JPS60500767A - 生特異的親和反応の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化　合　物 技術分野 本発明は化合物ンこ関する。、 背景技術 免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）は、種々の生物液体中の被検物質の量 が通常非常ｔこ少ないためｔこ、分析の感度が決定的ｔこ重要な分野である。そ のためｅこ放射性同位元素がその使用ｔこよる欠点ｅこもかかわらず免疫検定法 における標識として広く使用されてきた。しかしこれと同時ｔこ放射性同位元素 ｔこ代えてこれと少なくとも同等またはそれ以上の感度を有する標識を見出すた めｔこ極めて熱心な研究も行なわれてきた。

放射性同位元素の最も可能性のある代替物質の一つとして螢光分子が提示されて いる。現在知られている螢光免疫分析法について、優れた概観を与える包括的な 調査が最近公表された（参照：　Ｓｍ１ｔｈほか（１９８１）　Ａｎｎ、　Ｃ］ 、ｉｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８，２５３−２７４．　Ｕｌｌｍａｎ　（１９８１）　「螢 光イ１−／アッセイ技術１こおける最近の進歩」）。

免疫検定法ｅこおける螢光標識の感度は、理論的ｅこは非常に高いという事実ｔ こもかかわらず、高いバックグラウンド螢光によって非常をこ制限されている。

通常、バックグラウンド螢光を減少させて所望の感度を得ることは可能である。

上述の調査も、放射性同位元素によって得ることができる感度に対応する高い感 度を必要とする物質の免疫検定ｔこおいて従来の螢光標識の使用を困難ｅこして いる種々の制限について記述している。

しかし、時間分割螢光法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏ］、ｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｎｃｅ　）（参照：　５ｏｉｎｉほか（１９７９）　Ｃ１，ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、 　２５．３５３−３６１．　）の使用により、標識の特定螢光を不特定な妨害バ ックグラウンド螢光から分離することができる。生竹異的親和反応をこ関連する 時間分割螢光法の使用原理は、米国特許第４，３７４，１２０号および欧州特許 願第８２８５００７’７．７号に開示されている。時間分割螢光法においては、 螢光標識は短い継続時間の光パルスで励起され、その螢光は励起パルスから一定 の時間が経過するまでは検出されない。

励起と検出の間（こ経過する時間め間ｔこいがなる妨害源からの螢光も減衰して しまうのて、時間分割螢光に使用可能な標識からの信号のみが検出される。

この種の標識は可及的に強い螢光と、比較的長い発光波長と、大きいストークス シフトと、標識を抗原、・・ブテン（ｈａｐｔｅｎ　）　、抗体、核酸、ポリヌ クレＡチｌ（こ共有結合させることができる化学構造とを有していなければなら ない。上述の要件を満足させる一つの螢光標識（米国特許第４，３７４，１．２ ０号）はランクニド（１，ａｎｔｈａｎｉｄｅ　）と芳香族β−ジケトンとによ って形成されたランクニドキレートからなり、このランタニドはＥＤＴＡ類似体 を介して抗原、ハプテン、抗体、核酸またはポリヌクレオチドと結合して螢光ラ ンタニド複合体が形成される。

この標識の螢光減衰時間は長く５０〜１０００μｓｅｃであり時間分割検出原理 に極めて適している。標識からの螢光は、この標識が抗原、ハプテン、抗体、核 酸またはポリヌクレオチドと結合したときに測定することができる。

あるいはまた適当ｔこ選定された条件下てランタニドとＥＤＴＡ類似体との間の 結合を断つことｅこよってランタニドを上述の物質から分離することができ、螢 光はランタニドとともにランタニドｔこ特有の螢光をもっミセル糸を形成する芳 香族β−ジケトン、相乗的化合物（ｓｙｎｅｒｇｉ　ｓｔｊ、ｃｃｏｍｐｏｕｎ ｄ　）および界面活性剤の存在下て溶液中に生じる（欧州特許願第８２５００７ ７．７号）。

生竹異的親和反応の標識としてランクニドを用いる場合ｅこ、原則として二つの 機能を識別することができる。

生竹異的親和反応？こおいて標識として使用てきるためｔこ、一方うンク二ドは 螢光キレ−１−を形成しなければならず、他方、ランクニドは抗原、ハプテン、 抗体、核酸またはポリヌクレオチドである生物有機分子と結合しなければならな い。

螢光ランタニドキレートを形成するための必要条件は欧州特許願第８３８５０２ ４４．１号ｅこ開示されている。ランクニドの生物有機分子への特定の制御され た結合は、多くの溶液が試験されているけれども、困難である″ことが判明して いる。このような結合においては、ランクニ１、が非常ｅこ高い親和力で生物有 機分子と結合すること、およびこの結合が動的（こ安定していることか望ましい 。生物有機分子と共有結合するとともｅこ、ランタニｌとキレート結合するコ次 配位子は励起エネルギーを吸収することができ、このエネルギーが欧州特許願第 ８３８５０２４４゜１号１こ述べられた原理ｅこ基づいてランタニドｅこ伝達さ れる。あるいは１次配位子は単にランクニドの生物有機分子への結合のための中 間体として作用する。前述のＥＤＴＡ類似体（米国特許第４，３７４．．１２０ 号）は後者の原理（こ従う。アミノフェニル−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　−Ｅｕ　は例 えばジアゾ化され、その後タンパク質中のチロシンまたはヒスデシン残基と結合 することができる。しかし、合成されたり７パク質−ＥＤＴＡ　−Ｅｌｌ複合体 は励起されると、長い持続時間の非常に低いランクニド螢光を発生ずる。これは １次配位子が必要な励起エネルギーを吸１５！せずう７タニト？こ伝達しないか らである。これにもかかわらず、この配位子は米国特許第４，３７４，１２０号 および欧州特許願第８２８５００７７．７号に記載された原理ｅこ基づいて生竹 異的親和反応ｅこおいて優れた機能を発揮する。

エチレンジアミン四酢酸（Ｅｒ　Ｄ　’１１’　Ａ、　）はよく知られた一般に 使用されている化合物であり、適当な条件下で多くの金属イオンと安定したキレ ートを形成する（＃照Ｒｉｎｇｂｏｍ　（１９６４）　Ｋｏｍｐｌ、ｅｋｓｏ、 ｍｅｔｒｊ、ｓｋ　ａ、ｎａｌｙｓ　）　ｏこの分子のキレート形成特性は、生 特異親和反応１・こ使用するために例えばランクニドを生物有機分子と結合させ るのに使用することができる。但し、この配位子の生物有機分子への共有結合が 行なわれうることが必要である。こ（５） れは例えばＥＤＴＡ二無水物（ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ　）を合成することによ ってなされ、この物質は適当な生物有機分子と結合され、第４カルボキシル基が 共役結合ｅご用いられるとき生物分子のジアミン）　ＩＪ酢酸誘導体が得られる （参照：　Ｗｉｅｄｅｒ他、米国特許第４，３５３，７５１号）。さら（こ、Ｅ ＤＴＡ構造を生物有機分子と結合させるのｔこ使用することができるアミノフェ ニル−ＥＤＴＡ誘導体を合成することができる（参照：　Ｓｕｎｄｂｅｒｇ他、 米国特許第３．９９４，９６６号）。

しかし、金属イオンと安定したキレートを形成するＥＤ　Ｔ　Ａ以外の化合物も ある（参照　Ｒｉｎｇｂｏｍ　（１９６４）Ｋｏｍｐｌｅｋｓｏｍｅｔｒｊｓｋ 　ａｒ＋ａｌｙｓ　）　ｏこのような化合物のうちの一つとして例えばジエチレ ントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ　）が腎臓機能の検査ｔこ関して放射性同位 元素と結合するの（・こ使用された（参ｆＩＡ：　Ｋｌｏｐｐｅｒ他　（］、９ ７２）Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、、　１３．１０７−１１０）　。ＤＴＰＡはまた 、その分子の環式無水物を用いることｅこよってタンパク質ｔこ結合された。こ の場合四つ、のカルボキシル基がキレート結合のためｅこ残存する（参照　Ｈｎ ａ　ｔｏｗｉ　ｃｈ他（１９８２）　Ｉｎｔ、Ｊ。

Ａｐｐｉ、　Ｒａｄｉ、ａｔ、　ｌ５ｏｔ、３３．３２７−３３２　）。

発明の開示 本発明の目的は１．ａ、ランタニドと強力にキレート結合するとともに、金属キ レートを生物有機分子例えばハフ。

テン、抗原、核酸または抗体ｔこ結合させることができる活性官能基からなるキ レート化化合物を提供することである。本発明の特徴は本明細書に添付された請 求の範囲から明らかである。

図面の簡単な説明 図面は七つの異なる濃度ｔこ対する二つの標準（ｃｌｕｐｌｊ、ｃａｔｅｓｔａ ｎｄａｒｄｓ　）による典型的なＡＦＰ定量結果を示す。

詳細な説明 本発明による化合物は次の基本構造から出発して誘導することができる。

ＯＨ２ Ｒはアルキレン基からなる２〜８原子長さの共有結合ブリッジ（ｃｏｖａｌｅｎ ｔ　ｂｒｉｄｇｅ　）であり、Ｙはカルボン酸またはホスホン酸がらなりその数 はｎとｍ（こよって変わり、 Ｘは活性官能基で、生物有機分子への結合を許容し、例えばＮＨ２、ＯＨ、’Ｃ ０ＯＨまたはＮＣ８基からなる芳香族リングからなり、 ｎとｍは○または１であり、 Ｘは分子中のＹ官能基の一つと置換することができる。

このキレート化化合物は次の方法で合成することができる。

２、Ｏｆのジエチレントリアミンを２５ｍｌのトルエンンこ溶解させ、２５ｇ／ のトルエンｅこ溶解させた１、Ｏｆの４−二トロペンジルプロミドを添加する。

この反応混合物を室温で３時間攪拌する。沈澱物をろ過してトルエン相を水で抽 出する。水相をクロロポルムで抽出しこれを蒸発乾燥する。最終生成物は黄色の シロップ状である（０，８５ｆ、収率７７％）。

ＴＬＣニジリカゲル；アンモニア　エタノール　ｌ°４；Ｒｆｊ！Ｎ’化合物１ コ対して０．３８およびＮ２化合物ｔこ対して０．２９゜ ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１５）　：δ＝　７．８　＜ｑ　、　ｕｑ　、　Ｎａ２％ 　）　、　■・、ｒ２ニ対し。

て３．７およびＮｌ化合物をこ対して３，９８Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２−）　１．６ （Ｓ、　２Ｈ−ＮＨ−＆　−ＮＨ２）。

ＵＶ（Ｎ２０）　λｍａｘ　＝　２７３　ｎｍ　０工程２゜ Ｎｌ−オ、Ｊ：　ヒＮ２−　（４−ニトロベンジル）−ジエチレントリアミンの 混合物を水ｅこ溶解させる。この水溶液を７ＭＫＯＨ溶液でアルカリ性（ｐｌ＋ ９〜１１）となし、攪拌しっつ５０　’Ｃに加熱する。ブロム酢酸（２，５ｇ） の水溶液をゆっくり添加し、ＫＯＨ溶液溶液上りｐ［Ｉを９〜］ｌに維持する。

添加後も攪拌および加熱（５０℃）を少なくとも４時間継続し、ときどきＫＯＨ 溶液を添加してｐｌ＋を９と１１の間に維持する。反応混合液を酸性化（ｐ１１ 約コ）シ、冷却により生じる微量の沈澱物をろ別する。溶液を蒸発減量して塩を 沈澱させ、この沈澱をアセトンを添加することｅこより容易にする。溶液を蒸発 乾燥させて不純物を含む生成物を得る（　３．１１　、所望の化合物約５０％を 含む）。生成物を調製用液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ　ＰｒｅｐＰＡ Ｋ−５００／ＣＩａ　、　Ｎ２０　）で精製し、異なる異性体を別々に分離する 。

ＴＬＣニジリカゲル；アセトニトリル／水　４．：１ｉＲｆはＮ１化合物に対し てＯ，］　６およびＩＶ＋２化合物ｔこ対して０．３３゜ ”Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２０）δ＝５２４および５２６・（−四２ＣＨ２−）。

５７””−＝２ｃｏｅ＝＞　＝９−（Ｄ−ｉ、−＝−）。

１２６．９　、１３４．３　、１４１−．８および１５０．７（ｌ（２化合物ｔ こ対して） ＵＶ［Ｎ２０）　’λｍａｘ　＝　２６９　ｎｍＩＲ（ＫＢｒ）　：　νｍａｘ 　＝　１７４０　、　１５３０，１３５０α−１工程３・ 先の合成工程で得られた化合物２．Ｏｆを５０　ｍｌの水に溶解し、圧力反応容 器内の溶液Ｅこ０．２Ｆの活性炭上のパラジウム（５％）を添加する。圧力反応 器を。〜＋５’Ｃｔこ冷却し、窒素ガスと水素ガスで洗浄する。還元が約］、　 ＭＰａ（大気圧以上の圧力）０〜＋５℃で行なわれる。この反応（９） ｔこ続いて薄層板（アセトニトリル／水　４：１）を用い液体クロマトグラフィ ー（ａｐｔ、ｃ　）　またはＵＶ−分光測光を行なう。最終生成物は１７１　、 収率８９％。

ＴＬＣニジリカゲル；アセトニトリル／水　４：１ｉＲ４はＢｕ’＋キレートと してのＮ１化合物に対して０．２５　、　Ｎ２化合物ｔこ対して０，３０゜１５ Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２０）　δ＝　１５０．９　、１４０．９　、１２１．７お、Ｊ ：　ヒ１２０．０合物に対して） ＵＶ（Ｎ２０）　；λｍａＸ　＝　２８４および２３８　ｒｒｍ　（〜１　：　 ８　）ＩＲ（ＫＢｒ）　：　ｖｍａｘ　＝　１５８０〜１６４０．１４００　ａ ｘ　’工程４： Ｎ２−（４−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン−１、Ｎ’、　Ｎ３．　 Ｎ３−テトラ酢酸２，３ｆを約１５宵ｌの水ｔ−溶解すｅ　、この溶液をチオホ スゲン１．７Ｆ、りｏｏホルム１５１１および炭酸水素す）ＩＪウム１ｆを含む 混合試薬に添加する。この反応混合物を室温で約２０分強力に攪拌する。諸相が 分離され、水相をクロロホルム（３×５ｇ？）で洗浄し、これを蒸発乾燥させ、 得られた生成物をエタノールで洗浄する。最終生成物２．２ｇ・、収率８３％。

ＴＬＣニジリカゲル；アセトニトリル／水　４：１；Ｎ’Ｎ　化合物に対するＲ ｆＯ，’４５゜ ＵＶ（Ｎ２０）　：λｍａｘ＝２６８Ｘ２８０ｎｍ　（〜１　：　１）ＩＲ（Ｋ Ｂｒ）　：　ｖｍａｘ　＝　２０００〜２２００１−１反応式 （異性体はＨＰＬＯで分離される。） 対応するアミノ誘導体 対応するインチオシアナト誘導体 既述の他の化合物は対応するポリアルキレン−ポリアミンから出発して対応する 方法で合成できる。カルボキシル基はホヌホン酸で代えることもできる（　Ｋ、 ＭＯＥＤＲＩＴＺＥＲ−Ｒ，Ｒ，ＩＲＡＮＩ、　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　 ３１．１６０３　（１９６６）　）。

以Ｖｔこ本発明の適用性を限定されない実施例ｅこよって説明する。

例１．アルファフェトプロティン（ＡＦＰ　）の測定。

キレート化化合物Ｎ２　＜　ｐ−インチオシアナトベンジル）−ジエチレントリ アミン−Ｎｌ、　Ｎ’、　Ｎ５．　Ｎ’−テトラ酢酸（ｐ　−ＩＴＣ−Ｂ　−Ｄ ＴＴＡ　）　をユーロピウムとキレート結合するのｅこ使用し、このユーロピウ ムキレートを単クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　）抗ＡＦＰ抗体ｔこ結合す る。このユーロピウムで標識された抗体をＡＦＰの免疫検定ｔこ使用した。

抗体のユーロピウムによる標識 ｐ−ＩＴＣ−Ｂ−ＤＴＴＡ−Ｅｕを抗ＡＦＰ溶液（２００μ１ＶＰＢＳ中０２ｗ ）　ｔこ０℃で添加し、この溶液のｐ■を１　ｋＡ　Ｎａ２ＣＯ３］、ＯＡ（！ １こよって９．５ｅこ調整した。キレートと抗体間のモル比は６０：］であった 。この反応混合物を一晩恒温保持し、抗体抱合体（ａｎｔｉ、ｂｏｄｙ　ｃｏｎ ｊｕｇａｔｅ　）をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ−５０カラム（ Ｐｈａｒｍａｃｊ、ａ　）　ｆこおけるゲルろ過によって遊離未反応標識から分 離した。共役結合の度合はユーロピウム螢光を測定することｅこよって決定した が、それは約７　Ｅｕ、／ＩｇＧであることが判明した。

免疫検定 ５０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４と９　ｆ／ｅ　ＮａＣ１中ｔこ抗ＡＦＰ１μｐを含む溶 液２５０ａｅでポリスチレン管を室温で一晩処理することにより抗ＡＦＰで被覆 した。この管の表面を１リス−ＨＣｌ、！！ｌ！ｉｉ液１）１１７．”７０中に ＢＳＡ　Ｏ，５％を含む溶液２５０μｌで飽和させた（室温にて２時間）。この 管を洗浄した後、免疫検定に用いた。

この被覆された管に、０９％ＮａＣ１、０，０５％　ＮａＮ　５．０．５％ＢＳ Ａ　、０．０５％牛ガンマグロブリン、０．０１％トウイー　ン（Ｔｗｅｅｎ　 ）　−４０、および２０μＭ　ＤＴＰＡを含む２２５μｌのトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ′７．７１こユーロピウムで標識された抗ＡＦＰ　５０　ｎＪを添加したも のととも（こ２５μｅの血清サンプルまたは対応する標準液を入れて一晩恒温保 持した。恒温保持後、管を０．０．５％ＮａＮ３　を含む生理的塩化ナトリウム 溶液２　ｍｌで３回吸い出し洗浄した。

時間分割螢光（こよるユーロピウムーの定量免疫分析においてキレ−１−と標識 付き抗体とを介して管の表面ｅこ付着されたユーロピウムの量を０．５ｍｌの増 強溶液（フタレート−アセテート−緩衝液ｐＨ３，２中１．５μＭβ−ナフトイ ルトリフルオロアセトン クチルポスフインオキシド、０．１％　トライ１ン（’ｐｒｉ．ｔｏｎ）Ｘ　− 　］、００　）を加えて測定した。この溶液はキレートからユーロピウムを分離 し、新しい螢光キレ−１がミセル相中ｔこ形成され、その量は得られた時間分割 螢光信号と分離したユーロピウムの量とｅこ比例する。

結果 二重の標準液を用い７種の異なる濃度ｅこよる典型的なＡＦＰ測定結果を表１と 添付図ｅこ示す。

Ｌｎｍｎｍｌｌｏｎｓｌ＾ｐｐＩ＋ｅｍｕｏｎＮｏ、ＰＣＴ／５Ｅ８４’１００ ０８９１″童ｓ＋ｎＮ１ａｎｓｌＡｐｐｌｉｃ＋＋ｊｌｏｎＮｏＰＣＴ／ＳＥ８ ４１０００ｇ９第１頁の続き ０発　明　者　ムカラ、ヴエーリーマテイ９発明者　ヘミレ、イルカ フィンランド国、ニスエフ−２０７４０トウルク７４　ヤ−４−７”。

り、７　ニー　１６ フインランド国、ニスエフ−２０６１０）ウルツ　６１　パルヤス−６ニー　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １次の構造を有する化合物 Ｈ２ Ｈ２ ！ ここｅこ、Ｒは２〜８個の炭素原子からなる直鎖または分校アルキレン基であり 、 ｎおよびｍはＯまたは１てあり、 Ｙはカルボン酸またはホスホン酸であり、そしてχは生物有機分子との共有結合 を許容する活性官能基である。 ２活性官能基が２〜８個の炭素原子を有するアルキレノ基、またはＮＨ２−、Ｈ Ｏ−１−ＣＯＯＨ１イソチオシアネートもしくはイソシアネート基を置換基とし て有するフェニル環もしくは芳香族複素環からなる請求の範囲１１こよる化合物 。 ３、Ｘが分子中のＹ官能基の一つと位置を換えることかできる請求の範囲ｌによ る化合物。 ４、　Ｒがエチレン基であり、ｎ＝ｍ−○てあり、Ｙがカルボン酸であり、モし てＸがｐ−アミノフェニルまたはｐ−イソチオシアナト−フェニル基である請求 の範囲Ｌｔこよる化合物。