JPS60500732A - 抗原決定のための抗体塗布スポツトのマトリツクス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 抗原決定のだめの抗体塗布スポットのマトリックス技術分野 本発明は細胞生物学および免疫学の分野に属し、更に詳細には新規な免疫検定器 具および抗原性物質の決定法に関する。

背景技術 細胞表面の抗原はそれらの抗体との特異的反応性により多くの方法によって検定 できる。最も普通に使用される方法は免疫螢光染色検定、放射性物質結合検定お よび補体仲介細胞溶解法である。それぞれの方法では、細胞表面抗原に対する、 個々の抗体による細胞の反応性は個別に決定される。すなわち、細胞は試験され るべきそれぞれの抗体と共に、別々にインキュベートさ扛る。例えは、マイクロ タイタープレートを用いる補体仲介細胞溶解法においては、細胞はマイクロタイ タープレートの各ウェル中で抗体と共に個別にインキュベートされる。通常、マ イクロクイタープレートはウェル中に凍結乾燥された所望の抗体を含んでいるも のとして買うことができる。細胞を各ウェルに添加し、抗体と相互作用させた後 、染料と共に神体を添加する。抗体が結合した抗原全有する細胞を溶解し、溶解 された細胞に染料が取込まれる。この方法では、抗体が結合されている細胞は、 マイクロタイタープレートを目で見ることによって検知できる。

ある種の検定での個々の試験回数がしばしば非常に多い。例２　待人％１６（１ −！’１０Ｕ７３２　（３）細胞表面のアロ抗原を決定する組織においては、少 くとも８０以上の個別試験が、ＨＬＡ−Ａ、　−Ｂ、　−Ｃおよび−ＤＲ移植抗 原のアロタイプ全決定するために必要である。このような多数の検定には多量の 繰返しのピペッティングが必要である。繰返しのピペッティングは、時間全浪費 し、失敗する機会も増加するため好しくない。更に、多数回の検定では一般に大 量のサンプルおよび試験を必要とする。これら物質は入手が困難または高価であ るためしばしば供給が制限される。

発明の開示 本発明は免疫結合現象全利用する、細胞表面の特定抗原性物質を決定するだめの 簡単かつ強力な手法に関するものである。

最も広義には、本発明は新規な免疫検定器具および抗原性物質を検知する方法を 与える。本発明は細胞表面上の個々の抗原の存在全検知するのに特に有用である が、この用途に限５［されるものでなく、溶液中の抗原を決定するためにも使用 てきる。

この器具は、支持体表面上の微小な抗体塗布スフピットのパターンまたは配列か ら本質土酸る。各抗体塗布スポットは異なる、区別できる特異性金持つ複数の抗 体から構成される。各スポ′ソトは微小な特異的細胞免疫吸着剤として作用する 。細胞による個々の表面抗原の発現は、細胞がどの抗体塗布スポットに結合する かを測定することにより検知される。異なる多数の抗体塗布スポットは、支持体 表面上の極めて小さい部分に配置できる。

本発明は、当面している免疫細胞学上および免疫化学上の方法論を非常に単純化 している。本発明の方法では、組織タイピング（ｊｌｓｓ＋ユｅ　ｔｙｐｉｎｇ ）　におけるような、異なるいくつかの抗原についての多数の個別の試験を行う 場合の繰返しのピベノテインクを不要にｆきる。更に、本発明は、その名称が意 味しているように補体仲介細胞溶解法において必要な補体のような高価な試薬全 不要にしている。

図面の簡単な説明 第１図はガラス表面上の抗−ＨＬＡ−Ａ２抗体に対するアロタイプＨＬＡ−Ａ２ 　ｆｆ持つヒトからの単核細胞の結合を示す。

第１ａ図は１ｍｍ直径の抗ＨＬ／Ａ−Ａ２抗体スポットへの単核細胞の結合を示 し、第１　ｂ図は０．５　ｍｒｎ直径のスポットへの結合、お・よび第１ｃ図は ０．２５ｍｍ直径のスポットへの結合を示す。

第２図は抗−ＨＬＡ−Ａ２抗体塗布スフ１ぞツー・の１０個×１０個マドワック スに対する単核細胞の結合を示す。

第３図は抗−Ｌｙｔ２．１および抗−Ｌｙｔ　２．２　ｋ含む抗体マトリックス に対するＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ＣおよびそれらのＦ″１を−らの胸腺細胞の結 合な°示す。

第３ａ図は７トリノクス中の２個の抗体の配列を説明的に示す。抗体の塗布、細 胞サンプルの適用および写真は実施例に説明する。

第３１）図は（ＡＫＲ／ＪＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆｌ　の胸腺細胞による細胞結合の 結果を示す。

第３ｃ図はＡＫＲ／Ｊの胸腺細胞による細胞結合の結果を示す。

第３ｄ図はＢＡＬＢ／Ｃの胸腺細胞による細胞結合の結果を示す。

発明全実施するだめの最良の態様 本発明の免疫測定装置は、その表面に抗体全コーティングした面又はスポットの 列を有する支持体よりなる。好１しくに、この支持体はガラス又はプラスチック カバースリップのような平坦な平面を持つ固体物質である。抗体コーティング領 域は、支持体の表面において非コーテイング表面領域に囲１れた複数の小スポッ ト’を形成する。抗体コーティングスポットの抗体は、支持体の表面に結合され ており、共イｉ結合または非共有結合で結合されている。

支持体の表面」−のスポットの最もりｆ寸しい配列は、長方形の行列（マトリッ クス）である。行列配列は’ｌ：！ｊ定スボ゛ットの行と列を指定することによ り、座標表示に」ニジ容易に任意ス、ｌｒソトの特定をｎＪ能にする。抗体のス ポットは、間隔乞密接させて完成スポット行列により占められる表面面積を最小 に［７、−まだ。

必要とするサンプル量を最少にすべきである。例えば、１．ＯＸ　１０のスポッ ト行列は、支持体表面に１．・いてｒＪ　］、　ｃｍ　２又はそｉｔ以卜の面積 を占めるようにすべきである。

本発明によれば、各スポット又はスポット配列中の各組の各々（例えば−行又は −列のスポットの組）は、Ｉｌへ−の明瞭な特異性を有する抗体よシなる。各ス ポット又はスポットの各組は、他のスポットと特異性の異なる抗体を有する。従 って、１００スポツトの行列において１１００ｔの異なる特異性を持つ抗体の試 験が可能である。抗体コーティングスポットは、抗体が反応する抗原に対する微 小な特異的免疫吸着体として作用する。細胞の特異的表面抗原に対する抗体から なる抗体コーティングスポットは、そのような表面抗原を有する細胞に対する特 異的免疫吸着体として作用する。

５ 抗体コーティングされたスポットの抗体濃度は、細胞の免疫吸着体としてのスポ ットの機能と関係を有する。支持体の表面に共有結合まだは非共有結合によシ結 合した抗体の濃度は、細胞の結合を検出するだめの後続工程において、装置を通 常の操作に付す間に、細胞がスポットにしつかシと結合し結合状態が保持される 濃度でなければ々らない。細胞がしっかり支持体の表面に結合するためには、細 胞の表面抗原と抗体との間の架橋が多いことが必要と考えられる。しかしながら 、好ましくは抗体の濃度は、抗体に結合しつる表面抗原を持つ適度の濃度の細胞 との接触に際して、抗体コーティングされたスポットの全体を覆う顕微鏡的に均 一な結合細胞層を生じるに十分なものでなｉ　ければならない。このような細胞 の均一層の形成は、細胞が結合したスポットの検出全可能にするため望ましい。

顕微鏡的に均一な細胞層音生ずるに要する濃度は、恐らく緊密な細胞結合に十分 な最低濃度より多いであろう。

本発明の免疫測定装置は、支持体の表面に少量の抗体溶液を施し、抗体が表面に 吸着されるまで、この溶液を支持体上に保持することにより製造される。所望に より、抗体は蛋白質全固相に共有結合的に結合させる慣用方法音用いて支持体の 表面に化学的に結合させてもよい。

抗体溶液は表面に小滴として施してもよい。小滴の容積は、もちろん抗体コーテ ィング面積の大きさを決定する。その好ましい容積は、直径Ｑ、２５ｍＷ−１， ０＋ｎｍ−ト番諦の抗体コーティングされた点を得るために０．００５−０．５ μｇである。小滴は、抗体コーティングされたスポットの所望配列に一致させて 表面上に施される。

抗体溶液はミクロピペットまだは他の適当手段で分配供給する。好ましくは、施 用具（アプリケーター）は、各小滴を支持体表面の正確な位置に施用して、実質 的に同寸法の均一面積を覆うことが出来るもので々ければなら永い。小滴の形以 外にも任意の形で溶液全施用する手段１例えば支持体の表面へ直接接触しても抗 体溶液をその部分に移行させる装置が同様の要求を満足させることができる。

コーティングのために表面に施用さ扛る溶液中の抗体の１．ｌＩｉしい濃度は約 １０μ、ｊｉｌ　／ｍｌ！　である。これが多くの抗体にとって最適濃度と思わ れる。しかしながら、蛋白質の結合は溶液中にＪ、・ける濃度とともに比率にも 影響されるから、所望の細胞結合を得るために十分な濃度の抗体コーティングＮ ’ＪるためにＶよ、抗体溶液は高度に抗体価を強化しておく必要もある。千ツク ｒｌ　−ナル抗体は、抗体コーティングされたスボ′ットヲ製造するために十分 強化された溶液状態で得られる。細胞表面抗原に対する多くのモノクローナル抗 体の入手ｑ能性が高凍れば、広い範囲の抗原の測定のための抗体マトリックスを 作成することができる。本発明のために、多クローン性抗体も十分に強化された 溶液として得られる。

種々の抗体を支持体の表面に施して吸着又は結合が起るに十分な時間その表面に 保持した後、支持体の全表面全蛋白質又は血清の溶液で満し、未吸着抗体を除去 しそして支持体の周辺表面のコーティングされなかった部分及び非特異的結合ザ イ）ｋブロックする。この蛋白溶液は、該表面に約５−１０分間保持する。この 器具を次いで蒸留水で洗浄して乾燥する。器具は直ちに使用しても良く使用まで 保存しても良い。

器具完成後、抗原測定は１〜２時間の短時間で実施できる。

簡単に説明すれば、本発明の器具は次の方法で使用する。特定の表面抗原の存在 を試験すべき細胞を通常の食塩液に懸濁させ、細胞がマトリックス中の抗体コー ティングされたスポットの全てを覆うように器具表面に施す。全マトリックスを 覆うに必要な細胞の数はマトリックスの大きさ及び細胞のタイプにより異る。し かしながら、スポットの１　ｃｍ　２マトリツクス中の全抗体スポラトラ覆うた めには、２００μｌ容積中の約２刈０６細胞で十分である。

細胞の懸濁液全前記のように支持体の表面に塗布した後、細胞を該表面に定着さ せ、そして、スポット中の抗体と反応させる。次いで、非イマ１着細胞を表面か ら除去する。こねは器Ｊ）−を洗浄および攪ｒ１することによって、あるいは、 付着細胞を分割しないようなその他の適当な方法により行なうことができる。抗 体スポットのマトリックスを試験し、スポット細胞の結合を決定する。細胞を固 定し、そして染色することによって、細胞が付着したスポットの同定を促進でき る。

本発明の免疫検定器具は表面細胞上の特異抗原の存在の決定ばかりでなく、別個 の分化抗原を発現する機能的に異なる細胞細区分集団を分析するのにも使用でき る。抗体被覆固体表面は、該抗体と反応する特異表面抗原全有する細胞を細胞類 の混合集団から吸着できることが確認された。本発明の抗体マトリックス法は混 合集団中′の特異小集団の割合、例えば、単核細胞集団中のＢ細胞、Ｔ細胞およ び単球の割合またはＴ細胞集団中の誘導物質およびサプレッサーＴ細胞の割合を 決定するのにも使用できるであろう。これらの全ての細胞と特異的に反応するマ ウスモノクローナル抗体が利用できるので、免疫付着器具および前記の試験を行 なう方法を発展させることもできる。これらのテストは現在、各個体抗体を別々 に分析する螢光流れ細胞測定法により行なうことができるが、抗体マトリックス 法は多数の測定を同時に行なうことを可能にする。

吐だ、本発明は細胞の表面上の抗原の検出に限定されない。

本発明は可溶性抗原、ウィルス捷たは細菌の測定にも適用できる。有用な用途は 例えば、アイソタイプ、ア「Ｉアイソまたはイディオタイプの抗体の測定および ウィルス址たは細１１４検体の型決定などである。

本発明の器具および方法は抗体塗布スポットよりもむ［７ろ、様々な抗原の塗布 されたスポットの配列′？ｆ、たはマ）　ｌ）ソクスを使用することによって、 抗原に対する抗体の！１＋ｉ異性全測定することにも使用できる。この種の測定 の方法論はおおむね」―述のとおりである。抗体のサンプルを、抗原の塗布され たスΣ１μソトの全配列と接触するように支持体表面に塗布し、そして、スポッ トへの抗体の結合量を測定する。

下記の実施例によｐ本発明を更に詳細に説明する。

実施例 ３９７（１９７８））により創製されたマウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ２（ＩｇＧ１） を米国％Ｍａｉｎｅ州、Ｓｃａｒｆｏｒｏｕｇｈ市にあるＡｔ１．ａ、ｎもｉｒ ２９ Ａｎｔｉｆｏｄ、ｉｅｓ社から購入した。特異抗原は一連の塩分別法により腹水 から供給者によシ濃縮されていた。典型的マウス抗−Ｌｙｔ　２．１　（１ｇＣ ２ａ）は５ｈｅｎにより創製され、そして、米国。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州、　Ｂｏ　ｓ　ｔｏｎ市にあるＮｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社から腹水の形で購入した。１ｇＣ２ａをタ／バク質Ａ −８６ｐｈａ、ｒｏｓｅ４Ｂカラムに吸着させることによって１ｇＣ２ａ全濃縮 した。腹水から濃縮したマウス抗−Ｌｙｔ　２．２　（工ｇＭ）はＰｅｎｎ５ｇ １ｖａｎｉａ　太字のｆｆ１ｖｉａ　Ｒａｕｌｅｔ博士から贈′与してもらった 。元のハイプリドーマはＧｏｔｔｌｉｅｂら（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　 １０　：　５４５　（１９８０）　）によって創製された。

アネートは米国、　Ｏｈｊ、ｏ州、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ市にあるＲｅＳｅａｒＣ ｈＯｒｇａｎ　ｉｃ　ｓ社から購入した。Ｐｙｒｅｘ製ディスポーザブル微量採 取ピ深ットは米国、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｉ＜州、Ｃａｒｎｉｎｇ市にあるＣｏｒｎｉ ｎｇＧｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｏ社から購入した。ピ投ソ）ｋ加熱し、０．００５〜 １μｌＪｋ排出する薄肉のピペットに加工した。０．５μｌの目盛全微細先端マ ーカーペンで入れた。マイクロカバーグラス（厚さ０．１３〜０．１９ｍｍ、　 ｌｌＸ２２ｍｍ、　２２Ｘ３０ｍｍおよび２２　Ｘ　４０ｍｍ　）はＡｒｔｈｕ 、ｒ　Ｈ，Ｔｈｏｍａｓ社（カタログガロ６６６３−ＦＩＯ１６６３−に１９お よび６６６３−に４６）から購入した。

マウスオよび細胞−ＢＡＬＢ／Ｃマウスは米国、Ｍａｓｓａｃｈｕ、５ｅｔｔｓ 州、Ｗｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ市にあるＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉ ｎｇ　Ｌａｆｏｒａｔｅ−１□。８社から購入した。ＡＫＲ／Ｊ　’および（Ａ ＫＲ／Ｊ　ｘＡＫＲ／ｃＪ）ＦｌマウスはＭａｉｎｅ州　Ｂａｒ　Ｈａｒｆｏｒ 市にあるＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｆｏｒａｔｅｒｉｅｓ社から購入した。・これら のマウスは使用時、生後６〜８週を経過していた。胸腺細胞は胸腺をステンレス 製篩で薄くそぐことによって調製した。ヒト末梢血液単核細胞はヘパリン化血液 をＦｉｃｏｌｌ／ジアドリゾエートナトリウム溶液（米国、ＮｅＷＪ’ｅｒｓｅ ｙ州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ市にあるＰｈａｒｍａｃ　ｉａ社の製品）で遠心分 離することによって調製した。単核細胞は２層不連続密度勾配の界面から回収し た。

カバーガラススリップ上への抗体の塗布セク／ヨンに一パーの小片（Ｖ２インチ 長さへの１０分割）はそのカバースリップの下側にテープされた。そのカバース リップは１０ＣＴＬ直径のベトｌ）皿の中央に置いた。その皿のまわりの空間お よびそのふたの内側は水分を保持するため湿潤は−パーティソンユで被覆された 。特にことわりがなければ、約０．０５μｅ抗体溶液は細い先端の５μ６０マイ クロピペツトでそのグリッド上に点として適用された。小滴の適用は、もし実験 室中の空気が乾燥している寿らば冷い（４℃の）室で行なわれるべきである。４ ℃で一昼夜又は６０分間室温でインキュベートの後、その皿中のバーバーティッ シュは除去され、そしてそのカバースリップは、３０％小牛の血清全速かに注い でその抗体全稀釈し、そして未塗布空間および結合部分をブロックした。５〜１ ０分後その被覆スリップは蒸留水で洗浄されそしてアスピレータ−て乾燥された 。そのカバースリップはただちに湿潤２−バーティッシュでカバーされたふたの 内側と共にハトリ皿に置き、そしてその皿の内側はパラフィンでソールされた。

そのスリップは、それから使用まで４℃で貯蔵された。

抗体被覆ガラス片への細胞の付着 １ 抗体塗布スリップ−ｉ−＜＋−り皿上にテープで止めた。マウスの胸腺細胞また はヒトの末梢血液単核細胞全１％胎仔牛血清含有培地内にｌ　Ｘ　ＩＱ　７７ｍ １で懸濁させた。微量の懸濁ｌｅＬを抗体マトリックス上に置いた：５×５７ト リックスに対して約５０μｇおよび１０×１０マ１．　リソクスに対して２００ μｅ０細胞を室温で３０分間沈降させた。約ＩＱｍｌの燐酸塩緩衝塩水全ハト９ 皿に加えた。

非付着細胞を、皿の側面ヲ１０ないし２０回軽くたたいて除去し、流し出した。

カバースリップ上、の保持細胞を室温で３０分間１．Ｑｍｌホルムアルデヒド溶 液中でインキュベートすることにより次いで固定した。カバースリップを次いで 蒸留水で洗いそして紙テイソ／ユ」二で空気乾燥させた。ある場合、蒸留水によ る洗浄と乾燥の前に細胞ヲ３７°Ｃで２０分間螢光インチオンアネート（燐酸塩 緩衝塩水中００５〜／ｍｌ）でもって染色した。

細胞結合の評価 全ての結合は裸眼（顕微鏡を用いることなく）で簡単に評価することができた。

立体顕微鏡を用いて５ないし３０倍の大きさで黒色滑面非フラクタイル（ｎｏｎ 　ｆｒａｃｔｉｌ、ｃ）紙上である試料の写真を撮った。

約０．００５−０．５ｆ’６　（７）範囲にあル量（７）　＝　’）　ス抗ヒト Ｉ（ＬＡ−Ａ２抗体（１０ｔ１２／ｍｌ）　ｋ・小さいガラスカバースリップ（ １１Ｘ　２２ｍｍ　）に施用した。０．０５μｅ　以上の量は計量しそして取ｐ 出した。

０．０５＃　以下の液滴の量を、取り出した単位体積当りの滴数により評価した 。例えば、ｏ、ｉ、ｕｇｔ取り出して２０滴が得られたとすれば、滴のイ均寸法 は０００５μｅ　である。前述の通りカバースリップを作成した後、アロタイプ Ａ２でヒトがら分離した末梢血液単核細胞を抗体被覆区域に施用した。結合後、 非付着細胞を洗い出し：付着細胞全ホルムアルデヒドで固定して乾燥した。カバ ースリップを通常の顕微鏡で検査しそして立体顕微鏡で写真撮影した。

第１図は開缶の倍率で１訂、０．５　ｍｍ、および０．２５ｍｍ直径のスポット に示している。ガラス表面は顕微鏡でみて一様である。

第１表は変化した寸法の抗体点の細胞吸着容量をまとめている。カバースリップ 全一・マサイトメーター」−に置きそして単位面積当りの細胞数およびスポット の直径から細胞総数全評価した。点のほとんど全ての空間は満されているので、 この数はたぶん最大容量を示す。最小の０．２５＋ｎ＋ｎのス子′ノドは徒だ容 易に見ることができ１１００細胞を含むことができる。これらの数は、自動分析 器でどうにか定量できる限界［）甘こあるへきである。

第１表 種々の寸法の抗体スポット内の細胞数 スポット寸法（直径）　１　ｍｍ　０．５ｍｍ　０．２５ｍｍ細胞数ａ１７００ ０＋２０００４５０００±３０００１．ｌｏｏ”２００ａ：　数は平均値±３回 の測定の標準偏差である。

抗体マトリックスの分析容量 関連するがしかし区別できる特異性の抗体全調製してかつ精製することができれ ば、これらの抗体を小面積の固相上に塗布して抗原を分析するために用いること ができる。この種の抗体の最も好都合な配列は第２図に例示されているような配 列と思われ、本図において１００個の抗体スポットは１０　Ｘ　１０角のマト１ ３ リツクス内にまとめられた。この実施例において、マウスの抗ヒ１−ＨＬＡ−Ａ ２は抗体であハＡ２アロタイプを備えたヒトからの末梢血液単核細胞は細胞抗原 であった。

第２表は抗体７トリンクスの分析容量ケ説明している。議論は１ｃｒｒＬ２のマ トリックス面積に基づいた。全ての抗体が有用であると仮定すれば、約８０のア ロタイプを互いに有するＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−ＤＲ用タイピングは細 胞試料の１回の施用で行うことができる。０．２５　ｍｍのスポットによシ、個 々のアロタイプの試験を５回繰り返すことができる。細胞結合の結果の解析は適 当な器具で行なうことができると思われる。第２表はまた、個々の抗体マトリッ クスが１個ないし数個の微滴量プレートに相当する容量をもつことができること を示している。

第２表 １　Ｃｍ２の抗体マトリックスを用いて抗原を決定する分析容量スポット寸法（ 直径）　１ｍｍ　０．５ｒｎｍ　０．２５ｍｍ総Ａ数ａ２５　１００　４００ 微滴批プレートに相当する数（６０ウエル）　０．５　１．５　７ＨＬＡタイピ ング用レプリケートの数（８０−１５個の総アロタイプ） ａ：　隣接点間の距離はスポット直径に等しい。

抗体マトリックス分析法全使用するのに必要な細胞試料と抗体単核細胞の直径を ７μｍと仮定すると（若干のものは明らかにそれより大きい）、１．５　Ｘ　１ ０．’個の細胞で１　ｃｒｎ　２の面積を完（５×５マトリツクス）及びｌＣｍ ２（１０ｘ１０マトリツクス）の面積についてそれぞれ５Ｘ１０”個の細胞（５ ０μｅ中）及び２×１０６個の細胞（１００μｌ　中）を適用した。１ｍ／ｌの 血液は平均で１×１０６個の単核細胞を含んでいるから、１ｃＴｎ２の抗体マ） ・リツクスの試験について数ｍ／！の血液で十分である。

抗体マ）　ｌ）マウスはごく少量の試剤しか必要としムい。抗体をほとんどの抗 体に最適な１０μｇ７ｍｌ：　の濃度で塗布する場合、１１１１９の抗体で直径 ０５闘の抗体ドツトＴｈ２００．０００個作ることができる（第３表）。

ドツトの大きさく直径）　１ｍｍ　０．５ｍｍ　０．２５ｍｍ抗体溶液の大体の 容量　０．５ｆ’ｅ　０．０５１’１４　０．００５ｍ６１ｍ９の抗体で塗布で きるドツトのｉ”’　２０，０００　２００．０００　２，０００．０００１− 一−―−−一＋□□−□□−□−□←−−□□−□□※　抗体濃度は１０μｇＸ ”である。

抗体マｌ−ＩＪソクス中の特異抗体に対する細胞のパインデング蛋白質の固体表 面に対するパインディングは溶液中の蛋白質濃度ばかりでなく、その割合にも左 右されるので、特異抗体はそれ全十分満足できるように塗布するにはかな９ｃ厚 でなければならない。そのような抗体は今だ多くは得られていない。不研究はマ ウスのＴ細胞の表面分化抗原Ｌｙｔ−２のアロタイプと反応する抗体を用いて抗 体マトリックスにおける抗体ドツトに対する細胞バインデングの特異性を調べる ものである。抗−Ｌｙｔ２，１及びＬｙｔ２．２モノクローナル抗体が開発され ているが、その抗体のアイソタイプは特異抗体生成性ノ・イブリドーマを有して いる腹水症のマウスから容易に単離することができる。

５ 第３ａ図は２種の抗（＊全交互に塗布して５×５７）　ｌ）マウスを形成する方 法を概略図示するものである。マ）　ｌ）マウスの大きさは（０，５ｃｍ）２で 、ドツトの太きさは直径０．５　ｍｍである。

ＡＫＲ（Ｌｙｔ　２．１　”　）、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｌｙｔ　２．２＋）　及び（ ＡＫＲｘＢＡ、ＬＢ／ｃ）ｌｊ’　１　（Ｌｙｔ　２．１　及び２２　）の胸腺 細胞をカバーガラス上の」−記載体マトリックスに適用した。第３ｂ図、第３Ｃ 図及び第３ｄ図は、ＡＫＲ細胞は抗−Ｌｙｚ２．１スポツトだけに、ＢＡＬＢ／ ｃ細胞は抗−Ｌｙｔ、２．２スポツトだけに結合し、それらのＦｌ細胞は」二記 両スポットに結合することを示している。このパインデ／グは非常に特異的であ る。第３図に示される５×５７）　ｌ）マウスを用いる単一細胞バインデング検 定においては、抗−Ｌｙｔ２．１による試験は１３回、また抗−Ｌｙも２．２に よる試験は１２回そｉＬぞれ繰り返して行った。

本発明は、臨床検査室、ちるいは研究室において多数の抗原を測定する必要のあ る試験または方法を行うのに利用されよう。

一般に、免疫検定器具の製造、すなわちガラスカバー片まだは他のタイプの支持 体に多数の抗体を塗布する必要のちる工程は、これらの実験室において通常行な われることではない。本発明が広く使用されるためには、これらの器具を使用者 達に市販でさなくてはならない。これらの器具を大量生産するために、機械的塗 布器具を開発し抗体を塗布することができた。上述の如く、塗布器具（アプリケ ーター）は抗体を塗布するスポットの位置を正確に定めることができ、又、均一 な形（好１しくけ円（Ｕ）及び実質的に同じサイズのスポットを形成できなけれ ばならない。

抗体を塗布したスポットに結合する細胞の結果を分析するために、各抗体塗布ス ポットへの細胞結合物を測定しデータ全処理する自動的分析機器が高度に望まれ る。

当業者は通常の実験の範囲でも−Ｌ述の本発明の特定置体例に対する多くの均等 物を確認あるいは特定できよう。そのような均等物も下記請求の範囲に包含され るものと考えられる。

浄書（内容Ｇこ変更なし） ○・０・○ ＦｉｇＪＡ 手続補正書（方式） １．事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８４１００１５０□　−− ６、補正をする者 事件との関係　出　願　人 名称　セントコ−・インコーポレーテノト５、補市命令の１−１付　昭和６０年 　２月　５日（発送［ヨ）６、補正の対象 国際副食報告　−−一一一−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、小さな、独立の、間隔が近接した抗体塗布区域をその表面に配列してなる支 持体からなる免疫検定器具。 ２、上記抗体塗布区域のすべてが実質的に同じサイズと形を有する請求の範囲第 １項記載の免疫検定器具。 ３　上記小さな別々の抗体塗布表面区域の抗体全上記表面に均−且つ濃厚に吸着 して、該吸着された抗体が結合している細胞相持表面抗原が充分々濃度の上記抗 体塗布区域と接触した場合該細胞が上記抗体塗布区域と緊密に接着して顕微鏡的 に均一な結合した細胞の層を抗体塗布区域全面をおおって形成するようにした請 求の範囲第１項記載の免疫検定器具。 ４　上記抗体塗布区域の抗体が上記支持体の表面に共有結合している請求の範囲 第１項の免疫検定器具。 ５、各抗体塗布表面区域あるいは抗体塗布表面区域の同一とみなされるセットの 抗体が異なる別個の特異性を有する抗体である請求の範囲第１項記載の免疫検定 器具。 ６、上記抗体塗布区域の抗体が高度に精製された７Ｆリクロ一ナル抗１本である 請求の範囲第１項記載の免疫検定器具。 ７、上記抗体塗布区域の抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載 の免疫検定器具。 ８　支持体がガラスまたはプラスチックのカバー片である請求の範囲第１項記載 の免疫検定器具。 ９　上記抗体塗布区域の配列が長方形のマトリックスである請求の範囲第１項記 載の免疫検定器具。 １０、１記載体塗布表面区域が直径約０．２５ｍｍないし１．　Ｏｍｍ０点であ る請求の範囲第１項記載の免疫検定器具。 １１、支持体の表面上の抗体塗布点が５〜１０個の点×５〜ｌｏ個の点の長方形 のマトリックスとして配置されている請求の範囲第１項記載の免疫検定器具。 １２、方形の全マトリックスが、支持体表面の約０．５〜１．　Ｏｒｘ　２の領 域内に含まれている、前記請求の範囲第１０項に記載の免疫測定装置。 １３、ドツトは０．５　ｍｍの直径をもち、５×５ドツト方形マトリツクスによ りコンパクト５ドツトの形状に整えられた、小さい、分離した、抗−Ｌｙｔ２． １および抗−Ｌｙｔ２．２抗体塗布ドツト全表面に有するカバーグラスからなる 胸腺細胞表面上のＬｙｔ２分化抗原のアロタイゾを測定するに有用な免疫測定装 置。 ］、４．ａ−）　支持体表面に区別できる特異性抗体の実質的に富む水溶液の小 滴を施用し、該小滴が支持体表面の小さい、分離した、近接した間隔の領域をカ バーしかつ配列を形成するように該小滴を位置させ； ｂ）　支持体表面の該領域に溶液中の抗体が吸着され、抗体塗布領域を形成させ るに充分な時間、抗体の水溶液を該領域に残存させ； Ｃ）　種々の抗体溶液中の未吸着抗１に希釈するためかつ抗体塗布領域を取シ囲 む該固体支持体表面の非特定結合場所を封鎖するために、たん白質水溶液に該固 体支持体の全表面を直ちに浸し； ｄ）　該装置を洗浄、乾燥する； 各工程から成る免疫測定装置の製造方法。 １９ １５、工程ａにおいて該小さい、分離した領域に対し付ける該抗体溶液が、大き さおよび形状において実質的に同じである前記請求の範囲第１４項に記載の免疫 測定装置の製造方法。 １６、工程ａにおいて、該抗体水溶液中の抗体濃度が約１０μｇ／ｍｅである前 記請求の範囲第１４項に記載の方法。 １７、工程ａにおいて、各抗体溶液を約０００５μ６−０．５μｅの容積の小液 滴の形状で該固体支持体表面に施用する前記請求の範囲第１４項に記載の方法。 】８．該抗体溶液を施用する該支持本表向の小さい、分離した領域が約０．２５ 　ｍｍ〜１．０　ｍｍの直径を有するビットである前記請求の範囲第１４項に記 載の方法。 １９、該１・゛ットが固体支持内の表面上に位置させて、方形のマトリックスを 形成する前記請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２０、　ａ　）　支持体の表面に細胞の懸濁液を・施用し、該支持体は表面に小 さい、分離した、抗体塗布スΣビットヲ有し、各スポットまたはス；ドツトの成 るセットの各々は異なったかつ明白な特異性の抗体で塗布されている； ｂ）　該細胞が抗体塗布スポットの全てと接触させるように、支持体表面上に該 細胞を定着させ； Ｃ）　抗体塗布スポットにおいて、該細胞を該抗体と反応させ； ｄ）　非付着細胞金除去し； ｅ）　どの抗体塗布スポットに該細胞が付着したか全決定する； 各工程から成る、細胞の表面上の特殊な抗原の存在を決定する方法。 ２１、胸腺細胞表面上のＬｙｔ２分化抗原のアロタイゾ　全決定する方法におい て、 ａ）　ガラス製カバースリップの表面に胸腺の懸濁液全施用し、該ガラス製カバ ースリットはその表面に５×５個の１・゛ソトによる方形マトリックスの形に配 列された小さい、独立した抗Ｌｙｔ２．１−および抗Ｌｙｔ２．２−抗（４）塗 布ドツト全持ち、それによって懸濁液が抗体塗布スポットの方形７トリンクス全 体全カバーし； ｂ）　胸腺全豹３０分間ガラス製カバースリットの表面トに沈降させ； ｃ）　リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、ツノバースリソシン：攪利することによシ 非吸着胸腺細胞全除去し；（１）　螢光インチオンアネートで吸着細胞を染色し ；ｅ）　細胞が抗Ｌｙ−シ２．１抗体塗布ス・↑−°ノ１斗たは抗Ｌｙｔ２．２ 抗体塗布ス丹２ットに結合したか否かを、抗体塗布ス・１！ソトのマトリックス を目で観察することにより決定する；各工程から成る方法。 ２２、液中の抗原の存在を決定する方法において、ａ）　支持体の表面に抗原を 含有する液体のサンゾルを施用し、該支持体が、その表向に小さい、独立した抗 体塗布スポットの配列を持ち、各スポットは異なる区別できる特異性を持つ抗体 で塗布されており、それによって抗原含有ｒＬを全ての抗体塗布スポットに接触 させ； ｂ）　抗体塗布スポット中で抗原を抗体と反応させ：１ Ｃ）　検定器Ａ’を洗浄して全ての非結合抗原全除去し；ｄ）　どの抗体−塗面 スポットに抗原が結合しているかを決定する； 各工程から成る方法。 ２３、混合された細胞中での特異表面分化抗原を持つ細胞の割合を決定する方法 において、 ａ）　支持体表面に細胞懸濁液全施用し、該支持体は、その表面に、異なる、区 別できる特異性を持つ抗体を塗布した小さい、独立した抗体塗布スポットの配列 を持ち；ｂ）　細胞を支持体表面」二に沈澱させて細胞を全ての抗体塗布スポ゛ ソトと接触させ； Ｃ）　抗体塗布ス４リド中の抗体と細胞とを反応させ；ｃｌ）　非吸着細胞全除 去し； ｅ）　抗体塗布ス４リドに結合した細胞を定量し；ｒ）　細胞の相対割合’ｃ　 Ｆ算する；各工程から成る方法。 ２４、その表面に、小さく、独立し、間隔のせ捷い抗原塗布区域金持ち、各区域 が異なる抗原により塗布されている免疫検定器具。 ２＆　液中の抗体の抗原特異性を決定する方法において、ａ）　支持体の表面に 抗体含有液体のサンプルを施用し、該支持体は、各ス、ｉソソトが異なる抗原で 塗布されている小さく、独立した抗原塗布スポットの配列をその表面に有し、そ れによって抗体含有液体を全ての抗原塗布スポットと接触させ；ｂ）　抗本全、 抗原鹸布スポット中の抗原と反応させ：２ Ｃ）　検定器具を洗浄して全ての非結合抗原全除去し；ｄ）　どの抗原塗布スポ ットに抗体が結合さオｔているかを決定する； 各工程から成る方法。 浄傅（内容に変更なし） ■