学的技術またはイムノアッセイ 操作を使って骨髄白血病およびある種のリンパ腫の検出のために使用することも 有用である。免疫組織化学的技術による組織サンプル中のＣＥＡ検出に使用され るいくつかのＣＥＡ特異性抗体は、それらがモノクロナール抗体であるがまたは ポリクロナール抗体であるかに関係なく比較し得るであろうが、他の場合には、 本発明によるモノクロナール抗体の使用は有意義な利益、特にそれらはもっとコ ンスタントな結果を与える利益を有するであろう。本発明による抗原の他の免疫 組織化学的応用は、同し組織標本中の多数マーカー局在化のため、それへ導入さ れた異なる標識、例えば放射標識、螢光標識等を有するこれら抗原の使用を含む 。他の用途はリンパ腫表現型化におけるに／Ｌ軽チェーン比の決定または白血病 患者の組織中のＮ　ＣＡの検出におけるように、組織中のマーカー比の検出であ る。 本発明の抗体は、慣用技術、例えばアフィニティクロマトクラフィー、沈鍛その 他を使って抗原決定基の精製のために使用することができる。それらはまた新規 な決定基および関連する抗原のファミリー中の未だ限定されない決定基を解明す るための助けとして使用することができる。反対に、単一エピトープを含有する 抗原フラグメントを含む精製抗原は抗体、例えばモノクロナール抗体、不均質抗 体製剤、および血液、組織、他の体液その他のような他の調製物を検出し、精製 し、滴定しそして特徴化するのに用途がある。精製した抗原は、融合の必要性な しに高度に一モノ特異性の抗体の製造のため、すなわちモノクロナール抗体と実 質上聞しモノ特異性を有する抗体をそれらの製造のためハイブリドーマ技術を使 用しない製造のために勿論有用である。 抗原性フラグメントを生成するための高度に精製した抗原の消化は、該フラグメ ントが単一の免疫化学的に活性なエピトープへ限られる場合、そのような技術の 有用性をさらに増幅する。本発明抗原は、例えばスタフィロコソ力スプロテアー ゼＶ−８，トリプシン、キモトリプシン、サーモリシンその他のようなタンパク 分解酵素へ露出ずおことによってフラグメント化することができる。フラグメン トは共通または特定エピトープ特異性を有する結合したモノクロナール抗体を含 有する免疫吸収剤を使用することによって単離することができる。好ましくは、 そのようなフラグメントは単一エビトープのみを含有するであろう。 これ以上苦心することなく、当業１者はこれまでの説明を使用し、本発明をその 全範囲において使用することができるものと信しられる。従って以下の好ましい 特定具体例は単に例証であり、記載の残部を少しも限定しないものと考えるべき である。以下の実施例において、すべての温度は未補正摂氏であり、すべての部 およびバーセ゛ントはことわりのない限りＭＭによる。 実施例１ ］！屑Ｉ−織か′ＣＥＡおよ」１ この研究に用いたＣＥＡ製品は、ＲＩＡ用を除いて、Ｎｅｗｍａｎ　ｅｔａｌ、 （Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３４　：　２＋２５．１９７４）によって修飾され たＫｒｕｐｅｙｅｔ　ａｔ、　（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　９　：　６１７．１ ９７２　）の操作に従って、結腸アデノカルチノーマの肝臓転移から単離された 。概して、濃縮したＰＣＡ抽出液は０、ＩＭ　ＮＨ４ＡＣ，ｐＨ４，０へ平衡化 したＤＥＡＥおよびＣＭセルロースｌ：１混合物（Ｗｈａｔｍａｎ、　Ｃ１１ｆ ｔｏｎ、　Ｎ、Ｊ、）　ヘ適用された。吸着された物質を同し緩衝液中の０．０ ５Ｍ、・０．１Ｍおよび０．２Ｍ　Ｎａαの非連続勾配で溶離した。ＰＣＡ抽出 液中の当初のＣＥＡ免疫反応性の約３０％が、ロシュＣＥＡアッセイキット（Ｎ ｕｔｌｙ、　Ｎ。 Ｖ、）でモニターし、適用緩衝液（Ａ）　、０．０５Ｍ　Ｎａα（Ｂ）、お余び Ｏ，ＬＭ　ＮａＣ１，（Ｃ）分画のめいめい中に出現した。該Ｃ分画は、０゜０ ５Ｍ　ＰＯ４，ｐＨ５，０プラス０．１５　Ｍ　ＮａＣｊ！緩衝液中のセファ０ −ス６ＢおよびセファデックスＧ−２００（ファルマシア）」二の順次クロマト グラフィーにかけた。コンカナバリン−Ａセファローズ（ファルマシア）上の最 終分離ステップは、Ｐｒｉ　ｔｃｈａｒｄおよびＴｏｄｄの方法に従って実施さ れ、それにより吸着された抗原は室温で２０％輸／Ｖ）のα−メチル−Ｄ−グル コジッドで溶離された。ＣＥＡは茎溜水に対して透析され、凍結乾燥され、Ｃａ Ｃ１ｚ上でコンスタント重量へ乾燥された。精製したＣＥＡはロシュアノセイで 決定する時特異活性（単位乾燥重量当たりの中和活性）０．７を持っていた。そ れは免疫電気泳動において正常ヒト血清に比較してα−グロブリンとして移動し 、そして二重免疫拡散においてロシュ参照ＣＥＡと一致するハンドを与えた。タ ンパクまたは炭水化物のために染色した７、５％ポリアクリルアミドゲル中にお いて単一ハンドが観察された。 ＤＥＡＥ−ＣＭセルロースイオン交換体からのＡ分画はＮＣＡを含有し、そして ５Ｘ９０ｃｍセファデックスＧ−２００カラム上のクロマトグラフィーによって この分画中にやはり存在するＣＥＡがら分離された。ＮＣＡの存在は二重免疫拡 散によってモニターされ、抗原活性のピークは１０００ないＬ１２００ｍ、ｅの 溶出容積中に現れた。 この分画はＣＥＡについて記載したコンカナバリン−Ａセファロースクロマ］・ グラフィーにかけられ、そして吸着された抗原は抗ＮＣＡ免疫吸着剤上の通過に よってさらに精製された。ＮＣＡは０．２Ｍグリシン−１１ｃｔ２．　ｐ　ｆ（ ２，０によって免疫吸着剤から溶出され、ＮａＯＨで中和され、ＰＢＳに対して 透析され、そしてＡｍ１ｃｏｎ　ＰＭ−１０膜（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｌｅｘｉｎｇ ｔｏｎ＋　Ｍａｓｓ　）上で濃縮された。精製されたＮＣＡは免疫電気泳動にお いてβ−グロブリンとして移動し、そして二重免疫拡散において参照ＮＣＡとの 一致反応を与えた。ＮＣＡはまた前に記載したように（Ｐｒｉｍｕｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　１１８　：　５５．１９７７）免疫沈澱によ って正常肺臓から部分的に精製された。 実施例２ 施便左亥Ｍ人辺１１ 胎便５０ｇを０．１Ｍ　ＰＯ４，ｐＨ８，０の３００厭中に懸濁し、−夜４°で 混合した。３０分間１０ＰＯＯＯｘ　ｇにおいて遠心後、上清のｐＨを８．５へ 調節し、そして冷無水エタノールを最終濃度４０％まで加えた。遠心後得られた エタノール性」二重を０．０２Ｍ　ＰＯ４，ｐＨ７゜８に対して透析し、同し緩 衝液で平衡化したＤ　Ｅ　５２　（Ｗｈａｔｍａｎ　）５．０ｇと混合した。適 用した緩衝液で未結合物質を溶出した後、吸着した物質を同し緩衝液中の非連続 ＮａＣ１２勾配で除去した。０．１ＭＮａα分画中に出て来る抗原活性を０．０ ５Ｍ　ＰＯ４，ｐ　Ｈ５，０プラス０゜］、５ＮａＯ１！に対して透析し、ＹＭ −１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）上で濃縮し、そして２．６Ｘ９０ＣＩｌセファクリル Ｓ−３００（ファルマシア）カラムへ適用した。２２５ないし２７０ボ溶離容積 に含まれている抗原活性をプールし、０．１Ｍ　ＰＯ４，ｐｌ（７，０に対して 透析し、そしてヤギ特異性抗ＣＥＡ抗体を含有する免疫吸着剤の上を通過させた 。後者の免疫吸着剤からの未吸着分画を次に前に記載した胎便モノクロナールＣ ＥＡ抗体ＮＰ−３を含んでいる第２・の免疫吸着剤へ適用した。ヤギからの交差 反応性ＣＥＡ抗体による阻止研究を基にして、ＮＩ”３ば胎便中のＣＥＡおよび ＮＣＡ非関連ＣＥＡ関連物質問に共有される決定基を認識することを示した。Ｎ 　Ｐ、−３へ結合した抗原をＮＣＡ精製のため前記のように溶離した。吸着した 分画を中和し、ＰＢＳに対して透析し、そしてＹト１０膜上で濃縮した。 実施例３ 、疫および−ｌ−の＋１゛′ ヤギ抗ＣＥＡ抗血清は、等量のメチル化ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ｓｔ 、　Ｌｏｕｉｓ、門ｏ、　）へ結合しそして等容積の完全フｌコインドアシュハ ント（Ｄｉｆｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈ、）中に乳化した精ＭＣＥ　 Ａ１００ないし２ｃｏｎｇの注射によって調製した。不完全アジュへントは最初 の注射の後で使用された。２１回の注射の１１　ｆａられたヤギ抗ＣＥＡ抗血清 は、血液凝集活性がなくなるまで、Ｌｅ８およびＬｅｂ個人からのＡ、Ｂおよび ○赤血球で反復吸収した。抗血を青は次に正常結腸およびＮＣＡ免疫吸着剤−ヒ の順次クロマトクラフィーにかけられ、吸着されない分画が両方の場合に使用さ れた。吸着の完全性は、正常組織抽出液およびＮＣＡに対する二重免疫拡散にお いて分析された。ＮＣＡ中和抗ＣＥＡ抗血清の−ｇＢは、抗血清ｒｄ、当たりア ルコール抽出胎便２５０■（乾燥重量）を加えることにより胎便でさらに吸収さ れた。免疫沈澱の分離後、吸収の完全性は胎便乙こ対する二重免疫拡散により証 明された。このＮ　ＣＡおよび胎便吸着抗血清は、以後特異性抗ＣＥＡ抗血清と 同定された。 ヤギ抗ＮＣＡ抗血清は、ＣＥＡ免疫吸着剤」二の通過によってＣＦ。 Ａと交差反応する抗体を除去された。ＣＥＡ中和抗血１Ｍは二車免疫拡散または ＲＩ　ＡにおいてＣＥＡと反応しなかった。 実施例４ 山【史１−お−よにと一ヤＡニー抗−血ｆ′青−マウス免疫に使用するＣ、　Ｅ 　ＡおよびＮＣＡは、結腸アデノカルチノーマの肝臓転移から単離され、そして ＭＡは胎便からＰｒｉｍｕｓ　ｅｔａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３． 　Ｆｅｂ、、　１９８３　（以後”Ｐｒｉｍｕｓ　’８３）に記載のように単離 された。すべての抗原はクロラミンＴ法により１２５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　 Ａｒ１１ｎにｔｏｎ　ｔｌｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ　）で約３０Ｃｉ／ｇの比活性 へ放射ヨード化された。ロシュＣＥＡアッセイキット（Ｎｕｔｌｅｙ。 Ｎ、、１．）からの放射標識ＣＥ　Ａは、それが免疫化のために使用したＣＥＡ で得られたものと同様の結果を与えることが判明した時、日常的に用いられた。 ロノユキノトのヤギ抗ＣＥ−′Ａ抗体はＲＩＡに用いられた。ヤギ抗ＮＣＡ抗血 清（Ｎｏ８０）は、Ｒｏｃｈｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｎｕｔｌ ｅｙ、ＮＪのＥｄｗａｒｄ　Ｎｅｗｍａｎの好意て供拾され、そして使用前ＣＥ Ａ免疫吸着剤上の通過によってＣＥＡと交差反応する抗体か除去された。 ヤギ抗血清との標識ＣＥＡ、ＭＡおよびＮＣＡの結合特性はＰｒｉｍｕｓ゛８３ に記載されている。ロシュキノト抗体と、ＮＣＡおよび胎便て吸収したＣ　ＩＥ 　Ａに対し特異性となしたヤギ抗ＣＥＡ抗血清は、標識ＣＥＡと同様に反応した 。標識したＭＡはロンユキノト抗体によって結合されたが、しかしヤギ特異性抗 ＣＥＡ抗血清によっては結合されなかった。ＮＣＡはロシュキノト抗体または特 異性抗ＣＥＡ抗血ｌｎと反応ゼす、またヤギ特異性抗ＣＥ抗血はＣＥＡおよびＭ Ａと結合しなかった。 実施例５ ｙ」ノじ鍜莞化 ３ないし４月令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ雌マウマウスａｒトａｎ−３ｐｒａｇｕｅ −Ｄａｗｌｅｙ。 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ、　）　ヘ、不完全フロインドアジュバント 中のＣＥＡ２０μｇの１．ｐ、注射３回を投与した。２回目および３回目の注射 は第１回からそれぞれ２および８週離した。最初の免疫化から６ケ月後、ＣＥＡ に対する血清抗体を示す２匹のマウスを＃臓細胞ドナーとして選び、そして５ｔ ａｈｌｉ　ｅｔ　ａｌ、のＲｅｓ、　Ｍｏｎｏｇｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。 ３　：　２０１．１９８１の免疫化プロトコールに従って食塩水中容５０■の最 終ＣＥＡ注射注射−リースけた。融合の４日および１日前に、ＣＥＡを１．ｐ　 注射し、融合の３日および２０前に、それは１．ｐ、と１、ｖ、注射のために等 量に分離した。 実施例６ 狙胆量金方娑βグローニング Ｐｒｉｍｕｓ　’８３に引用されているＭｃＫｅａｒｎの方法に従って、２匹の ＣＥＡ免疫マウスから得た肺臓細胞と二つの別々の融合が実施された。 各融合のため、５Ｘ］０７のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離牌臓細胞と５× １０’　、Ｐ３−ｘ　６３−Ａｇ８．６５３骨髄細胞（Ｓａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　ＣＡ、）とを６０ｍｍ培養皿中で混合し、２５０ Ｍｇで５分間遠心した。過剰の媒体を除去し、そして３７゛ｃで　Ｄｕｌｂｅｃ ｃｏの修飾イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、 　）中５０％（Ｖ　／ｖ　）ポリエチレングリコール（１５００，ｆｉｓｈｅｒ ）　１．　Ｏｍｌで置換した。ポリエチレングリコールへ３０秒露出後、細胞を ２回洗浄し、そして次に２０％無ガンマウマ血清（ＫＣＢｏｉｌｏｇｉｃａｌｓ 、　Ｉｎｃ、、　Ｌｅｎｅｘａ、　ＫＳ）　＋Ｌ−グルタミン２　ｍＭ、ピルビ ン酸ナトリウム１ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．５５ｍＭ、Ｌ−アスパラギン０．２ ７ｍＭ、および葉酸１４μ門を補給したＤｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏの修飾イークル培 地５厭中で一夜インキュベートした。細胞をヒボキザンチンＯ，ＩｍＭ、アミノ プテリン０．４μ連およびチミジン１６μ門、をさらに補給した後者の培地３０ ｄ以上中に分散した。 細胞分散液を９６ウエルのミクロウェルプレート（Ｃａｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ。 Ｍａｓｓ、　）中にウェル当たり１００．ｃ＋βづつ分配した。アミノプテリン の除いノこ培地の追加１００μβを７日後にウェルへ加えた。培養２ないし４週 後、生育している細胞クローンを含んでいるウェルがらの培地をＲＩＡによって ＣＥＡ抗体についてアッセイした。ＣＥＡ抗体陽性ウェルを、ウェル当たり１０ ”ｌｌＵの照射した（１４００Ｒ）ルイスラット胸腺細胞を含んでいる２４ウエ ルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中へ広げた。交会に達した時、抗体陽性を持続して いるすべての培養物を凍結し、他方４クローンを制限希釈度において２回再クロ ーンした。ハイブリドーマをウェル当たり１０６　（固の照射ルイスラット胸腺 細胞を含んでいる９６ウエルプレート中に再クローンした。 選択された再クローンしたハイフリトーマ細胞系統を１０％無カン実施例７ シー久−■ブーニル痕木精製 モノクロナール抗体は１０％輿カンマウマ血清を含有する培地から精製された。 楯して、免疫グロブリンをｐ　Ｈ７，０において５０％（Ｎ１１４１２ｓＯ４で 沈澱し、芸溜水に再溶解し、ポリエチレングリコ−Ｉ〕（７０００−９０００） で最終濃度１３％（ｗ　／ν）において再沈澱した。 ポリエチレングリコール沈澱は０．０２Ｍ　ＰＯ４，ｐＨ５，６中に溶解し、同 し緩衝液で平衡化したＣＭセルロース（Ｗｈａｊｍａｎ、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　 Ｎ、Ｊ、）へ適用した。吸着された免疫グロブリンを０．０’２Ｍ　ＰＯ４，ｐ Ｈ’７．８プラス０．２Ｍ　Ｎａ（ＪＥテ溶離し、０．０１Ｍ　ＰＯ４，ｐＨｓ 、ｏニ対して透析カラムへ適用した。吸着された抗体を０．０２５Ｍ　ＰＯ４， ｐＨ８，０で溶離し、ＰＢＳに対して平衡化し、限外口過（八ｍ１ｃｏｎ、　Ｄ ａｎｖｅｒｓ。 ＭＡ、　）によって濃縮した。精製したモノクロナール抗体はクロラミン−Ｔ法 によって比活性５ないし１ｏμＣｉ／μｇ−’＞放射性ヨード化された。マウス ＩｇＧに加え、精製した抗体は、放射性ヨード化した製品を固相ヤギ抗ウマＩｇ Ｇへ結合させることによって測定し、１ｏないし４０％のウマ免疫グロブリンを 含有していた。製品中のモノクロナール抗体のパーセントは、Ｉ’ｒｉｍｕｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１８　：５５、１９７７に記載さ れているように、放射性ヨード化した製品のＣＥＡ免疫吸着剤への結合によって 決定された。 実施例８ ＲＩＡ（−ジオイムノアノセそ） 結合および遊離標識抗原の分離方法において異なる二つのタイプのＲＩＡが使用 された。抗ＣＥＡおよび抗ＭＡ抗体活性についでハイブリドーマ培養物からの上 清培地のアッセイは、ｌ１ａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ。 Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌ、＋　５　：　１３９．１９７４記載のＺ−ゲル法を 使用した。選定したモノクロナール抗体のＣＥＡおよびＭＡとの結合研究と、そ してＮＣＡ反応性についてのすへてのアッセイは、固相タプル抗体操イ乍　（Ｎ ｅｗｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、八ｍ、Ａｓ５ｏｃ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、２１　：　２１８．　１９８０　）を使用した。基本アッセイは２１．０％正 常ウつキ血清と、約０．５　ｎｇの標識抗原（３０ないし５ｏμＣｉ／μｇ）と 、そして抗体製品の０゜０５戴部分標本とを含む２．０級の０．ＯＬＭ　Ｎ８４ ＡＣ，ｐＨ６，２５とからなっていた。４５°　１時間のインキユベーシヨンか ハイフリドーマ培養物中のＣＥＡおよび１ＶＩＡ抗体活性の検出に使用され、同 温度４時間のインキュベーションがＮＣＡ抗体の検出に使用された。標識抗体結 合曲線および競合的阻止測定は、それぞれ４５°　４時間および室温２４時間の インキュヘーション後に誘導された。インキュヘーション後、Ｚ−ケルまたは固 相抗免疫グロブリンＣＡＭもしくばＤＡＣの１蔵へ添加され、試験管が混合され た。Ｚ−ケルか入っている試験管を直ちに遠心し、ＣＡＭまたはＤＡＣが入って いる試験管については追加の室温１５分のインキュベーションが実施された。試 験管は、カウントの前にＯ，ＬＭ　Ｎ８４ＡＣ（Ｚ−ケルアッセイ）ま−ま たはＰＢＳ　（ダブル抗体アッセイ）２．０ｍｉ’で一回洗浄した。非特異性結 合は、Ｚ−ゲルおよびダブル抗体アッセイに対しそれぞれ１０％および１％であ った。モノクロナール抗体、ヤギ抗血清、未標識抗原、および標識抗原はヒト血 清アルフミン１．０％を含有するＰＢＳ中に希釈された。 実施１例９ 拉卦】Ｕ旧ｒ酊定− 抗体親和性はＭｕｅｌｌｅｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　３４ 　：　３４５．１９８０の競合ＲＴＡ法によって測定した。計算した結合定数と 抗体濃度との積は、Ｊａｃｏｂｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５０　：　７７、１９８２によ＼っで推奨されるように１ ０未満であった。 実施例１０ 朋」ｈ−ヱＪ−１＝並 相互阻止実験は固相競合サンドイッチ操作を使用した。ポリクロナールヤギ抗Ｃ ＥＡ［［１１’ｉ’ｔｔｆはフッ化ヒニＩＪデン粉末（Ｋｙｎａｒ、クレート３ ０　／Ｆ　；　Ｐｅｎｎ１ｙａｌｔ　Ｃｏｒｐ、、　Ｋｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｕｓ ｓｉａ、　ＰＡ；）へ結合され、０．０１Ｍ　Ｎ８４ＡＣ中４５゛　１時間のイ ンキュベーションにより未Ｋｙｎａｒ　Ｏ，５獣をモノクロナール抗体希釈液の ０．０５叡部分標本と４５゛て１時間インキニヘートし、遠心し、そしてベレソ Ｉ・を１％正常ウサギ血清を含有する０、　ＯＩ　Ｍ　ＮＨ４ＡＣ１，ＯｍＲ中 に再シＵ濁した。０゜０５淑中Ｇこ含まれる放射性ヨード化モノクロナール抗体 を試験管へ加え、４５°て１時間インキュベートし、遠心し、−面洗浄し、そし てペレットをカウントした。標識した抗体製品の未増感Ｋｙｎａｒへの非特異性 結合は５％未満であった。 実施例１１ 赤血亙請金 Ａ、ＢおよびＯ分泌者および非分訳者個人からの赤血球を同個数で２％または１ ０％懸濁液として混合し、そしてハイフリドーマ組織培地の５０μｐ部分標本と 室温で１時間インキュベートした。血球を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そして 重いそして軽いヂエーン特異性を有する放射性ヨード化アフィニティー精製ＣＡ Ｍと室温で１時間インキュベートした。インキュヘーション後、赤血球を洗い、 カウントした。 実施例１２ 且・１几　および 結直腸がんを有する２３人から組織を得た。これらアデノカルチノーマのうち、 ３例は盲腸、６例は上行結腸、および１４例は直腸Ｓ状結腸であった。１例はあ まり分化されてぃなかったが、残りはよく分化されていた。腫瘍に隣接したおよ び／または切除縁の形態上正常な粘膜がこれら例の２１例から入手可能であった 。Ｄｕｋｅの分類が臨床的ステージングに使用された（Ｄｕｋｅ、　Ｇ、Ｅ、、 　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３５　：　３２２．１９３２　）。 外科標本は日常的に１０％緩衝化ホルマリンｐ　Ｈ７，２中に固定され、６例に おいては、それらはＰｒｉｍｕｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎ ｃｅｒＴｎｓＬｉ、、　６７　：　１０．１９８１に以前記載したようにＥＡ中 にも固定された。 組織はパラフィン中に埋め込まれ、５μｍの厚さに順次切片化された。切片はゼ ラチン化スライド上にマウントされ、キシレンで脱バ実施例１３ 免度凪檄化享班撒作 ＢＲＡＢ免疫ベ免疫ベルオキシガーゼ方法およびモノクロナール抗体による染色 反応の大部分のために使用された（Ｇｕｅｓｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　２７　：　１１３１１９７９） 　ａヤギ抗体による基本的操作は、一時ヤギ抗体、ビオチン化つサギ抗ヤギＩｇ Ｇ（５０μｇ／ｍｆ）、遊離アビジン（１００μｇ／ｉ）、およびヒオチン化ワ サビペルオキシダーゼ（５０μｇ／ｍ）を順次適用することよりなっていた。ビ オチン化試薬およびアビジンはＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕ ｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）から（与た。アビジンを０．０５Ｍ　トリス、ｐＨ ８゜６プラス０．１５ＭＮａα中に希釈したのを除き、すべての試薬はＰＢＳ中 に希釈された。ネスミモノクロナール抗体による抗原の検出のため、基本的操作 はモノクロナール抗体の最初の適用後アフィニテプも省略し、そして正常ウサギ 血清の代わりに未希釈圧密ウマ血清とのプレインキュヘーションを使用した。酵 素開示反応は以下のものからなっていた。−６，７ｎ＋ｇ／ｍβ−Ｄ−クルコー ス（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　−Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ、　ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ ）　、０．６７　ｍｇ／ｍｉＮ　Ｅ　Ｔ　（Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃｓ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、および０．００５Ｍ１−リス、ｐ Ｔ４８．３中の０．０１６１ｍｇ／淑フェナジンメトサルフェト（Ｓｉｇｍａ、 　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。 門０）。グルコースおよびＮＢＴを３７°Ｃて１時間プレヒートし、その時点で フェナジンメトサルフェートおよび組織片を加えた。３７℃においてさらに４５ 分インキュヘーション後、スライドを洗浄し、そして核ファーストレッドで対比 染色した。 以上の実施例は、本発明の一般的にまたは特定的に記載した反応剤および／また は作業条件を以上の実施例に用いたそれらに代えることにより、同程度の成功度 をもってくり返すことができる。 以上の説明から、当業者は本発明の必須の特徴を容易に確かめることができ、そ してその精神および範囲から逸脱することなく、それを種々の用途および条件に 適合させるため・種々の変更および修飾をすることができる。 ＦＩＧ、　１ 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも一つのＣＥＡ交差反応性決定基に対して実質上モノ特異性な抗体 。 ２、前記決定基は、ＣＥＡおよびＭＡに対して共通のエピトープ、ＣＥＡおよび ＮＣＡに対して共通なエピトープ、またはＣＥＡ。 ＮＣＡおよびＭＡに対して共通のエピトープである第１項の抗体。 ３、ハイブリトーマから得られたモノクロナール抗体である第１項の抗体。 ４、ＭＡ上のエピトープに対して実質上モノ特異性であり、そしてＣＥＡまたは ＮＣＡと免疫反応性でない第１項の抗体。 ５、ハイブリドーマから得られたモノクロナール抗体である第４項の抗体。 ６、ＮＣＡのエピトープに対するモノクロナール抗体であり、ＣＥＡと免疫反応 性でない第１項の抗体。 ７、実質上純粋な胎便抗原。 ８、抗原がＣＥＡであるか、またはＣＥＡ上のあるエピトープと実質上同じ免疫 反応性を有する少なくとも一つのエピトープを有する他の抗原である、抗原上の 特定のエピトープの存在を検出するだめの方法であって、該方法は前記抗原を、 （ｄｌｃＥＡ上のあるエピトープに対して実質上モノ特異性であり、そしてＮＣ ＡもしくはＭＡと免疫反応性でない抗体；！！］）ＮＣＡ上のあるエピトープに 対して実質上モノ特異性であり、そしてＣＥＡもしくはＭＡと免疫反応性でない 抗体；ｆＣＩ　ＭＡ上のあるエピトープに対して実質上モノ特異性であり、そし てＣＥＡもしくはＮＣＡと免疫反応性でない抗体；（ｄｌｃＥＡおよびＮＣＡに 共通のあるエピトープに対して実質上モノ特異性であり、そしてＭＡと免疫反応 性でない抗体；（ｅ＋　ＣＥＡおよびＭＡに共通のあるエピトープに対して実質 上モノ特異性であり、そしてＮＣＡと免疫反応性でない抗体：（ｆ）ＮＣＡおよ びＭＡに共通のあるエピトープに対して実質上モノ特異性であり、そしてＣＥＡ と免疫反応性でない抗体；またはｆｇｌ　ＣＥＡ、ＮＣＡおよびＭＡに共通のあ るエピトープに対して実質上モノ特異性な抗体 の少なくとも一つと接触させるステップを含む前記方法。 ９、同じまたは異なる抗原上に存在する少なくとも二つの異なるエピトープの相 対的割合を測定するためのイムノアッセイ方法であって、 （ａｌ　前記少なくとも二つのエピトープを含有する被分析物を、前記少なくと も二つのエピトープを保有するスペシスを結合することができる少なくとも一つ の捕獲抗体と接触させるステップと、■）　生成した結合スペシスを、前記少な くとも二つの異なるエピトープの一方を結合することができるプローブ抗体を含 むプローブと接触させるステップと、そして （Ｃ）前記結合プローブの濃度を測定するステップとを含む前記方法。 １０、前記少なくとも二つの異なるエピトープは同し抗原上に存在する第９項の 方法。 １１、前記少なくとも二つの異なるエピトープは異なる抗原上に存在する第１０ 項の方法。 １２、前記少なくとも二つの異なる抗原の各自は前記捕獲抗体によって認識され る共通のエピトープをさらに持っている第１１項の方法。