JPS60500558A - Ａｔｃｃ ｈｂ８２０９ 及びそのエリスロポエチンに対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　ＡＴＣＣＨＢ８２０９　及びそのエリスルホニチンに対するモノク ローナル抗体 発明の背景 本発明は、一般的に、流体試料中のホルモンであるエリスルホニチンの定量的検 出及び単離のだめの免疫学的操作用の材料及び方法に関する。より具体的には、 本発明は、新規な腫瘍細胞系であるＡＴＣＣＨＢ８２０９　により産生されたモ ノクローナル抗エリスロポエチンに関する。この抗体は、エリス四ポエチン内に 存在する配列と実質的に重複するアミノ酸配列を有する低分子量ポリペプチドと 免疫学的な反応性を有する。この抗体は、ヒトの流体に対する診断アッセイ及び ヒトエリスルホニチンのアフィニティ精製及び単離操作に有用である。

エリスロポエシス、即ち赤血球生成、はヒトの寿命期間を通じて細胞破壊を補う ために連続的に行われている。

エリスロポエシスは、極め℃精密に制御された生理学的機構であり、それによっ て血液中の赤血球の数が適当に組織への酸素供給を行なうには十分であるけれど もこの血液細胞によって循環が阻害されるほどには多くないようになっている。

赤血球の形成は骨髄中に起こり、このホルモン即ちエリスルホニチンの制御下に ある。

エリスルホニチン、即ちほぼ３４，０００の分子量の酸性糖蛋白質、は三つの形 態、即ちα、β及びアシアロの形態、で存在するであろ５゜α形及びβ形は炭水 化物成分において僅かに異るが、同一の効力、生物学的活性及び分子量を有する 。アシアロ形は、末端炭水化物（シアル酸）が除去されたα或いはβ形である。

エリスロポエチンは、現存する数の赤血球から組織が十分な酸素供給を受けてい て体が健康な状態にある場合には、血漿中に極めて低濃度で存在する。この正常 な濃度の低さは、正常に老化により失われる赤血球の置換を刺戟するに十分なも のである。

液の喪失、放射線への過剰曝露による赤血球の破壊、高所或いは長時間にわたっ て意識が無いことによる酸素摂取の減少、或いは各種形態の貧血により生じ得る ものである。低酸素症のストレスを受けている細胞に応答して、エリスロＩエチ ンは、骨髄中の未発達な前駆体細胞の前赤血芽球（即ち、引き続き成熟し、ヘモ グロビンを合成し、循環血液中に赤血球として放出される骨髄細胞）への転換を 刺戟することによって、赤血球の産生を増大する。循環血液中の赤血球の数が正 常な組織の酸素要求に必要とされるよりも大きくなると、循環血液中のエリスロ ポリエチンは減少する。

エリスロポエチンは赤血球形成の過程において必須であるので、このホルモンは 赤血球産生が低度であったり或いは欠陥があることにより特徴付けられる血液の 障害の診断及び治療の両者において潜在的な有用性を有するものである。しかし ながら、従来のエリスロボエチンを血漿或いは尿から良好な収率で得る試みは、 比較的不成功なものであることが判明している。複雑且つ煩雑な実験室技術が必 要とされ、不純且つ不安定なエリスロポエチン含有抽出物が極めて少量得られる だけであることがふつうである。

米国特許第３，０３３，７５３号明細書には、エリスロポエチン含有粗製固体抽 出物を低収率で与えるヒツジの血漿からのエリスロポエテンの部分的精製方法が 記載されている。

エリスロポエチンを尿から単離する初期の試みは、このホルモンの不安定な生物 学的に不活性な標品を与えるに過ぎなかった。米国特許第３，８６５，８０１号 明細書には、尿から回収されたエリスロポエチン含有粗製物質の生物学的活性を 安定化する方法が記載されている。得られたエリスロポエチン含有粗製標品は、 いわれているところによれば９０チのエリスロボエチン活性を保持し、且つ安定 である。

形成不全性貧血の患者の尿からのヒトエリスロポエチンを精製するもう一つの方 法がミャヶ等の轍叉に記載されている［Ｍｉｙａｋｓ＋　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

’Ｖｏｌ、２５２．　Ｎｏ、１５（Ａｕｇｕｓｔ　１０．　１９７７）、ｐｐ− ５５５８−５５６４１゜この７エ程の操作はイオン交換クロマ本グラフィー、エ タノール沈殿、ゲルｐ過及び吸着クロマトグラフィーを含むものであり、蛋白質 ｍｇ当９７０，４００単位の効力の粗製エリスロポエチン標品を２１％の収率で もたらすものである。この宿製ホルモンは、ｐＨ９のＩリアクリルアミドゲル中 においてｐＨ７のドデシル硫酸ナトリウムの存在下において及びＰＨ６のＴｒｉ ｔｏｎＸ−１００の存在下において単一の電気泳動成分を有するものである。分 別の最終工程において、Ｐデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動により同一の効力 及び分子サイズであるが、しかしＰＨ９における移動度において僅かに異る二つ の両分が得られる。

精製エリスロポエチンを得るために使用されているその他の技術は、免疫学的操 作を含むものである。エリスロポエチンに対するポリクローナル抗体は、動物、 好ましくはラット或いはウサギ、にヒトエリスロポエチンを注射することにより 誘発される。注射されたヒトエリスロポエチンは、該動物の免疫系により外来抗 原物質と、して認識され、この抗原に対する抗体の産生を誘発する。

この抗原物質による刺戟に対して応答する異った細胞は、他の応答細胞により産 生されるものとは僅かに異った抗体を産生し℃循環血液中に放出する。この抗体 活性は、その血液が採血された際に動物の血清中に残留する。未精製の血清或い は血清イムノグロブリンＧ画分として精製された抗体標品はヒトエリスロポエチ ンの検出及び複合体形成を行うアッセイに使用することができるが、この標品に は大きな欠点がある。即ち、この血清抗体は個々の細胞により産生される全て異 った抗体で構成されるためにその性質上ポリクローナルであり、エリスロポエチ ン単独以外の粗Ｈｍ出物中の成分と複合体を形成するのである。

本発明の背景として興味深いのは、選ばれた抗原の単一の抗原決定基と特異的に 免疫学的に反応する性質を有する単一種の抗体を産生ずる能力を有する細胞の連 続培養を開発する技術における最近の進歩である。一般的には、Ｃｈｊｓｈｏ１ ｍ著、Ｈｉｇｈ　Ｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｙｏｌ、３゜Ｎｏ、１．　５７−６ ３（１９８３）　’ｅ参照されたい。エリスロボエチンに対する「モノクローナ ル」抗体を開発する細胞融合及びハイゾリッＦ化技術を用いる試み、及びこれら の抗体をヒトエリスロボエチンの単離及び定量的検出に用いる試みがなされてい る。−例として、ヒトエリスロにチンに対するモノクローナル抗体を分泌する１ ウス−マウスハイブリドーマ細胞系の成功した開発の轍叉がアブストラクトの形 態でＦｅｄ、Ｐｒｏｃ、、旦、５２０（１９８２）のアブストラクト番号１４６ ３に表われている。もう一つの例として、モノクローナル抗エリスロポエチン抗 体の調製及び使用の詳細な説明がＷａｔｓｓらのＰ、Ｎ。

Ａ、Ｓ、（ＵＳＡ）、　７９．　５４６５−５４６９（１９８２）に表われてい る。

上記二つの刊行物によって免疫学的アフィニティ精製によるエリスロボエチンの 効率的な単離及び免役結合アッセイによるエリス四ポエチンの定量的検出に有用 なモノクローナル抗体が身近かなものとなったとしても、その様な精製及びアッ セイは他の生物学的に活性な蛋白質物質に関するその他の免疫学的操作に典型的 に係る問題を有する。−例として、蛋白質物質（モノクローナル或いはポリクロ ーナル抗体が使用されるか否かに拘らず）のアフィニティ精製の殆んどの操作に おける共通の問題は、固定化抗体に結合した蛋白質を溶出するために強酸或いは 強塩基溶液が必要であるということである。溶出条件によっては単離ずべき物質 の生物学的活性が減少し或いは破壊されることがしばしばである。もう−っの例 として、免疫結合アッセイが流体試料中の蛋白質物質の定量的検出に使用される 場合には、試料中に存在する物質の量は通常所定量の同一の蛋白質物質を純粋な 形で含む「標準」溶液に対する抗体の免疫結合反応の程度の比較により決定され るのがふつうである。その様なアッセイの一例は、蛋白質物質が所定量の同一の 蛋白質量を純粋な形で含む「標準」溶液の存在下において抗体に対して競争する 競争反応である。競争反応の定量は、抗体純粋標準物の増加量との反応の程度に 対する比較により行われる。エリスロポエチンの場合のように被検物が変化し易 い物質であって標準溶液を生成及び保存する過程（放射標識過程を含む）におい て容易に破壊されるものである場合には、全アッセイ系の精度は着るしく影響を 受ける。

本発明の背景として興味深い別のものとしては、天然の蛋白質、ｍ蛋白質及び核 蛋白質に存在するアミノ酸配列と実質的に重複する合成ペプチド類の免疫学的活 性についての報告である。即ち、比較的低分子量のポリペプチド類が生理学的に 重要な蛋白質、例えばウィルス抗原、ＩリペプチＦホルモン類などの免疫反応に 対して継続性及び程度において同様な免疫反応に関与することが示されている。

その様なポリペプチド類の免疫反応には、免疫的に活性な動物における特異抗体 の形成の誘発がある。

例えば、下記文献を参照されたい。Ｌｅｒｎｅｒら：Ｃ・１１゜２３、３０９− ３１０（１９８１）、ＲｏｓｌＩら：　Ｎａｔｕｒｅ、　２９４゜６５４−６５ ６（１９８１）、Ｗａｉｔｅｒら：　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、（ＵＳＡ）　。

７７、５１９７−５２００（１９８０）、Ｌｅｒｎｅｒら：　Ｐ−Ｎ、Ａ、Ｓ。

（ＵＳＡ）、　７８．３４０３−３４０７（１９８１）、Ｗａｉｔｅｒら：ｊＮ 、Ａ、Ｓ、（ＵＳＡ）、７８．４８８２−４８８６（１９８１）、Ｗｏｎｇら： 　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（ＵＳＡ）　、■、　７４１２−７４１６（１９８１）、 Ｇｒｅｅｎら：　Ｃｅ１ｌ、２８．４７７−４８７（１９８２）、Ｎｉ　ｇｇら ：　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、（ＵＳＡ）、■、　５３２２−５３２６（１９８２）、ｆ ３ｈｒｏｎら：　Ｃｅ１ｌ、　２８．　３９５−４０４（１９８２）、Ｄｒ＊　 −ｓｓｍａｎら：　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５．１５８−１６０（１９８２）、及 びＬ＊ｒｎ＠ｒ　：　５ｅｌｅｎｔｉｆｉｅ　Ａｍｅｒｉｅａｎ、　２４８．　 Ｎｏ、２゜６６−７４（１９８３）。上記研究は、勿論、エリスロポエチン（即 ちアミノ酸配列の情報が実質的に何も刊行されていない物質）以外の蛋白質のア ミノ酸配列に関するものである。

この技術分野における最近の実質的進歩にも拘らず、多量の純粋な生物的に活性 なエリスロポエテンを血漿或いは尿から得るのに有用な別の新規な方法及び物質 並びにヒト流体試料におけるエリスロポエチンの正確な定量的検出に有用な方法 及び物質に対する実質的需要が存在する。

概要 本発明は、新規なマウス−マクスハイシリドーマ細胞系Ａ、Ｔ、Ｃ０Ｃ−Ｎｏ、 ＨＢ８２０９を提供するものである。

この細胞系は、その生育産生物として培地中に次のアミノ酸配列を含むポリペプ チドとも特異的に免疫反応性である高度に特異的なモノクローナル抗エリスロポ エテン抗体を分泌する。ＮＨ２−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌａｗ−Ｉ 　１　ｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ−ｖａｌ−Ｌａｗ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｅ−ＣＯＯＫ、　Ａ−Ｔ−Ｃ ，Ｃ，ＨＢ８２０９により産生される抗体は、この様にエリスロポエチン及びエ リスロポエチンに存在するアミノ酸配列と実質的に重複するポリペプチドの両者 と免疫反応性を有することが初めて示された最初の抗体物質である。腫瘍細胞系 Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ０ＥＩＢ８２θ９は、Ｍａｒｙｌａｎｄ州２０８５２　。

ＲｏｅｋｖｉＬｌｅ、１２３０１　Ｐｍｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ａ、Ｔ、 Ｃ。

Ｃ１に寄託されている。

本発明によれば、Ａ、Ｔ、Ｃ０Ｃ１ＨＢ８２０９により産生されるＩｇＧ　１抗 体は多量の純粋な生物学的活性エリスロポエチンの単離のための免疫学的操作及 び流体試料中のエリスロポエチンの定量的検出のための診断イムノアッセイに有 利に使用される。

本発明により提供される抗体物質によれば、流体試料（例えば血液、血清、尿、 包嚢流体、及び脳を髄液等）におけるエリスロＩエチンの定量的検出のアッセイ 法、特にエリスロポエチンの二つの異った抗原決定基と免疫的に反応しうる二つ の抗体の使用を必要とするアッセイ法、の実施が容易になる。その様な操作にお いて、第一の抗体（例えばＡ、Ｔ、Ｃ０Ｃ１ＨＢ８２０９により産生されるもの ）は固体支持体上に固定され、試料液体と接触する際に流体中のエリスロポエチ ンの一つの抗原決定基に免疫結合する。第二の抗体く例えは、従来技術において これまでに記載された多価の血清由来抗体或いはモノクローナル抗体の一つ）は 、好ましくは検出可能な標識物質に結合されているものであって、エリスロポエ チンと第一抗体との複合体と接触すると、エリスロポエチンの異った抗原決定基 に結合する。試料中のエリスロポエデンの量は、その後で、結合された第二抗体 の定量によりめられる。

本発明の方法及び物質は、選ばれた蛋白質物質の定量的検出及びアフイニテイ精 製の操作における有意義な進歩を構成するものである。その様な本発明の一つの 局面は、流体試料中の選ばれた蛋白質の定量的検出のための改良されたイムノア ッセイ法、即ち試料を蛋白質物質と免疫結合反応を行うことのできる抗体と接触 させ、また試料中の蛋白質物質の量を、（ａ）抗体と試料成分との免疫結合反応 の程度と、（ｂ）その抗体と所定量の標準物質との免疫結合反応の程度との対比 によりめることからなるイムノアッセイ法、を提供することである。本発明の改 良は、選ばれた蛋白質物質及びその蛋白質物質に存在するアミノ酸配列と実質的 に重複する比較的低分子量のポリペプチド「断片」の両者と免疫的に反応しうる モノクローナル抗体を抗体として使用し、その後そのぼりペプチドを標準物質と して使用することからなるものである。この改良されたイムノアッセイ法は、具 体的には、Ａ、Ｔ、（、Ｃ−Ｎｏ、ＨＢ８２０９　により産生される抗体の使用 によるエリスロポエチンの検出に適用可能なものである。

本発明の局面の他の一つは、流体からの選ばれた蛋白質物質のアフィニティ精製 及び単離の改良された、そして単離される物質の生物学的活性の維持において有 意義な利点を提供するところの、方法である。この改良された方法は、下記の工 程を含むものである。

（１）選ばれた蛋白質物質及びこの蛋白質物質に存在するアミノ酸配列と実質的 に重複するポリペプチド「断片」と免疫的に反応しうるモノクローナル抗体を固 体基体上に固定化する工程。該抗体は、該蛋白質物質に対するよりも該ポリペプ チド断片に対して高い免役学的親和性を有するものである。

（２）該流体を固定化抗体と接触させて、選ばれた蛋白質物質を抗体に免役結合 することにより固定化する工程。

（３）該抗体との免疫学的親和性がより大きいポリペプチドの溶液と接触させる ことによって、該蛋白質物質を固定化抗体との免役結合会合から溶離させる工程 。

溶離操作は最初の免疫結合操作と実質的に同一のｐＨ及び温度条件下において行 なうことができるので、単離（ポリペプチドによる移動による）された蛋白質物 質は、その生物学的及び化学的特性及び活性を完全に保持することができるであ ろう。Ａ、Ｔ、Ｃ１Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９により韮生されるモノクローナル 抗体は、エリスロポエテンに比べて前記ｊ？ポリペプチド対してより高い親和性 を有するので、この改良されたアフィニテイ精製は特にエリスロポエチン単離に 適用可能なものである。

本発明のその他の特徴及び利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明により 明らかとなるであろう。

具体的な説明 下記の実施例は、ハイシリドーマ細胞系Ａ−Ｔ、Ｃ，Ｃ０Ｎｏ、　ＨＢ８２０９ 　の製造及びエリスロポエチン及びそのアミン末端におけるエリスロポエチンに 存在するアミノ酸と重複する低分子量（２０−ｍ＋ｅｒ）ポリペプチドの両者に 対するモノクローナル抗体の単離における本発明の詳細な説明するものである。

又、Ａ、Ｔ、Ｃ０Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９によって産生される抗体の特徴付け 、拡張及び性質の決定も説明される。

例　１ エリスロポエチンは、ミャケらの方法［：　Ｍｉｙａｋｅ　。

＠ｔ、ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５２．５５５８−５５６４（１９ ７７）　］　に従って単離し、アミノ酸分析は、Ｍ、ヘラインクらの方法［Ｈｅ ｗｉｅｋ、　Ｍ、、ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５６．７９９０−７９９７（１９８１））に従って気相シークエ ンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ％ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｅ、）により行った。糖 蛋白質のアミン末端の最初の２０個のアミノ酸について判明した配列は、下記の 通りである。

１２３４５６７８ ＮＨ２−Ａｌａ−ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅａ−１１ｅ−Ｃｙａ−Ａａｐ　 −９１０１１１２１３１４１５１６１７１８Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｓｎ− Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ＠ｕ−Ｌｅａ−Ｇｉｎ９２０ −Ａｌ　ａ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ０ ホツプらの方法ＣＨｏｐｐ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

（ＵＳＡ）、７８．　３８２４（１９８１）　：）　による配列の分析によれば 、９〜１４０間のアミノ酸（Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅａ−Ｇｉｌｔ−Ａｒ ｇ　）　はかなりに親水性であり、従って実質的な抗原性ポテンシャルを有する ようである。

上記２０−　ｍａｒ　の合成レプリカはメリフィールドの方法（Ｍｅｒｒｉｆｌ ｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｊ、ｏｆ　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｅ、、８５．　２１４９−２１５４（１９６３）　］　（Ｓｔｅｗａｒｔ、 　Ｊ。

Ｍ、、ａｔ　ａｌ、、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅ 　−５ｉｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｅｉｓｃｏ：　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃ ｏ。

（１９６９）をも参照されたい〕により調製し、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステｋ　（Ｐｔｅｒｅｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｒｐ、　）　を用いて笠貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐａｔ　ｈ ａｍｏｅｙａｎｉｔ＋　）　（ＫＬＨ）担体蛋白質にオサリパン等の方法（０’ ５ｕｌｌｉ−ｖａｎ、ｅｔ　ｍｌ＋、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｅｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　１００゜１００−１０８（１９７９）　）に従って共有結合的に架 橋させた。

ハイブリドーマ細胞系Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ０Ｎｏ、ＨＢ８２０９の製造操作において 、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（５ｉｒｎｏｎｓｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇ１ １ｒｏｙ、　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｍ）を例１に従って調製されたＫＬＨ結合合成 ポリペプチドに対して高度免疫化した。この免疫化及び細胞融合操作は、オーイ 等の標準的方法に実質的に従って行った［Ｏｌ、ａｔａｌ、、　５ｅｌｅｅｔ＠ ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍａ−ｎｏｌｏｇｙ　（Ｍ ｌｓｈｅｌｌ、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、）、Ｗ、Ｈ０Ｆｒ＠ｅｍａｎ　Ｐｕｂｌ ｓｓｈｉｎｇ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｅｉ＠ｃｏ　（１９７９）〕。最初の接種は 皮下に行われ、１０μｇの未架橋２０−ｍａｒ　の合成ペプチドプラスＤｉｆｅ ｏ　ＨＲａ児全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　を 含有するものであった。その後の接種は、皮下注射後１２．２６及び３７日目に 腹腔内に行われ、各々１０μｇの架橋２０−ｍａｒ　合成ペプチドを含有するも のであった。細胞融合３日前に、マウスに１５μｇの架橋２０−ｍａｒ合成ぺグ チドを含有する最終腹腔内注射によって接種を行なった。

５回の注射後、数匹のマウスからの血清をラジオイムノ沈殿（ＲＩＰ）アッセイ により分析したところ、１２５Ｉ−エリスロＩエチン及び１２５ニ一標識化合成 ペプチドの両者に対し℃血清抗体の存在について陽性であった。

解離した免疫沈殿剤及び純粋の１２５エーエリスロポエチンを１２．５％ドデシ ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）上の電気泳動に 付した。このゲルのオートラジオグラフは、解離した免疫複合体及び標識化され た１２５エーエリスロポエチンは同一に移動したことを示す。免疫血清もまたバ イオアッセ−１［：Ｃｏｔａｓ。

Ｎａｔｕｒｅ、Ｈす、１０６５−１０６７（１９６１）　］において首尾よくエ リスロポエチン活性を阻害した。

接種されたマウスがエリスロポエチン及び合成ポリペプチドに対する血清抗体を 産生ずることを確認してから、少量の抗体産生リン／ｅ球を含有する免疫化され たＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺臓を崩壊させて単一細胞にする。細胞融合促進物質ポ リエチレングリコールの存在下に免疫ドナー膵臓細胞を親ＢＡＬＢ／Ｃミエロー マ細胞系であるＳ　Ｐ　２１０　（ｕｐｇ’ｒ−］　［Ｓｅｈａ１ｍａｎ、　ｅ ｔ　ｍｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２７６、２６９（１９７８）　）と融合させて、各種ハイブリ ッドを製造する。簡単に説明すると、細胞膜が融合し、２個以上の核で共通の細 胞質を取り囲む。その後数日して核が融合し、同時有糸分裂を行うことができる ようになる。これらの融合細胞が分裂するにつれ、両方の融合相手の染色体は種 々の数で失われて、ハイブリッド細胞系が安定化する。

融合細胞を、ウェル当り１０”〜１０６個の細胞数の割合で五重の９６−ウェル プレート（合計４４５ウエル）にプレート培養する。５Ｐ２１０　：　５Ｐ２１ ０及び膵臓：肺臓細胞ハイブリッドをも産生ずる融合体からの５ｐ２１０：膵臓 細胞ハイブリッドの選択は、融合混合物をヒポキサンチン−アミノプテリン−チ ミジン（ＨＡＴ）培地内で２週間培養することにより達成される。ＨＡＴ培地は 、５Ｐ２１０：ＳＦ３，１０が分裂することを防止する。膵臓：肺臓細胞ハイブ リッドは、培養液中で通常２週間後に死滅する。この様に、ＨＡＴ培地は５Ｐ２ １０：ｎ臓ハイプリッＰ細胞のみの生育を許容するものである。

１０日後、４４５個のウェルは多数の生育可能な細胞コロニーを含有した。その 後、個々の細胞コロニーをスクリーニングして、イムノグロブリン及びエリスロ ポエチンー特異性抗体の存在を調べた。

例２と同様にして２ジオイムノ沈殿アッセイヲ行って、これらのウェル内の特異 的抗エリスロポエチン、抗ポリペプチド抗体の存在を明らかにした。これらの二 つのスクリーニングアッセイの結果、４４５個の最初のウェルの中６０個が抗ポ リペブチＰ抗体に対して陽性であることがわかった。これらの６０個の中３個が １２５エーエリスｐポエチンとの免疫反応性に対して陽性であった。

これらの３個の最初にスクリーニングされたコロニーの各々の細胞を更に数個の マルチウェルプレート中に小分割して（各ウェル当り約１０個の細胞）、生育さ せた。

これらのウェルについて再び抗ポリペブチＰ及び抗エリスロポエチン抗体の存在 を調べるべくラジオイムノ沈殿によりスクリーニングを行った。最初の３個の陽 性のウェルの中、一つのみが最初のサブクローニング工程後に安定な抗体産生ク ローンをもたらした。

第一回のサブクローニングからの最強の陽性ウェルからの細胞を、計算濃度が５ ウェル当り１細胞となるようＦ希釈し℃新たなプレート中に入れた。濃度が低い ことによって、高割合のコロニーが単一細胞から得られることが確実となる。そ の後、全ウェルからの培養液を上記方法によりラジオイムノ沈殿により分析した 。このクローニング操作の結果、ポリペプチド及びエリスロポエチンの両者に対 する抗体を産生じ、十分な細胞生育速度及び密度を有する１１個のおそらく等価 な強度に陽性の単一〜細胞コロニーが得られた。これらの細胞系の一つを選んで 、Ａ、Ｔ、Ｃ０Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９として寄託した。

Ａ、Ｔ−Ｃ−Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９の培養液について行ったＥＬ　Ｉ　Ｓ　 Ａ　（Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐｅｒｌｍａｎ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　− ｇ　Ｙ　ｒ　リ猥、１２９（１９７２）　参照〕によって、このクローンはＩｇ Ｇ　１　サシクラスの抗体を産生ずるものとされた。

このクローン培養液の標識化１２５エーエリスロポエチン及び　エーポリペゾチ ドを沈殿させる能力を評価するために、ラジオイムノ沈殿アンセイを行ったとこ ろ、Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＨＢ８２０９により産生されるモノクローナル抗体はエリス ロボエチンに対するよりもポリペプチドに対してほぼ８〜ｌＯ倍大きい親和性を 有することが判明した。

最大抗体産生細胞と瓜止させる目的で、老化の悪影響を回避するためにＡ、Ｔ、 Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９細胞を連続的に継代培養する。ハイプリドーマ細 胞の生育に望ましい培地は、１％ウシ胎児血清（Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｇ　）を補給したＨ　Ｂ　１０１　（Ｈａｎｎａ　Ｂｉｏ 　−１ｏｇｉｅａ１ｍ　）である。但し、細胞が升培養液を採取する状態にある 場合には、培地はウシ胎児血清なしにＨＢｌｏｌに変えるのが好ましい。

モノクローナル抗体は、培養液からＡＭＩＣＯＮ濾過濃ｍ　（Ａｍｉ　ｅｏｎ　 ）により単離した後、硫酸アンモニウムで沈殿させて単離することができる。或 いはまた、濃縮培養液をプロティンへ−セファロースカラム（Ｐｈａｒ−ｍａｅ ｉａ　Ｃｏｒｐ、）に吸着させることもできる（　Ｇｏｄｉｎｇ。

Ｊ、Ｉｍｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、３９．　２８５−３０８（１９８０）参照〕。

これらのカラムにおいて、プロティンＡは抗体イムノグロブリンのＦｅ　部分に 付着し、培養液中の他の汚染物質を抗体との会合から溶離させる。マウスＩｇＧ 　１　に対するカラム能力は低いにも拘らず、この方法によりこの抗体は相当に 精製される。

組織培養において産生されたものよりも濃縮された抗体を得るために、本発明の モノクローナル抗体は、一般的にケネス等により説明されている腹水法により増 幅すｊ　ることができる（　Ｋｅｎｎ＠ｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、（ｅｄｓ、）。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：　Ａ 　ＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｔｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ 、ｐ、４０３゜Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（１９８１）　 ）。　この方法に従えば、３Ｘ１０６〜３Ｘ１０７個のハイブリドーマ細胞を予 め０．２５ｍ１のＰｒｔａｔａｎｅ　（Ａｌｄｒｉｅｈ　Ｃｈｅｒｎｉ　−ｅａ ｌ　Ｃｏ、　）　で処理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射することがで きる。Ｐｒ１ａｔａｎｅ処理によって、腹腔内において腹水の形で腫瘍細胞が生 育するようになる。

いったん腹水の腫瘍細胞が生育すると、マウスを殺し、モノクローナル抗体を含 有する腹水液を細胞から遠心分離により採取する。次いで、腹水液中のモノクロ ーナル抗体について抗体力価の分析を行う。腹水液抗体は、４０チ硫酸アンモニ ウム沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製して腹水液アルジミ ンを除くことエリスロポエチンの単離 高度に特異的且つ高度に反応性の抗エリスロポエチンモノクローナル抗体を提供 することによって、本発明は多量のエリスロポエチンを血液、血清、尿、包嚢液 及び脳を髄液などの生物学的流体から公知のアフイニテイ精製方法により単離す ることを可能にするものである。簡単に述べると、好ましい単離操作は、本発明 の抗体を固体支持体（例えばクロマトグラフカラム）上に固定し、エリスロポエ チン含有流体をこの固定化抗体と接触させ、その後精製されたエリスロポエチン を抗体との免疫複合体会合から溶離させることを含むものである。

前記のように、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９により産生される抗体が 、エリスロデエチンに対するよりもハイツリドーマ細胞系の発生に用いられた合 成ポリペプチドに対して実質的により高い観相性を有することにより℃、激しい 試薬及び反応条件を用いる代りにこのポリペプチドの溶液を用いて複合体を処理 することによりエリスロポエチンを免疫結合形態から単離することが可能となる 。

これは、単離されたエリスロポエチンについてより良好な生物学的活性の保持を 可能にする結果となる。更に、その様な「免疫学的置換による単離」はハイシリ ドーマの調製に使用された２０−ｍａｒ　よりも小さなポリペプチド断片を使用 することにより行うことができそうである。この目的のための可能性のある候補 としては、式ＲＮＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅａ−１１＠−Ｃｙ ｍ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｔ−Ｌ＠ｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅ ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌｔ−Ｌｙｅ−ＣＯＯＲ’　（式中Ｒ及びＲ′は同種ま たは異種であり、水素或いは１個以上のアミノ酸残基よりなる群から選ばれる） で表わされるポリペブチＰが挙げられよう。その様な配列は、例１で示した高度 に親水性の配列（Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−人ｒｇ）を含むこ とがわかり、従って、Ａ、Ｔ、Ｃ０Ｃ，ＨＢ８２０９により産生されるモノクロ ーナル抗体の特異的抗原部位であるように思われる。

その高度に特異的な抗エリスロデエチンモノクローナル抗体の提供により、本発 明はまた１個より多くの抗体を用いる生物学的流体試料中のエリスロポエチンの 定量的検出の新規アッセイを可能にするものである。その様なアッセイは、下記 の工程を含むものであろう。

（１）その流体を、流体中のエリスロポエチンの第一の抗原決定基と反応する第 一の固定化抗体と接触させて、エリスロボエチンと第一の抗体との免疫学的複合 体を形成させる工程。

（２）工程（１）において形成された複合体を、第一の抗原箋決定基以外のエリ スロポエチンの抗原決定基と反応する第二の抗体と接触させる工程。

（３）工程（２）において形成された免役学的複合体に結合した第二の抗体の量 を定量する工程。

その様なアッセイにおいて、抗体の一つ（好ましくは第一抗体）はＡ、Ｔ、Ｃ， Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ８２０９により産生されたモノクローナル抗体であろう。第二 の抗体はもう一つのモノクローナル抗体、抗エリスロ２エチン抗体（例えば既に 技術上報告されているもの）或いは多価の血清由来抗体であり得る。

前記のように、エリスロポエチン及びエリスロポエチンポリペプチド配列と重複 するポリペプチド毒の両者と選択的に免疫的に反応しうるモノクローナル抗体の 提供は、エリスロポエチンの定量的検出に対して従来方法において相当な改良を 与えるものである。試料内のエリスロポエチンの量を定量する目的で通常行なわ れるように試料エリスロボエチンの抗体との免疫結合反応がその抗体と固定化さ れた或いは標準化された量の純粋エリスロポエチンとの免疫結合反応と対比され る場合（或いは固定量のエリスロポエチン含有標準物質との競争後にその抗体と 増加濃度の純粋エリスロポエチンとの反応に対比される場合）には、使用される 抗体は例えばＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ０Ｎｏ、　ＨＢ８２（１９により産生されたもので より、「標準」物質はエリスロポエチンよりもむしろポリペプチド（ハイブリド ーマ形成に使用された２０−ｍａｒ　或いは例５に示したようなその断片）であ り得る。その様な操作によれば、エリスロポエテンを標準物質として連続的に供 給する必要がなくなるであろうし、また純粋なエリスロポエチンをイムノアッセ イの標準物質として使用するととに伴うことが予想される検出精度の損失が減少 するであろう。

以上述べた本発明の好ましい実施態様の説明を考慮して当業者には本発明を実施 するに際して数多くの改変及び変形が可能であるものと思われる。従って、本発 明は請求の範囲に記載された事項によってのみ、制限されるに過ぎない。

国際調査報告 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．新規組成物としての、ハイプリドーマ細胞系ム−Ｔ。 Ｃ，Ｃ，）ＩＢ８２０９゜ 乙　新規組成物としての、バイブリドゴマ細胞系Ａ、Ｔ。 Ｃ，Ｃ１ＨＢ８２０９から産生され、エリスロポエチンと特異的に免疫的に反応 しうるモノクローナル抗体。 ３、請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体を、生物学的流体から生物学的 に活性なエリスロポエチンを単離する免疫学的操作において使用する方法。 ４、該流体がヒトの流体である、請求の範囲第３項記載の方法。 ５、該流体が全血、血清、尿、包嚢液及び脳を髄液を含む群の一員である、請求 の範囲第３項記載の方法。 ６、請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体を、生物学的流体中のエリスロ ポエチンの定量的検出のための免疫学的操作において使用する方法。 ７、＃流体がヒトの流体である、請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該流体が全血、血清、尿、包嚢液及び脳を髄液を含む群の一員である、請求 の範囲第６項記載の方法。 ９、該免疫学的操作が免役結合アッセイである、請求の範囲第６項記載の方法。 １０、ｉ規組成物としての、エリスロボエデンと特異的に免疫的に反応しうる、 且つエリスロポエチン中ニ存在するアミノ酸配列と実質的に重複するポリペプチ ドと特異的に免疫的に反応しうる、モノクローナル抗体。 １１、該抗体が免疫的に反応しうる該ポリペブチＰのアミノ酸配列が、次式で表 わされるものを含む、請求の範囲第１０項記載の組成物。 ＮＨ２−Ａｉｍ−Ｐｒｏ−Ｐｒ、ｏ−Ａｒｇ−Ｌ＠ｕ−Ｉｌｅ　−Ｃｙｍ−Ａｓ ｐ−８＠ｒ−Ａｒｇ−Ｍａｌ−Ｌｅａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅａ−Ｌｓ ｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ。 臣、下記工程を含んでなることを特徴とする、生物学的流体試料中のエリスロポ エチンの定量的検出のための免疫学的アッセイ法。 （１）該流体を該流体中のエリスロポエチンの第一の抗原決定基と反応する第一 の固定化された抗体と接触させて、エリスロポエチンと該第−の抗体とよりなる 免疫学的複合体を形成させる工程。 （２）工程（１）において形成された複合体を該第−の抗原決定基以外のエリス ロポエチンの抗原決定基と反応する第二の抗体と接触させ℃、エリスロポエテン と該第二の抗体とよりなる免役学的複合体を形成させる工程。 （３）工程（２）において形成された該免疫学的複合体に結合された該第二の抗 体の量を定量する工程。 但し、該第−或いは該第二の抗体のいずれかは、請求の範囲第１０項記載のモノ クローナル抗体よりなるものである。 １３、該第−の抗体或いは該第二の抗体が、多価の、血清由来抗体である、請求 の範囲第１２項記載のアッセイ法。 １４、液体試料中の選ばれた蛋白質物質を定量的に検出するに際して、該試料を 該蛋白質物質と免疫結合反応を行うことのできる抗体と接触させ、また該試料中 の該蛋白質物質の量を（、）該抗体と試料成分との免疫結合反応の程度と（ｂ） 該抗体と固定量の標準物質の免疫結合反応の程度とを対比することによりめるイ ムノアッセイ法において２７選ばれた蛋白質物質及び該蛋白質物質内に存在する アミノ酸配列と実質的に重複するポリペプチドの両者と免疫的に反応しうるモノ クローナル抗体を該抗体として使用し、該ポリペプチドを該標準物質として用い ることを特徴とする、イムノアッセイ法。 １５、エリスルホニチンの定量的検出のだめの請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、該ポリペプチドのアミノ酸配列が次式で表わされるものを含む、請求の範 囲第１４項記載の方法。 ＲＮＨ−８ｅ　ｒ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ　−Ｌａ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ　−Ｃ ＯＯＲ’　（式中Ｒ及びＲ′は同種又は異種であり、水素或いは１以上のアミノ 酸残基よりなる群から選ばれる）。 １７、該ポリペプチドのアミノ酸配列が次式で表わされるものを含む、請求の範 囲第１４項記載の方法。 ＲＮＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｅ−Ａｒｇ−Ｌｅａ−Ｉｌｅ　−Ｃｙｍ−Ａｓｐ −８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｍａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅａ　−Ｌｅ ａ−Ｇｌｕ−Ａｌ　ｔ−ＬｙＩＩ−ＣＯＯＲ’（式中Ｒ及びＲ′は同種又は異種 であり、水素或いは１以上のアミノ酸残基よりなる群から選ばれる）。 １８、下記工程を含んでなることを特徴とする、選ばれた蛋白質物質を流体から 単離する方法。 （１）該選ばれた蛋白質物質及び該蛋白質物質中に存在するアミノ酸配列と実質 的に重複する４リペプチＰと免疫的反応しうると共に該蛋白質物質に対するより も該ポリペプチドに対し℃高い免疫学的親和性を有することにより特徴付けられ るモノクローナル抗体を固体基体上に固定化すること。 （２）該固定化抗体と接触させて、該選ばれた蛋白質物質を該抗体に免疫結合さ せることにより固定化すること。 （３）該蛋白質物質を、該抗体がより高い免疫学的親和性を有する該ポリペプチ ドの溶液と接触させることにより該固定化された抗体との免疫結合会合から溶離 させること。 １９、該蛋白質物質がエリスルホニチンである、請求の範囲第１８項記載の方法 。 Ｉ、該ポリペプチドのアミノ酸配列が次式で表わされるものを含む、請求の範囲 第１８項記載の方法。 ＲＮＨ−８＠ｒ−Ａｒｇ−ｖａｌ−Ｌｅａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＣＯＯＲ’　（式 中、Ｒ及びＲ′は同種又は異種であり、水素或いは１以上のアミノ酸残基よりな る群から選ばれる）。 ム、該ポリペプチドのアミノ酸配列が次式で表わされるものを含む、請求の範囲 第１４項記載の方法。 ＲＮ）（−Ａｌｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌａ、ｕ−目、ｅ−Ｃｙｓ−Ａｓ ｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ＠ｕ−Ｌｅ ａ−Ｇｉｎ−ＡＩ−ａ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＲ’（式中、Ｒ及びＲ′は同種又は異種 であり、水素或いは１以上のアミノ酸残基よりなる群から選ばれる）。