JPS60500973A - 非特異性の蛋白質結合を阻止するよう処理した不溶性物質 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 、１１特異性の蛋白質結合を阻止する−よう処理した不溶性物質 技術分野 本発明は診断試験、酵素処理、アフィニティ精製等用の固体担体に伺酒した生物 学的又は免疫学的物質に関するものである。

背景技術 固体担体に伺着した可溶性生物学的物質は診断試験、酵素処理およびアフィニテ ィ粘製に多く使用されている。たとえば、抗体又は抗原を固体担体へ封着するこ とにより、その免疫学的パートナ−を多くの物質の４Ｎ、合物から容易に除去す ることができる。同様に、酵素を固体担体に４１着すると、これを反応混合物か ら容易に除去するか、または連続流動処理に用いることができる。異種放射免疫 検定および酵素免疫検定は１種又はそれ以」二の反応体を固相に付着して遊離の 反応体から分離し得ることに依存する。凝集検定（流体中の抗原又は抗体の存在 を決定するため）は免疫学的錯体を一層容易に可視し得るため指示薬又は担体粒 子（適切な免−疫学的材料を運ぶ）を利用する。細胞、細胞構成要素および細菌 の分離および固定は固体に結合した抗体又は抗原により助成される。生物学的粒 子は、たとえば適当な抗体および抗原で被覆された固体に特異的に封着するので 、他の米１″Ｉ子からの分画を行うことができる。生物学的粒子の固定１」適当 な抗体又は抗原で被覆された小粒子の特異的封着により行うことができる。これ ら小粕イはその存在を−・層容易に検出し得る物質、たと人ば波光染料、放用性 トレーナ−又は電子濃密物質を含有することかできる。

上述した如き同体担体を用いる際の主なる２イΦの困難さは、可溶性生物学的物 質を確実に伺！１することと、不所望な物質の担体への非猫異的固Ａを防１１′ することである。これら問題の小太さは、検定時の過剰に高い背景および低感度 と、アフィニティ精製および酵素処理における材料損失およυ低い純度を包含す る。

これらの第１の問題に対する解決が蛋白質類およびペプチド類の重合体固体への 共役結合によりなされている。たとえば、米国特語第３，８４５，８５２−号に は、ハロゲン化シアンを用いて水不溶性重合体を活性化し、次いで水溶性蛋白質 に結合する方法が記載されている。

米国特許第３，８５７．！１３１号によれば、水溶性力ルホジイミド類は蛋白質 を爪合体担体粒イに結合するだめの凝縮剤として用いることができる。米国特許 第４，００１．．５８３ ３号に記載されているように、生物学的物質を表面がグルタルアルデヒドで被渡 されたプラスチック材料に共有結合させることができる。米国特許第４，０４８ ，７２３号には蛋白質類を表面にカルボン酸アミド基を有するラテックスに結合 するだめの３段階法が披　されている。蛋白質又はペプチドポリスチレンラテッ クス化合物の製造方法が米国特許第４，１１８，３４９号に記載されており、こ の場合その結合が芳香族ジアゾニウム化合物により行われている。二官能アルデ ヒドとの反応に続くカルボジイミドで媒介されたジアミンとの反応を経て免疫学 的物質をラテックス重合体に結合する２段階法が米国特許第４，１４０．ｅｆｉ ２号に披　されている。生物学的物質を重合体材料へ結合するのに既知の上述し た方法並びに他の方法（たとえばキエファー著”Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｈａｐｔｅｎｓ、　Ａｎｄ　５ｏ ｌｉｄＳｕｐｐｏｒｔｓ　”　、免疫学的方法、アカデミツクプレス、１８７８ 、第１３７〜１５０頁参照）は通常共有結合法以前に使用されていた疎水性結合 よりも一層確実性のあるものであることは疑う余地もない。しかし、これら方法 は非特異性固着の問題を解消せず、時には悪くする。

米国特許第４，２８４，７８６号には、水溶性ポリヒドロキシ化合物、好ましく はアミノ多糖類をラテックス担体、好ましくはカルボキシル化重合体に水溶性カ ルボジイミド、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−特表昭ＧＯ−５００９７ ：（（５） フェニル−インキサゾリウム−３′−スルホネート）又は水溶性クロロホルミエ ートを介して共有結合することにより上述した問題の幾つかを解決する発明が記 載されている。ラテン１、クス担体と結合しないアミノ多糖類の７ミノ基をヒド ロキシル基に転化する。次いで、多糖類を過ヨウ素酸塩で活性化してグルコース 環の幾つかをジアルデヒド類に酸化する。然る後、免疫学的に活性な材料をこの 活性化した多糖類と反応させる。免疫学的に活性な材料との反応はジアルデヒド 類の形成後短時間内で行う必要がある。その理由は、ジアルデヒド含有多糖類が 比較的速い劣化を受けるからである。すなわち、予じめ活性化したラテックス− 多糖類粒子は容易に貯蔵することがでさず、また任意所望の免疫学的に活性な材 料を付着し得る最終使用者まで船積みすることができない。さらに、免疫学的に 活性な材料のアミン基とジアルデヒド類との反応により生じたシック塩基は硼水 素化ナトリウムにより安定化する必要がある。これは、過剰の免疫学的に活性な 材料の除去後変性を最小に保持するため０℃で行う必要がある。

米国特許第４，２８４，７８８号におけるラテックス粒子は、ラテックス表面上 のカルボキシル基に結合するアミノ多糖類で完全に覆われた表面を有する。これ は付着した免疫学的に活性な材料に対するパートナ−である蛋白質以外の溶液中 の蛋白質がラテックス粒子に付着するのを防止する。この方法の問題は、ジアル デヒドの形成、ジアルデヒドとの反応およびシッフ塩基の還元が熟練と注意を要 する反応であり、著しく多くの費用と時間を要することにある。

発明の開示 本発明の一例によれば、蛋白質が他の蛋白質類を同伴する場合に生物学的物質に 対する特異的結合パートナ−となる特異的結合蛋白質に特異的に結合するのに有 用な組成物が記載されている。この組成物は特異的結合蛋白質および他の蛋白質 類を同伴する能力の表面を有する水不溶性支持体を含有する。また、」二記組成 物は第１および第２の実質表面部分から主としてなる支持体表面のうち第１実質 部分に蛋白質が結合するのをほとんど防止するに十分に第１実質部分を覆うが第 ２実質部分を覆わない多糖類コーティングを含有する。

本発明の他の例によれば、前述した組成物がさらに第２実質表面部分に付着した 生物学的物質を含有する。

さらに本発明の他の例によれば、蛋白質が他の蛋白質類を同伴する場合に生物学 的物質に対する特異的結合パートナ−となる特異的結合蛋白質に特異的に結合す るための固体支持体の水不溶性表面を形成する方法を提供する。この方法は、特 異的結合蛋白質並びに他の蛋白質類を同伴し得る水不溶性表面で、第１の実質表 面部分と第２の実質表面部分とから主としてなり多糖類コーティングで第１実質 部分が覆われ第２実質部分が覆われてないところの表面を有する固体支持体を用 意することにある。

本発明の更なる他の例によれば、第１の生物学的物質に対する特異的結合パート ナ−となる第１の結合部位を有する特異的結合蛋白質を他の蛋白質類を同伴して 含有する試料水溶液を増大した特異性および感度で検定する方法が記載されてい る。この方法は、試料水溶液を特異的結合蛋白質並びに他の蛋白質類を同伴し得 る第１の水不溶性表面で、多糖類コーティングにより遮蔽された第１の実質表面 部分と第１生物学的物質が付着した第２の実質表面部分とから主としてなる表面 を有する第１の固体支持体と接触させることにある。試料水溶液を第１固体支持 体から分離し、イ」着した第１生物学的物質に結合した特異的結合蛋白質の量を 検出する。

本発明の他の例は、第１の実質表面部分と第２の実質表面部分とから主としてな り生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる特異的結合蛋白質に結合す る能力を有する水不溶性表面に不所望な蛋白質類か刺着するのを減する方法であ る。この方法は、第１実質表面部分を多糖類コーティングで遮蔽し、生物学的７ 物質を第２実質表血部分に付Ａすることにある。

さらに、本発明の他の例は第１の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−と なる第１の結噴部位と、第２の生物学的物質に対する結合パートナ−となる第２ の結合）′ζ［☆とを潜在的に含有し特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴す る試料を増大した特異性および感摂で検定するためのキットを提供する。このキ ットは、特異的結合蛋白質と他の蛋白質類とを同伴することができ、遮蔽された 第１の実質表面部分と第１生物学的物質が付着した第２の実質表面部分とから主 としてなる第１の水不溶性表面を看する固体支持体を其える。このキ７１□はさ らに、特異的結合蛋白質と他の蛋白質類とを同伴することができ、多糖類コーテ ィングで遮蔽された第１の実質表面部分と第２牛物学的物質が伺着した第２の実 質表面部分とから主としてなる第２の不溶性表面をぞれぞれ有する複数の固体粒 子を含イーする。

本発明は、多糖類コーティングが蛋白質類を通常同伴し得る固体支持体の表面の 第１の部分を覆い、特異的な生物学的物質を該表面の残りに付盾５せた場合、生 物学的物質に対する特異的結合パートナ−でない蛋白質類は生物学的物質のみが イ」着した表面部分においてさえ支持体表面に伺着し得ないという発見に基つく ものである。本発明の部分的に被布された組成物（世その製造が比較的容易であ り、生物学的物知、の付着が全１Ｎ表昭ＧＯ−５００９７３（６） く容易である。一般に、これら組成物は説１．＜安価（こ製造することができる 。また、本発明のｍ代物は任だ。

所望の生物学的物質の付着用状Ｆ’Ｕ、て１１．ｉ″ｉ′蔵又は船楯みすること かできる。

未発明を実施するための最良の形０３、イト−白１ｅ↓か他の蛋白質類を同伴す る場合生物学的物質に対する特界的結合パートナ−となる特異的結合４丁白買に 対して特異的に結合させるに有用な組成物を１に供する。ここに゛′イ１６物学 的物質パと称するは特異的結合蛋白質に対する特異的結合パー　トナーとなる任 意の物質を示ずｊ−めに広く用いられている。この仕物学的物Ｖ１を例示すれは 、酵素類、抗体類、チロキシン結合グロブリンおよびアヒジンの如き天然受容体 類、ヘモグロビンの如きクロビン類、水晶体蛋白質類、表面抗原類、Ｎ［↓識迫 １合性抗原類等がある。特異的結合蛋白質は水不溶・−支持体と結合するのか望 ましい任が、の蛋白質とすることかできる。かかる物質の長大なリストか１でに 米国都い第４゜２Ｆ３４，７８８月に披〕歴されている。

本発明の組成物１−！　’ｌｊ　！’Ｉ！的結合イＦ白τり並ひに他１のイ１「 白質類を同伴し得る表面を崩する水不溶に↓支持体を含イ］する。この固体支持 体は微小又は巨大粒イ若しくは壁、平担板、ウェル等の如きし大拡張性表面の形 ｊル、とすることができ、いずれも蛋白質４１配合物の分離に用いることができ る。

本発明によれば、水不溶性支持体か相ダ９個の粒子形態である場合、これら粒子 は水性媒質中で安定に懸濁し得るよう水に近い比重を有するのが好ましい。がが る粒子は通常直径が約０．２　ミクロ７〜１勺１ｃｍである。

固体支持体自体は免疫学的診断試験に対して不活性である必要がある。多数の材 料を水不溶性支持体として用いることができる。特に興味あるものは米国特許第 ４．０４１３，７２３号、第４，１１８，３４９号、第４，１４０，６８２号お よび第４，２６４，７８６号に記載された如きラテックス類である。使用し得る カラス表面が米国特許第４．１１３９．１３８号に記載されている。他の有用な 重合体類が米国特許第３，６１９，３７１号、第３，７００，８０９号、第３． ８５３，９８７号、第４，１０８．！１１７２号および第４，２０１，７６３号 に披ミ歴されている。これら特許明細書の各々に、種々の生物学的物質、特に蛋 白質に結合するための広範囲の結合基が記述きれている。固体支持体がラテック スで、ポリヒドロキシ化合物と共侑結合を形成し得る活性基を看することか好適 である。従って、ラテックス支持体はカルボキシル基、アミノ基又はこれらに転 化し得る基の如き活＋１基を有することかできる。ラテックス支持体に対するイ １用な活性基は−ｃｏＯｕ、−Ｃｆ３Ｎｌ（２の如き活性水素含有基、第一級お よび第二級アミン基又は二トリルノｇである。米国ｖｆ詐第４，２８４．７Ｈ号 には、本発明に用いるに特に適した多数のラテックス材料が記載されている。本 発明を実施するに好適なラテックス材料はポリスチレンである。特に、アクリル 酸、メタクリル酸等の如きカルボキシル含イＪ化合物とｔ（Φ合したポリスチレ ンも包含される。

水溶性支持体表面の第１の〕ご質表面部分を１′分（コフル′覆して蛋白質が、 ｉゑ水不溶性支持体の第１実質表［１１１部分に結合するのを実質的に防什する ための多ａＩ！知コーティングを用斉、する。また、この多れ１１類コーテイン グは支持体の第２の実質表！ｆｌ！　’ｊ４１ｆ分を被覆しないことか要求され る。多糖類コーティングは晋辿水溶Ｐ１て、５．０００ダルトン以上、特に１０ ，０００タルＩ・ル以斗の几較的高分子昂を特徴とする多糖類から形成され、分 １′−硅が１，０００，０００タルドル又はぞれ以トとなる。多わ１１類＋−ｋ 　’ＩＩ”　）レコースおよびフラグ１−−−スの如さグルニ〕−ス（類）の重 合体又は共」１合体、ノイラミン酸類、ウロン酸類、グリコサミン類へ゛の如さ 炭水化合物類の＋Ｄ＋ｊ合物とすることができる。さらに、染料＋３”ｎはフロ ックλ゛１しくは交カー共重合体類の組合せ、又はその４１１類イータよひ縮合 モノマー類、特にエポキシド類との川合せとすることができる。特に興味ある多 糖類はデキストラン、フィニル（Ｆｉｃｏｌｌ、スクロースとエピクロルヒドリ ンどの合成共重合体、ノアーマシア　フィン　ゲきカルス社製の商品名）、アガ ロース又はヒアルロン酸′・１である。

多糖類の官能基に結合した約２〜・６個の）↓（し４原ｒを有するアルキレン知 鎖に通常結合するアミン基力」４に興味ある。ジアミン類と多糖類に存在するカ ルボキシル官能基との反応生成物が特に便利である。たとえばＪ、ｏｆ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇ！１，１１４．７０４〜７０９　（１９７５）を参照。

本発明によれば、前述した１、０００〜１，０００，０００又はそれ以」−の分 子量を普通有するフィコルの如き比較的高分子量のアミン多糖類を用いることが 特に好適である。約４ｏｏ、ｏｏｏの分子量を有するアミノフィコルを用いるこ とにより優れた結果が得られた。

水不溶性表面の第１実質表面部分のみを被覆し、水不溶性表面の第２実質表面部 が多糖類で覆われることなく残るようにするため、多糖類の付着量を水不溶性表 面の全面積の１ｃｍ’当り約０．５　Ｘ　１０−’　〜３　Ｘ　１０−’　、ｇ の範囲に制御する必要がある。これは、多糖類の分子量が約４００，０００　ノ 場合、約７００−．４０００分子／ｐＬ２ニ相当する。

本発明の一例によれば、生物学的物質を水不溶性表面の第２実質表面部分に付着 する。この付着は疎水性吸着、静電結合、共有結合又はその組合せにより行うこ とができる。好ましくは、生物学的物質を第２実質表面部分に共有結合させる。

生物学的物質を第２実質表面部分に共有結合させる場合、かかる共有結合を任意 多数の方法で達成することができる。水溶性カルボジイミドの如き活性化剤を用 いてラテックス表面」二のカルボニル基との付加物を形成することかでさる。次 に、カルボジイミド付加物を生物学的物質上のアミノ基と反応させてアミン結合 をラテックス支持体に残す。他の有用な活性化剤はウッドワード試薬Ｋ　（Ｎ　 −エチル−５−フェニル−イソキサゾリウム−３′−スルホネート）又は水溶性 クロロホルミエートである。

混合物中に存在する蛋白質に対し特異的に結合させるために不溶性材料を用いる 場合に、当該組成物を使用することができる。この関係は　抗菌な蛋白質結合検 定、細胞区分け、細胞学、組織学等において遭遇する。処置を極めて広く変える ことかできるため、本発明は一般に粒子としての不溶性材料又は一層巨大な構造 の表面と蛋白質混合物とを組合せ、該表面上の生物学的物質および特異的蛋白質 結合パートナ−間を結合するに十分な時間を許容することを包含する。次に、固 体表面を非特異的結合蛋白質から遊離するよう洗浄して特異的蛋白質のみを残す 。

標識付は又は未標識伺けの粒子を用いる関係が特に興味がある。標識としてはラ ジオアイソトープ、　光料、磁気材料、酵素、酵素基質、発色染わ等がある。

かかる標識を水不溶性表面、多糖類又は生物学的物質に結合することができ、望 ましくは水不溶性表面又は多糖類に結合する。所要に応じて、標識を粒子全体に 均一に分散させることができる。

また、第１の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第１の結合部位 と第２の生物学的物質に対する結合パートナ−となる第２の結合部位とを有する 特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴して潜在的に含有する試料を検定するた めのキットを提供する立場が特に興味がある。かかるキットはスライド、ウェル 等の如き支持体上に画成された巨大拡張性表面壁を具える。支持体は特異的結合 蛋白質および他の蛋白質類を同伴し得る第１の水不溶性表面を有する。この第１ 水不溶性表面は多糖類コーティングで遮蔽された第１の実質表面部分と、第１の 生物学的物質が伺着した第２の実質表面部分とから主としてなる。また、キット は特異的結合蛋白質および他の蛋白質類を同伴し得る第２の不溶性表面をそれぞ れ有する複数の固体粒子を具える。この第２不溶性表面は多糖類コーティングで 遮蔽された第１の実質表面部分と、第２の生物学的物質が伺着した第２の実質表 面部分とから主とＩ−でなる。これら粒子は検出信号を発生し得る標識で標識付 けすることができる。たとえば、粒子を染料の如き色イ］与剤により着色するこ とができ、信号は単に色そのものとなる。或は又、前述した如き他の標識を利用 することができる。

製造方法 本発明の組成物は多数の方法で製造することができ、そのうちの幾つかを後述す る。

九法王 本発明の組成物は、特異的結合蛋白質および他の蛋白質類を同伴し得る水不溶性 表面を有する固体支持体を準備することにより製造することができる。前記表面 の第１の実質表面部分を多糖類コーティングで被覆する一方、前記表面の第２の 実質表面部分は多糖類コーティングで覆わない。これは、前記表面をたとえば硝 酸および硫酸の混合物を用いて硝化してニトロ基を添加することにより達成され る。酸混合物を表面から洗浄除去した後、塩化第一錫の如き手近な還元剤を塩酸 と共に用いてニトロ基をアミノ基に還元する。固体支持体を再び洗浄し、ハロゲ ン化シアン成分を７ミノ基に付着する。ハロゲン化シアンは普通水溶解度が小さ いためエタノール溶液として固体表面と接触する水溶液に添加する。ハロゲン化 シアンは実際添加時にモノエトキシ誘導体の状態にあるものと思われる。任意過 剰の塩化シアンを洗浄除去する。次に、ハロゲン化シアンｆｉｌの残留ハロゲン 化物がヒドロニウムイオンに解離するヒドロキシル基（ｐｋａ　：約１０−’） に加水分解して負に帯電した正味の表面になるものと思われる。これはカルボキ シル基を必ずしも有しない表面へのアミノ多糖類の静電結合を促進するのに役立 つ。次いで、アミノ多糖類分子が該表面に付着される。このようにして形成した 中間生成物はアミン多糖類が少くとも第１表面部分に静電刺着した水不溶性表面 を有する固体支持体である。次に、この中間生成物をハロゲン化シアンと反応さ せて隣接するアミン多糖類分子を交差結合し、有用な組成物を形成することがで きる。

このハロゲン化シアンとの反応は、その酸性度およびイオン強度により少くとも 第２の表面部分をアミン多糖類被覆から自由にするのに役立つ。

前述した如き生物学的物質を水不溶性表面の第２実質表面部分に付着することが できる。これは、上述した如き活性化剤の使用を介して疎水性吸着、静電結合又 は特に共有結合により達成することができる。

友広」 本発明の組成物を製造する他の方法は、表面にカルボキシル基を有する水不溶性 支持体を用意することにある。該表面をアミン多糖類の単分子層で覆うに十分な 借景上の分量で前記表面をアミン多糖類と接触させる。たとえば、過剰量のアミ ノフィコルを水溶液中で該表面と接触させることができる。アミン多糖類を静電 結合により表面に保持する。これは酸および高濃度塩溶液が多糖類の除去になる ことからも知られている。

過剰のアミノ多糖類を固体支持体から水洗除去する。然る後、上述した如きハロ ゲン化シアンのエタノール溶液をアミン多糖類で被覆された固体表面に添加する 。ハロゲン化シアンを少くともアミン基の相当部分がハロゲン化シアン付加物に 添加して種々のアミノ基を互いに交差結合するに十分な分量で使用する。

この反応の終了時、水不溶性表面の第１の実質表面部分がアミノ多糖類で被覆さ れる一力、前記水不溶性表面の第２の実質表面部分はアミン多糖類で覆われない 。前記表面は本来静電結合したアミン多糖類で被覆されていると信じられるが、 ハロゲン化シアン成分との反応後該表面はもはやアミノ多糖類で完全に覆われな いことを実験的に確かめた。その代わり、かかる表面の部分は生物学的物質への 結合用に入手し得る。さらに、ハロゲン化シアン成分との反応後、酪および／ま たは高濃度塩溶液はアミノ多糖類をもはや除去しない。一般に、水不溶性表面上 に残存するアミノ多糖類の分量は水不溶性表面の面積１ｃｍ’当り約０．５ＸＩ Ｏ−’〜３Ｘ１０−’ｇである。

生物学的物質を前述した如き疎水性吸着又は共有結合を介して第２の実質表面部 分に付着させることかでさらに本発明の組成物を製造する他の方法は、カルボキ シル基の如き活性基を看する水不溶性表面を該表面全体を被覆するには不十分な アミン多糖類および水溶性カルボジイミドと単一反応工程で反応させることにあ る。このようにして得た生成物はたとえばカルボキシル基によりカルボジイミド を介して水不溶性表面の第１の実質表面部分に共有結合したアミン多糖類を含有 する。該表面の第２の実質表面部分はアミン多糖類分子により覆われることなく 残存する。

再び、生物学的物質を任意所望の方法により第２実質表面部分にイづ着させるこ とができる。

この方法は、過剰のカルボジイミドを用いる１合、第２実質表面部分上に所望の 生物学的物質と共有結合だめのカルボジイミドで活性化された活性基（たとえば カルボキシル基）がなお存在し得る利点を有す本発明の組成物を形成する他の方 法においては、活刺基（たとえばカルボキシル基）を含有する水不溶性表面を有 する固体支持体を水溶性カルボジイミドの如き過剰の活性剤化合物と反応させて カルボジイミド（ｊ加物の如きイ」加物を形成する。任意過剰の活性剤を洗浄除 去する。全ての活性化部位と反応するに不十分な重工の生物学的物質を添加する 。反応完了後、生物学的物質が第２の実質表面部分に伺漬したままである。次に 、表面を洗浄して任斉の反応生成物を除去する。水を該表面と］［１ひ接触させ 、アミノ多糖類を添７１１１１〜、活性剤により活性化されたままの活性基に結 合させる。

このようにして得た生成物はアミノ多糖類と、活性）、（を揄し活性化剤の使用 により水不溶性表面に共有結合Ｉ７た生物学的物質どを有する。

上述した種々の方法はカルボキシル活性基およびカルポジイミＩ・活性化剤の使 用に間して述べたものであるが、他の活性基および活性化剤、たとえば予じめ述 べたものを適宜使用し得る。

検定方法 検定方法もまた本発明の重賞な部分を構成する。本発明によれは、第１の生物学 的物質に対する特異的結合パートナ−となる第１の結合部イ）“ｌをイｌする特 異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴して含有する試料を検定する方法が記述さ れている。この方法は、特異的結合蛋白質および他の蛋白質類を同伴することか でき、多軸類コーティングで遮蔽された第１の実で１表面部分と第１生物学的物 質が付着した第２の天竺表面部分を有する第］の水不溶性表面の第１支持体を試 料の水溶液と接触させることにより操作する。ごの試料水溶フィシを第１固体支 持体および伺箔した第１生物学的物質に結合した特異的結合蛋白質から分Ｎする 。支持体は曹通複数のね子からなり、これらは通常検出し得る標識て標識（＝１ けされている。支持体の一例と１．ては、板又はウェルの如き巨大拡張性表面又 は］個以１のウェルをイＪする板がある。アミノ多糖類、生物学的物％ｔ　’： ’ｉ　ｆ′Ａ前述した如きものである。

本発明の特に好適な一例においては、第］固体支持体は巨大拡張性表面で、検出 Ｔ４゛１は約数の粒子状で特異的結合蛋白質及び他の蛋白ｒ′を類を回イ才する ことかでき多糖類コーティングで遮蔽された追加の第１実質表面部分と第２生物 学的物質か付着した追加の第２実質表面部分とを有する第２の水不溶性表面の第 ２固体支持体を第１巨大拡張性表面、すなわち板又はウェルと接触させることに ある。特異的結合蛋白質ぼ第２生物学的物質に対する特異的パートナ−となる第 ２の結合部位を有するものとして避択される。次いで、巨大拡張性表面への粒子 の封着度合いを観察する。

また、第１の実質表面部分と第２の実質表面部分とから主としてなり、生物学的 物質に対する特異的結合ハードナーとなる特異的結合蛋白質に結合するための能 力を水不溶性表面への不所望な蛋白質類の刺着を減するための方法が記述されて いる。＄１実施表面部分は多糖類コーティングで遮蔽され、生物学的物質が第２ 実質表面部分に付着されている。遮蔽および付着工程は同時に又は順次に行うこ とができる。本例における表面は普通巨大拡張性表面である。このようにして、 刺着減少方法は牛血清アルブミンの巨大拡張性表面」二への利用に対する道を付 与する。これは牛血清アルブミンの高価さのため、また一つのパッチから次のパ ッチにおける牛血清アルブミンの完全な均一性ノ欠如のため特に崩用であり、上 記非均一性はこ、の反応体の生物学的生産に固有のものである。

検ｊＬ先フ」 本発明によれば、第１の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第１ の結合部位と、第２の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第２の 結合部位を有する特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴して潜在的に含有する 試料を検定するためのキットを提供する。このキットは、第１の水不溶性表面を 有する固体支持体を具え、該支持体は巨大拡張性壁で、第１水不溶性表面は壁面 である。この第１水不溶性表面は特異的結合蛋白質と他の蛋白質類とを同伴する ことができる。前記第１表面は多糖類コーティングで遮蔽された第１の実質表面 部分と、第１の生物学的物質が付着した第２の実質表面部分とから主としてなる 。複数の固体粒子もキットの一部を構成する。各粒子は特異的結合蛋白質と他の 蛋白質類とを同伴し得る第２の不溶性表面とを有する。この第２表面はそれぞれ 多糖類コーティングで遮蔽された第１の実質表面部分と、第２の生物学的物質が 付着した第２の実質表面部分とから主としてなる。一般に、これら粒子は検出信 号を付与し得る標識で標識伺けされている。多くの場合、この標識は単に色付与 剤で、信号はその色である。

本発明の他の例によるキットは、上述した如きキットにおけるような複数の粒子 を具えるが、第１水不溶性表面を有する壁支持体は付着した第１生物学的物質を 有するけれど、その第１実質部分」二に多糖類コーティングを有しない。その代 わり、牛廂清アルブミン又は他の遮蔽剤が使用される。

次に本発明を実施例につき説明する。

実施例■ 直径１ミクロンのポリスチレン微小球（ポリサイエンシズ　インコーポレーショ ン、ワーリントン、ピーエイ）　５ｇを　５０Ｍ文の水冷した７５％Ｈ２ＳＯ４ に懸濁させ、１００ｍ文氷冷したｌ：ｌのＨＮＯ，：　Ｈ２ｓｏ、に添加した。

生成した混合物を水浴中で３０分間攪拌し、次いで１文の氷水中に注ぐことによ り急冷した。このようにして硝化した微小球を遠心分離を利用して３回水洗した 。

匙−」 硝化微小球を１００ｍ文の濃ＨＣ文に１１０ｇのＳｎ０文、・２Ｈ２０と共に懸 濁させ、常温で１０時間攪拌した。硝酸塩基がアミン基に還元された微小球をＳ ｎ０文２溶液から分離し、遠心分離により２回水洗した。次いで、微小球を水、 Ｏ，ｌＮ　ＨＣＩ、Ｈ２Ｏ、０，ＩＮ　ＮａＯＨおよびＨ２Ｏの順で洗浄した。

ｉおされた微小球の塩化シアンでの活１逃アミン微小球を９００ｍ！：Ｌの冷水 に懸濁させ、ステンレス銅製超音波浴洗浄器中で超音波処理により分散させた。

０．５ｇの塩化シアンを２：ｌの水およびアルコールの４昆合物　（１５０ｍ文 ）に溶解した溶液を添加し、生成した溶液を間欠超音波処理しながら３０分間定 温放置した。これによりアミ７基を塩化シアン付加物に転化した。懸濁液を遠心 分離して塩化シアン付加物の残留塩２ 化物の加水分解により形成されたヒドロキシル基を含有する微小球を取り出し、 これを遠心分離により冷水で２回洗浄した。

り小球のＮ−２−アミノエチル　カルボキシメチルヒフ　コル　ＡＥＣＭ−フ　 コル　での　勺微小球を１文の冷水中に超音波処理により懸濁させ、１．２ｇの ＡＥＣＭ−フィニルを５０ｎｌの水に溶解した溶液を添加した。生成した混合物 を間欠超音波処理しながら１２時間定温放置した。ＡＥＣＭ−フィニルの結合し た微小球を遠心分離により２回水洗した。これらをホワットマン＃１紙を介して 真空濾過してあらゆる凝集した微小球を除去した。使用したＡＥＣＭ−フィニル は約４００．０００の分子量と、１分子当り約８０個のアミン基とを有した。

ＡＥＣに一部　コル　Ｘ云壬入　るための’ｆｆＬＭ′ハ　のｉ−ヒシアンでの １なる　■− ＡＥＣ：Ｍ−フィニルで静電被覆された微小球をＯ′Ｃに冷却した７５０ｎｌの 水に懸濁させた。塩化シアン（１ｇ）を２００ｍ文のｌ＝１のアルコール：水の 冷溶腋に溶解した溶液を懸濁液に添加してＡＥＣＭ−フィニルを交差結合した。

表面の一部だけが塩化シアンが反応する際の８０文の生成により生じた酸性のた めＡＥＣＭ−フィニルで被覆されたままであった。生成した懸濁液をＯｏＣで３ ５分間定温放置し、微小球を該懸濁液から遠心分離した。この微小球を遠心分離 により冷水で３回洗浄した。この微小球を常温での培養により蛋白質に結合した 。これは重大な劣化なしに約４°Ｃで一年間に亘って貯蔵することができること を確かめた。

支蔑上」 ポリスチレン巨 ０℃（７）１２０ｍＭ　（７）　２　：　１　（７）Ｈ２Ｓ％：ＨＮＯ３で覆い 、穏和に混合しなから０℃で１５分間定温放置した。混酸を注ぎ出し、球をｏ　 ’ｃの５０％硫酸で洗浄し、次いで洗浄水が中性になるまで氷冷水で洗浄した。

１−Σ 硝化球を、＋１０ｇｃ７）　５ｎＣ１ｑ　・２ＨＪを１００＋＋１（７）濃塩酸 に溶解した溶液で覆い、時々かきまぜながら常温で１５時間定温処理してニトロ 基をアミノ基に転化した。Ｓｎ０文２溶液をデカンテーションし、球を水、０、 ＩＮＨＣ文、水、さらに０．ｌＮ　ＮａＯＨそして水の順で洗浄した。

剖ヒシアンでの′　−ヒ アミン球を、０．１ｇの塩化シアンを　１０ｍ１のアルコールおよび２００ｍＭ の水に溶解した溶液で覆い、常温で４０分間定温放置した。塩化シアン溶液を球 からデカンテーションし、然る後球を数回に分けて水洗した。

１８Ｍ＃ＧＯ−５００９７３　（１０）ＡＥＣＭ−フ　コルで 球を、０．１４ｇ　（７）ＡＥＣＭ　−７イコルを１２０ｍＭ（７）水に溶解し た溶液で覆い、時々かきまぜながら１２時間定温放置した。ＡＥＣＭ−フィコル 溶液を球からデカンテーションし、次いで球を冷水で２回洗浄した。このように してＡＥＣＭ−フィニルが球上に静電結合したコーティングを得た。

ＡＥＣＭ−７コル　−ゞ−三１ム　ルタメ’−ｆ’（１）　ｊｂ’ｙ７ンでの　 なる几理 ＡＥＣＭ−フィニルで静電被覆された球をＯ′Ｃに冷却し、０．１８ｇの塩化シ アンと　１８ｎｌのアルコールとを含有する１５０ｍ文の氷冷水溶液で覆った。

定温放置をＯ′Ｃで３０分間続けた。塩化シアン溶液を球からデカンテーション し１次いで球を氷冷水で３回洗浄した。表面の一部だけが塩化シアンが反応する 際のＨＣ文の形成により生じた酸性のためＡＥＣＭ−フィニルで覆われたままで あった。該反応に用いたＡＥＣＭ−フィニルはＡＥＣＭ−フィニルの分子肖り約 ８０個のアミノ基を有した。このようにして得た球をｒｇｃ、酵素等の如き蛋白 質巨大分子と反応させる。これは重大な劣化なしに約０°Ｃで数ケ月間貯蔵する ことができる。

幻１」 蛋　に　る′ハ　“１ 上述した如くして製造したＡＥＣＭ−フィコル微小球０．１２ミルクラムに、１ ．１＋ｎ文標準塩水の全容積中で３マイクログラム／ｍ文の最終蛋白質濃度を形 成するに十分なＭＯＰ、Ｃ−２１骨髄腫蛋白質を添加した。１時間の常温放置後 、未結合蛋白質を遠心分離により標準塩水で３回洗浄して除去した。次いで、Ｍ ＯＰ（、−２１の結合した微小球を０．６４２　ミルグラム７ｍ文の１′１′で 標識付けされた中クーロン抗体、アンチ−４８を含有する１ｍ１ｊの塩水中に常 温で１時間定温放置した。未結合の標識付けされた蛋白質を微小球から０．１％ の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含イ１する塩水で遠心分離により３回洗浄除去 した後、結合した標識を計数した。その結果、約２００１ｇＧ分子／微小球に相 当する０、０１３重量％のアンチ−４ａであった。

支崖廻■ カール−スキシル化ポリスチレン倣小球へのＡＥＣＭ−フィニルの結合 ＡＥＣＭ−フィニルのカルボキシル化ポリスチレン微小球への結合程度を決定す るため数種の実験を行った。

使用した微小球は過硫酸カリウムを触媒として用いて９５．２毛量部の新鮮な真 空法留したスチレンと４．８垂部部の新町な真空蒸留したメタクリル酸とを６０ ℃で重７合して得た懸濁前であった。重合完了後、微・３１球を希ＮａＯＨで洗 浄し、ガラスウールにより濾過し、希）ＩＩでｐＨ＝７にし、遠心分離により蒸 留水で３回洗浄し、固形竹製ＩＷを０．７４５重竜％に調整した。走査型電子顕 微鏡を用いて微小球が３％以下の標準偏差で０．５ミクロ６ ンの直径を崩することを確かめた。このようにして得た１００　ミクロリットル の試料は８．５　Ｘ　１０’−’１’方ミクロンの表面積を有した。

５０ｍｇのＩ！フィコル（滴定により分子量４０，０００当り８０個のカルボキ シル基）を５ｎｌのＨ２Ｏ中で６６．５ｍｇのエチレンジアミン　ヒドロクロラ イド−ｃ’９　（２５マイクロキユリーの（Ｈ／４　を含有）および７５ｍｇの （３−ジメチルアミノプロピル）エチル　カルボジイミド　ヒドロクロライド’ 　（ＥＤＡＣ）とｐＨ＝　４．７で反応させることによりＣ”−ＡＥＣＭフィコ ルを調整した。このＣ”　−ＡＥＣＭ　フィニルを低分子量反応体からゲル濾過 および４°Ｃでノに留水に対する徹底的な透析により分離した。このＣ”　−Ａ ＥＣＭ７　イコＪｌ／は１１２ｏ中テ０．９１重垂部で、２１２゜ｃｐｍ／１０ マイクロリットルを有した９同様にして一μＩ整した冷（非−Ｇ”　）　ＡＥＣ Ｍ７　イＤ　Ｊｌ／試＊［はＨＰＬＣ（高＋１能液体クロマトクラフィー）によ り４４３，０００の平均分子量を増するので、Ｃ”　−ＡＥＣＭフィコルζ日測 定条件下で１．７　Ｘ　１０　ｃｐｍ／分子を４１した。

Ｃ”−ＡＥＣＭフィコルの１００マイクロリットルのカルボキシル化微小球への 結合を、氷又は叙種■液等の全容積５００マイクロリツトル中で所要時間単に接 触させることにより実施し、次いで微小球を遠心性ｐｌにより水又は緩衝液等で ３回洗浄し、集積した洗浄廃油と洗浄微小球とをＣ″　に関して計数した。第１ 表は水洗に引き続いて水中で所定時間定温放置した後に微小球上に残存するＣ” 　−ＡＥＣＭフィコルの量を示す。

亀上玉 ＨＯで　ＡＥＣ）ｌフ　コル１）　ハ　ヘ定１丸ＩＬ朋　使」Ｌシナこ辷Ｊ」　 欺」連速」」久」１１分　２１２０　８９Ｂ １５分　２１２０　９１７ １３時間　２１２０　８３４ １５分　４１４０　１０２８ １５分　８２８０　１０９４ １）　２１２０ｃｐｍ使用 第１表のデータは、微小球のＡＥＣＭブイフルでの飽和が速かに起り、１１０９ ４ｃｐを示す微小球が得られることを示す。

次に微小球に結合するＡＥＣＭフィコルの分量に対するｐＨの効果を測定した。

微小球を第１表における如く処理したが、結合および洗浄用溶液のｐ）ｌは第２ 表に特定した如くして使用した。

第」Ｌ表 ＡＥＣＭフ　コル、　Ｈユ０　−々の Ｈｌでハに− Ｌ臥及Ｉ　Ｌ血１１　’／−０１１１ ｐＨ４，７０，Ｈ，ＯＨｉｏ　４３Ｂ ｐＨ５，８０、Ｈ，ＯＨ，Ｌｏ　８Ｂ＋ｐ）ＩＢ、７５．Ｈ＊ＯＨス０８３４ ＰＨ７，１０，Ｈｉ１０　ＨｑＯ１３１？ｐＨ７，８０，ＨａＯＨ２Ｏ９４９ ＰＨ８，８５、ｋＯＨ，：Ｌ０８！１Ｂ１）　２１２０ｃｐｍ使用 ２）蒸留ＨｓＬＯのｐ）ｌをＮａＯＨ又はＨｉで調節ＡＥＣＭ−フィコルの結合 は高いｐＨ値より低いｐＨ値、たとえば約６以下で著しく少ない。すなわち、微 小球へのＡＥＣＭ−フィニルの付着量を制御する方法が得られる。

第２表のデータは、ＡＥ（１；Ｍ−フィコル上のアミ７基と微小球上のカルボキ シル基との間の塩形成（イオン結合）が多分観察される結合の原因であることを 意味する。このイオン結合は弱酸および弱塩基に対してはｐＨ＝　１／２Ｊｏｇ 　Ｋｗ　−１／２．ＪｏｇＫａ＋　１／２Ｋｂで付与される等量点で最大となる 。ＫａおよびＫｂの値は使用した物質では未知であるが、類似の化合物、すなわ ち酢酸のＫａ＝　４．７３、エチルアミンのＫＩＩ＋＝　３．２５から評価する ことができる。このようにして計算した等量点はｐｌ＝　７．７４で、最大結合 が観察されたｐ）Ｉ＝　７．９とよく一致する。

次に、微小球に結合するＡＥＣＭ−フィニルの分量に対する塩類の効果を測定し た。微小球を第１表における如く処理したが、結合および洗浄用の溶液は第３表 に特定した如きものであった。

許Ｉ ＡＥＣＭフ　コル、　？）、）よび １−・１中で・７、ト、。

１ＬＬｆｉ！　ｕ　１土旦ユ１匹ｕ Ｈ文ＯＰＢＳ　１５５ ＮＳ　Ｈｉ２０　４０３ ＮＳ　ＮＳ　１’９４ ＮＳ　ＰＢＳ　１３８ ＰＢＳ　Ｈユ０　３３８ ＰＢＳ　ＰＢＳ　５８ １）　２＋２０ｃｐ屈使用 ２）ＮＳ−標準塩水 ３）　ＰＢＳ−燐酸塩緩衝塩水、ｐ）ｌ＝７．３第３表のデータは、ＡＥＣＭフ ィコルが希釈イオン性溶液で洗浄することにより結合を阻止されるばかりか微小 球から容易に除去されることを示す。第３表の微小球を非放射性ＡＥＧ：Ｍフィ コルと定温放置すると、ＡＥＣＭフィコルの僅か約５０ｃｐｍが交換し得なかっ た。第３表の６番目の試料は、ＡＥＣＭフィコルの一部が微小球に極Ｏ めて強くイオン結合しているか又は共有結合を形成していることを示す。

第４表は水溶性カルボジイミド活性化剤を用いるＡＥＣＭ−フィニルの共有結合 に関するデータを示す。

乳工蓋 ＡＥＣＭフ　コルを）１２０　カルボジイミドて′ハ　に　人 則Ｍ旦ノじ　定ｊＬ雄１」１則　流勢　倣Ｊ豆床ユＪ久」す０　１時間　ＰＢＳ 　１５５ ０．００８　１時間　ＰＢＳ　ｆｉ９？０．０１２　１時間　ＰＢＳ　５８２ ０．０２５　１詩間　ＰＢＳ　４９９ ０．０５　１時間　ＰＢＳ　４８８ ０．５　３８時間　ＰＢＳ　１　？　９第４表のデータは、Ｃ”−ＡＥＣＭ７４ 　コル（２１２０ｃｐｍ）を微小球と種々の量のカルボジイミドの存在中で反応 させ、ｐＨ＝７．３のＰＢＳで３回洗浄することにより得られた。第４表の微小 球と非放射性ＡＥＣＭフィコルとの定温放置は、ＥＤＡＣ：を用いない場合以外 、ＡＥＣＭフィコルが交換し得ないことを示す。恐らく、ＡＥＣＭフィコルのア ミノ基がアミド結合を介して微小球の表面上のカルボキシル基に共有結合してい るものと思われる。ＡＥＣＭフィコルの結合量が多量のＥＤＡＣにより減ぜられ る理由は前述した一層高いイオン強度の抑制効果（ＡＥＣＭ−フィニルの微小球 への初期イオン結合の抑制）により説明することができる。しかし、ＡＥＣＭフ ィコルがＥＤＡＣの存在下表面に一度付漬すると、これは共有結合となる。その 理由は、ＰＢＳ洗浄はこのＡＥＣＭフィコルを除去ゼす、イオゾ結合したＡＥＣ ＪＩフィコルを除去するから！ある（第３表と比較参照）。

共有結合の仮定を試験し、過剰のＥＤＡＣをＨＯで洗浄除去した後微小球が共イ 〕結合を行うよう活性化されたままであることをめるために、第５表に要約した 実幻しポジイーミ」１介して禍Ｍ１、去の−１でた仕ＣＭムＬユ亙豆舊殆 １０．５ｍｇＥＤＡＣＣ”　７ＡＥＣＭ７　イＤル　微小球＝ｆｕｆｉ’ｔ’　 の添加前過剰ＥＤＡＧ　上ノｃｐ！！ＩのＨ久０での除去 ｌ　８２０　＄　５３９ ２　Ｈり０　イ１　３７８ ３　ＰＢＳ　無　２２６ ４　ＰＢＳ　有　５２３ プロトコルは微小球をＥＤＡＣ（過剰量）およびＣＩ＋−ＡＥＣＭフィコルと共 に１時間定温放置し、次いで試料１および３に関してはＰＢＳで洗浄することか らなった。

次に、試料１および３を計数した。試料２および４はＥＤＡＣと共に１詩間定温 放置し、Ｈ，０で２回洗浄し、Ｃ々　−ＡＥＣＭフィコルを添加してＨ２Ｏ中に 再ひ懸濁さぜ、さらに１時間定温放置し、ＰＢＳで洗浄した後訂数された。微小 球試料は非放射性ＡＥＣＭフィコルとの交換に関して負であり、共有結合を示し た。これらの結果は、ＥＤＡＣがＰＢＳの存在部位において共イ〕結合に関しカ ルボキシル化微小球を活性化し、過剰のＥＤＡＣの除去後も活性が残ることを示 す。ＰＢＳは微小球の相勾−接ｊＨを制限することによりＡＥＣＭフィコルの微 小球への結合を抑制することが明らかである。その理由１ま、ＰＢＳか微小球の ＥＤＡＣ：活性化を干渉しないからである。

また、ＡＥＣＭフィコル微小球を結合するための塩化シアンの有用性を検詞し、 その概要を第６表に示す。

□　□　−且Ｐ、、！−一−−−−５」−甲　□　−興Ｐ　−−−−−−−無　 熱い　９６７　０．８５　４７１　冷たい　５５　２４］無　冷たい　７　０． ６５　０　熱い　１３９３　４４４無　熱い　１０９８　０．６５　３５９　熱 い　１３６４　８６９０．０５　熱い　１２４７　０．８５　４９　熱い　７０ ８８　６７３無　熱い　１０７９　無　３１　にたい　４０５　４５７１）　Ａ ／Ｆ＝　ＡＥＩ：Ｍ７　イ＝ｌル、熱い一２１２０ｃｐｍ　（放射性ＡＥＣＭ７ 　イコル）　、冷たイー０．０Ｅｉ９＋ｎｇ　（７１＋非放射性ＡＥＣＭフィコ ル ２）　ＣＴＣ＝　５０マイクロリットルの無水アルコールに溶解した塩化シアン ｍｇ 使用したプロトコルは、１００マイクロリットルの微小球をＣヌは非−Ｃ”　Ａ ＥＣＭフィコルとＨユ０中ＥＤＡＣのイ〕無で反応させ、Ｈ，Ｏで３回洗浄（１ 回目の洗浄）−し、塩化シアンと３０分間反応させ、Ｈ，Ｏで３回洗浄（２回目 の洗浄）し、Ｃ／＜２又は非−〇’　ＡＥＣＭフィコルと１時間反応させ、Ｈユ ０で３回洗浄（３回目の洗浄）し、次いで微小球を計数することからなった。

データ（試料１）は、約２５０ＣＩ）Ｅの非交換性ＡＥＣＭフイコルを塩化シア ンの使用によりＡＥＣＭフィコルのイオン結合をすでに有する微小球」−に結合 し得ることを示す。しかしＡＥＣにフィニルのＥ［］ＡＣ；結合層をすでに有す る微小球の塩化シアン処理は追加のＡＥＣ：Ｍフィニルの吸収を容易にすること ができない。たとえば、第６表の４番［」の試料の第３回洗浄は塩化シアン処理 に添加されたカウントの８８％を含有する。２および３番目の試お↓に関する微 小球］二の２５０以上の過剰カウントは明らかにＡＥＣＭフィコルのイオン結合 によるものである。塩化シアンがＡＥＣＭフィコルを非交換的に結合する機構は 恐らくアミン基を幾つかの隣接するＡＥＣＭフィコル分子−１−で交差結合する ことによる。このようにして交差結合されたＡＥｆ１Ｍフィコル分子はＰＢＳで 洗浄除去されないよう強く結合した分子（たとえは第３表の６番目の試料）で、 微小球」−に保持される。残りは洗浄除去される。

要約すれば、ＡＥＣＭフィコルを１００マイクロリツトルの微小球にＨ４Ｏ中で イオン結合するために達成する１１０９４ｃｐの最大値は７５７０分子／表面積 １平方ミクロンに相当する。これはＩ０９４ｃｐｍ　／　（１，７Ｘ　１０−” ｃｐｍ／分子）Ｘ　（８，５Ｘ　１０９平方ミクロン／　１００マイクロリツト ル）と等しい。この事は、ＡＥＣＭフィコル分イが表面１−で１３．２１０−Ｐ 方オンゲストロー１、を占め、分子が立Ｊフ形状と仮定すると−・辺が１１５オ ンゲス）・ローＪ１で、１．５×１０６立方オングストロームの容積であると、 １１１’１．　Ｌ得ることを意味する。４４３，０００の平均分子率、アボカド 口数および上記仮定した容積から、密度は０．４９ｇ／ｃｃと、１ｌａ−するこ とができる。同様に、ＦＤＡＣにより共有結合した８９７　ｃｐｍ　（７）最大 値は０．２５ｇ／ｃｃになる。多糖類のＨり。

溶液による乾燥容積の数倍までの脚間ｔ」周知の現象であり、観察された結果の 説明となる。しかし、表面」−で膨油および平担化の組合せが観１察された表面 被覆である。

ＡＥＣＭフィコルでほぼ完全に葎われだ表ｉｆ＋ｉを用いて本発明を実施するこ とができない。その理由は、他の美施例の幾つかによって示される如くル白賀類 、抗体塚を該表面に塩化シアン又（オＥＤＡＣのいずれかと共に結合することが できないからである。米国特許第４，２６４゜７６６号には、蛋白質を多糖類コ ーティングに伺）ｊするための複雑な酸化、結合および還元処理が開示されてい るが、これは使用者の取扱いが簡単でなく、本発明を実施するに必要なホウ水素 化還元後全ての蛋白質がその生物学的活性を保持しない。

本発明は微小球に付着した蛋白質、抗体等を該表面の多糖類で覆われた他の領域 の大部分又は全てと共に提供する。多糖類コーティング前又は後で蛋白質を共有 又は非共有結合するための実施例は許可する。多数の方法によって製造されたＡ ＥＣＭフィコルの部分層を有する本発明の材料は、慣例的に観察して一年を越え る期間４°Ｃでの貯蔵安定性を有する。この材料は蛋白質との単なる混合により 該蛋白質に容易に結合するもので、これは使用者自身の蛋白質を結合し長期間の 貯蔵寿命を欲している 使用者にとって著しい利点となる。蛋白質に一度結合した試薬は６ケ月以上の貯 蔵寿命を有する。

支−差−［ 宥ハト　ＡＥＣＭ）　コル　無での ２０個の試験管の各々にｐ）Ｉ＝７の燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）　４００マイク ロリツトルと、１００マイクロリツトルのカルボキシル化ポリスチレン倣小球（ 直径０．５ミクロン、蒸留水中０．７４重量％）とを入れた。これら試験管を簡 単に超音波処理し、５マイクロリツトルのＥＤＡＣ：を１０ｍｇ／ｍｕの割合で 添加した。再び、試験管を超音波処理し、常温で２時間定温放置した。定温放置 後、微小球懸濁液を遠心分離によりＰＢＳで２回洗浄し、５００マイクロリツト ルのＰＢＳに再び懸濁させ、簡単に超音波処理した。

種々の量のＴ−１５抗体を１ｍｇ／１ｍ文ＰＢＳの割合で試験管に添加した。す なわち、試験管１．５．９．１３．’ｉ？は５０マイクロリツトルのＴ−１５を 受け取った。試験管２、　６　、　ｔｏ、　１４．１８は２５マイクロリツトル のＴ　−１５を受け取った。試験管３　、７　、１１，１５．１９は１０マイク ロリツトルのＴ−１５を受け取った。試験管４，８，１２゜１８．２０は５マイ クロリットルＴ−１５を受け取った。すべての試験管を簡単に超音波処理し、常 温で１時間定温放置した。

定温放置後、試験管１〜４の微小球懸濁液を遠心分離によりＰＢＳで２回洗浄し 、超音波処理しながら５００マイクロリツトルのＰＢＳに再懸濁させた。

試験管５〜８の内容物を１％の牛血清アルブミンおよび０．１％のアジ化ナトリ ウム（蛋白質緩衝液）を含有するＰＢＳで２回洗浄し、超音波処理しながら５０ ０マイクロリツトルの蛋白質緩衝液中に再懸濁させた。これらを４°Ｃで４８時 間保持した。試験管９〜２０内の微小球を蒸留水で２回洗浄し、超音波処理しな がら５００マイクロリツトルの蒸留水に再懸濁させた。

試験管１３〜２０内の微小球に１０マイクロリツトルの非放射性ＡＥＣＭフィコ ルを添加した。

試験管９〜２０を常温で１時間、さらに４°Ｃで４８時間定温放置した。

試験管９〜１２の内容物を遠心分離によりＰＢＳで３回洗浄し、各試験管の洗浄 廃液を集積した。集積した洗浄廃液および洗浄した微小球をそれぞれ兆ンチレー ション瓶に入れ、　２０川文のシンチレーション液　（放射線に曝した際蛍光を 発する標準液）を容箱に添加し、計数した。

このようにして下記の結果が得られた。

茎胞贋　製産１工呼り　先制１七邊澱 ９　５［ｉ９　１８３１ １０　５１２　２０３８ ＋１　４１３　１９３３ １２　４］？　１９４８ １０マイクロリツトルのＣ１４ＡＥＣＭフィコルー２１２０ｃｐ川これらの結果 は、放射性標識付けされたＡＥＣＭフィコルのほぼ一定量が試験管９〜１２に用 いた単クーロン抗体に１０倍の減少にかかわらず結合されることを示す。使用し た最高の抗体濃度（試験管９）は試料中の微小球を完全に単層被覆できることを 示した。これは、同様な量のＣ１４−ＡＥＣＭフィコルの結合により示される如 く生じないことは、負に帯電された抗体が負に帯電された微小球に接近する困難 さの指標である。

試験管１３〜１６の微小球をＰＢＳで２回洗浄し、簡単な超音波処理しながら５ ００マイクロリツトルのＰＢＳに再懸濁させた。試験管１７〜２０の微小球を蛋 白質緩衝液で２回洗浄し、５００マイクロリツトルの蛋白質緩衝液に８ 再懸濁させ、簡単に超音波処理した。一方、可撓性Ｕ字底ｐｖＣ（ポリ塩化ビニ ル）８６ウエルマイクロリツトル板（グイナテックィンコポレーション）の４８ ウエルは、５０マイクロリットルＴ−１５をＰＢＳ　１ｍ１当り０．１ｍｇの割 合で最初の１６ウエルの各々に入れ、５０マイクロリツトルの燐コリンー牛ガン マグロブリン共役物（ＰＣＢＣＧ、　Ｔ−１５抗体の特異的結合パートナ−）を ＰＢＳ　１ｍＭ当り０．１ｍｇの割合で次の１８ウエルの各々に入れ、５０マイ クロリツトルの蛋白質緩衝液を残りの１６ウエルーの各々に入れ、これらを常温 で１時間定温放置することにより調製した。これらウェルの内容物を吸引により 除去し、蛋白質緩衝液を頂部に充填し、内容物をアスピレーションすることによ りこれらウェルを蛋白質緩衝液で３回洗浄した。次いで、試験管１〜８および１ ３〜２０で調製した微小球の５０マイクロリツトルをウェル内に入れて各微小球 の組合せを常温で１時間定温放置し、アスピレーションし、然る後ウェルを蛋白 質緩衝液で３回洗浄し、次いでアスピレーションにより蒸留水で２回洗浄した。

これらウェルな乾燥し、４．３，２．１および負の数（−１）を用いて肉眼で観 察してウェルに結合した微小球の相対数を評価した。

結果は次の通りである。

ＰＣＢＧＧ　４４４４４４４４４　４　４　４　４　４　４　４緩種１液　１１ １２１１１１−１−１−１−１−１−１−１−ＩＰＣＢＧＧはＴ−１５抗体の特 異的結合パートナ−であり、ＰＣＢＧＧ不在下での微小球のあらゆる封着（本例 ではすべてＴ−１５が結合）は非特異的結合を示す。すべての微小球がＰＣＢＧ Ｇ板コートに対し特異的結合を示す。ＡＥＣＭフィコルを有する微小球（試験管 １３〜２０）は結合を緩衝液中で蛋白質の不在下に行った場合（試験管１３〜１ Ｇ）でさえも検出し得る非特異的結合を示さなかった。ＡＥＣＭフィコルなしの 微小球は全ての場合、特に緩杓液中で蛋白質の不在（試験管１〜４）下に非特異 的結合を示した。

本例は特異的結合対非特異的結合の比を抗体に結合していない微小球表面の部分 をＡＥＣＭフィコルで覆うことにより高める明白な証拠を提供する。また、非抗 体結合表面の量が過剰の抗体および共有結合を用いる場合でもカルボキシル化微 小球に対し相当なものであることを示す。

支庭血Ｍ ＥＤＡＣ／ＡＥＣ町７　５ル／ＣＴＣ’　ハ（７）　リー乃前述した如くして通 常製造した緑蛍光的径０．７２　ミクロンのカルボキシル化ポリスチレン微小球 トにＦ記の方法で共有結合したＡＥＣＭフィコルの部分表面コーティングを形成 した。３．７５ｇの微小球を含イ１する　４４．５＋ｃ９−の懸濁液を７０８　 ｍ　！ｌ　（’）　Ｈ２０に添加し、次いテ０．４１ｇ　ｃ７）ＡＥＣＭフィコ ルを含イ］する　３９ｎｌの木を添加した。生成した懸濁液を十分に４４合し、 これに撹拌および超音波処理しながら３０Ｉ１１９．の水に溶解した７５ｍｇの ＥＤＡＣを添加した。この時点でのｐ）Ｉは５以下であった。この懸／！ｉ′ｌ ’Ｊｌｒｊを常温で２日間放置し、蒸留水で３回洗浄した。超ｆ１波処理しなか ら１文の水に再鼾、濁させた後、微小球をホワットマン＃１紙を介１．て吸引渉 過してあらゆる凝集物を除去し、再度遠心分離し１−澄の液を除去した。次いで 、微小球を１８６ｍ文の冷水に占び懸濁させ、単一微小球＠濁液が得られるまで 超音波処理した。この懸、濁液に０．３６ｇの塩化シアンを３６ｍ文のＥＴＯＨ および　７６ｍ文の冷水に溶解した溶靜を添加した。生成した懸濁液を超毛波処 理し、水浴中で３０分間保持した後４°Ｃで遠心分離した。１−、澄み液を除去 し、微小球を遠心分離により冷水で３回洗浄した。この微小球を超音波処理しな がら３２０ｍｆｌのＨ２Ｏに再び懸濁させ、これは１．０７重量％の固形分を含 有した。１０マイクロリットルの微小球を５マイクロリツトルのＩ　１２５−Ｔ 　−１５抗体（１７、１４８ｃｐｍ分間定温放貿し、遠心分離により蛋白質緩衝 液で３回洗浄して、微小球に２＋１０ｃｐｍの抗体を結合させた。

実」１」■ 組織培パシた細１の標識・ｔけ友不仁の（ｉＬＩト毬−への結合実施例■の微小 球の一部を超音波処理により１００ｍ文の標＠塩水に常温で懸濁させたもの　１ ０ｍ１と共に０、１ｍｇのＭｙ−１，ねずみ単クーロン抗体１ｇに（カッパ）を 定温放置することにより該微小球をＭＹ−１に結合させた。次いで、微小球を冷 蔵遠心分離機中１０，０ＯＯＸ　ｇ且つ４°Ｃで１０分間ペレ７ｈ化し、上澄み 液を除去した。

このペレットを超音波処理しながら１０％の新生子牛廂４ｆＪを含有するＩ００ ＋ｎｕのＲＰＭＩ　１８４０細胞培地に再懸濁させ、１ユ述した如くしてペレッ ト化、上澄み液を除去した。この操作を再度繰返した後、ペレットを１０％の新 生イ牛血清を含有する２０ｍ文のＲＰＭＩ　Ｉｆ（４０Ｍ胞培地に再懸濁させ、 超音波処理し、無菌下４°Ｃで貯蔵した。

かかるＭＹ−１の結合した微小球は十分に活性を維持しなから６ケ月間以上保持 された。

■１合した′ｎハエ、の　さ９坐］□的」Ｅ合フ→スコ内のＨＬ−６０培養細胞 およびＤＡＵＤＩ人体白色組織培香細胞の各細胞懸濁液（１０ｍ文）を別個の１ ５ｍ又２ 遠心管内で３文文のヒストパキ、、１０７？細胞層化奴？グ（シグマケミカルカ ンパニーの商品名）−１−に層にし、８５０　Ｘ　ｇ且つ常温で３０分間遠心分 離した。−ト、澄み府を除去し、細胞含有界面層を１０％の胎児牛血清（ＦＣＳ ）を含有するＲＰＭＩ　１８４０細胞培地で２回洗浄した。）ＩＬ−［０および ＤＡＵＤＩ細胞をそれぞれの遠心管中で、０．１％のＢＳＡ（生血情アルブミン ）および０．１％のアジ化ナトリウムを含有するＨＢＳＳ　（バンク緩衝塩溶府 ）に１．Ｘｌ０６細胞／ｍ文の割合で再懸濁させた。０．５ｍ文の両細胞懸濁液 のアリコートを２４ウ工ル組織培養板の各２ｍ文のウェルに置いた。上記で調製 した２０マイクロリツＩ・ルのＭＹｌ−１抗体試薬を両細胞溶液に添加し、穏和 に程合した。この板に＋５０Ｘｇ且つ４°Ｃで９分間遠心分離を施し、４°Ｃで １時間定温放置した。懸ｐ：Ｊｍを４Ｍ合し、別個の１２Ｘ７５ｍｍのカラス開 山で１１１１文のＦＣＳ上に層にし、２５０　Ｘ　ｇ且つ常温で１０分間遠心分 離した。遊離の微小球すべてがＦＣＳ上で十澄み液中に残存し、これを、除去し た。次いで、細胞板をＯ，ｌ＋ｎ文のＲＰＭＩ　１６４０に穏和に再懸濁させた 。細胞に対するＭｙ−１抗体微小珪伺活に関し、２０マイクロリツトルの両細胞 懸８Ｍを蛍光顕微鏡により、検査した。

３ １ ＤＡＵＤＩ　３．８ Ｍｙ−１抗体は人体顆粒球および）Ｉｔ、−ｆｆＯ細胞の表面に対する細胞表面 マーカーである。

このマーカーはＤＡＵＤＩおよび他の人体の白血球細胞にはない。同様の結果が 標識付けられた細胞を顆粒性白血球である人体の白血球細胞に対して得られた。

１厳孤１ ＡＥＣＭフ　コルに　合した微小球の ２　の−法による比 カルボキシル化ポリスチレン微小球の３種の異ったパッチから取ったアリコート を２種の異った方法で処理して、２種の異った反応表面を得た。次いで、これら を異った表面特性を示すため実験に使用した。

微小球：Ａ）直径０．９９　ミクロン、蛍光青色染料を含有Ｂ）直径０．５４　 ミクロン、蛍光青色染料を含有Ｃ）直径１．０１ミクロン、未染色 これら微小球を蒸留水でｐ）Ｉ＝７にした。

蝮工」 カルボジイミド　用いて共有結ム、−一　被１．２５ｇの微小球Ａ、ＢおよびＣ を含有する容積それぞれをＡ１、ＢＩ　Ｃ１と標識付けし２２０ｍ文の蒸留水を 含侑する３個のビーカーに入れ、超音波処理して微小球を特表昭６０−５００９ ７３　（１５） 分散させた。次いで、まず、０．８２５重量％のＡＥＣ：Ｍ、（微小球の表面を 完全に覆うに必要な量よりも過剰）のＥＴＯＨ溶液　１５ｍ文を、さらに０．０ ２５ｇのＥＤＡＣ（カルボジイミド）のＥＴＯＨ溶液　１０＋ｎＪ２を各ビーカ ーに添加した。

添加後、懸濁液をよく超音波処理し、常温で１２時間定温放置した。微小球を遠 心分離により蒸留水で３回洗浄し、２００ｍ文の蒸留水に再懸濁させた。次いで 、懸濁液をホワットマン＃ｌ濾紙により濾過した。微小球懸濁液Ａ１、Ｂ１およ びＣ１を各重量百分率に関し試験し、残留微小球に対し必要な調節を行った。こ のようにしてＡ１を１．４７％に、Ｂ１を０．８０％に、またＣ１を１．５％に ３周節し、その結果全容積はＡがＩＥｉ５ｍ文、Ｂが２００ｍ文、Ｃが１００ｍ 文であった。

４凡」 イオン　人にｒきハロゲンヒシアンによる一差゛人２．９４ｇの微小球Ａ、１． ６ｇの微小球Ｂおよび２．９８ｇの微小球Ｃをそれぞれ含有する容積を各々Ａ２ 、Ｂ２、Ｃ２と標識付けし８０ｍ１の蒸留水を含有するビーカーに入れた。０． ８８５重量％のＡＥＣＭフィコルの溶液１０ｍ文を各ビーカーに添加し、十分な 超音波処理により分散させた。常温で約１５分間の定温放置後、懸濁液を遠心分 離により蒸留水で２回洗浄し、超音波処理し、１２５ｍ文の法留水に再懸濁させ 、超音波処理し、ホワットマン＃ｌ濾紙により濾過した。各微小球懸濁液を蒸留 水で１８０口文にした。これからアリコートを取り出し、処理工における如く容 積を調節してＡ２は１．４７重量％、１９７ｎｌｊに、Ｂ２は０．８０重量％、 １８８ｍ文に、またＣ２は１．５重量％、１９３ＩＩ１文にした。

各微小球懸濁液を　７０＋ｎ文の蒸留水に添加し、十分に超音波処理した。０． １３ｇの塩化シアンを　１０ｍ文のＥＴＯＨに溶解し、　２０ｍ文の蒸留水で希 釈したものを３種の懸濁液の各々に添加し、十分な超音波処理により分散させた 。　１／２時間の定温放置後、懸濁液を遠心分間により蒸留水で３回洗浄し、超 音波処理し、１９０＋ｎ文の蒸留水に再懸濁させ、十分超音波処理した。これか らアリコートを取出し、その容積および重量％をＡは１９７ｍ１ｊ、１．４７％ 、Ｂは１９９ｍ文、０．８０％、またＣは１８３ｍ文、１．５％に調節した（上 記処理■参照）。

史に 微小球懸濁液Ａ１、Ｂ１、ＣＩ（処理■）およびＡ２、Ｂ２．０２（処理■）を 含有する６個の試料を上述した如くして調製した。６個の試験管の各々に５００ マイクロリツトルの燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）を添加し、次いで６種の微小球懸 濁液（ＡＩ、Ｂ１、Ｃ１、Ａ２、Ｂ２および０２）の各々５０マイクロリツトル を各試験管に入れ、これら試験管を簡単に超音波処理した。４ｍｇ／ｍ文のＴ− １５抗体２５＋ｎ文を各試験管に添加し、超音波処理し、常温で１時間定温放置 した。次に、微小球懸濁液を１％新生子牛血清と０．１％のアジ化物（蛋白質緩 衝液）とを含有するＰＢＳで遠心分離により３回洗浄し、超音波処理により　５ ００マイクロリ・ントルの蛋白質緩衝液に再ｕ％Ａさせた。

一方、可撓性のＵ字底ＰｖＣの８８ウエルマイクロリツトル板（グイナテックイ ンコーポレーション）の１８ウエルを、最初の６ウエルの各々に０．１ｍｇ／ｍ 文のＴ−１５のＰＢＳ溶液５０マイクロリットルを入れることにより調製した。

次の６ウエルの各々にはＯ，１ｍＨ／ｍ文の燐コリンー牛ガンマグロブリン共役 物（ＰＣＢＣＧ）のＰＢＳ溶液５０マイクロリットルを、また次の６ウエルの各 々には５０マイクロリツトルの蛋白質緩衝液を入れた。これら板コートを常温で １時間定温放荷し、ウェルの内容物を吸引により除去し、次いでウェルの頂部に 蛋白質緩衝液を充填し、内容物をアスピレーションすることにより蛋白質緩衝液 でのウェル洗浄を３回行った。

然る後、上述した微小球ＡＩ、Ｂ１．　ＣＩ、Ａ２、Ｂ２、Ｃ２の各々５０マイ クロリツトルを対応するウェルに入れてＴ−１５、ＰＣＢＣＧおよび蛋白質緩衝 液で処理したウェルと反応させた。１時間の定温放置後、内容物をウェルからア スピレーションし、次いで、ウェルを蛋白質緩衝液で３回、また蒸留水で２回洗 浄した。板を乾燥し、肉眼により４．３．２、■および負の数（−１）を用いて 観察してウェルに結合した微小球の数を評価した。

試験　＃　ＡＩ　ＢＩ　ＣＩ　Ａ２　８２　Ｃ２ＰＣＢＣＧ　−１−１−１４３ ４ 淡白質緩衝液　−１−１−１−１−１−１処理■（部分ＡＥＣにフィコル被覆） に従って調製した微小球がＰＣＢＣＧ　、その特異的結合パートナ−に対する特 異的結合を示すが、処理Ｉ（表面がＡＥＣＭフィコルで完全に覆われている）に 従って調製した微小球はＰＣＢＧＧ又は他のものに結合しないことが上述した実 験かられかる。

すなわち、ＡＥＣＭフィコルで完全に覆われた微小球は生物学的活性材料に対す る結合能力を有しない。

支五孤ｙ ＥＤＡＣ／ＡＥＣＭフ　コル　ｌ′ハ　とその　ヒシアンで１に几テ　したアリ コートとの上−生ｇカルボキシル化ポリスチレン倣小球懸濁液をＤｌ、Ｅｌおよ びＦｌと標識付けした蒸留水の瓶中で下記のようにして調製した。

旧：直径１．３ミクロン、１．９重量％、蛍光緑色染料を含有 Ｅｌ、直径０．９８ミクロン、１．５重量％、蛍光赤色染料を含有 Ｆｌ：直径０．７　ミクロン、１．０４重量％、蛍光赤色染料を含有 これら微小球の３種のバッチを実施例■における如き処理工により処理して微小 球表面をＡＥＣＭフィコルで完全に覆った。

微小球ＤＩ’、　ＥｌおよびＦｌの各０．８２５ｇの試おｌをＤ２、Ｆ２および Ｆ２とそれぞれ標識伺けした２５０ｍＭのエルシンマイヤーフラスコ中で超音波 処理しながら３５ｍ９Ｌの蒸留水に懸濁させた。この懸濁液を水冷し、０．０６ ５ｇの塩化シアンを５ｍ文のＥＴＯＨに溶解し１０ｍ１の冷ノに留水で６釈した ものを添加した。生成した懸濁液を超音波処理し、氷上で３０分間定温放置した 。これらを遠心分離により冷基留水で３回洗浄し、超音波処理し、蒸留水（３０ ｍ　ｌ　（Ｄ２）、　３０ｍ文（Ｆ２）および　５０ｍ文（Ｆ２））に再懸濁し 、その正確な容積および固形分子量％をＤ２は４０ｍ１．１．８％に、Ｆ２は４ ０ｍ１．１．５％に、またＦ２は１００ｍ父、１．０４％に調節した。

瓶Ｄ１、ＥｌおよびＦｌからの各アリコート５０マイクロリツトルを燐酸塩緩衝 塩水（ＰＨ１）で一度洗浄し、超音波処理しながら５００マイクロリツトルのＰ ＢＳに再　％Ａさせた。これらをそれぞれＤ３、Ｆ３およびＦ３と標識付けした 。フラスコＤ２、Ｆ２およびＦ２からの各試料５０マイクロリツトルをＤ４、Ｆ ４およびＦ４とそれぞれ標識付けられ、それぞれ５００マイクロリツトルのＰＢ Ｓを含有する試験管に入れた。この試験管を超音波処理し、Ｌｍｇ／ｍｌのやぎ 敵対ねずみ抗体のＰＢＳ溶液２５マイクロリットルを添加した。フラスコＤ２、 Ｆ２およびＦ２がらの各試料５０マイクロリツトルを、Ｄ５、Ｆ５およびＦ５と それぞれ標識付けされ、それぞれ５００マイクロリツトルのＰＢＳを含有する試 験管に入れた。

＼ ０ この試験管を超音波処理し、Ｉ　Ｂ／ｍｌのやぎ敵対ねずみ抗体のＰＢＳ溶液２ ５マイクロリットルを添加した。フラスコＤ２、Ｆ２およびＦ２からの各試料５ ０マイクロリツトルをＤ５、Ｆ５およびＦ５とそれぞれ標識十１けし５００マイ クロリツトルのＰＢＳを含有する試験管に入れた。

この試験管を超音波処理し、ｌ　ｍｇ／＋ＩＩＱのＵＰＣ１０（ねずみ骨髄腫蛋 白質）のＰＢＳ溶液２５マイクロリットルを試験管Ｄ４、Ｆ４およびＦ４にそれ ぞれ添加した。これら試験管Ｄ４、Ｆ４、Ｆ４、Ｄ５、Ｆ５およびＦ５を常温で １時間定温放置した。これら試験管内の微小球を遠心分離により１％の新生子牛 血清と０．１％のアジ化すｌ・リウム（蛋白質緩衝液）とを含有するＰＢＳで３ 回洗浄し、再懸濁させた。これらをそれぞれ超音波処理しながら５００マイクロ リツトルの蛋白質緩衝液に再懸濁させた。

次いで、可撓性のＵ字底ＰＶＣ９８ウエルマイクロリツトル板（グイナテックイ ンコーポレーション）の２７ウエルを、　０．１ｍｇ／ｍｕのやぎおよびねずみ 抗体のＰＢＳ溶液５０マイクロリットルを最初の９ウエルの各々に入れ、０．１ ｍｇ／ｎｌｊ　ＵＰＣ１０の５０マイクロリツトルを次の９ウエルの各々に、ま た５０マイクロリンドルの蛋白質緩衝液を最後の９ウエルの各々に入れることに より調製した。これらウェルを常温で１時間定温放置し、液体をウェルからアス ビレーションし、次いでウェルの頂部に蛋白質緩衝液を充ｔシし、内容物をアス ピレーションすることにより各ウェルを蛋白質緩衝液で３回洗浄した。

次いで、試験管Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｅ３、Ｅ４．　Ｅ５、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５から の各アリコート５０マイクロリツトルを被）マイクロリットル板の該当ウェルに 置き、常温で１時間定温放置した。次いで、これらを蛋白質緩衝液で３回、蒸留 水で２回洗浄し、乾燥した。その結果すべて負（−１）の結合を示した。

試験管＃　Ｄ３　Ｅ３　Ｆ３０４　Ｅ４　Ｆ４　Ｄ５　Ｅ５　Ｆ５やぎ敵対ねず み抗体　−１−１−１−１−１−１−１−１−ＩＵＰＣ１０−１−１−１−１− １−１−１−１−１蛋白質緩衝液　−１−１−１−１−１−１−１−１−ＩＰＢ Ｓ中の微小球Ｄｉ、　ＥｌおよびＦｌは塩化シアン処理後でさえ板上の蛋白質コ ートに結合せず、これは実施例■の処理工における如き多糖類コーテイング後の 蛋白質への結合不能性を示す。

支農廻Ｊ 法　中１．０４００の、゛　Ａ−る　径０．７ミクロンのカルポキシルヒポリス チレン■の　Ｉに　ける如＜　ＥＤＡＧ／ＡＥＣＭフ　コルで　した　の　いる 蛋白質を微小球に結合するための最適濃度を見つけるために種々の濃度のＥＡＤ Ｃを比較した。Ｔ−１５抗体は３種の異った濃度にした。

５０マイクロリツトルの微小球を１，３．５．７．９の番号付けし５００マイク ロリツトルの燐酸塩緩衝塩水をそれぞれ含有する試験管内に入れた。

これら試験管を超音波処理して微小球を分散させた。０．０５ｍｇのＴ　−１５ 抗体および０−０５ｍｇノＥＡＤＣを試験管１に添加し、０．０５＋ａ、ｇのＴ −１５抗体および０−００５ｍｇのＥＡＩＩＣを試験管３に添加し、０．００５ ｍｇのＴ−１５抗体および０．０５ｍｇのＥＡＤＣを試験管５に添加し、０．０ ０５ｍｇのＴ−１５抗体および０．００５ｍｇのＥＡＤＣを試験管７に添加し、 試験管９には０．０５ｍｇのＴ−１５抗体を添加し、ＥＡＤＣは添加しなかった 。各試験管は蛋白質の添加後およびＥＡＤＣの添加後に簡単に超音波処理した。

微小球懸濁液を常温で１時間定温放置し、遠心分離により１％の新生子牛血清お よび０−１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで３回洗浄し、超音波処理しな がら５００マイクロリツトルの蛋白質緩衝液に再懸濁させた。

次いで、可撓性のＵ字底ＰＶＣ９８ウエルマイクロリツトル板（グイナテックイ ンコーポレーション）の１５ウエルを、　９．１ｍｇ／３１のＴ−１５抗体のＰ ＢＳ溶液５０マイクロリットルを最初の５ウエルの各々に、　０．１ｍｇ／ＩＩ 文の燐コリン牛ガンマグロブリン（ＰＣＢＣＧ）（７）ＰＢＳ　溶液５０マイク ロリツトルを次の５ウエルの各々に、また５０マイクロリツトルの蛋白質緩衝液 を最後の５ウエルの各々に入れることにより調製した。常温で１時間の定温放置 後、ウェルの内容物を吸引により除去し、ウェルの頂部に蛋白質緩衝液を充填し 、内容物をアスピレーションすることによりウェルを蛋白質緩衝液で３回洗浄し た。

次に、Ｔ　−１５／微小球１．３．５．７および９の各５０マイクロリツトルを 該当するウェルに入れ、常温で１時間定温放置した。ウェルの内容物を吸引によ り除去し、ウェルな充填およびアスピレーション操作により蛋白質緩衝液で３回 、蒸留水で２．［１ｌｉｌ洗浄した。板を乾燥し、肉眼により４．３．２、ｌお よび負の数（−１）を用いて観察してウェル壁に結合した微小球の数を評価した 。

＃　１３５７９ ＰＣＢＧＧ　１　１　１　１　−１ 蛋白質緩衝液　−１−１−１−１−１ ｐｃＢｃｉｃコートを有するウェルｌ、３．５および７内の少数の微小球は、若 干の特異的結合が生ずるが信頼性ある結果としては十分でないことを示す。

支亙班Ｊ 口°　、に　る　キード 本例においては、可撓性のＵ字底ポリ塩化ビニル９６ウエルマイクロリツトル板 （グイナテツクインコーポレーション）を用いた。また、透明なポリ塩化ビニル ４ ストリップをマイクロリットル板のウェルのウェルに代えて用い、この場合試薬 をウェルに置く代わりにストリップを試薬に置いた。

蛍光緑色染料を含有する直径０．７ミクロンの微小球を調製し、ＡＥＣＭフィコ ル／塩化シアフシアンして実施例■、処理■におけるような部分コーティングを 得た。１００マイクロリツトルの微小球を１ｍｌのＰＢＳを含有する試験管に入 れ、超音波処理した。４＋＊ｇ／薦文のＴ−１５抗体のＰＢＳ溶液５０マイクロ リットルを添加し、超音波処理により混合した。常温で１時間の定温放置後、こ の微小球懸濁液を遠心分離により蛋白質緩衝液で３回洗浄し、超音波処理しなが ら再懸濁させた。この微小球をＩＩＩＩＬの蛋白質緩衝液に再懸濁させ、十分に ３．４および５と番号付けした試験管の各々で調製した。試験管ｌ内の濃度は０ ．　ｌｆｆ１ｇ／＋ｓ文、試験管２内のものは０．０１ｍｇ／ｍ文等とした。

次に、可撓性のＵ字底ＰＶＣ９Ｅｉウエルマイクロリツトル板を、最初の６ウエ ルの各々にＱ、１ｍｇ／ｍ文のＴ−１５抗体の燐酸塩緩衝塩水５０１又を入れて 調製した。ウェル７にはＱ、１＋＊ｇ／ｍｕの燐コリン牛ガンマグロブリン（Ｐ ＣＢＣＧ）のＰＢＳ液５０マイクロリットルを入れた。ウェル８には１％の牛血 清アルブミンと０．１％アジ化ナトリウム（蛋白質緩衝液）とを含有する５０マ イクロリットルのＰＢＳを入れた。これら板コートを常温で１時間定温放置し、 ウェル内容物をアスビレーションし、ウェルの頂部に蛋白質緩衝液を充填しアス ビレーシ目ンすることよりウェル蛋白質緩衝液で３回洗浄した。

試験管１〜５から５０マイクロリツトルをウェル１〜５に入れ、５０マイクロリ ツトルの蛋白質緩衝液をウェル６〜８に入れた。常温で１時間定温放置した後、 ウェルの内容物をアスピレーションし、各ウェルを充填およびアスピレーション により蛋白質緩衝液で３回洗浄した。

Ｔ−１５抗体の結合した微小球５０マイクロリツトルをウェル１〜８に入れた。

板を常温で１時間定温放置し、ウェルをアスビレーションし、蛋白質緩衝液で３ 回、また蒸留水で２回洗浄した。微小球の結合量を前述した４、３，２．１およ び負の数（−１）のスケールで記録して下記の結果を得た。

−管＃　１２３４５６７８ Ｔ−１５＋　ＰＣＢＧＧ 希釈液　４　３　２　−１　−１　−１　４　−ＩＰＣＢＧＧ　Ｂ／ｍ文　０． Ｉ　Ｑ、０１０．００１０．０ＯＱＪ　Ｑ、■Ｉこの実験は、Ｔ−１５板コート がＰＣＢＧＧの層を結合し次いでＴ−１５抗体を有する微小球が板コートと結合 せず該コートの一部を構成する燐コリン成分に結合することを示す。

支東輿１ 一テスト　′″キー ド明なポリ塩化ビニルストリップを抗体＃ｌと定温放置し、ゼラチン又は牛血清 アルブミンで被覆する。

次いで、これを妊娠の疑いのある尿中に入れ、１〜６０分間定温放置し、然る後 ストリップを抗体＃２に結合した微小球内に定温放置する。かかる微小球はカル ボジイミドで活性化し、洗浄し、抗体＃２と反応させ、洗浄し、ＡＥＣＭフィコ ルと反応させたカルボキシル化ポリスチレンである。抗体＃ｌおよび＃２は人体 の紫膜ゴナドトロピン又は人体の紫膜ゴナドトロピンのベータサブユニットと同 時に反応し得る性質を有する抗体である。すなわち、人体の紫膜ゴナドトロピン 又は人体の紫膜ゴナドトロピンのベータサブユニットの所定分子はこれに同時に 付着した抗体＃ｌおよび抗体＃２を有することができる。ストリップを微小球中 で１〜６０分間定温放置した後、これを取出し、洗浄する。陽性テストは微小球 の付着により生じた曇った外観を有するプラスチックストリップにより示される 。この検定は人間以外の種族の尿中の紫膜ゴナドトロピンにも適用することがで きる。

産業上の利用可能性 本発明の一例によれば、水溶性多糖類で部分的に被覆され、通常アミン官能化さ れ且つ生物学的物質の分子に一部付着した水不溶性表面を有する新規な組成物が 提供される。生物学的物質に対する結合パートナ−となる分子と、生物学的物質 に対する結合パートナ−とならない結合パートナ−との間で明白で正確且つ著し く選択性ある分離を得ることができる。

本発明を」二連した実施例により理解をよくするため若干詳細に記述したが、成 る変化および変性を本発明の範囲内で実施し得ることを明らかである。

図面の簡単な説明 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴する際、生物学的物質に対する特異 的結合パートナ−となる前記特異的結合蛋白質に特異的に結合する有用な組成物 において、 前記特異的結合蛋白質および他の蛋白質類を同伴し得る表面を有する水不溶性支 持体と、 前記表面の第１の実質表面部分に蛋白質類が結合するのを実質的に防止するに十 分該第１実質表面部分を覆うが前記表面の第２の実質表面部分を覆わない多糖類 コーティングとからなる組成物。 ２、支持体はラテックスよりなる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、生物学的物質が第２実質表面部分のほぼ全面に付着してなる特許請求の範囲 第１項記載の組成物。 ４、生物学的物質が第２実質表面部分に共有結合させる特許請求の範囲第３項記 載の組成物。 ５、生物学的物質が第２実質表面部分上に疎水性的に吸着させる特許請求の範囲 第３項記載の組成物。 ６、多糖類コーティングはアミン多糖類コーティングであり、ハロゲン化シアン 成分を介して交差結合させる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ７、支持体はカルボキシル官能基を有し、多糖類を第１実質表面部分に前記カル ボキシル官能基を介して共有結合させる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ９ ８、共有結合はカルボジイミド活性化剤の使用により達成される特許請求の範囲 第７項記載の組成物。 ９、生物学的物質を第２実質表面部分に共有結合させる特許請求の範囲第８項記 載の組成物。 ＼ ＼ １０、多糖類コーティングを第１実質表面部分に静電的に保持する特許請求の範 囲第１項記載の組成物。 １１、支持体は粒子で、組成物は検出信号を付与しイする標識で標識伺けされて いる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １２、支持体は巨大拡張性表面である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １３、巨大拡張性表面はウェルを崩する特許請求の範囲第１２項記載の組成物。 １４、多糖類コーティングは表面１ｃｍ’当り約０．５　Ｘ　１０−７〜３ＸＩ Ｏ−ｇの分量である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １５、特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴する際に生物学的物質に対する特 異的結合パートナ−となる前記特異的結合蛋白質に特異的に結合するだめの固体 支持体の水不溶性表面を調製するに当り、前記特異的結合蛋白質および他の蛋白 質類を同伴し得る水不溶性表面を有する固体支持体を用意し、前記表面の第１の 実質表面部分を多糖類コーティングで被覆する一方、前記表面の第２の実質表面 部分を前記多糖類コーティングで覆わないことを特徴とする固体支持体の水不溶 性表面を調製する方法。 １６、多糖類による被覆は前記表面を硝化してニトロ基を添加し、 該ニトロ基をアミ７基に還元し、 ハロゲン化シアン成分を前記アミノ基に伺石し、アミン多糖類分子を第１実質表 面部分に静電的に付着する工程よりなる特許請求の範囲第１５項記載の力〃、。 １７、ハロゲン化シアンを静電的に付着したアミノ多糖類分子と接触させて隣接 アミン多糖類分子を交差結合する工程をさらに含む特許請求の範囲第１６項記載 の方法。 １８、アミン多糖類の伺着量は前記表面の面積１ｃｍ’当り約０．５　Ｘ　１０ −７へ−３Ｘ　１０−７ｇである特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、アミノ多糖類の付着量は前記表面の面積１ｃｌＴ１′当り約０．５　Ｘ　 ｌｏ−７〜３Ｘ１０−７ｇである特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２０、生物学的物質を第２実質表面部分に付着する工程をさらに含む特許請求の 範囲第１６項記載の方法。 ２１、生物学的物質の付着は該生物学的物質を第２実質表面部分上に静電吸着さ せることからなる特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、生物学的物質の付着は該生物学的物質を第２実質表面部分に共有結合させ ることからなる特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３、多糖類の被覆は前記表面をアミノ多糖類と該表面がアミン多糖類の単分子 層で覆われるに十分な量以−にの分量で接触させ、 過剰のアミン多糖類を前記表面から若干又は全熱塩分を有しないほぼ中性の水溶 液で洗浄して前記表面に静電的に結合したアミン多糖類の一部を残し、残存する アミン多糖類の一部を交差結合する工程からなる特許請求の範囲第１５項記載の 方法。 ２４、交差結合はハロゲン化シアン化合物を残存アミン多糖類の一部と反応させ ると同時に第２実質表面部分を露出させることからなる特許請求の範囲＄２３項 記載の方法。 ２５、ハロゲン化シアン化合物はハロゲン化シアンとエタノールとの反応生成物 である特許請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６、アミン多糖類の交差結合量は前記表面の面積１ｃｒｒｆ当り約０．５Ｘ１ ０〜３ＸＩＯｇである特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２７、生物学的物質を第２実質表面部分に付着する工程をさらに含む特許請求の 範囲第２３項記載の方法。 ２８、生物学的物質の付着は該生物学的物質を第２実質表面部分上に静電的に吸 着させることからなる特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９、生物学的物質の付着は該生物学的物質を第２実質表面部分に共有結合させ ることからなる特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ３０、前記表面か水溶性活性化剤と反応し得る活性基を有する場合、該表面を水 溶液中でアミン多糖類化合物および前記水溶性活性化剤と接触させて被覆を行う 特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ３１、水溶液はほぼ中性で、はとんど塩を含イ１せず、アミン多糖類の分量は前 記表面を完全に覆うには不十分なものである特許請求の範囲第３０項記載の方法 。 ３２、活性化剤は水溶性カルボジイミドである特許請求の範囲第３０項記載の方 法。 ３３、アミン多糖類の付着量は前記表面の面積１ｃｒｎ’当り約０　、５　Ｘ　 Ｉ　Ｏ−７〜３ＸＩＯ−７ｇであるｌＰｆ訂請求の範囲第３０項記載の方法。 ３４．７ミノ多糖類化合物は接触］工程により第１実質表面部分上の活性基に共 有結合される特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３５、生物学的物質を第２実質表面部分に付着する工程をさらに含む特許請求の 範囲第３０項記載の方法。 ３６、生物学的物質の付着は第２実質表面部分１−の活性基に対する生物学的物 質と活性化剤（＝ｊ加物との反応を介して前記生物学的物質を第２実質表面部分 に共有結合させることからなる特許請求の範囲第３５ｆＡ記載の方法。 ３７、生物学的物質の伺着前に任意過剰の活性化剤を洗浄除去する工程をさらに 含む特許請求の範囲第３６項記載の方法。 ３８、前記表面が活性化剤化合物と反応し得る活性基を含有する場合、該表面を 過剰の前記活性化剤化合物と任意過剰量の活性他剤化合物を洗浄除去し、生物学 的物質を活性化剤付加物全てと反応す１に不十分な量で前記表面上の活性基に添 加して該生物学的物質を第２実質表面部分に共有結合させ、該表面を洗浄し、 前記表面を水の存在下アミノ多糖類化合物と接触させてそのアミノ基の反応によ り該アミン多糖類化合物を第１実質表面部分に共有結合させる工程からなる被覆 を行う特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ３９、活性化剤は水溶性カルボジイミドである特許請求の範囲第３８項記載の方 法。 ４０、前記表面が活性化剤と反応し得る活性基を含有する場合、アミン多糖類を 第１実質表面部分に付着し、前記表面を水溶性活性化剤と接触させて前記活性基 との付加物を第２実質表面部分上に形成し、該付加物を生物学的物質と反応させ て該生物学的物質を前記活性基を介して第２実質表面部分に共有結合させる工程 からなる被覆を行う特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ４１、活性化剤はカルボジイミド活性化剤である特許請求の範囲第４０項記載の 方法。 ４２、支持体は複数の水懸濁性粒子よりなる特許請求の範囲第１５項記載の方法 。 ４３、支持体を検出信号を付与し得る標識で標識付けした特許請求の範囲第３９ 項記載の方法。 ４４、標識は色付与剤であり、信号は色そのものである特許請求の範囲第４３項 記載の方法。 ４５、支持体は巨大拡張性表面を有する巨大拡張性支持体である特許請求の範囲 第４１項記載の方法。 ４６、巨大拡張性支持体は巨大拡張性表面を画成するウェルな有する特許請求の 範囲第４５項記載の方法。 ４７、第１の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第１の結合部位 を有する特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴して含有する試料水溶液を増大 した特異性および感度で検定するに当り、前記特異的結合蛋白質を他の蛋白質類 と同伴することができ、多糖類コーティングで遮蔽された第１の実質表面部分と 前記第１生物学的物質が付着した第２の実質表面部分とからなる第１の水不溶性 表面を有する第１の固体支持体を前記試料水溶液と接触させ、前記付着した第１ 生物学的物質に結合した特異的結合蛋白質の量を検出することを特徴とする試料 水溶液の検定方法。 ４８、検出前に前記試料水溶液を第１固体支持体から分離することを含む特許請 求の範囲第４７項記載の方法。 ４８、支持体は複数の粒子よりなる特許請求の範囲第４７項記載の方法。 ５０、粒子を検出し得る標識で標識付けしてなる特許請求の範囲第４８項記載の 方法。 ５１、支持体は巨大拡張性表面を有する巨大拡張性支持体である特許請求の範囲 第４７項記載の方法。 ５２、巨大拡張性支持体は前記巨大拡張性表面を画成するウェルを含有する特許 請求の範囲第５１項記載の方法。 ５３、多糖類はアミノ多糖類であり、生物学的物質を第２実質表面部分にカルボ キシル基を介して付着する特許請求の範囲第４７項記載の方法。 ５４、検出工程は、第２の生物学的物質に対する特異的パートナ−となる第２の 結合部位を有する特異的結合蛋白質と他の蛋白質類を同伴することができ、多糖 類コーティングにより遮蔽された付加的第１の実質表面部分と、前記第２生物学 的物質が付着した付加的第２の実質表面部分とからなる第２の水不溶性表面を有 する複数の粒子で構成した第２の固体支持体を含有する水溶液を前記巨大拡張性 表面と接触させ、該巨大拡張性表面部材に対する前記粒子の付着度合を観察する ことからなる特許請求の範囲第５１項記載の方法。 ５５、粒子を検出し得る標識で標識付けしてなる特許請求の範囲第５４項記載の 方法。 ５６、第１の実質表面部分と第２の実質表面部分とから主としてなり、生物学的 物質に対する特異的結合パートナ−となる特異的結合蛋白質に結合するための能 力を有する水不溶性表面に対する不所望な蛋白質類の付６丁 着を減するに当り、 前記第１実質表面部分を多糖類コーティングで遮蔽し、 前記生物学的物質を前記第２実質表面部分に付着させることを特徴とする不所望 蛋白質類の付着を減する方法。 ５７、遮蔽工程を付着工程の前に行う特許請求の範囲第５６項記載の方法。 ５８、遮蔽工程と付着工程とをほぼ同時に実施する特許請求の範囲第５６項記載 の方法。 ５９、付着工程を遮蔽工程の前に行う特許請求の範囲第５６項記載の方法。 ８０、前記表面が巨大拡張性支持体上にある特許請求の範囲第５６項記載の方法 。 ８１、第１の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第１の結合部位 と、第２の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第２の結合部位と を有する特異的結合蛋白質を他の蛋白質類と同伴して潜在的に含有する試料を検 定するためのキットにおいて、 前記特異的結合蛋白質および他の蛋白質類を同伴することができ、多糖類コーチ イブで遮蔽された第１の実質表面部分と前記第１生物学的物質が付着した第２の 実質表面部分とから主としてなる第１の水不溶性表面を有する固体巨大拡張性支 持体と、 前記特異的結合蛋白質と他の蛋白質類とを同伴することができ、多糖類コーティ ングで遮蔽された第１の実質表面部分と、前記第２生物学的物質が付着した第２ の実質的表面部分とから主としてなる第２の不溶＋＋衣表面それぞれ有する複数 の固体粒子とを具えてなる試料の検定用キット。 ６２、粒子は検出信号を付与し得る標識で標識伺けされてなる特許請求の範囲第 ６１項記載のキット。 ６３、標識は色（＝ｊ与剤で、信号は色そのものである特許請求の範囲第６２項 記載のキット。 ６４、第１の生物学的物質に対する特異的結合パートナ・−となる第１の結合部 位と、第２の生物学的物質に対する特異的結合パートナ−となる第２の結合部位 とを有する特異的結合蛋白質を他の蛋白質類とともに同伴して潜在的に含有する 試料を検定するためのキットにおいて、 特異的結合蛋白質と他の蛋白質類とを同伴することができるが、これら特異的結 合蛋白質と他の蛋白質類との同伴を防止するよう遮蔽した第１の実質表面部分と 、前記第１生物学的物質が付着した第２の実質的表面部分とから主としてなる第 １の水不溶性表面を有する巨大拡張固体支持体と、 前記特異的結合蛋白質と他の蛋白質類とを同伴することができ、多糖類コーティ ングにより遮蔽された第１の実質表面部分と、前記第２生物学的物質が付着した 第２の実質表面部分から主どしてなる第２の不溶性表面をそれぞれ有する複数の 固体粒子とを具えてなる試料の検定用キット。 ６５、粒子を検出信号を付与し得る標識で標識伺けしてなる特許請求の範囲第６ ４項記載のキット。 ６６、標識は色付与剤で、信号が色そのものである特許請求の範囲第６５項記載 のキット。