JPS63210665A - コラゲナ−ゼインヒビタ−の酵素免疫学的定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト及びその他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊水
、血液、慢性リウマチ関節液中及び関節軟骨細胞、滑液
細胞、各穐組織由来線維芽細胞、線維肉腫細胞培養液中
のコラゲナーゼインヒビターを高感度に定量する方法に
関するものである。さらに詳しくは、本発明は、ウシコ
ラダナーゼインヒビター（ティシュ・インヒビター・オ
プ・メタロプロテアーゼ：　ＴＩＭＰ）に対するモノク
ローナル抗体を用いるサンドイツチ法に基づく酵素免疫
学的測定法によるウシコラゲナーゼインヒビターおよび
ヒトコラゲナーゼインヒビターの定量法を提供するもの
であって、固相担体に結合させる抗体及び酵素標識を付
与する抗体としてウシコラゲナーゼインヒビターの異な
る抗原結定基に対し特異的に結合する２種類のモノクロ
ーナル抗体を用いることを特徴とするものである。

従来、コラグナーゼイ／ヒビターを定ｉｆる手段として
は、その生物活性の測定による方法が知られている。し
かしながら、Ｊ　、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ。

Ｍｅｄ、　７５　、２５８〜２６３　（１９７０）にＲ
１５ｅｎらが記載しているように血清中や血漿中にはコ
ラゲナーゼインヒビター活性の測定を妨害する蛋白質、
例えばＣ２−マクログロブリンが存在するため、そのよ
うな場合にはコラゲナーゼインヒビター活性を精確に測
定することは実質上不可能である。

コラゲナーゼインヒビターを特異的に、精度よく、定量
することができれば、コラゲナーゼインヒビター投与に
よる疾病の治療の過程における血中のコラゲナーゼイン
ヒビターの濃度の変動の測定（モニタリング）や医療用
コラゲナーゼインヒビターの製造の際の原料中のコラゲ
ナーゼインヒビターの含有量の解析あるいは製品におけ
るコラゲナーゼインヒビターの純度の測定などに極めて
意義のあることとなる。

本発明者らは、ウシコラゲナーゼインヒビターに対する
モノクローナル抗体を用い、サンドイツチ法に基づく酵
素免疫学的測定法（ＥＩＡ）を行うことにより少量の試
料で精度よく、簡便、迅速にコラゲナーゼインヒビター
を特異的に定量する方法を完成した。

すなわち、本発明は、同相単体に結合させる抗体及び酵
素標識を付与する抗体としてウシコラゲナーゼインヒビ
ターの異なる抗原決定基に対し、特異的に結合するモノ
クローナル抗体を用い、酵素免疫学的測定法によりウシ
コラゲナーゼインヒビターおよびヒトコラゲナーゼイン
ヒビターを定量する方法を提供するものである。

本発明方法を行うにあたっては、固相担体としてポリス
チレン製ピーズをはじめ、抗原や抗体を受動的に良く吸
着するポリカーボネート、ポリプロピレン、−リビニー
ル製のマイクロプレート、スティック、試験管など種々
の担体を使用することができる。一方、酵素標識を付与
する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、ＤＥＡ３
−８ｅｐｈａｃｅｌの如き陰イオン交換ｒルにより精製
したＩｇＧ画分、更にはペゾシ／消化後、還元して得ら
れる特異的結合部分Ｆａｂ’を用いることもできる。

本発明方法により、固相単体に結合させる抗体及び酵素
標識を付与する抗体として、ウシコラゲナーゼインヒビ
ターの異なる抗原決定基に対し、特異的に結合する２種
類のモノクローナル抗体の組合せを用いて、固相法酵素
免疫学的測定法によりウシコラゲナーゼインヒビターお
よびヒトコラゲナーゼインヒビターを定量することがで
きる。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

ただし本発明はこれら実施例に限定されるものではない
。

実施例　１ 抗つシコラｒナーゼインヒピターモノクローナル抗体の
作製 （ａ）　　抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９６．３９５〜４０４　（
１９８４）に記載の本発明者らの方法に従いウシ未萌出
知歯の根部歯髄をイーグルＭＥＩＭ培地（日永製薬製）
で培養した培養外液からＣｏｎ　Ａ−セファロース、ウ
ルトロ１’　＃　ＡｃＡ　４４およヒＤＥ−５２セルロ
ースの各カラムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精
製した。

精製インヒビターはＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　８０．５
７９〜５９９（１９７３）に記載のＬａｅｍｍｌ　ｉ　
　らの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（３ＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ
分子量約３２，０００ダルトン（Ｄ）の単一バンドを示
した。

（ｂ）　　抗体産生細胞の調製 ６週令のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス２匹をまずフロインｒ完
全アジュバンＰ中で、前記（−で記述した精製ウシコラ
ゲナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそれぞ
れ４８μＩのウシコラゲナーゼインヒビターを０．４−
の溶液として腹腔内投与する。さらに３０日目に生理食
塩水に溶解した８４μ９のウシコラゲナーゼインヒビタ
ーを追加免疫する。最終免疫として５８日目に腹腔内投
与（９５〜１５００μ！生理食塩水）により補助免疫し
、３日後にマウス膵臓を取り出し、牌細胞を調製する。

（Ｃ）　　細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ａ　１６４０　
（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ−ｒａｔ、ｏｒｉｅｓ）に重炭
酸ナトリウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１
ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ　）　、ペニシリンＧ
カリウム（５０Ｕ／ｍｆ）、硫酸ストレプトマイシン（
５０μｍ１／Ｉｌｌ　）　、および硫酸アミカシン（１
００μｍ１／ＦＲＩ　）を加え、ドライアイスで−を１
２にし、０．２μｍμｍ東洋メンブレンフィルター菌−
過する。

Ｎ８−１培地：上記ＲＰＭＩ　１６４０培地に除菌濾過
した仔牛脂児血清（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）
を１５％（ｖ／Ｖ）の濃度に加える。

Ｐ、ＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭ工１６４０培地の
ポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ　４，００
０、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、　。

Ｉｎｃ、　）　５０チ（Ｗ／Ｗ）無血清溶液を調製する
。

８−アゾグアニン耐性ミエローマ細胞ＮＳ−１（Ｐ３−
ＮＳ１−１　）との融合は５ｅｌｅｃ　ｔｅｄ　Ｍｅ　
ｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒｒｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　（ｅｄ、　Ｂ、Ｂ、Ｍｔｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ　
、Ｍ、Ｓｈｉｉｇｉ）　、Ｗ。

Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９
８０）、３５１〜３７２に記載の０１らの方法を若干改
変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核膵臓細胞（生細胞率１
００チ）とミエローマ細胞（生細淘率１００％）とを５
：１の割合で融合する。膵臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のＲＰＭＩ　１６４０培地で洗滌する。次に同
じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合す
る。容量５０１０円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｉｗ
ａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）を用い、４０ｄのＲＰＭｌ　１６
４０培地中４００Ｘ＃、１０分間遠心し、上清を完全に
吸出する。沈殿細胞に６７℃加温ＰＥＧ４，０００溶液
１．３１１１１を穏やかに攪拌しながら１分間で滴下し
、さらに１分間攪拌し細胞を再げん濁、分散させる。次
に′５７℃加温ＲＰＭＩ　１６４０培地１．３−を１分
間で滴下する。この操作をさらに１回繰返した後、同培
地９ｄを２〜６分間で常に攪拌しながら滴下し細胞を分
散させる。これを４００Ｘ、９．１０分間遠心分離し、
上清を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細胞に３７℃
加温Ｎ５−１培地１２．９ｍＪをすみやかに加え、細胞
の大きい塊すな１０−のピペットを用いて注意深くピペ
ッティングして分散する。さらに同培地２６１Ｌｔを加
えて希釈し、ポリステレ／製９６穴マイクロウェル（Ｉ
ｗａｋｉ　（）ｌａｓｓ）にウェル当り６．０Ｘ１０５
個１０．ＩＷＬｌの細胞を加える。なお、この時使用す
る９６穴マイクロウエルは前処理として０．２ｄのＮ８
−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（３７℃）で−晩保
温し、使用時に培地を吸引除去しておく。細胞を加えた
上記のマイクロウェルな７％炭酸ガス／９３％空気中で
温度６７℃、湿度１００チ下に培養に付する。

（ｄ）　　選択培地によるハイプリドーマの選択的増（
１）　　使用する培地は以下のとおりである。

ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＭＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０，
４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記Ｅ（Ａ
Ｔ培地と同一組成のものでおる。

（２）前記（Ｃ）の培養開始後翌日（１８目）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｒｎｌ
　）を加える。２．３．５．８．１１日目に培地の半分
（ｏ、１ａｊ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日
目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。

以降３〜４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換
える。通常２〜６週間で充分なハイプリドーマの生育が
観察される。ハイプリドーマ生育全ウェルについて次項
（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウェルをチェックする。次にフィーダーとして
１０　　個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ＴｆＬｌ
をポリスチレン製２４穴セルウエル（Ｉｗａｋｉ　（）
ｌａｓｓ）に加えたものを用い、上記で検出された各陽
性ハイプリドーマの全内容物を移す。これを前記（ｃ）
におけると同様に７チ炭酸ガス存在下、３７℃で約１週
間培養に付する。その間１〜２回各ウェルの上清ｏ、ｓ
ｙを新しいＨＴ培地０．５ｄと交換する。ハイプリドー
マの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確
認し、それぞれＫついて次項（ｆ）記載の限界希釈法に
よるクローニングを行う。なお、クローニングに使用後
の残液をポリスチレン製２５ｃＭ３組織培養フラスコ（
Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）に移し、凍結保存用試料を調
製する。

（ｅ）　　固相−抗体結合テス）　（ＥＬＩＳＡ）によ
る抗つシコラｒナーゼインヒビター抗体産生ハイプリド
ーマの検索 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５〜２１４
　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干
改変した方法を用いる。

この方法は、ハイプリドーマ抗体の検出に適している。

９６穴ミクロタイトレージヨンプレート（Ｆｌｏｗ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｉｎｃ、　）を０．５〜
ｉ、ｏμＪのウシコラビナ−ゼインヒビターでコートし
、次に、未コート部分を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）でブロックする。これに前記（ｄ）で得られたハイプ
リドーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約１時
間インキュベートする。２次抗体として西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロプリ＝ｙ　（
ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加え、さらに室温で約１時
間インキュベートする。次に過酸化水素と基質である０
−７二二レンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉眼
で定性的に判定するか、あるいはコロナ２波長マイクロ
プレート光度計（ＭＴＰ−２２、コロナ電気社）を用い
て５００　ｎｍの吸光度を測定する。

（ｆ）　　クロー二／グ 前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイプ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イプリＰ−マな取得する。ＭＳ−１培地ｄ当りフィーダ
ーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー二／グ
培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエル、６
６ウエルおよび２４ウエルにウェル当り５個、１個およ
び０．５個のハイプリドーマを加える。５日目、１２２
日目全ウェルに各約０．１　ｄのＭＳ−１培地を追加す
る。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハイプリ
ドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェルが５
０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行う。テスト
した全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中のコ
ロニー数を確認し、ウェル中に１コロニーが確認された
ウェルを４〜６個選び再りロー二／グする。

最終的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノク
ローナル抗体産生ハイプリドーマ１７株が得られた。

（ａ　モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 七ツクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイプリドーマをＮ８
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白濃度は１０〜１００μｆ！、Ａｔである）。一
方、大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細胞
の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ　、マウス）に
腫瘍形成促進剤プリスタン（２，６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカ／、ＡｌｄｒｉＣｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａ１社）をマウス−匹当り０，５ｒｒＬｌ腹腔内投与し
、１〜６週間後に、各ハイプリＰ−７１×１０個を同じ
く腹腔内投与することにより生体内で、さらに、１〜２
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７　Ｑｌ
ｏｔｊの腹水を得ることができる。

（ｈ）　　モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖及びアイソ
タイプ 前記（−で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナーゼ
インヒビターをコートしたミクロタイトレーシミ／プレ
ートに前述したＥＬＩＳＡ法に従って結合させる。ＰＢ
Ｓによる洗滌後火に、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウ
スエｇ抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
加える。ＰＢＳによる洗滌後、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基
質として２，２′−アジノージ（３−エチルベンゾチア
ゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した。

その結果をまとめて後掲の第１表に示した。得られたウ
シコラゲナーゼインヒビターに対するモノクローナル抗
体の内１５個が免疫グロブリン鎖γ１／にを、１個が１
２ａ／にを、そして、１個が１２ｂ／にを有していた。

（１）　　モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（４０チ飽和）
後、塩化ナトリウム０．０６　Ｍを含む４０ｍＭリン酸
緩衝液、−８，０で平衡化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｃ
ｅｌ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の非吸着画分を分取し、
このＩｇＧ画分を更に０．４２Ｍ塩化ナトリウムを含む
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化した５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌＳ　−３００５ｕｐｅｒｆｉｎｅ　（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社）カラムでダル炉遇し、培地中のＦｅ
２およびマウス由来のたん白質を分離、除去した。

実施例　２ ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターとモノクローナル抗
体との交叉性 （ａ）　　酵素標識モノクローナル抗体（Ｆａｂ’−Ｐ
ＯＤ複合体）の調製法 （１）　　Ｆａｂ’画分の調製 実施例１（１）で得られたＩｇＧ画分を０．１　Ｍ塩化
ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）に溶
解し、その溶液を以下述べるようにしてペプシ／で消化
した。すなわち、前記画分中のＩｇＧに対し２２％（Ｗ
／Ｗ）のペプシンを加え、３７℃、２４時間消化した。

更にその消化物に２　Ｍ　トＩＪス溶液を加えて−をＺ
Ｏに調整することにより消化反応を停止させ、０．１　
Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７、０）で平衡化したウルト
ロｒルＡｃＡ　４４カラム（ＬＫＢ製）を用いたグル濾
過によりＦ（ａｂ漣分を分取した。

次に、このＦ　（ａｂ’）　２両分をエチレンシアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）中で透析し、終濃度１０ｍＭとなるようにアミノ
エタンチオール（ＭＥＡ）を加え３７℃で１５時間還元
した後、Ｓ　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）で平衡化したウルトロｒルＡｃＡ　４４
カラムを用いてグル濾過し、Ｆａｂ’画分を分取した。

（２）　　マレイミＰ標識ＰＯＤ画分の調製上記（１）
の操作とは別に、以下述べるようにして西洋わさび由来
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にマレイミ）％を標識した
。すなわち、ＰＯＤを１Ｑｑ／ｄの量で０．１　Ｍ　Ｉ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、そのＰＯＤに対
して、２５倍モル量のＮ−（ε−マレイミドカプロイル
オキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣ８）をジメチルホルム
アミ）４溶液として加え、３０℃、６０分間反応させた
。これを０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で
平衡化したセファデックスＧ−５０カラムでｒ／Ｌ／濾
過し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分取した。

（３）　　Ｆａｂ’　−ＰＯＤ複合体画分の調製上記（
１）の如くして調製した画分中のＦａｂ’に対して上記
（２）で得られた画分中のマレイミＰ標識ＰＯＤとして
等モルになるようにして、両画分を混合し、更にＦａｂ
’およびマレイミｒ標１！ｌ　ＰＯＤの終濃度が１００
μＭとなるように５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ　Ｉ
Ｊン酸緩衝液（ＰＨ６，０）で希釈した。この混合液を
４℃、２０時間反応後、Ｆｈｂ’の１０倍モル量のＮ−
エチルマレイミドで未反応のチオール基をブロックした
。これを０．１Ｍリン酸緩衝１（ｐＨ６，５）で平衡化
したウルトＣ１））”　／ｌ／　ＡＣＡ　４４カラムで
ｒＡ／濾過し、Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体画分を分取後、
０．１チ牛血清アルブミン（Ｂ　ＳＡ）及び０．００５
チチメロサールを添加し、４℃で保存した。

（ｂ）　　ウェスタンブロッティング 実施例１（ａ）項で精製したウシ歯髄コラｒナーゼイン
ヒビターをＳＤ８−　ＰＡＧＥに供した後、市販のＰＯ
Ｄ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンおよび上記実施例２
（ａ）で得られたＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用いて細胞
工学１＆２．１０６１〜１０６８　（１９８３）に記載
の円部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い
、酵素抗体染色のパターンを得た。

これを第１図に示す。第１図において、Ａ及びＢはウェ
スタンブロッティング後のニトロセルロース膜をそれぞ
れ実施例２（ａ）で得られたＦａｂ’（クローン７−３
Ｆ１　）　−ＰＯＤ複合体及びＦａｂ’　（クローン７
−２１　Ｂ１２）−ＰＯＤ複合体で免疫染色した結果を
示すものである。

また、１〜１６は下記の各モノクローナル抗体（いずれ
もＩｇＣ）タイプ）の溶液にウェスタンブロッティング
後のニトロセルロース膜を浸した後、あらためて各ニト
ロセルロース膜をＰＯＤ標識ヤイ抗マウス免疫グロブリ
ン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏ−ｒａ　ｔｏｒｉｅｓ製）
で免疫染色した結果を示す本のである。

１：クローン７−３Ｆ１．２　：クローン７−４１２．
３：クローン７−５ＡＩ　、４　：クローン７−６ＣＩ
　、５　：クローン７−７Ｆｊ１　、６　：クローン７
−８Ｂ２，７：クローン７−９Ｂ４．８　：クローン７
−１０Ｅ１１．９：クローン７−１１Ａ５．１０：クロ
ーン７−１２Ｂ６　、１１　：クローン７−１５Ｅ８．
１２：クローン７−ｉ　８Ｆ３　、１３：クローン７−
１９Ｆ６．１４　：クローン７−２０Ｃ２，１５：クロ
ーン７−２１Ｂ１２．１６：クローン７−２３０９第１
図に示されるところから明らかなように、上記のモノク
ローナル抗体は、いずれもウシ歯髄コラｒナーゼインヒ
ビターと交叉することがわかった。

実施例　６ サンドイッチ酵素免疫測定法 （ａ）　　モノクローナル抗体結合ボールの調製法Ｊ　
、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ＡＪ２０９〜３２７　（１
９８３）に記載の石川らの方法に従って実施例１（１）
で得られたモノクローナル抗体を０．１％アジ化ナトリ
ウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し
、それを１００μｉＡｌ　（Ａ２８ｏ＝ｏ、　１ｓ　）
の濃度に調整した後、そのモノクローナル抗体溶液にポ
リスチレンボール（径６５■、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐ
ｌａｓもｉｃ　Ｂａ１ｌ製）を浸漬し、４℃に２４時間
靜装した。次にモノクローナル抗体溶液を除去した後、
０．１％ＢＳＡ　、０．１チ塩化ナトリウム及び０．１
％アジ化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）（以下緩衝液Ａと略記する）で５回洗浄した後、
緩衝液Ａに浸し、４℃で保存した。

（ｂ）　　サンドイッチ測定法 精製したコラゲナーゼインヒビター溶液、あるいはコラ
ゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を１％ＢＳＡを含
む緩衝液Ａで希釈し、各試験管に３００μｌ加えた。次
に前記（ａ）項で調製した抗体結合ボールを加え、３７
℃で１時間振とり加温後（第１反応）、０．１Ｍ塩化す
）　ＩＪウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
３−で各試験管を６回洗浄した。次に実施例２（ａ）項
で調製したＦｅｂ’−ＰＯＤ複合体を２０　ｎｇ／試験
管となるように０．１　％　Ｂ８Ａ及び０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で希
釈し３０℃で１時間振とう加温した（第２反応）。反応
終了後、第１反応終了時と同様に洗浄した。次に０，１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解したＰＯＤ基質、す
なわちα０１６４％テトラメチルペンチジン（ＴＭＢＺ
）を０．６ｄ加え、更に０．０１％過酸化水素０．１ｄ
を加えて３０℃で１時間振とり加温（第３反応）後、１
．３３Ｎ硫酸０．６　ｒ！Ｌｌを添加することにより反
応を停止させた。その反応混液のＡ４５０値を分光光度
計で測定し、標準直線より試料中のコラゲナーゼインヒ
ビター量を求めた。

（Ｃ）　　サ／Ｐイツチ測定用モノクローナル抗体の選
択 コラゲナーゼインヒビターを定量することが可能なモノ
クローナル抗体の組合せを探す目的で実施例１（１）の
方法で調製したクローン７−３Ｆ１．７−６Ｃ１，７−
１９Ｆ’６及び７−２１　Ｂ１２の各モノクローナル抗
体からＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を調製した。一方、クロ
ーン７−３Ｆ１．７−４Ｆ２．７−５ＡＩ　、７−６Ｃ
Ｉ、７−７Ｆ１１．７−８Ｂ２．７−９Ｂ４．７−１０
Ｅ１１．７−１１Ａ５．７−１２Ｂ６．７−１５Ｅ８．
７−１８Ｆ３．７−１９Ｆ’６　、７−２０Ｃ２，７−
２１Ｂ１２　、及び７−２３Ｃ）９の各モノクローナル
抗体を固相として、試験管肖たり１ｎｌの精製したウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビターを用いて実施例５（ｂ）
の方法によりサンドイッチ定量を行った。

得られたＡ４５０値を第２表（後掲）に示す。

なお、第２表中のＡ４５０値は試料１ｎＩ添加の値から
コラゲナーゼインヒビターを添加しない時の値を差し引
いた数値である。上記４種類のいずれのＦａｂ’−ＰＯ
Ｄ複合体を用いた場合においても、固相として７−４Ｆ
２．７−１１Ａ５．７−１２Ｂ６．７−１８Ｆ３．７−
２ＤＣ２、及び７−２３（）９０６種類の抗体を用いた
時のＡ４５Ｑが２以上の値を示した。次にこれら２４通
りの組合せＫついて、ウシ歯髄コラゲナーゼ・インヒビ
ターの添加量を変えてサンドイッチ定量を行った。Ｆａ
ｂ”（クローン７−３Ｆ１　）−ＰＯＤを複合体とし、
クローン７−４Ｅ２抗体を固相とした場合に得られた結
果を第２゛図に示す。第２図に見られるように、添加し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター量とＡ４５０の間
に直線関係が成立し、定量感度は試験管当たり約０．６
　ｐｇ　（１９ａ　ｍｏｌ）であった。上記以外の組合
せについても上記の直線関係が見られ、いずれの組合せ
についてもサンドイッチ定量が可能であることがわかっ
た。

実施例　４ 血清中あるいは血漿中のコラゲナーゼインヒビターの同
定 （ａ）　　アフイニテイカラムの調製 Ｎａｔｕｒｅ　２１４．１３０２〜１３０４　（１９６
７）に記載のＡＸ４ｎら及びＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　６１　、６３６〜６４
３（１９６８）に記載のＣｕａｔｒｅｃａｓａｓらの方
法に従って臭化シアンを介して担体のセファロース４Ｂ
にリガンＰとして実施例１（１）で得られた精製モノク
ローナル抗体を固定化した。次に抗体結合セファロース
４Ｂ　ｆル０．３−をガラス管に充填し、０．１Ｍ塩化
ナトリウム及び５　ｍＭ塩化カルシウム含有３０　ｍＭ
　）　１，１スー塩酸緩衝液で平衡化し使用した。

（Ｕ　コラゲナーゼインヒビターのアフイニテイ精製 健常人血清及び天庖癒患者血漿、ならびにウシ血清各１
ｄを０．１Ｍ塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム
含有３０　ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に
対して透析した後、上記（ａ）項記載の方法に従って調
製したクローン７−２１　Ｂ１２抗体結合セファロース
４Ｂカラムに供し、上記緩衝液で洗浄しく非吸着画分）
、次にカラムを２Ｍ塩化ナトリウム含有３０　ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液−７、５）及び０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム含有０．２Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１１，０）で順次洗浄しく洗浄画分）、最後にカラム
に吸着した蛋白質を０．２　Ｍグリシン−塩酸緩衝液（
ＰＪ４２．０）で溶出した（溶出画分）。後掲の第３表
に示した如く健常人血清（ヒト血清）、天庖衝患者血漿
及びウシ血清を用いた時の溶出画分にそれぞれ２．０、
ｔ８及びｚ１μ９の蛋白質が得られた。なお、これらの
溶出画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、多数のパ
ンＰが認められた。これらのパンＰのうち、コラゲナー
ゼインヒビターに相当するバンドを確認するためウェス
タンブロッティングを行った。その結果を第３図に示す
。

第３図に示したように、Ａ：健常人血清、Ｂ：天庖癒患
者血漿及びＣ：ウシ血清を用いて得られた溶出画分を５
ＤＢ−ＰＡＣ）Ｅに供した後、１：クローン７−３Ｆ１
．２：クローン７−６ＣＩ　、　３　：　７−１９Ｆ６
及び４　：　７−２１Ｂ１２の各モノクローナル抗体か
ら調製したＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用いてウェスタン
ブロッティングを行った結果、いずれの血清中及び血漿
中にもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対するモノ
クローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒビターが
存在することがわかった。しかも、それらの分子量はい
ずれも実施例１（ａ）項で得られたウシ歯髄コラゲナー
ゼインヒビターのそれと同じ３２，０ＯＯＤであること
がわかった。

（ｂｊ　　サンドイッチ測定法によるウシ血清中及びヒ
ト血清中のコラゲナーゼインヒビターの定量 実施例３（ｃ）項に示したモノクローナル抗体の組合せ
についてサンドイッチ定量を行い、ウシ血清中及びヒト
血清中のコラゲナーゼインヒビター量を測定した。その
結果を第４表（後掲）に示す。

なお、このサンドイッチ定量において、標準直線の作製
には抗原として実施例１（ａ）項で精製したウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターを用い。

また、血清を測定する場合には１１　ＢＳＡを含む緩衝
液Ａで１０００倍、２０００倍、４０００倍及び８００
０倍にそれぞれ希釈してサンドイッチ定量を行い、それ
らの平均値を第４表中に示した。

ウシ血清の場合、測定に供したいずれの組合せについて
も血清中のコラゲナーゼインヒビターを定量でき、それ
らの平均値は血清１ｄ由たり１２８μｇであった。一方
、ヒト血清の場合、測定に供したほとんどの組合せでＡ
４５０は全く検出されなかったが、固相用抗体としてク
ローン７−２３０９抗体、複合体としてＦａｂ’　（ク
ローン７−６Ｃｆ）−ＰＯＤを用いた場合、サンドイッ
チ定量可能であることがわかった。

次に上記の組合せを用いて、健常人血清（ヒト血清）５
検体、肝臓癌患者血清２検体及び天庖癒患者血漿２検体
の中に存在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッ
チ定量した。その結果を第５表（後掲）に示す。第５表
に示したように、健常人血清１ＷＬｔ中に存在するコラ
ゲナーゼインヒビター量は平均０．２９μｇであり、ウ
シ血清中のその量とほぼ同じ値を示した。また、天ｆｒ
ＬｆＩ！患者血漿中のコラゲナーゼインヒビターの量は
健常人血清中のそれに比べて約ＶＳ２と明らかに少ない
ことがわかった。

第　　１　　表 クローン番号　　　　サックラス／鎖 ７−３ＦＩ　　　　　　　　ＩｇＧ１／シアー４Ｆ２　
　　　　　　　ＩｇＧ１／に７−５ＡＩ　　　　　　　
　ＩｇＧ１／に７−６ＣＩ　　　　　　　　ＩｇＧ１／
に７−７Ｆ１１　　　　　　　　ＩｇＧ１／に７−８Ｂ
２　　　　　　　　ＩｇＣ）２ａ／ｃ７−９Ｂ４　　　
　　　　　ＩｇＧ１／に７−１０Ｅ１１　　　　　　　
ＩｇＧ１／に７−１１Ａ５　　　　　　　ＩｇＧ１／に
７−１２Ｂ６　　　　　　　　ＩｇＧ１／に７−１４Ｅ
９　　　　　　　ＩｇＧ１／に７−１５Ｅ８　　　　　
　　Ｉ　ｇＧ１／に７−１８Ｆ３　　　　　　　ＩｇＧ
２ｂ／に７−１９Ｆ６　　　　　　　ＩｇＧ１／に７−
２０Ｃ２ＩｇＧ１／に ７−２１Ｂ１２　　　　　　　ＬｇＧ１／に

【図面の簡単な説明】

第１図はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを５ＤＳ−
ＰＡＧＥに供した後、種々のモノクローナル抗体を用い
た時のウエスタンプロッテイングノ４ターンを示す図で
あり、第２図は固相７−４Ｆ２抗体−複合体Ｆａｂ’　
（７−３Ｆ１　）−ＰＯＤ測定系でのウシ歯髄コラゲナ
ーゼインヒビターの標準直線を示す図であり、第３図は
（Ａ）ヒト血清（健常人）　、　（Ｂ）天庖癒患者血漿
及び（Ｃ）ウシ血清をそれぞれモノクローナル抗体（７
−２１Ｂ１２）結合セファロース４Ｂカラムからの溶出
画分のウェスタンプロッティングパターンを示す図であ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ウシコラゲナーゼインヒビターの異なる抗原決定基に対
   し、特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体の組
   合せを用いてサンドイッチ法により酵素免疫学的に測定
   することを特徴とするウシコラゲナーゼインヒビターお
   よびヒトコラゲナーゼインヒビターの定量法。