JPS60500714A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体 技術分野 本発明は、モノクローナル抗体に関する。より詳しく言うと、本発明は、ヒトの α型インターフェロンに対するモノクロ−ナル抗体、モノクローナル抗体の１Ｍ 製法、ヒトのα型インターフェロンの免疫″ト的検定にお＋Ｊるモノクローナル 抗体の使用法、ヒトのα型インターフェロンを含む標品の免疫学的精！！Ｉ！！ １，７！作におけるモノクローナル抗体の使用法及びヒトのα型インターフェロ ンに対する抗体の検定法に関する。

背景技術 インターフェロンとは、抗ウィルス活性及び細胞生長の抑制といつ特性をボす一 群のクンバク質に与えられている遺伝学的名前である（スチュワードＷ、Ｅ、（ １９７９）　、”インターフェロン・システム”、ンユブリンガー、ウィーン及 び゛’−１ンターフェロン・シテスムの生物学”、エルンビアーノースホラント ・バイオケミカルプレス、アムステルダム）。インターフェロンは、３つのをに 分類することができる。即ぢ、α型インターフェロン（［ＦＮ−α又は白血球イ ンターフェロン）、β型インターフェロン（ＩＦＮ−β又は線維芽細胞インター フェロン）及びγ型インターフェロン（Ｉ　ＦＮ−γ又は免疫インターフェロン ）である。

（スチュワードＷ、Ｅ、他＜１９８０）　”インターフェロンの命名法゛ネイチ ャー、ロンドン　蔓６．１１０）　、本発明は、α型インターフェロン、特にヒ トのα型インターフェロン（Ｈｕ−ＩＦＮ−α）に７１するモノクローナル抗体 に関１′る。

同時に糸属し、公開され（いる英国特許出願ＣＢ　２０８３８３５八（これは国 際公開Ｗ０　８１１０２８９９によっても公表されている）示がなされている。

このモノクローナル抗体は、コーラ−とミルシュタインの細胞融合プロセスによ り調製された細胞系によって分泌される（コーラ−とミルシュタイン、ネイチャ ー　２５６　、４９５〜４９７）。Ｇ　Ｂ　２０８３８３６　Ａにおいて主張さ れているこの発明のより具体的な実施態様は、ＮＫ２と呼ばれる細胞系によって 分泌　されるモノクローナル抗体である。また、この同時系層中の出願には、Ｎ Ｋ２からのモノクローナル抗体を使用した免疫学的精製プロセスについても開示 されている。

現在、ＮＫ２のような細胞系に由来するヒトのα型インターフェロンに対するモ ノクローナル抗体は、固相に固定された抗体より成る免疫吸着カラムを通過した インターフェロンを含む標品のインターフ立ロン活性を完全にはなくさないこと が見出されている。このことは、幾つかの状況の下では好ましくないような標品 の分別が必要となってくる。この明白な結果は、多くの研究者によって注目され ている（ミューアーズ　Ｅ、他、インフエクショ２０７〜２１２頁）。これらの 結果は、ヒトのα型インターフェロンに対するモノクローナル抗体は、所定の標 品の構成部分の全部に結合しているの゛ではないということを示唆しており、更 にはα型インターフェロンの構成部分の全部を精製するためのモノクローナル抗 体親和性クロマトグラフィーを使用するためには、全構成部分に結合する別の抗 体を探すり・要があること、又＋ｒ相補的な特異性を持っている２つ又はそれ以 上の抗体を組み合せて使う必要があることを示唆している。

本発明は、ＮＫ２細胞細胞内来するヒトのα型インターフェロンに対して相補的 な特異性を持っているモノクローナル抗体を提供することを目的とする。Ｈｕ− ＩＦＮ−αは、サブタイプとし′ζ知られている数多くの異なる分子集合体より 構成されている。

Ｈｕ−ＩＦＮ−αの確認されたサブタイプは８から１２あるが、それらの相対的 な割合については今後の解明が待たれる。サブタイプは、それぞれ約１６５のア ミノ酸残基の長ざを持ち、多くの同し特徴を持っている。現在までにＨｕ　ＩＦ Ｎ−αにり・（シて２０の異なる遺伝子が確認されているので、合ＰＩｌずれば 入熱のＨ＋＋−ＩＦＮ−αについて２０までの異なるサブタイプがあるものと考 えられ゛（いる。歴史的な理由により、Ｈｕ−ＩＦＮ−αの一リプタイブの命名 法は公認のものではなく、１つにはアルファヘット式による命、名法があり、代 わりのものとしては数字を使−２六二命名法がある。

これらの命名法の関係６１８次のように４１″る。

Ａ　Ｂ　ＣＤ　Ｅ　Ｆ　ＧＨｌ、ＪＲ α２　α８　α１０　αｌ　α４　α３　α５　α６　α７この明８ＩＩＩ書に おいては、通常アルファへ、７１□　ｉｒ、命名７＋、を１・）・＋１＋する。

木兄間者は、ＮＫ２細胞細胞内来する七ツクローナル抗体は、ＡＪＪブタイブの ヒトのインターフェロン（Ｈｕ−ＩＦＮ−α２）に選択的に結合することを見出 した。驚くべきことには、木兄間者はまた、へザフ゛タイプのヒトのインターフ ェロンＩンよりもＤリフタイブのヒトのインターフェロン（＋−（ｕ−＋ＦＮ− α１）により選択的に結合するモノクローナル抗体は、モノクローナル）Ｊ′［ 体ｒＪｌ相性クロマトグラフィーの操作においてＮ　Ｉ＜　２細胞糸に由来する インターフェロンに対する相補的抗体として非密に効果的に作用することを見出 した。

発明の開示 本発明の最初の態様では、へカブタイプのヒ（・のα型インターフェロンよりも Ｄサブタイプのヒトのα型インターフエｒＪンによ４ り大きな結合能力を持っている、ヒトのα型インターフェロンに対するモノクロ ーナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、ヒトのα型インターフェロ ンの他のいかなるサブタイプよりもＤサブタイプのヒトのインターフェロンによ り大きな結合能力を持っていることが好ましい。このモノクローナル抗体は、Ｙ ＯＫ５／１９と命名されている細胞系から産生されたものであることが好ましい 。

本明細書において使用する“結合能力”という用語は、ヒトのα型インターフェ ロンの特定のザブタイプに対するモノクローナル抗体の相対的な親和力の程度で ある。この結合能力は、単にモ。

ツクローナル抗体の特Ｗ性を表すだけではなく、モノクローナル抗体とこれに対 応する抗原決定基間に形成される免疫化学的結合の親和力をも表している。

本明細書中において使用する“相補的結合能力゛という用語は、本発明の最初の 態様によれば、モノクローナル抗体の結合能力を補う結合能力を指す。相補的結 合能力を持っている抗体の一例は、ＮＫ２細胞細胞内来するモノクローナル抗体 である。

ＮＫ２細胞細胞内の調製法は、公開された英国特許出願ＣＢ２０８３８３６　Ａ 　（国際公開された出ｔａｎ　Ｗ　Ｏ’　８０／　０２８９９参！！６）にｊイ ゛細に説明されている。

ヒトのα型インターフェロンのサブタイプに対するモノクローナル抗体の結合能 力は、（例えば、ヒトのα型インターフェｌノンに対する固定されたモノクロー ナル抗体による）固体の支持体上のサブタイプの標品を固定化することにより測 定するのが虻まＬ７い。試験中の放射性同位元素でラベルされたモノクローブ° −ル抗体は、次に固定化された純粋のサブタイプと共に、培養し、洗浄の後、固 体支持体の比放射能を測定する。ラベルされたモノクローナル抗体の非特異的結 合に基づく放射能のバンクグランド・レヘ５　ｎ−６０〜５００７１４　（３） ルの数値的調整を行った後において、（これ以降ｃｐｍと吋ふ、を当りのカウン ト数における）結合している放射能は、サブタイプに対するモノクローナル抗体 の結合能力の程度である。ヒトのα型インターフェロンの特定のサブタイプに対 するモノクローナル抗体の結合能力を測定する別の好ましい技術とし′ζ、中和 試験を使用することができる。この中和試験では、ヒトのα型インターフェロン のサブタイプとモノクローナル抗体より成る標品を混合した後の試験標品に残っ ている中和されていないインターフェロンに原因するウィルスのＲＮＡ合成を阻 害する程度を測定することにより、結合能力を評価する。

本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様に基づくモノクローナル抗体と相 補的な結合能力を持つモノクローナル抗体との組合わせより成る組成物を提供す る。相補的な結合能力を持つモノクローナル抗体は、ＮＫ２細胞細胞内来するも のであることが好ましい。

このような組成物の利点は、相補的な結合能力を持つ２つのモノクローナル抗体 が組合わされることにより殆どのヒトのα型インターフェロンのサブタイプに高 い結合能力を有していることである。

本発明の第３の態様では、ヒトのα型インターフェロンを含む標品の免疫精製の ための処理方法を提供する。この処理方法において、本発明の第１の態様に基づ くモノクローナル抗体又は本発明の第２の態様に基づく組成物は固体支持体上に 同定化されて免疫精製培地が形成され、次にヒトのα型インターフェロンを含む 標品がこの培地に接触する。

抗体は、例えば粒子状の固体支持体上に固定化することもできる。それぞれの支 持体粒子は、本発明の第１の態様に係る七ツクに とができる。これらの粒子の混合物は、免疫精製カラムを作るために使用するこ とができる。

本発明の第４の態様では、ヒトのα型インターフェロンを含む標品の免疫精製処 理方法を提供する。この処理方法において、標品は、先に本発明の第１の態様に 基づく固定化されたモノクローナル抗体より成る免疫精製カラムを通され、連続 的に相補的な結合能力を持つ固定化されたモノクローナル抗体より成る免疫精製 カラムを通されるか、又はこの逆の順序で通される。相補的な結合能力を持つモ ノクローナル抗体は、ＮＫ２細胞細胞内来するものであることが好ましい。これ らのカラムは、別体になっていても良く、または一体になっていても良い。

本発明の第５の！３様では、本発明の第１の態様に基づく抗体を使用して成るヒ トのα型インターフェロンの免疫学的検定法を提供する。

この検定法では、ヒトのα型インターフェロンを検定するための標品を使用し、 固相の支持体に結合しているヒトのα型インターフェロンに対する第１の抗体及 びラベルを付着したヒトのα型インターフェロンに対する第２の抗体を使用する のが好ましい。

また、この検定法では、第１及び舅２の抗体のうちの１つば本発明の第１の態様 に基づくモノクローナル抗体であり、他の抗体は、ヒトのα型インターフェロン に対するポリクローナル抗体又は相補的結合能力を持っているモノクローナル抗 体であることが好ましい。この検定法は、標品と第１の抗体と第２の抗体とを順 に又は組合わせて接触させる段階と、ヒトのα型インターフェロンと第１の抗体 により固相に結合している第２の抗体の量を測定する段階より成る。

標品は、第１段階で第１の抗体と接触させ、次に第２の抗体を添加するのが好ま しい。第１の抗体は、ポリクローナル抗体（例えば、ヒツジの抗α型インターフ ェロン）であり、第２の抗体は、本発明の第１の態様に基づくモノクローナル抗 体であることが好ましい。ラベルは、放射性同位元素によるラベルであることが 好ましいが、例えば酵素、発色団、蛍光団、化学ルミネセンスを起こす化学基又 は検知し得る信号を発することができるものであれば何でもよい。ヒトのα型イ ンクフェロンに対するポリクローナル抗体は、ヒツジの抗α型インターフェロン であることが好ましい。相補的結合能力を持つモノクローナル抗体は、ＮＫ２細 胞細胞内来するものであることが好ましい。

本発明の第６の態様では、ヒトのα型インターフェロンに対する第１の抗体の免 疫学的検定法を提供する。この検定法において、ヒトのα型インターフェロンに 対する第１の抗体を検定するための標品、ヒトのα型インターフェロンに対する 第２の抗体が結合している固相の支持体、ヒトのα型インターフェロンに結合し ている第２の抗体、ラベルが付着していて第１の抗体に結合することができる第 ３の抗体を使用する。この検定法は、固相の支持体を標品に接触させ、これによ り第１の抗体を第２の抗体により固相に付着しているヒトのα型インターフェロ ンに結合させる段階、固相の支持体を第３の抗体に接触さ（、これにより第３の 抗体をヒトのα型インターフェロンと第２の抗体により同相に付着している第１ の抗体のいずれかに結合させる段階及び固相に結合している第３の抗体の量を測 定する段階より成る。第２の抗体は、ヒツジの抗インターフェロンであり、第３ の抗体は、第１の抗体に対する放射性同位元素でラベルされたヒツジの抗体であ ることが好ましい。本発明の第１の態様に基づく抗体のための検定法を使用する 場合、第２の抗体は、相補的な結合能力を持つ抗体で良いが、好ましくはＮＫ２ 細胞細胞内来するヒトのα型インターフェロンに対するモノクローナル抗体を使 用する。

８ 本発明の第７の態様では、本発明の第１の９３様に基づくモノクローナル抗体を 分泌することができるハイブリドーマ細胞系を生産するための方法を提供する。

この方法は、ヒトのα型インターフェロンで動物を免疫する段階と、動物の免疫 系にヒトのα型インターフェロンに対してリンパ球を産生させる段階と、牌細胞 とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマ細胞のコロニーを作る段階と、ハ イブリトーマ細胞のコロニーをスクリーニングして本発明の第１の態様に基づく モノクローナル抗体を分泌する細胞を探す段階とより成る。この方法のスクリー ニング段階では、本発明の第６の態様に基づ（検定法を使用し、第３の抗体は、 検定で使用する前に相補的結合能力のある固定化された抗体より成る免疫精製カ ラムを通してお（。相補的結合能力のある抗体は、ＮＫ２細胞系に由来するモノ クローナル抗体であることが好ましい。第３の抗体は、第１の抗体に対する放射 性同位元素でラベルされたヒツジの抗体であることが好ましい。第２の抗体は、 Ｎ　Ｋ　２細胞系に由来するモノクローナル抗体であることが好まＵ７い。

図面の簡単な説明 第１図ばＹＯＫ５／１９抗体を含む標品の一連の希釈液に対する抗インターフェ ロンの結合能力を検定した結果を示すグラフ、第２図は２つのモノクローナル抗 体を使用して１群のインターフェロンについて行ったＩＲＭＡ検定の結果を示す 棒グラフ、第３図はＹＯＫ５／１９を使用して１群のインターフェロンについて 抗インターフェロンの結合能力を検定した結果を示す棒グラフ、第４図はモノク ローナル抗体とポリクローナル抗体を使用して１群のインターフェロンについて 行ったＩＲＭＡ検定の結果を゛示す棒グラフである。

発明を実施するための最良の形態 モノクローナル抗体の調製 ９′　特表口Ｕ６Ｕ−５００７１４（４）モノクローナル抗体は、ラットをヒト のα型インターフェロンで免疫し、牌細胞と骨髄腫細胞とを融合した後、所望の 型の抗体を分泌しているクローンを選択することにより調製した。

免疫に使用した抗原は、白血球から調製したヒトのα型インターフェロン（Ｈｕ −ＩＦＮ−α（Ｌｅ）（“Ｐ−ＩＦ″）（カンチル化、１９８１）であり、ヘル シンキのに、カンチル博士から得たものである（ハツチ　１９１２０７８−Ａ、 　３８Ｘ　１０’　Ｕ／　ｎｊ！、全タンパク質２８ｍｇ／　ｍＡ）。抗原は、 リン酸塩で緩衝し７た塩類（ＰＢＳ）中で２　Ｘ　１０６Ｕ／　ｍ７！に希釈し 、０．５　ｍ１２（ｆｉ　（アリニ７−ト）ずつに分けた後−２０°で貯蔵した 。

略１週間置きにアリコートを溶かして、アジュハン１〜なしにＬ　ＯＵ系の若い 大人のラットの首と背中の多くの皮下部分に注射した。免疫注射する曲毎に血液 サンプルを尾から取った。約１９箇月後、ラットに白ＩＭ球で産へ１．され、Ｎ Ｋ２−セファロース４Ｂカラムを使用した免疫吸着りｌ′＋７トグラフイーで精 製した２ｘ１．０６ＵのＨｕ−ＩＦＮ−α（”ＮＫ２−ＩＦＮ”）をブースター 注射した。このインターフェロンを不完全なフＬＪイン１−のアジｊ、／＼ント 中で乳濁化さゼた後、筋肉量注射及び皮下注射を施した。最後のブースター注射 は、３週間後にＩ−’　ＢＳ中のインターフェロン（Ｐ−ＩＦ）を静脈（尾の静 脈）間注射を（２Ｘ　１０６Ｕ）施することにより行った。

０ 表　１　免疫化のスケジュール 免疫化の操作を続行するため、ラットの尾が６２球１＋１１　Ｌ、＋１１１　？ −ｆのサンプルを略１週間毎に集めた後、プラーク減少検定法で血’／Ｈのα！ ５νインターフェロンの抗ウィルス活性を中ｐＵする能力を試験した。この検定 で、力価がつり合う量の水泡性口内炎ウィルスを添加する１ｉｉｉに１１１層の 上席なヒトの細胞十で培養した場合、１０（ＪのＩＦＮにより　（Ｉ　ＦＮのな い）対照中のウィルスのプラークと比べ（、数が夕１照の約２０％に減少してい た。インターフェロンをｉｉ’４ｊ１イ細胞に添加する前に前辺てラットの血ｌ ｌ￥（最後の希釈率は］　／　ｆｉ（１のカンプルと培養しておくと、幾つかの ゲースでｉｌｌプシーク故の回復が見られた（表２参１１６）。

６０４日１１にラットを１女し、牌）藏を無菌的に取り出した。標１Ｉｌｌ的な 方法（ガルフレとミルシュクイン、１９８１参照）を使用し、］０゜個のＩＩＱ ’細胞をラットのハイシリトーマ系（Ｙ　１３２　／３．０Δ＋Ｘ　２０）に由 来する分泌しない変種の６Ｘ］０’の細胞と融合した（ガルフレ１　ミルシュフ ィンとフィト、　１！１７！１）。残り一の肝細胞は、液体窒素中に低ＹＡＡ保 存した。

融合の後、細胞を２４１１？Ｊのウェルを存するプレート（リンプロ）６ごおい て！１８　２　ｍ、ｅの培養液中に分散さ一口だ。−１１ｆ！合のＪ３週間１投 、。

１′１目屯：’ｌ　＋−に一は４８のつ上ル中２３（固で観察された。

表　２ ここで、−一血清の効果なし ＋−プラーク数の幾つかが回復 ＋＋＋−プラーク数の８０％が回復 融合の３週間後、培養液の」二ｌｎを抗インターフェロン抗体を検出するために 試験した。この検定・法は、免疫放射検定（セチャー１９８１）による、インタ ーフェロン濃度を測定するために４１画された方法の変形である。ヒツジの抗イ ンターフェ「ｌン抗体は、プラスチックの基材上に塗布した。このプラスチック の基材は、試験管又はビーズ又はマイクロ滴定トレーのウェルの形態をなしてい る。本発明者は、専ら９６のウェルを有するマイクロ滴定ル−を使用した。１０ μｐのヒツジ抗インターフェロン（精製した１ｇＧ）） ラクション；　Ｐ　Ｂ　Ｓ１０．１％ＮａＮ：Ｉ、　５ｍ　Ｍエチレンジアミン 四酢酸中１０〜２５μｇ／ｍρ）をウェル毎に添加し、４“Ｃで１６時間培養す る。次に、抗体の溶液を取り除いた後、ウェルを“阻止培養液”　（１％（Ｖ／ Ｖ）の正常なヒトの血脩、０５％のウシの血１７７アルブミレ（ＢＳＡ）　、０ ．１％のＮ　ａ　Ｎ　３を含むＰＢＳ）で満たし、次に室温で少なくとも１時間 （又は４℃で１晩）培養する。■１Ｆ培養液を除いた後、ウェルを０５％ＢＳＡ と０．１％ＮａＮ３を含む。

ＰＢＳで２回洗った。Ｈｕ−ＩＦＮ−ｃｘを含む溶液（１００μｒ、阻止培養液 巾約４０００Ｖ／　ｍ７りを対照のウェルを除いてそれぞれのウェルに添加し、 対照のウェルには１００μｒの阻止培養液を添加する。２０〜２５°で２時間の 培養の後、インターフェロンを除き、試験すべき１００　ｌｔ　ｅの溶液をウェ ルに添加する。（一般的にｔよ、このｆ４液は細胞培養液の上清である）。更に 培養した後（２０〜２５゜で約２時間）、試験溶液を除き、ウェルを０．５％Ｂ ＳＡと０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで２回洗う。試験溶液を完全に除き、且つ 洗浄を出来るだけ速く行うように注意しなければ成らない。

次の段階では、ラベルした抗うットＩｇ抗体と一緒に培養することにより行う。

１００μｌの１２４１でラベルしたヒツジの抗ラット免疫グロブリン抗体（５× １０５〜ｌＯ°”　ｃｐｍ　／　ｍ７！、１μｃｉ／ｌ＋ｇ、０．５％のＢＳＡ と０．１％のＮａＮａを含むＰＢＳ中の精製したヒツジ抗体の親和力）をそれぞ れのウェルに添加した後、２０〜２５°で約２時間培養する。次に、結合してい ないラベルされた抗体は除き、ウェルを０．５％のＢＳＡと０．１％のＮａＮ＋ を含むＰＢＳで２回以上洗浄する。

それぞれのウェルに残っている放射能は、結合しているヒツジの抗ラット１ｇの 割合であり、これがまたインターフェロンとヒツジの抗インターフェロンとの架 橋により固相に結合したラノ；・の抗インターフェＩコン抗体の割合でもある。

この放射能は、ウェルの底を熱線で切除し、それぞれのウェルをｄに験管に移し 換え゛ζガンマ・カウンターで計測することにより＾り定することができる。

この検定法の別の方法では、ヒツジの抗インターフェロンではなくプラスチック に結合しているモノクローナル抗体（例えば、ＮＫ２）を使用する。この場合、 ラヘノＣされたヒツジの抗うットＩｇ抗体は、使用前ＮＫ２に結合している抗体 を除くため、ＮＫ２−セファロースカラムを通さなければならない。この検定法 では、ＮＫ２により識別された抗原決定基とは異な−る抗原決定基を識別する抗 体のみが明瞭な信号を出すが、ＮＫ２決定基の無いＩＦＮ種のめに結合している 抗体は明瞭な信号を出さないといつ利＋ｊ：ｊを有する。

この代わりの検定法（ＮＫ２を塗布したプラスチックを使用）を使用して、融合 の３週間後、活発に生長している細胞を含む全ての培養液からの上滑を抗インタ ーフェロン抗体の存在を確認するために試験した。結果（表３）は、ＮＫ２抗体 のように同時にα型インターフェロンに結合できる抗インターフェロン抗体を産 生ずる培養液（ＹＯＫ　５／１９）が１つだけあることを示唆していた。α型イ ンターフェロン分子はモノマーなので、このことはＹＯＫ５／１９抗体とＮＫ２ 抗体はそれぞれ異なる抗原部位を識別するということを示唆している。この検定 を融合の４週間から５週間後に培養液の上清について繰り返し行ったが、活性は 安定し表　３ 結合に係るｃｐＩｌｌ（×１Ｏ−２） 試　料　＋ＩＦＮ　−ＩＦＮ 免疫化したラットからの 血清（１／１０００）　６１　８ ＹＯＫ５／１９培養液上清　１６　６ ２１の他の培養液上清　５〜９　５〜８クローニングとモノクローナル抗体の産 生細胞は順次薄め、それぞれの希釈段階で（９６ウエルＸ　Ｏ，２ｍｌ　）のマ イクロ滴定トレーに取った。細胞培養液の上清は、細胞の生長が依然として観察 される最高の希釈度で接種されたトレーから１０〜１４日で取り、検定を行った 。最も陽性の強い培養液（ＹＯＫ５／　１９（３１）からの細胞を生長させ、長 期保存のために液体窒素中で冷凍し、約５　Ｘ　１０７の細胞を前辺て“プリス タン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）でプライムしておいたＦＩ　ＡＯｘＬＯＵラットの腹 膜腔内に注射した（ガルフレとミルシュタイン、１（１８１）　、腹水腫瘍が発 生し、２週間後細胞を腹膜から取り出し、培養液に戻した。細胞は良好に生長し 、抗インターフェロン抗体を産生じ続けた。これらの細胞（、Ｙ　ＯＫ　５／　 １９ｆ３１　（Ａ　ｓ　）　）は再び上述したように希釈分別を行い、ヒツジの 抗インターフェロンと未精製のＨｕ　−Ｉ　ＦＮ−α（Ｌｅ）又はクローン化し たＩＦＮ−α１を使用した結合による検定法（表４）に基づき、ＹＯＫ　５／１ ９（３）　（Ａｓ）　（３，８０＞を選別した。

次に、寒天の代わりにアガロースを使用し、アガロースの添加前にマウスの腹膜 細胞をベトリ皿に付着させたことを除いて、この培養液からの細胞を上述したよ うに半固体支持体上でクローン化するのに成功した（ガルフレとミルシュタイン 、１９８１　）。これは殺して間もないＢａβｂ／Ｃマウスの腹膜腔を皮下注射 器により。

細胞培養液（２％８ｍｊりで洗うことにより達成された。次に、細胞懸濁液を１ ０〜２０×９ｃＩｎのペトリ皿に分け、４〜２４時間培養した。この培養の後、 培養液を取り出し、溶かしたアガロース（培養液中０．５％）を加えた。

表　４ ）１ｕ−ＩＦＮ　−α（Ｌｅ）　Ｈｕ−ＩＦＮ　−α１（Ｌｅ）＊非特異的な結 合（１００〜２００）は槍いである。

クローンは約２０個のクローンを含むペトリ皿から選び出した。

そして、抗インターフェロン検定で試験した１３個のクローンのうち１０個が陽 性であった。

選び出したクローンＹＯＫ５／１９ｆ３１　（Ａｓ）　（３，８０）　、３１の 再クローン化を行い、次ニクｏ−７ＹＯＫ　５／１９（３１（Ａｓ）　（３，８ ０）　。

３１．９を単離した。このクローンを改めてＹＯＫ　５／１９．３１．９と命名 し、これにより産生された抗体を単にＹＯＫ５／１９抗体と呼ぶことにした。

ＹＯＫ５／１９抗体を含む血清と腹水を得るため、上述したように培養液からの 細胞（ラット当り１〜５　Ｘ　１０’　）をＡＯＸＬＯＵ系統のＦ１雑種ラット の腹膜間又は皮下に注射した（ガルフレとミルシュタイン、１９８１）。次のよ うなりローンを使用したが、顕著な差異は観察されなかった。

ＹＯＫ　５／１９（３１（Ａｓ）　（３，８０）　、８．　ＹＯＫ　５／１９ｆ ３１　（Ａｓ）（３，８０）　、２２．ｙＯＫ　５／１９＋３１　（八ｓ）　（ ３，８０）　、３１．Ｙ　ＯＫ　５／　１９ｆ３１　（Ａｓ）　（３，８０）　 、３１．９注射の１０〜２０日後、ラットを殺し、腹水と血液又はいずれかを取 り出した。血液を凝固させた後、血清を取り出し、−２ｏ°で貯蔵した。腹水を 遠心分離にかけて細胞を分離した後、上滑を取り出し、−２０°で貯蔵した。腹 水がらの細胞又は固体皮下腫瘍から調製した懸濁液からの細胞を生まれたばがり のラットに注射して細胞系を通過させた。血清と腹水のサンプルを酢酸セルロー スの電気泳動（マイクロゾーン、ベックマン）にかけて、動物中のＹＯＫ５／１ ９抗体の産生を検出した。

ＹＯＫ５／１９抗体を精製するため、次のような実験計画を採用した。

留めた１００μｌの血清と腹水に１００　ｐ　Ｉ）の飽和硫酸アンモニウム溶液 を４℃で攪拌しながら加えた。沈澱を１０．ＯＯＯｒｐｍ　（ＭＳＥ２１）Ｘ２ ０分の遠心分離で集めた後、ｐＨ７，５の１０　ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ４４ｍＡ）中で再熔解した。この溶液を１０　ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７ ，５（５ｘ　２リツトル）に対して透析し、遠心１６ 分離（１０，ＯＯＯｒｐｍ　Ｘ　２０分）にかけて、Ｄ　Ｅ　５２　（７，５ｃ ｍ　Ｘ　３．８５ｃ＋ｎ　。

フワソトマン）のカラム中にあり、同じ緩衝液中で平衡状態にある変性し、不溶 のタンパク質を取り除いた。次に、カラムを４２０ｍρの１０　ｍＭリン酸ナナ トリウム緩衝液ｐＨ７，４で溶出し、引き続き１０〜１００　ｍＭへ段階的に濃 度を高くしたリン酸ナトリウム溶液、ｐｌ＋７．４　（８００ｍβ＋８００　ｎ ｕ）で溶出した。分画を集め（１２，３ｍβ〕続いてこのカラム溶出物の吸光度 （２８０ｎｍ）を測定した。最初の濃度の溶液から溶出した最初のピークよりな る分画は、酢酸セルロース電気泳動により純粋なＹＯＫ５／１９と同定され、こ れを集め、蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥した。このような実験における タンパク質の収量は、３１３ｍｇであった。

免疫吸着クロマｌ−グラフィによるインターフェロンの精製のためのＹＯＫ５／ ＋９抗体のセファロース４Ｂへの結合。

上述したように精製されたＹＯＫ５／１９抗体は、以前に説明したように（セチ ャーとハーク、１９８０）　、膨潤したセファロースの１　ｍｌ当り］Ｏｍｇの タンパク質量でＣＮＢｒで活性化されたセファロース、ＩＢ（ファーマシア）に 結合した。セファロースとの反応前後の溶液中のタンパク質濃度を測定すること により判断すると、９５％以上の結合が形成されていた。

ＹＯＫ５／１．９抗体の放射性同位元素による標識上述したように精製されたＹ ＯＫ５／１９抗体は、ＮＫ２で以前に説明したように（セチャー、１９８１）　 、クロラミン−Ｔを使用して放射性同位元素１２４■により標識を行った。約２ ０μｃｉ／μｇ（３Ｃｉ　／　ｐ　ｍｏｌｅ）の比活性が得られた４ＹＯＫ５／ １９のＨｕ−ＩＦＮ−ｔｘ中和能力ＹＯＫ　５／１９．８とＹＯＫ５／１９．２ ２の血清を抗ウイルス検定法（アサ−トンとハーク、＋９７５）で試験し、その Ｈｕ−ＩＦＮ−αの活性を中和する能力を調べた６試験結果によれば、２５００ ｔＪのＨｕ−ＩＦＮ−α（Ｌｙ）　（ナマルバ）に対して試験したときは０．７ で中和され、また２５ＵのＨｕ−ＩＦＮ−αに対しては１．８で中和された。こ れらの結果は、高い抗体濃度で、ＹＯＫ５／１９は、ナマルバＴＦＮの主要構成 分の抗ウィルス活性を中和できることを示している。

各種のＨｕ−ＩＦＮ−α調製法を使用したＹＯＫ５／１９とＮＫ２抗インターフ ェロンの特異性 ＹＯＫ５／１９の選別とクローン化において、この検定法ではＮＫ２が塗布され たプラスチックのウェルを使用した。このウェルにより、ＹＯＫ５／１９により 識別される抗原部位は、ＮＫ２により識別される抗原部位とは異なるが、少なく とも幾つかのＨｕ−ＩＦＮ−α分子は、両方の抗原部位を持ら、そして両モノク ローナル抗体は同時に結合できることがわかった。異なるタイプのＨｕ　−Ｉ　 ＦＮ−αを使用した場合には、この２つの抗体の特異性は、ヒツジの抗インター フェロンを塗布したウェルを使用し、そして結合に係るｃｐｍを比較することに より更に調べた。ＩＦ’Ｎ群は、粗白血球Ｉ　ＦＮ　（Ｈｕ　−Ｉ　ＦＮ−（Ｘ 　（１，ｅ）　）より成り、粗白血球ＩＦＮをＮＫ２−セファロース　カラムに 通し、これ乙こよりＮＫ２をなくした場合の溶出物は、インターフェロン（“Ｎ Ｋ２溶出物″）、クローン化されたＨｕ−ＩＦＮ−α（Ｐザブクィブ）及びクロ ーン化されたＨｕ−ＩＦＮ−αのＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｆ。

１、Ｊ、Ｋを識別した。ＩＦＮを検定に加えなかった場合の結合に係るｃｐｍは 、他の数値から差し引かれた非特異的な結合の１直（普通２００〜４００　ｃｐ ｍ　）を明らかにした。

表の５と６は、異なるこのような実験の結果を示し、また検定法の再現性を示す ものである。

実験結果によれば、ＮＫ２はＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄを識別するが、Ｆは識別しないのに 対し、ＹＯＫ５／１９はｌ　ＦＮ−Ｄに最も活性であることをはっきり示してい る。

表　５ ＩＦＮ 数値は、ＩＦＮを検定に加えない場合に得られたハックグラウンドｃｐｍを差し 引いた後の結合に係る（固相付着物の）　ｃｐｍ（ｘｌＯ−２）を示している。

Ｙ　ＯＫ　５／　１９（１１は、元のＹＯＫ５／１６の２次培養物である。ＹＯ Ｋ４．［、Ｃ６は、絶えた異なる融合物からの培養物である。

表　６ ＩＦＮ 八　Ｂ　（：　［］　Ｆ　Ｉ　Ｊ　Ｋ　１ｌｕ−ＩＦＮ−αｌ粗ＩＦＮ−αＮＫ ２−［１ｉＮ　ＮＫ２−　／８出液ＹＯＫ　５／１９．　３１．９もロッジ、： Ｌ　（Ｒｏｃｈｅ　）からのＨｕ−ＩＦＮ−Ａについて、同様の検定法で試験し た。結果は、この検定条件では、への識別はなされなかったことを示唆している 。

抗体濃度を測定するために使用する抗インターフェロン検定法」二連した抗イン ターフェロン結合検定法は、異なるサンプル中におけるｙｏＫ５／１．９抗体の 相対濃度を測定するためにも使用した。各サンプルに対して段階的な希釈液を用 意し、各希釈液に対して、適当なＩＦＮ（例えばＩＦＮ−α１又は粗ＩＦＮ）を 使用したこの検定法における結合に係る（固相付着物の）　ｃｐｍを測定した。

このような実験の結果を第１図に示す。この実験結果から、力１ｉ１１ｉ　（最 大の結合に係るｃｐｍの半分の希釈度）は、１／１０’〜１／１０５の間であり 、クローン化前のＹＯＫ５／１９細胞の」二ｌＮ中の濃度の１００倍以上である ことがわかる。ハ、タグランドの結合に係るｃｐｎｔ値を得るため、α型インタ ーフェロンが存在しない状態で対照実験を行った。

ｙ　ｏ　Ｋ　５／　１９．３１．９抗体の免疫グロブリンクラスさせ、放射性同 位元素を含む」−清を一ト述したようにＳ　Ｉ）　Ｓ−ポリアクリルアミド・ゲ ル電気泳動とオー１ラジオグラフイにかＬＪた（ガルフレとミルシュタイン、１ ．９８］）　６オートラジオグラフイによれば、１本の（γ）Ｈ鎖と１本のＬ鎖 の存在をはっきり示し、これはＹ　ＯＫ　５／　１９．３１．９が単一細胞に由 来するものであることの証明となり、またこの抗体がＩｇＧであることを立証す るものである。

同様の結論は、上述したようにラベルされた”１−ＹＯＫ５／１９精製抗体のＳ ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動からも得られた。オー）・ラジオグラフ中 に見える唯一のハン１゛は、■１鎖（γ）とＩ−鎖の易動度を持っていた。

ＹＯＫ５／１９を用いた免疫放射検定法ＩＦＮ−αを測定するための既述した免 疫放射検定法（ＩＲＭＡ）（セチャー、１９８１　）の幾つかの類イνの方法を 考案し、試験した。

これらの方法では、上述したように調製した、１２４１でラベルされたＹＯＫ５ ／１９抗体又はＹＯＫ５／１９抗体が塗布されたプラスチックヒーズ（又は他の 固体支持体）を使用した。この方法では、次のようにして行う。先ず、上述した ように硫酸アンモニウム沈澱とイオン交換クロマトグラフィで精製したＹＯＫ５ ／１９抗体を０．０５％の１ｌａＮ３と５　ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で５ （ｌμｇ／ｍｆｆに薄めた後、２００個のポリスチレン・ビーズをこの溶液中に ４℃で１６時間＆潰した。次に、ビーズを洗い、０．１％ＮａＮ３と０．５％Ｂ ＳＡを含むＰＢＳ中で貯蔵した。ＹＯＫ５／１９が塗布されたビーズとトレイサ ーとして放射性同位元素でラベルされたＹＯＫ　５／１９を使用したＩＲＭＡに おいて、ＴＦＮｉ！！１度が１０５Ｕ／　ｍｊ！までは放射能の目立った結合は 見られなかった。このことは、インターフェロン１分子当りＹＯＫ５／１９に対 して抗原部位が１個だけ存在していることを示している。同様の観察はＮＫ２に ついても見られ、このことはＩＦＮ−α分子が単量体であるということと一モノ クローナル抗体を使用したＩＦＮ−αのＩＲＭＡＮｏ、固相抗体　ラベルされた 抗体（※）　検定可能性※このラベルされた抗体は、放射性同位元素でラベルさ れた抗体である。

表７には、Ｈｕ−ＩＦＮ−αに対して可能なＩＲＭ＾として試験したモノクロー ナル抗体の組合わせを挙げている。溶液中におけるヒツジの抗ＩＦＮ−αを使用 した“逆ＩＲＭＡ”を示している（ホーキンスとセチャー、１９８３）。

幾つかの検定では、放射性同位元素でラベルされた抗体によっては識別されない 他のＩＦＮ−α種による、固相に対する競合に原因する阻害という同し問題が生 じた。このことは、ビーズ上にポリクローナルヒツジ抗体を塗布した場合の検定 （表７のＮｏ。

１と２）においては顕著であり、程度は少ないが検定のＮｏ、６にも見られた。

トレイサーとして放射性同位元素でラベルされたＮＫ２を有する固体支持体上の ＹＯＫ５／１９の組合せは、この阻害の様子を全く示さず、５０．０ＯＯＵ　／ 　ｍ　Ｅで６５，０００ｃｐｍの入力に対して結合に係る３９００ｃｐｍを示し た。ＮＫ２抗原決定基とＹＯＫ　５／１９抗原決定基の両方を有するＩＦＮ−α 種だけが、２つのモノクローナル抗体を使用した検定により識別され得る。そし て、この特異性を更に調べるために、一群のＩＦＮを再び使用した（全て約　５ ００００．／　ｍｊ！　＞。この比較の結果を第２図に示す。（Ａ。

Ｉ３．Ｃ，Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、には、ヒトのα型インターフェロンの゛個々のサブ タイプの標品、Ｃｒはインターフェロンの粗標品、ＥｆはＮＫ２免疫精製カラム からの溶出液である。ＮＫはＮＫ２免疫精製カラムで精製されたインターフェロ ン、αｌはα１型ヒトのインターフェロンの標品、　ｂ／ｇはハソクグラウン１ ゛、即ち対照である。）第２図ａで、この検定には固相のＮＫ２抗体と放射性同 位元素でラベルされたＹＯＫ５／１９抗体を使用した。第２図すで、この検定に は固相のＹＯＫ５／１９抗体と放射性同位元素でラベルされたＮＫ２抗体、ＩＦ Ｎ−αのＢ、Ｆとα１　（全て、組合せた検定において識別されないと思われる ）を使用した。試験した他の種は全て、少なくとも一つの検定で識別された。固 相の抗体は、放射性同位元素でラベルされた抗体の実効濃度よりも遥かに高い実 効濃度を有している事実がらして、異なる相対的な反応性は多分色んな種Ｏ千対 する２つのモノクローナル抗体の結合力の差異に基づくものであろう。

抗体の濃度（と結合力）の重要性は、上述したような標準的な抗インターフェロ ン検定法で証明された。この検定法で、抗インターフェロンは１０μｇ／ｍ１又 は１Ｍｇ／ｍｊ！の精製された２ Ｙ　ＯＫ　５／　１９１ｇＧである。ＩＦＮ−α−りの場合、１つの検定では結 合に係るｃｐｍは、ＩＯＩＪｇ／ｍＩｌで約１４００から１Ｍｇ／ｍＡで１１０ ００に減少したが、ＩＦＮ−ｔｘ−Ａの場合、減少は約１５００ｃｐｍからバン クグラウンドの上略Ｏｃｐｍであった。Ｈｕ−ＩＦＮ−αのＡ、Ｃ，Ｄについて も幅広い濃度にわたって試験した。第３図の結果は、２つの検定における相対的 な反応性の相違は、ＩＦＮ濃度の不正確な推定結果に基づくものではありえない ということを示唆している。（第３′図ａは１０μｇ／ｍｎ、第３図すは１Ｍｇ ／ｍ７！である）。

ポリクローナル固相抗体と共に、ラベルされたモノクローナル抗体を１個だけ使 用した検定の抗原特異性についての同様の分析を第４図に示す。第４図において 、固相抗体はヒツジの抗αインターフェロンであり、第４図ａで、放射性同位元 素でラベルされた抗体はＹＯＫ５／１９抗体、第４図すで、放射性同位元素でラ ベルされた抗体はＮＫ２抗体である。

ＩＦＮ−α精製のためのＹＯＫ５／１９−セファロース４Ｂカラムの使用 ゛　白血球からのＨｕ−ＩＦＮ　（１’とＨｕ−ＩＦＮ−（Ｘを産生ずる大腸菌 からのＨｕ　−Ｉ　ＦＮ−αの免疫精製において、上述したようにＹＯＫ５／１ ９腫瘍を持つラットの血清と腹水から精製し、またセファロース４Ｂに結合させ たＩｇＧを使用した。

予備試験では、４５　ｍｌ！の粗白血球ＩＦＮがらＩＦＮ−αに精製するため、 ＮＫ２−セファロースに対して作成した実験計画（セチャーとハーク、　１９８ ０）と同し実験計画に従ってＹＯＫ　５／１９−セファロース４Ｂの小さなカラ ム（０，６ｍ７！’）を使用した。約２．２　Ｘ　１０６ＵのＩＦＮ−αを詰め た後、ｐＨ２で４６％のこのＩＦＮ−α（ＩＲＭＡにより判断）を溶出し、１個 の分画として回収した。

分画にふくまれているタンパク質を１−リクロル酢酸で沈澱させ、Ｓ　Ｄ　Ｓ　 −ＰＡＧＥニより分析した結果によれば、分子量１５，０００〜２０．０００の １本の主要なバンドとこれより多少高い分子量を有する２番目のかなり弱いバン ドが明らかになった。このことは、ＹＯＫ５／１９セファロース・カラムに一度 通過させるだけでＩＦＮを純粋にできることを示唆している。

抗インターフェロン検定（上記参照）により得られた特異性のデータによれば、 ＹＯＫ５／１９抗体はＮＫ２−カラム溶出液中のインターフェロンを識別し、ま たＹＯＫ　５〜セフアロースとＮＫ２−セファロースは、粗ＩＦ・Ｎｉ１合物が らのＩＦＮの精製において相補性を持つことができるということを示唆している 。このこと゛は、ＮＫ２−セファロースとＹＯＫ５／１９−セファロースを連続 的に使用することにより確認した。粗ＩＦＮ−α（Ｌｅ）をＮＫ２−セファロー ス・カラムに通した場合、抗ウイルス検定によりｆｌｕ渕される５０〜６０％の 活性が失われた（しかし、ｐ１１２でカラムがら溶出させることにより回復可能 であった）。残りのＩＦＮ活性の殆んどは、ＹＯＫ５／１９セファロース・カラ ムに通すことによりなくした。抗ウイルス検定によれば、約１０％のＴ　ＦＮＬ がＮＫ２とＹＯＫ　５セフアロースの組合せによっては保持されいないというこ とを示唆している。

別の実験では、ＮＫ２で識別されるインターフェロンを除いた粗Ｉ　ＦＮ　（１ ４００ｍｐ）をＹＯＫ　５−−ｆｚＶｙｎ−１，ノ１　ｍｆｆ（７）、’＋ラム に通した。ＹＯＫ５−ＩＦＮを０．１Ｍのクエン酸で溶出した後、銀で染色した Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥで分析した（し仁他、１９８１）。酸性分画にはＩＦＮ 活性の大部分が含まれていた。そして、Ｈｕ−ＩＦＮ−αを示す易動度を持つ１ 個の主要なハントを同しゲルにが＆ｊた。

ＮＫ２−セファロースでは精製できないＩＦＮ−α種を精製するためのＹＯＫ　 ５セフアロースの能力の更に詳しい例証として、組換えヒトα１遺伝子産物を含 む未精製の細菌溶解物（７０ｍｆ）をＹＯＫ５セファロースの４．４　ｍ１カラ ムに通した。（このＩＦＮα１は、ＩＲＭＡにおいて又はＮＫ２−セファロース によってはＮＫ２によって識別されなかった）。カラムは、ＰＢＳで洗い次に０ ．１Ｍの酢酸アンモニウムで洗った。結合しているＩＦＮ−α１を揮発性ノＰＩ ＋２ノ緩ｆｉ／ｌ！Ｌ（４，５％（Ｖ／Ｖ　）　ｌＩｃ０ＯＩ（，０，０１Ｍ酢 酸アンモニウム）で溶出した後、分画を固相上のヒツジ抗インターフェロンと放 射性同位元素でラベルしたＹＯＫ５／１９を使用したＩＲＭＡで検定した。

結果は、カラム中にあった約６５％のＩＦＮは２×４　ｍβの分画に回収された ということを示していた。このＩＦＮの純粋さは、分子量約１９０００の１個の 主要なハントを明らかにした５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ｌ！：銀染色により示された。

精製されたαＩの純正さは、最も活性な分画を凍結乾燥し、このタンパク質をヘ ソクマン８９ｏ３シーケンサに移してＮ末端アミノ酸配列を決定することにより 確認した。この配列は、α１遺伝子のＤＮＡ配列から予測される配列と２０以上 の残基について完全に一致していた。

命名に関する注意 この明細書において、クローンＹＯＫ　５／１９．３１．９　（元はＹＯＫ　５ ／１９（３１（Ａｇ）　（３，８０）　、３１．９と呼ばれていた）又は同様の クローンテあるＹＯＫ　５／１９．３１．ＹＯＫ　５／１９．２２．ＹＯＫ　５ ／１９．８の細胞により産生された抗体は、ＹＯＫ５／１９抗体と呼ぶ。

ＹＯＫ　５についての省略形は、Ｎ　Ｋ　２　／　１３．３５．６に対するＮＫ ２という省略形と同じである（セチャーとハーク、１９８０）。ＹＯＫ５セファ ロースで精製されたインターフェロンは、ＹＯＫ５−ＩＦＮと呼び、これはＮＫ ２についての一般的な習慣にも従っている。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モノクローナル抗体は、Ａサブタイプのヒトのα型インターフェロンよりも Ｄサブタイプのヒトのα型インターフェロンに対してより大きな結合能力を持っ ていることを特徴とするヒトのα型インターフェロンに対するモノクローナル抗 体。 ２、　モノクローナル抗体は、ヒトのα型インターフェロンのどのサブタイプよ りもＤサブタイプのヒトのα型インターフェロンに対してより大きな結合能力を 持っているととを特徴とする請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３、請求の範囲第１項又は第２項に敏づくモノクローナル抗体と相補的な結合能 力を持つモノクローナル抗体との組合わせで成る０組成物。 ４、相補的な結合能力を持つモノクローナル抗体は、ＮＫ２細胞細胞内来するも のである請求の範囲第３項記載の組成物。 ５、請求の範囲第１項又は第２項に基づくモノクローナル抗体若しくは請求の範 囲第３項又は第４項に基づく組成物が固体支持体上に固定化されて免疫精製培地 が形成され、ヒトのα型インターフェロンを含む標品がこの培地に接触するよう になされたヒトのα型インターフェロンを含む標品の免疫精製のための処理方法 。 ６、標品が、請求の範囲第１項又は第２項に基づく固定化されたモノクローナル 抗体より成る免疫精製カラムと相補的な結合能力を持つ固定化されたモノクロー ナル抗体より成る免疫精製カラムとをいずれかを先にして連続的に通過するよう に成されたヒトのα型インターフェロンを含む標品の免疫精製のための処理方法 。 ７、相補的な結合能力を持つ抗体はＮＫ２細胞細胞内来するものである請求の範 囲第５項又は第６項記載の処理方法。 ８、請求の範囲第１項又は第２項記載の抗体を使用、ジζ成るヒトのα型インタ ーフェロンのための免疫学的検定法。 ９、　ヒトのα型インターフェロンを検定するための標品と、固相支持体に結合 しているヒトのα型インターフェロンに対する第１の抗体と、ラベルが付着して いるヒトのα型インターフェロンに対する第２の抗体とを使用する請求の範囲第 ８項記載の免疫学的検定法。この検定法において、第１と第２の抗体のうちの１ つは、請求の範囲第１項又は第２項に基づくモノクローナル抗体であり、他の抗 体は、ヒトのα型インターフェロンに対するポリクローナル抗体又は相補的な結 合能力を持つモノクローナル抗体である。この検定法は、標品と第１の抗体とｆ ｆ５２の抗体とを順に又は組合わせて接触さセる段階と、ヒトのα型インターフ ェロンと第１の抗体により固相に結合している第２の抗体の量を測定する段階よ り成る。 １０、ヒトのα型インターフェロンに対する第１の抗体を検定するための標品と 、ヒトのα型インターフェロンに対する第２の抗体が結合している固相の支持体 と、ヒトのα型インターフェロンに結合している第２の抗体と、ラベルが付着し ていて第１の抗体に結合することができる第３の抗体とを使用するヒトのα型イ ンターフェロンに対する第１の抗体の免疫学的検定法。この検定法は、固相の支 持体を標品に接触させ、これにより第１の抗体を第２の抗体により同相に付着し ているヒトのα型インターフェロンに結合させる段階と、固相の支持体を第３の 抗体に接触させ、これにより第３の抗体をヒトのα型インターフェロンと第２の 抗体により固相に付着している第１の抗体のいず１１、ヒトのα型インターフェ ロンで動物を免疫化する段階と、動２９ 物の免疫系にヒトのα型インターフェロンに対するリンパ球を産生させる段階と 、動物から取った肺細胞のサンプルを調製する段階と、肺細胞と刊髄腫細胞とを 融合してハイブリトーマ細胞のコロニーを形成する段階と、ハイブリドーマ細胞 のコロニーをスクリーニングして請求の範囲第１項又は第２項記載のモノクロー ナル抗体を分泌する細胞を探す段階とより成る、請求の範囲第１項又は第２項記 載のモノクローナル抗体を産生ずることができるハイブリドーマ細胞系を生産す るための方法。この方法において、スクリーニング段階では請求の範囲第１Ｏ項 記載の検定法と、検定で使用する前に相補的な結合能力を持つ固定化された抗体 より成る免疫精製カラムを通された第３の抗体とを使用する。