JPS6051200A

JPS6051200A - 自家不和合性糖蛋白質

Info

Publication number: JPS6051200A
Application number: JP59108251A
Authority: JP
Inventors: アドリーン　イー．クラーク; シヤイオーリム　マウ; ロスリン　ホガート; マリリン　エー．アンダーソン; エリザベス　ジー．ウイリアムズ
Original assignee: Agrigenetics Research Associates Ltd
Current assignee: Agrigenetics Research Associates Ltd
Priority date: 1983-05-27
Filing date: 1984-05-28
Publication date: 1985-03-22
Also published as: NZ208297A; EP0127467A2; ATE74928T1; CA1241647A; AU578894B2; EP0127467B1; DE3485646D1; EP0127467A3; AU2873684A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、自家不和合性植物（特に、ナス科（ソラナ
シー科）およびアブラナ科（クルシフニラ科）の仲間で
１例えばニコチアナ・アラータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ａｌａｔａ　）　、つまり、装飾用タバコ。

リコペルシコン・ベルビアナム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓ　ｉ
ｃｏｎｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）　、つまり、野性トマト
およびブラシカ°オレラシア（Ｂｒａｓｓｒｃａ　ｏｌ
ｅｒａｃｅａ　＞　、つまり。

カリフラワーの一種（Ｂｒｎｓｓｅｌｓ　５ｐｒｏｕｔ
　）などの成熟花柱からの抗原性蛋白物質の本質的に純
粋な形式での同定および単離に関する。この花柱に特異
的な物質に関する研究により次のことが示されている。

それは、自家不和合性植物の自家不和合性遺伝子型に相
当し、かつ自家不和合性を制御する旦−遺伝子の産物で
ある。

それゆえに、この物質を用いれば花粉管の成長を制御し
うる可能性がある。例えば、自然な生殖母細胞の自家不
和合性および種間不和合性を制御。

誘導、あるいは促進するなどである。五−遺伝子および
その産物は、自家不和合性をもつ栽培植物を創製するた
めに用いることもできる。この方法で処理された植物は
、雑種種子の商業生産に大変価値あるものになるであろ
う。まとめると、この物質の有用性は次のとおりである
。

（ｉ）異系交配作物における自己の種子の生産。

（ｉｉ）新しい種間雑種作物の創造。

（ｉｉｉ　）一般に自家不和合性の作物における雑種種
子の商業生産に関する方法の開発。

ニコチアナ・アラータおよびリコペルシコン・ベルビア
ナムを含む多くの植物は、自分の花粉あるいは同じ五−
（あるいは自家不和合性）遺伝子型の植物の花粉により
受精することができない。

自家不和合性の分子的基礎は、植物の成熟花柱にΣ−遺
伝子蛋白物質が存在することにより、引き起こされると
信じられている。特に、ニコチアナ・アラータおよびリ
コペルシコン・ベルヒアナムの例では、このΣ−遺伝子
蛋白物質が花弁の色がつき始めたときのつぼみの発育過
程、その次の過程で開花した直後の未成熟過程、および
成熟した光沢を有する花柱をもつ花の花柱の抽出物中に
存在することが知られてきた。一方１．５Ｌ−遺伝子蛋
白物質は初期の発育過程の緑色葉および伸長した蕾には
存在しない。

自家不和合性を示す植物では、花粉および雌ずいの両方
に同じΣ−遺伝子が存在していて、花柱における花粉管
の成長が止められ授粉が行えない。

不和合性および和合性のいずれの授粉も最初の出来事は
明らかに同一である。花粉管が発芽し、柱頭のバビレの
間を、それから、花柱の連絡組織の細胞（原形質連絡に
より紋型ファイルに繋がっている）の間を細胞外へ成長
する。成熟すると、細胞外物質の粘度が低くなり花粉管
が細胞のファイルの間の無定形流動物質を通って成長す
る。花柱内のいくつかの点で不和合性な管の成長が止め
られる。このことが起こる花柱の正確な領域は周囲の温
度により変化する。成長する間の花粉管の挙動は次のこ
とを示す。該反応は成長しつつある花粉管と花柱の細胞
外成分との間の接触を包含する（特に成長しつつある花
粉管と五−遺伝子蛋白物質（前述）との接触）。

自家不和合性の一般的総説については以下の文献を参照
のこと：ｄｅ　Ｎｅｔｔａｎｃｏｕｒｔ　（１９７７）　＋　Ｉ
ｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｉｎＡｎｇｉｏｓｐｅ
ｒｍｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉ
ｎ；　１ｌｅｓｌｏｐ−１１ａｒｒｉｓｏｎ　（１９７
８）　１Ｐｒｏｃ、Ｒｏｙ、Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ　
Ｂ、　２０訂７３；　Ｌｅｗｉｓ　（１９７９）　Ｎ、
Ｚ、Ｊ、Ｂｏｔ、　１７　：　６３７　；　Ｐａｎｄｅ
ｙ（１９７９）　、　Ｎ、Ｚ、Ｊ、Ｂｏｔ、　１７　：
　６４５　およびＭｕｌｃａｈｙ（１９８３）　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２２０　：　１２４７．自家不和合性は雌の
両性化種子植物が自家授粉の後に接合体を作らないこと
として定義される。２つの型の自家不和合性（胞子体不
和合性および配偶体不和合性）が認められている。胞子
体不和合性においては、花粉の挙動は花粉を産生ずる植
物の遺伝子型により決まる。この型の不和合性は例えば
アブラナ科（クルシフニラ科）やキク科（コンポジテ科
）に見られる。もし、花粉の両親における五−遺伝子の
一つの対立遺伝子が雌のＭ織にも存在したら、花粉管の
成育は、花類の表面で阻害される。配偶体型の場合、花
粉の挙動は花粉の遺伝子型のみにより制御される。不和
合性の花粉管の成長は花類の表面ではなく花柱の中で止
められる。制御は通常。

多くの対立遺伝子をもつ一つの遺伝子領域（Σ−遺伝子
）を通して媒介される。花粉管が持っている与えられた
対立遺伝子と同じ対立遺伝子がもし花柱内に存在すると
花粉管の成長が阻害される。

配偶体多対立遺伝子型は花が咲く植物の自家不和合性の
先祖の形態と思われる。そして胞子体型はこれから派生
したものであると考えられる。２つの型における旦−遺
伝子の産物は構造的に関連があるかもしれない。

５種の配偶体自家不和合性植物および２種の胞子体不和
合性植物がある。それらにおいて、３Ｌ−遺伝子型に明
らかに関係する花柱や花類の違いが電気泳動的および免
疫的に発見されている。ニコチアナ・アラークにおいて
、特異的バンドと３つのΣ一対立遺伝子グループに関係
のあることが花柱抽出物の等電点焦点法により示された
（Ｂｒｅｄｅｍｅｉｊｅｒａｎｄ　ｌ１ｌａａｓ　（１
９８１）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　
５９　：　１８５）。

２つの主な抗原性成分がピルナス・アビムの成熟花柱に
おいて同定されている。　そのうちの一つ（旦−抗原）
は１つの特別な旦一対立遺伝子グループに特異的であっ
た（Ｒａｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）Ｐｌａｎ
ｔａ　１５３　：　１２５　；およびＭａｕ、　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８２）Ｐｌａｎｔａ　１匹＝５０５）。

抗原性成分、糖蛋白質はゲル濾過およびイオン交換クロ
マトグラフィーにより単離されている。２次元ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）により２つの成分（分子量がそれぞれ３
７．０００および３９，０００　’）が解析された。そ
の各々はｈｈの遺伝子型の栽培植物の２倍体花柱物質中
のｈおよびｈ産物に相当すると思われてきた。該物質は
、５３Ｓ４栽培植物の花粉管のインビトロ（ｉｎｖｉ　
ｔｒｏ）成長の有効な阻害剤となる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ
　ｅｔａｌ、　（１９８２）　Ｐｌａｎｔａ旦６　：　
５１７）。盈一対立遺伝７型グループに相当し、ウサギ
において効果的抗原である。花柱の成分は　Ｌｉｎ５ｋ
ｅｎｓ　（１９６０）、Ｚ、［ｉｏｔ。

４８　：　１２６により報告されたように、ペチュニア
ハイブリダ中で発見された。電気焦点法により分離した
リリウムロンジフロリムの４つの花柱蛋白質は花柱を５
０℃で加熱処理した前後で明らかに異なることが報告さ
れている。Σ−遺伝子産物は熱に弱いと考えられている
。なぜなら、５０°Ｃの加熱処理で自家不和合性はなく
なるからである。それゆえに、加熱処理で消失したハン
ドは旦−遺伝子産物に相当するのかもしれない（Ｄｉｃ
ｋｊｎｓｏｎ＋　ｅｔ旦、　（１９８２）、Ｐｒｏｃ、
Ｒｏｙ、Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂ、　２１５　：　４
５）。

トリホリム　ブラランスの花柱の導管の流動体がら単離
した分子Ｍ　２４，０００の蛋白質は、自家不和合性に
必要なのかもしれない（Ｈｅｓｌｏｐ　−Ｈａｒｒｉｓ
ｏｎ（１９８２）　八ｎｎ、Ｂｏｔ、４二９　：　７２
９）。

ブラシカ・カメストリスの遺伝子型すに相当する糖蛋白
質は、柱頭の抽出物からゲル濾過、続いて、　Ｃｏｎ−
Ａ−セファロース（登録商標Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｉｎｃ、Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）上でのアフ
ィー’−ティークロマトグラフィー、次いで９等電点焦
点症（Ｎｉｓｈｉ。

ａｎｄ　ｌ１ｉｎａｔａ　（１９７７）　Ｊａｐ、Ｊ、
　Ｇｅｎｅｔ、　５４　：　３０７）により単離されて
いる。該蛋白質はρＩ５．７で分子量５７．０００　（
ＳＤＳ−ＰＡＣ；Ｅによる）蛋白質と炭水化物の比がｌ
：１．２であった。核蛋白質は花柱および子房には存在
しない。同様の手法を用いて。

Ｎ１５ｈｉｏとｌ１ｉｎａｔａは対立遺伝子型上□、旦
ユおよびΣと　についてホモ接合体のブラシカ・オレラ
シア植物の柱頭の抽出物から五−特異的糖蛋白質を単離
した（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１００：　６４１　（１９８
２））　、該糖蛋白質はそれぞれ高いｐ［００，３，１
１，１および１０．６　）をもち、蛋白質と炭水化物の
比はそれぞれ１　：ｏ、ｏｓ　（ΣユおよびΣ□）およ
び］：０．２（Σヨ）であった。糖蛋白質の分子量（ソ
デウム・ドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動；　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる）は見かけ上Σ
ユおよびＳ３９は５７，０００であった。糖蛋白質Σユ
は見かけ上、異種成分からなっていた。２次元　５ＤＳ
−ＰＡＧＥにより分子量６０，０００と６５，０００の
２つの成分がわかった。各々の分離したΣ〜特異的糖蛋
白質による抗血清は、その同種の糖蛋白質のみならず他
のブラシカ・オレラシアの２つの盈−特異的糖蛋白質お
よびブラシカ・サンペストリスのΣ１特異的糖蛋白質に
対しても沈澱する（ｌｌｉｎａｔａｅｔ　ａｌ、　（１
９８２）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１００　；　６４９）。

Ｆｅｒｒａｒｉらは同様のΣ−特異的糖蛋白質を、異な
る手法により、ブラシカ・オレラシアの柱頭の抽出物か
ら単離した（（１９８１）　ＰＩａｎＬ、Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　６７　：　２７０）。

該糖蛋白質による５ＺＳＺ花粉の前処理により１通常の
和合性の柱頭上で花粉の発芽が妨げられた。このことは
、この処理が生物学的に活性であることを示している。

もう１つの部分精製がＦｅｒｒａｒｉら（１９８１）に
より報告されている。それによれば。

蔗糖密度勾配沈降およびコマジ−ブルー染色により同定
した蛋白質が入っているゲルにおける二重拡散試験を用
いた。

ニコチアナ・アラークの花柱から抽出されたパーオキシ
ダーゼイソ酵素は盈−遺伝子特異的であると報告されて
いる（Ｐａｎｄｅｙ（１９６７）、　Ｎａｔｕｒｅ〜η
１：６６９）　、その後、　Ｂｒｅｄｅｍｅｉｊｅｒと
旧ａｓｓは同じ種を用いて、旦−遺伝子型とパーオキシ
ダーゼイソ酵素のパターンとの間に相関を見つけること
ができず、パーオキシダーゼはＳ　−１Ｊｔ域と近接し
て連鎖している遺伝子によりコードされていると結論し
た（（１９８０）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、５７　：　１１９）。

ニコチアナ・アラータの花柱中のイソ酵素の１つが花粉
管の成長に必要ではないかと言われたが（Ｂｒｅｄｅｍ
ｅｉｊｅｒ　ａｎｄ　Ｂｌａｓｓ　（１９７５）　八ｃ
ｔａ　Ｂｏｔ、Ｎａｅｒｌ。

２４　：　３７）、後に、このイソ酵素は花柱の皮層に
生し、伝達組ｍ（花粉管成長部位）には無いことがわか
った（Ｂｒｅｄｅｍｅｉｊｅｒ　（１９７９）八ｃｔａ
　Ｂｏｔ、Ｎｅｅｒｌ。

２８　：　１９７）　、　Ｎａ５ｒａｌｌａｈ、　ｅｔ
　ａｌ、　（１９７０）　ｌ１ｅｒｅｄｉｔｙ２５　：
　２３．およびＮ１５ｈｉｏ　ａｎｄ　１ｌｉｎａｔａ
（１９７７）　１ｌｅｒｅｄｉｔｙ３８　：　３９１　
らは−Ｓ−一遺伝子型とブランカ・オレラシアの柱頭の
抽出物中のパーオキシダーゼイソ酵素のパターンとの間
に、何の相関も発見できなかった。これゆえに、もしあ
るとしても不和合性反応中でのパーオキシダーゼイソ酵
素の役割は不明である。

現在の研究においてニコチアナ・アラータの異種接合体
の自家不和合性遺伝子型虹りおよびｈｂからの花柱の抽
出物は、異種接合体の遺伝子型から生した同種接合体自
家不和合性遺伝子型Ｓ２５２および５３Ｓ３からの花柱
の抽出物と同様に、自家不和合性遺伝子型に相当する成
分物質について調べられている。ゲル電気泳動およびイ
ムノプロットアッセイを含む免疫学的方法がさまざまな
花柱の成分物質の性質の探究に用いられている。同様に
。

リコペルシコン・ベルビアナムの異種接合体自家不和合
性遺伝子型５１５２．５Ｏ５ｓおよびｂｂからの花柱抽
出物も五−蛋白物質について調べられている。

この研究の結果として、糖蛋白物質は、ニコチアナ・ア
ラータのすべての遺伝子型Ｓ＋鉦、　５ｔｈ。

−５２Ｓ２および５３Ｓ３．およびリコベルシコン・ベ
ルビアナムの遺伝子型Ｓ＋Ｓｚ、　Ｓｚｈ、Ｓ＋Ｓｚ、
ｈＳｚ、Ｓ＋Ｓｓおよび旦山の花柱の抽出物の分子量３
０　、０００の領域において同定されている。分子量３
０，０００　ＦＪ域のこれらの糖蛋白物質は、下達のよ
うに、Σ−遺伝子蛋白質として同定されている。

盈−遺伝子蛋白質という言葉は、以後、Σ−遺伝子によ
りコードされている蛋白質を示すのに用いる。）Ｉ遺伝
子によりコードされる蛋白質は次の基準を満たしていな
ければならない。

（１）五一対立遺伝子と一緒に分離すること；（２）花
柱無いの細胞外部位に存在する。それは空洞の花柱の粘
液中、あるいは壁か固体伝達組織をもつ花柱の伝達管細
胞の細胞外母組織の中に存在する。つまり、該蛋白質は
花粉管と接触する部位になければならない；（３）分化中の花柱において、該蛋白質が生じる時に、
同時に自家不和合性が発現しなければならない。多くの
種では、自家不和合性は未成熟な花柱では発現しない。

該）−遺伝子蛋白質は初期の分化過程では生じないはず
である。前述の基準に加えて、−呈一一遺伝子蛋白質の
インビトロ・アッセイでの生物学的活性は、前述の旦−
遺伝子蛋白質がそれ自身で花粉管成長を妨げるのに機能
的に活性をもつということを示すことが理解されるであ
ろう。しかしながら、活性成分は修飾された蛋白質が二
次産物である可能性もある。そのような場合。

五−遺伝子蛋白質の生物学的活性をバイオアッセイ系に
おいて証明するために他の成分の活性を要求するかもし
れない。ここで用いるように、蛋白質ということばは糖
蛋白質を含む。糖蛋白質とは蛋白質に１つあるいはそれ
以上の炭水化物グループが共有結合で結合しているよう
に修飾された蛋白質をいう。

以後の抗体および抗血清に関する議論において。

特に定義しない限り、抗体および抗血清という用語はモ
ノクローナルおよびポリクローナルの両方の抗体および
抗血清を含む。

非常に関連があるが、別個である糖蛋白物質は。

５ＤＳ−ＰＡＧＥのゲルで同定される。それは独立の遺
伝子型の研究に相当する。各々の遺伝子型について、遺
伝子型に特異的な糖蛋白質は花が成μ）したときにのみ
見られ、花弁の色が最初に見えた時および後の成ｙ／Ｈ
過程の蕾の花柱の抽出物にのみ発見でき、初期の蕾の過
程では発見できない。

２次元ゲルはこれらの糖蛋白質の遺伝子型特異性を確か
にし、これらがリコペルシコン・ベルビアナムの鉦遺伝
子蛋白質（ｐ＋　７．６）を省いて高い等電点をもつこ
とを示している。

この発明の重要な点は、花柱の抽出物によりできたウザ
ギ抗血清およびモノクローナル抗体が次のことを示すと
いうことがわかったことである。

すべての遺伝子型に特異的な糖蛋白質は抗原性を持ち、
また免疫学的に交叉反応し、完全に同一ではないが、異
なるＳ一対立遺伝子の産物間にかなりの構造的同一性が
あるということである。これら主−遺伝子型の連結した
抗原性糖蛋白質と５他の自家不和合性作物、および園芸
植物の花柱からの抽出物との間の免疫学的交叉反応性は
また次のことを示している。各々の場合におけるΣ−遺
伝子産物は高度に保存されている。つまりそれらは化学
的に密接に関連しているということである。

これらの抗原性糖蛋白物質の詳細および単離。

同定については後述する。

第１図および第２図はそれぞれ和合性および不和合性の
授粉における花粉管の成長の状態を示す顕微鏡写真であ
る。両図とも授粉後１反応の一部を縦に切り花粉管に特
異的な螢光染色剤で染色した後の顕微鏡写真である。第
１図において、ｂおよびシ４の両方の対立遺伝子が発現
している花柱がシーあるいはｈ対立遺伝子が発現してい
る花粉で授粉されている。花粉管が、直接、子房に成長
している。第２図において、花粉の対立遺伝子型が花柱
と一致している。花粉の成長が花柱の上部で止められて
いる。第３図は遺伝子型が５Ｉ５２．　Ｓｚｈおよび５
Ｉ５３の成μ（リコペルシコン・ベルビアナム。

および遺伝子型が５ｚＳｚ、　ｈｓｉ、５ｚＳｚおよび
鉦りのニコチアナ・アラークの花柱すべての抽出物の部
分的２次元ゲル電気泳動の結果である。さまざまな同定
された五−遺伝子型に関係したバンドがあり、銀染色お
よびコマジ−プル染色により見られる。

第４図は遺伝子型が鉦り、鉦Ｓ：ｌ、５ＺＳ３．　Ｓ−
＋Ｓ−＋。

ｈｈおよヒＳ　ｚ　Ｓ　２のリコベルシコン・ベルビア
ナムの花柱の抽出物の２次元ゲル電気泳動での分離を示
す。さまざまな同定された遺伝子型に関係するバンドが
ある。我々は新しい対立遺伝子（Ｓ４）を育種により同
定した。　そしてそれは花柱抽出物中に新しい糖蛋白質
として分離されることがわかる。我々はまた２つの新し
い同型接合体ｈｈおよびｈｈを有している。それらは育
種により同定された。花柱抽出物は、接合体中の対立遺
伝子のものである唯一のスポットを有する。常に２分子
両がΣ−遺伝子に関連したハンド（破線の輪）より少し
大きい２つの共通した成分がある。

第５図はここで述べる部分的２次元ゲル電気泳動法の説
明図である。

第６図はさまざまな発達過程における自家不和合性のニ
コチアナ・アラータの遺伝子型の全花柱抽出物のソディ
ウム・ドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。図中Ａは
成熟孔、Ｂは開花未成熟孔、Ｃは花弁着色開始、Ｄは伸
長緑色蕾そして、Ｅは緑色蕾を示す。

第７図〜第１０図はイオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過あるいはアフィニティー結合およびゲル濾過によ
り遺伝子型りのニコチアナ・アラータの３２ｋｄ　Ｓ−
遺伝子蛋白質の精製の過程を示す。第７図はニコチアナ
・アラータ花柱抽出物のＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー；第８図はＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー後のＳ、［蛋白質のバイオゲルＰ１５０ク
ロマトグラフィー；第９図はＤＥＡＥ−セファロースク
ロマトグラフィー後の与−糖蛋白質画分のＣｏｎ　Ａ−
セファロースアフィニティークロマトグラフィー；第１
０図はＣｏｎ　Ａ−セファロースクロマトグラフィー後
の５２−Ｉｆｆｉ蛋白質のバイオゲルＰ　１５０クロマ
トグラフイーである。

第１１図は遺伝子型がｈＳ＋およびｈｈのニコチアナ・
アラータの花柱の抽出物の免疫沈澱を示す。

これはニコチアナ・アラータ、プルナス・アビウムおよ
びリコペルシコン・ベルビアナムの１２１１−標識花柱
抽出物のプルナス・アビウムの精製Ｓ−糖蛋白質に対す
るウサギ抗血清との免疫沈澱である。抗血清をプロティ
ンＡ−セファロースのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより部分精製した。ウサギ抗血清は、リコペルシコ
ン・ベルビアナム、ニコチアナ・アラータ（５１５３）
　、特に精製したブラシカ・カンペストリス（Ｓ？）が
らのΣ−糖蛋白質および精製したプルナス・アビウム（
５２５４）からのΣ−糖蛋白質により引き起こしたもの
である。

第１２図は、ニコチアナ・アラータ、プルナス・アビウ
ム、リコペルシコン・ベルビアナムの花柱のブラシカ・
カンペストリス（Ｓｖ）がら部分精製したΣ−遺伝子型
に関係する糖蛋白質により引き起こした抗血清との免疫
沈澱による免疫交叉反応を示す。これは５２５１　（Ａ
　）および５３５３（Ｂ）遺伝子型の１２５１−標識ニ
コチアナ・アラータ花柱抽出物の以下のものに対するウ
サギ抗血清との免疫沈澱である：１がりコペルシコン・
ベルビアナム（５１５３）の未分画花柱抽出物；２がニ
コチアナ・アラータ（抽）の未分画花柱抽出物；３が叶
。

１１ｉｒａｔａから供与されたブラシカ・カンペストリ
ス（Ｓ？）の精製Ｓ−糖蛋白質；そして４がプルナス・
アビウム（Ｓ３Ｓ４）の精製Σ−糖蛋白質である。

第１３図は、ニコチアナ・アラータ、プルナス・アビウ
ムおよびリコペルシコン・ベルビアナムからの花柱の抽
出物の精製したプルナス・アビウムの糖蛋白質に対する
精製したウサギの抗血清による免疫沈澱を示す。　第１
４図は５１５３．５２５３１ｈｈおよび抽遺伝子型の花
柱抽出物の遺伝子型５Ｉ３３　にニコチアナ・アラータ
）の未分画花柱に対する抗血清を用いたウェスタンプロ
ットである。

最初に第１図および第２図について述べる。第１図では
１図式化した和合性授粉（例えば５１５２および５ｓＳ
ａの遺伝子型間の）において花粉管は正常な成長をして
いる。しかるに、第２図では自家不和合性授粉（例えば
釘す遺伝子型間による）においては花粉管の成長は止め
られているのがわかる。

この研究に用いる植物は自家不和合性の異種接合体遺伝
子型ｂｂおよび油のニコチアナ・アラータそして異種接
合体遺伝子型５ＩＳ２．５＋５３．５２Ｓ３および５３
Ｓ４のリコペルシコン・ベルビアナムに基礎を置く。同
種接合体自家不和合性遺伝子型はこれらの異種接合体か
ら花の蕾の自家授粉により作る。なぜなら自家不和合性
は初期の蕾の段階では発現せずに、蕾に緑やピンクの色
がつき始めた分化の段階で発現するから。使用した方法
を次に示す。

（以下余白）同種　合　を作るための蕾の授粉伸長した緑の蕾（ステージＤ第５図）の時期の５２Ｓ３
および虹りの異種接合体植物である。ニコチアナ・アラ
ータもしくはりコベルシコン・ベルビアナムから生じた
蕾をビンセットで注意深く花冠を細長く切り静かに未成
熟の杓を取り除いて除雄を行う。除雄してから２４時間
後（らようど花弁の色が付く前で、ステージＤとＣの間
、第５図）。

未成熟柱頭をもう１つの花から裂開した成熟的からの自
家花粉で授粉させる。授粉に先だし、柱頭の表面は次の
いずれかでおおう必要がある。

（１）成熟柱頭２つを静かに触れ合ねセで滲出させたも
の２　もしくは（ｉｉ　）ガラスのベトリ皿上に１５％蔗糖ｏ、ｏｏｔ
％ホウ＃Ｉ溶液を１滴おとし、そこへ柱頭を注意深くつ
けたもの。

この処理の後で柱頭を成熟花粉を含んだガラスのベトリ
皿に静かにつけるか、細かなプラノで柱頭の表面に花粉
を注意深くブラシがけするかで授粉させた。未成熟孔が
落ちるのを防くために花軸に新鮮なラノリン中の１％（
−八）インドール酢酸（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ、Ｎｏ、　
１−１２５０）を端が平らなスパチュラでぬりつけた。

蕾で授粉させた植物を２０’Ｃでフィトロン（Ｐｈｙｔ
ｏｔｒｏｎ）中で一定の湿度を保つ。そして花軸に札を
つけて標識とする。６週間後成熟し、乾燥した種子のさ
やを得た。

Ｆ、子孫の遺伝子型は既知の自家不和合性遺伝子型の試
験体と交雑することにより調べた。

抗原性糖蛋白物質の単離、同定に用いた一般的な方法は
次のとおりである。

花柱の収集および保存成熟した未授粉の花柱を、花弁に色が付く段階（ステー
ジＣ１第５図）の蕾を除雄した後２４〜４８時間後に集
めた。抗血清生産用の花柱は凍結乾燥後乾燥して一２０
℃で保存した収集物をただぢに用いる。蛋白質分析（ゲ
ルあるいは精製）のために抽出した花柱は新鮮なものが
あるいは一７０’Ｃで保存しであるものであった。（花
柱（ｓｔｙｌｅ）をここでは花柱と柱頭を合わせたもの
として用いる。）的ｒ血−を調製するための１■出物の
調製花柱を乳鉢と乳棒で０°Ｃで５分間、　５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｌ、　ｐＨ８ｑ５．１　ｍＭ　ＣａＣ
Ｉｚ　、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、　１
０ｍＭ　ＮａＣｌ、　３％（ｗ／ｖ　）ポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ）中でずりつふした。３０ｍ１ｌの抽出
緩衝液につき大体４００の花柱（凍結乾燥重量で１ｇ新
鮮体で４．５ｇ）を用いた。抽出物を４０’Ｃで１０，
０００　ｇ１５分間遠心分離した。透明な緑の上澄液を
１ｍｒずつ分注して一２０℃で保存した。ウサギに注射
する前に１　ｎｕの上澄液を前もって０．００５　Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、　０．１５Ｍ塩化ナトリウムｐ
Ｈ７，４（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で平衡化した。セファデックス
Ｇ−２５カラム（１ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ　；　Ｖｏ＝５
．８ｍ１）に通した。

花柱を液体窒素で凍結させて壊し、乳鉢と乳棒を用いて
、細かい粉にすりつぶした。この粉末を５０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，５１ｍｍ　ＤＴＴ、　１０ｍＭ
　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴ八、　１ｍＭフェニルメ
チルスルフォニルフルオライド抽出した。（１００本の
花柱にっき１０ｍｎの抽出緩衝液）抽出物を１０，ＯＯ
Ｏｇで４℃１ｏ分間遠心分離した。上澄を１　ｍｌｌず
つ分注し，−２０’ｃで保存した。

抽出物の蛋白質濃度は旧ｏｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａ
ｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，　Ｉｎｃ．、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ＋Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）を用いて子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と
同様に決定した。

抗血清の調製粗花柱抽出物からニコチアナ・アラータのウサギを用い
て抗血清を次のように調製した。

Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント（１．５　ｍ　７り
中の０．５ｍｌにＩｍｇの蛋白質抗原を入れウサギの首
の後ろの皮下に何ケ所かに分けて注射するが，ワキ腹の
筋肉内に注射した。ウサギを再び６週間後さらに１ｍｇ
＋７）抗原（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント中）ヲ
注射した。７〜１０日後ウサギの耳の端の静脈から採血
し．血清を集め２００μβずつ分注し一７０’Ｃで保存
した。

特　的ｒ血？１の　疫　着免疫吸着を凍結乾燥した花柱（１５の花柱／Ｉｍｊ！抗
血清）と抗血清を保温する（０．５，　Ｌ　１．５，　
２。

２、５時間　於２０°Ｃ）ことにより行った。花柱を除
き．抗血清を１０，ＯＯＯｇで４°ＣＩＯ分間遠心分離
して他の残存物を除いた。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をしａｅｍｉ，　Ｕ．に、。

Ｆａｖｒｅ，Ｍ．（１９７３）　Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
．　８０　：　５７５−５８３に従って，　１２．５％
（−／ν）のアクリルアミドを用いて行った。試料緩衝
液に，　１．４３ｍ　２−メルカプトエタノールを加え
て，試料を還元し．そして、沸騰水中で２分間加熱する
。分子両標準品は，コマジ−ブルー染色用には，ホスフ
ェリラーゼＢ　（９４，０００）。

子牛血清アルブミン（６７、０００）卵白アルブミン（
４３．０００）　、カルボニックアンヒドラーゼ（３０
，０００）。

大豆トリプシン阻害剤（２０，　１００）およびβ−ラ
クトアルブミン（１４，４００）であり、電気泳動ブロ
ッティング用は（”’Ｃ）でメチル化した，ミオシン（
２００，　０００）　、ホスフェリラーゼＢ　（９２，
０００）　ＢＳＡ　（６９，ＯｏＯ）、卵白アルブミン
（４６，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０
，　０００）　、リゾチーム（１４，３００）であった
。

電気泳動は濃縮用ゲルでは２５ｍＡで泳動用ゲルでは４
０ｍＭで行った。　電気泳動後，ゲルは０．１４％（　
ｗ／ｖ　）コマジ−ブルー（４５％（　ｗ／ｖ　）メタ
ノール、９％（　ｗ／ｖ　）酢酸中）で染色するかニト
ロセルロースフィルターへ移すかした。

電気床φ的プロッティング電気泳動で分離したポリアクリルアミド中の蛋　□白質
（２０μｇ）を電気泳動的プロット装置（Ｂｉｏｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ＋　Ｃ
Ａ．ＵＳＡ）を用いて２０℃で２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｉ
ＩＣＩ，　２０％メタノール、　１５ｍＭグリシン、ｐ
Ｈ８．３中で０．１Ａで１２時間ニトロセルロースフィ
ルターに移し，結合させた。

合ノ的２゛ーゲル電〜泳動リコベルシコン・ベルビアナムの花柱の抽出物を６つの
花柱を２０μｌの抽出用緩衝液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＩＩＣＩ　ｐＨ８．５．　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．
１ｍ　ＮａＣ１．　１ｍＭ　ＣａＣＩｚ）存在下で細い
ガラス棒で軽くつふして調製した。

抽出物を１０，ＯＯＯｇ　４℃　１５分間遠心分離し，
上澄液を集め２次元ゲル電気泳動で試験した。

抽出物（１５μｐで約１５μｇの蛋白質を含む）をＬＫ
Ｂ，　アンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ−Ｐｒｏ
ｄｕｋｔｅｒ　ＡＢ，　Ｂｒｏｍｍａ，　Ｓｗｅｄｅｎ
（２４ｃｍ　Ｉｌｉｉ．　１０ｃｍ長）、アンフオライ
ン（ｐｌ＋　３．５−９．５）を含む）にのせた。等電
点焦点法を生産者側の指示で以下のとおりの変法により
行った：１０°Ｃで３．５時間電極間９ｃｍで一定電力
（１５ワツト）。電極液はＩＭ　ＮａＯｔｌ（陽性）と
Ｉ　Ｍ　ＩｈＰ０４（陰性）。ゲルはコマジ−ブリリア
ントブルーで染色する前に３０分間．　１０％ＴＣＡと
３５％スルフォサリチル酸で固定した。

蛋白質の帯（大体０．５ｃｍ）あるいは他の例でも。

選択する狭いｐ＋範囲からでがっ等電点焦点法ゲルから
の蛋白質を切り出し蒸留水（２００ｍＩＶ）に１０分間
浸し、それから１０ｍｎのＬＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　
ｐｔ１６．８に５分間移した。ゲル片を蒸留水でさらに
１゜分間洗ってからＳＤＳ試料緩衝液で１．５時間室温
で緩衝化させた。そして、第５図に示すように。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの上に置いた。

２次元目のゲル電気泳動はＬａｅｍｍｌ　ｉ　らの方法
（１９７３）で１５％のアクリルアミドを用いて行った
。蛋白質は銀試薬かコマジ−ブルーを用いて検知された
。

魚腹１ど之上ヱヱ皇土蛋白質を電気泳動的にニトロセルロース紙に移した後１
紙の上に残っている活性部位を紙を３％（ｗ／ｖ　）Ｂ
　Ｓ　Ａ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｆｉｃＩ、　ｐｉｆ
　７．４．０．９％（１１／ｖ　）ＮａＣｌ中）で２０
’ｃで１時間静かに攪拌しながら洗うことにより封鎖し
た。抗血清を１＝２５゜１　：　１００．１　：　２０
０に３％Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｔｒｉｓ−５ａｌｉｎｅ中）で
希釈し、静かに撹拌しながら２０℃で１．５時間ニトロ
セルロース紙と保温した。該ニトロセルロース紙をＴｒ
ｉｓ−食塩水中で２０℃　１０分間洗い、続いて０．０
５％（ｖ／ｖ　）Ｎ　Ｐ　−４０Ｔｒｉｓ−食塩水中（
登録商標、　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｄａｔａ　Ｌａｂｓ　
Ｅｌｍｈｎｒｓｔ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）で２０℃　１
０分間、それからＴｒｉｓ−食塩水中で２０℃１０分間
洗った。

プロティンＡ（４０Ｊｇ）を、イオトジェン法を用いて
１２Ｊ　（０，３ｍＣｉによる）で標識した（比活性Ｉ
　ＸＩＯ’　−Ｉ　ＸＩＯ５ｃｐｍ／＋ｉ７　ｇプロテ
ィンＡ）。

１２５１−プロティンＡ（２０Ｊｇ）を３％Ｂ　Ｓ　Ａ
　（Ｔｒｉｓ−食塩水中）で２００ｍ１１！に希釈し２
０°Ｃで静かに攪拌しながら０．５時間ニトロセルロー
ス紙で保温した。、該ニトロセルロース紙をＴｒｉｓ−
食塩水でそれから０．０５％　Ｎ　Ｐ　４０　（Ｔｒｉ
ｓ−食塩水中）でそれぞれ２０℃ＩＯ分間洗った。　最
後に、０．５％しりトンＸ−１００（登録商標、　Ｒｏ
ｈ＋ｎ　ａｎｄ　１ｌａａｓ　Ｃｏｒｐ、。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉ
ａ　）、　０．１％ＳＤＳ。

０．２５％ゼラチン５ｍＭ　ＥＤＴＡ　（Ｔｒｉｓ−食
塩水中）で静かに攪拌しながら２０℃で１時間洗った。

咳紙をプラスチ、クバ、りに封し込みＫｏｄａｃ　ＸＡ
Ｒ−５Ｘ線フィルム　（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　
Ｃｏ、、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）を−７０℃で
６〜１６時間感光した。

免役抜鋒■条件７０、Ｌ１７Ｈの緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７
，４，５０ｍＭ；ＮａＣｌ、０．４Ｍ；　ＥＤＴＡ、５
ｍＭ、Ｋ１．　５ｍＭ；　ＮＰ−４０，０，０５％；Ｐ
ＭＳＦ、　１ｍＭ）、　２０＃　Ｒのヨード化した抽出
物（１・・・＞　１０　ＸＩ０６ＣＰＭ）、５μｌの腹
水か１０μρの非免疫のネズミ血清か１０μｌのウサギ
の抗花柱血清を混合して４℃１時間保温する。この期間
の後、１０ｐ１．の抗ネズミ　ＩｇＧ　（ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅ　ＩｇＧ−５ｒｇｍａ　Ｍ８８９０）を加え、
混合物をさらに４℃で１時間保温する。

５ｔａｐｈ、ａｕｒｅｕｓの細胞懸濁液（２０μりを加
え混合物を遠心分離する（１０，０００ｇ；　５分間）
、沈澱物を免疫沈降用後緩衝液で３回洗い、それから５
ＤＳ−緩衝Ｓ　（ｌ　ＸＬａｅｍｍｌｉ　ｓａｍｐｌｅ
）中で９０℃で９０秒保温した。それを１２．５％緩衝
液アクリルアミドを用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥにより試験
した。

ニコチアナ＋アラータの花柱からの３２ＫＳ２−Ｆ−迫
ｊ駆すＬ袈ニコチアナ・アラーク（遺伝子型５ｚＳｚ）からの花を
花弁の色が付き始めたときに除雄した。２日後、完全に
成熟した花柱をはずして一７０°Ｃで保存した。（花柱
（ｓｔｙｌｅ）とは−緒にはずされた花柱と柱頭を言う
。子房は含まない。）凍らした花柱（３ｇ）を液体窒素
中で乳鉢と乳棒を用いて粉末にすりつぶした。　これを
さらに、５０ｍ１！の抽出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、　ｐｉ（８，５，１ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、１
０ｍＭ　ＮａＣｌ、　１ｍＭ　ＤＴＴ、　１０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、および１％へ／−）不溶ポリビニルピロリドン
）ですりつふす。　８亥摩砕液を遠心分離しく１２，０
００ｇ　；　１５分間）上澄液（１１ｍＡ）を集めた。

イオン交換クロマトグラフィーに先立ち花柱の抽出物（
ｌｌｍｊりをセファデックスＧ−２５（登録商標、　Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓ
ｗｅｄｅｎ）カラム（１，６ｃｍ直径；　２２ｃｍ長　
空間容積１１ｍ７りを通過させることによりＮＬＩＩＣ
；Ｏｓ　５ｍＭ　ｐＨ８，６，ＮａＣ１１ｍＭ、　Ｃａ
Ｃ１ｚ、　１ｍＭ、　ＥＤＴＡ　１ｍＭに平衡化させた
。

空間容積の後の最初の１６ｍｆｆ１の溶出液を集めて１
３ＥＡＦ、−セファロース（登録商標、　Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　Ｉｎ’ｃ、。

Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　（ゲル容積２６　
ｍＬ　１．６ｃｍ直径Ｘ　１３ｃｍ長）　〔同じ炭酸ア
ンモニウム緩衝液で平衡化させである。〕にのセた。Ｎ
ａＣｌ勾配（０〜０．５Ｍ）をかける前に酸カラムをこ
の緩衝液（５０ｍｊりで洗う。溶出の結果については第
７図に示す。溶出はＡ　２＋１０で監視した。各々の分
画について、５ＤＳ−ＰＡＧＥで３２に一５ｚ　ｔｉ蛋
白質の存在を調べた。

該ｈ−糖蛋白質は、第７図に示すように、結合していな
い分画（あや目引きの区域）に存在する。

それから、室温でロータリーエバポレーションにより最
終審Ｊｕ１６ｍｊ！まで濃縮した。該ｈ−糖蛋白質をさ
らにＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２Ｓ５　（登録商標、　ＢｉｏＲ
ａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、
　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）により大きさで分画した（第
８図）。また、　Ｃｏｎ　Ａ−セファロース（登録商標
、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、＋　Ｕｐｐｓａｌａ
。

Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した。続いて、３：０ゲルＰ−１５０に
よるゲル濾過で精製した（第９図、第１０図）。

ＤＴｉＡＥ−セファロースの非吸着画分（８ｍｊりをＮ
ｌｌ、ＨＣＯｚ　１０ｍＭ、ｐＨ８，５，ＥＤＴＡ　１
０ｍＭ、ＮａＣ１Ｏ，ＩＭ。

ＣａＣ１□１ｍＭで平衡化したバイオゲルＰ１５０カラ
ム（空間容積１４ｍＬ　直径１．６ｃｍ、長さ３６．５
ｃ＋ｎ）にかけた。溶出バクーンを第８図に示す。各両
分について３２ＫＳｚＦ蛋白質の存在を５ＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動で調べた。錐−糖蛋白質を含む両
分（画分９−１６）をまとめ、ロータリーエバボレーク
ーでｌ　ｍｅに濃縮した。

Ｃｏｎ　Ａ−セファロースを緩衝液（酢酸ナトリウム２
０ｍＭ、　ｐｌ！　７．８；　ＮａＣｌ　０．１Ｍ　；
　ＭｇＣ１ｚ　１ｍＭ　；　ＣａＣＩｚｌ　ｍＭ　；　
ＭｎＣ１ｚ　１ｍＭ）に？容解したメチル−α−１）　
−マンノシド（０，１Ｍ）、５倍量で洗った。洗浄Ｃｏ
ｎ　Ａ−セファロースを次いで重炭酸緩衝液（０，２５
Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ３ｐｌ＋　８．８）に移し、室温で１
時間保った。重炭酸緩衝液を１時間の間に４回交換した
。０．０３％（ν／Ｖ）グルタルアルデヒドを含む４倍
量のＮａ１ｌＣＯ３０，２５Ｍ。

ｐｌ＋　８．８を加え、　Ｃｏｎ　Ａ−セファロースを
次いで０．５ＭＮａＣｌを含むＮａ１ｌＣＯ＋　０．１
Ｍ、　ｐＨ８，０で洗い酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム１
０ｍＭ、　ｐＨ７，８；　ＮａＣｌ　０．ＩＭ　；Ｍｇ
ＣＩｚ　１ｍＭ　；　ＣａＣＩｔ　１ｍＭ　；　ＭｎＣ
ｌ２１ｍＭ）に再懸濁しカラム（直径０．８ｃｍ、長さ
１４ｃｍ）に充填した。ＤＥＡＥ−セファロースの非吸
着画分を酢酸緩衝液で平衡化し、酢酸緩衝液で平衡化し
たセファデックスＧ−２５に通し１次いでこのカラムに
かけた。非吸着物質を集め、カラムを１０倍量の酢酸緩
衝液で洗い。

吸着物質を酢酸緩衝液中の０．１Ｍメチル−α−Ｄ−マ
ンノシドで溶出させた。その様子を第９図に示す。画分
３４−３８を集め、ロータリーエバポレーターで１　ｍ
ｊ！に濃縮した。

０．１Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドで溶出し、集めた
両分を錐−糖蛋白質とメチル−α−Ｄ−マンノシドを分
離するためバイオゲルＰ１５０のカラムに通した（第１
０図）（空間容積１３ｍＣ直径１．６ｃｍ、長さ３６．
５ｃｍ　：　ＮＩＩａｌｌＣＯ：＋　１０ｍＭ　ｐｌ＋
　８．５．　ＥＤＴＡ　１０ｍＭ、　ＮａＣｌ　０．１
Ｍ、　ＣａＣＩｚ　１ｍＭで平衡化し、？８出）。

さらに、５２−Ｆ蛋白質の炭水化物分析を行う前には微
量のメチル−α−Ｄ−マンノシドを除くため。

バイオゲルＰ２に通し、水で溶出した。

蛋白質■　回収率％セフ７テフクス　Ｇ−２５りＵマドグラフィー　から回収された　２８．６花柱抽出物ＤＥＡＥ−セファトス　２．７９　９．７非吸着画分バイオゲル　Ｐ２Ｓ５　０．５６　２．０（画分９−１
６）　３．７ＣｏｎＡ−セファ０−ス　０．４９　１．７（画分３４
−３８）精製五−遺伝子蛋白質は、バンドを見るための銀染色ま
たはコマジ−ブルー染色いずれかによる５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動および２次元ゲル電気泳動の
判定基準から１本質的に均一であった。Ｎ−末端配列分
析は精製均質が他の蛋白質の５％以下の混入であること
を示した。前述の精製手順は当業者が適当に考えつくで
あろう変更により他の植物種の旦−遺伝子蛋白質の精製
に応用される。この精製手順で実質的に純粋な形の盈−
遺伝子蛋白質が得られる。　ここで用いる“実質的に純
粋な形”とは精製物質が、銀染色またはコマジ−ブルー
染色のいずれかの染色で、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で単一成分として移動すること、およびＮ
−末端配列で他の蛋白質の混在が５％以下であることを
意味する。

猪果全花柱　出物の部分２゛−ゲル電気泳動ニコチアナ・ア
ラータ５１５３．５２５３，５ｚＳｚおよびｈｂ；およ
びリコベルシコン・ベルビアナム５Ｉ３２゜演、鉦唇、
ｈｈおよび５ｓＳｚは分子量２０Ｋから１２０にの範囲
で複雑な蛋白質のパターンを示した。大部分のハンドは
全遺伝子型に共通であるが、Σ−遺遺伝梨型相関し得る
２０に〜３０にでは相違がある。

これらの相違は銀染色（第３図、上部）およびコマジ−
ブルーで染色（第３図、下部）したゲルに見られる。第
３図の各列は属のイニシャル（Ｌ−リフペルシコン。Ｎ
−ニコチアナ）および自家不和合性遺伝子型で示しであ
る。分子量指標は各ゲルセットの右端に示しである。

各ニコチアナ・アラータ遺伝子型と相関している五−遺
伝子蛋白質の分子量は１分子量指標から決定されるよう
に、Ｓ、に対しては約２７キロダルトン、ｈに対しては
３２キロダルトンである。わ、−遺伝子産物は約２３Ｋ
に移動した。しかし共通ハンドが同時にあるので明確な
指摘は困難であった。分子量範囲２３に〜３５にのΣ−
−伝子特異的蛋白質はそれらの対応する盈一対立遺伝子
の性質と、ここで）−遺伝子蛋白質に対して示したすべ
ての基準に合致することが観察された。精製ニコチアナ
・アラータｈ−遺伝子蛋白質はコマンーブルーまたは銀
染色で見られるように５ＤＳ−ポリアクリルアミドおよ
び２次元ゲルの両者で単一成分として移動した。リコペ
ルシコン・ベルビアナム花柱はす、ｂおよびシー遺伝子
蛋白質夫々に対して分子量約２５に〜２８にの遺伝子型
特異的蛋白質バンドを与えた。これらの蛋白質はさらに
下記の２次元ゲル電気泳動および他の基準により、Σ−
−伝子特異的であることが示された。

明確な蛋白質が同様にｈｈ、釘Ｓｚ、　ｈＳｚ、５ｉＳ
ｓ。

５３Ｓ４およびｈｈの花柱抽出物に認められた（第４図
）。Ｓｌ、Ｓ２−およびｂ−遺伝子蛋白質の分子量はい
ずれも約２８にであった。　虹−遺伝子蛋白質はＳ２＋
　ｓ：ｌおよびｈのものより低いｐＴ等電点を有してい
た。　２次元ゲル電気泳動は木質的には０’　Ｆａｒｒ
ｅｌ　Ｉら（１９７７）　Ｃｅ１ｌ　１２　：　１１３
３に準じた。

蛋白はｐＴ＞１．５の多数群と低いｐｉの小数群に分か
れた。五−遺伝子蛋白質は高ｐｉ群にあった。第４図に
示された遺伝子型と相関したハンドに加え。

すべての花柱抽出物に共通なｐｉ　＞９．５の２本の明
確なハンドが存在し５　これらは遺伝子型を相関したハ
ンドと近接して移動するが２分子量が高いことから区別
される。低いｐ＋範囲の他のノ＼ンドは抽出物毎に異な
ることが認められたが、これらの）＜ンドは特定の遺伝
子型と相関がない事がわかった。

花柱の”塾と）　したし柱蛋白′− 緑色蕾、伸長緑、花弁色を呈し始めた蕾、開花未成熟花
、光沢を帯びた花柱を有する成熟化などの発達段階のニ
コチアナ・アラーク鉦鉦およびｈｓｔ花柱の抽出物を調
製し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し
た（第６図、この図はまた種々の発達段階を図式化して
いる）。すべての抽出物に多数の蛋白質が検知され、こ
れらの中に。

仮にΣ−−伝子蛋白質と同定された分子量範囲３０にの
ものは、花弁色を呈し始めた蕾および以降の成熟段階の
抽出物中には存在したが初期蕾段階には存在したかった
。仮に五−遺伝子蛋白質と名付けたバンドの出現を第１
表に要約する。同様の結果はりコベルシコン・ベルビア
ナムの一呈一−遺伝子Ｗ白質についても認められた。１
つの実験でｈおよびｈ遺伝子蛋白質が緑色蕾の抽出物中
に極く少量存在した。これら成分の見かけ濃度は黄色蕾
および成熟孔の花柱抽出物中に順次増大した。これらの
結果により、さらに前述の基準に従って旦−遺伝子蛋白
質として述べられた蛋白質と同一であったことが確認さ
れる。

第１表異なった成μｍ段階のニコチアナ・アラータ（５１５３
および５２Ｓ３）花柱抽出物中のΣ−遺伝子蛋白質に相
当する蛋白質の出現。

△不和合性は発現されず一蕾自家授粉は成し得る。

＊不和合性発現−自家授粉不能。

ニコチアナ・アラータ３２Ｋ　Ｉ白′が３２−遺伝子１
３２に糖蛋白質が柱頭および花柱上部に花柱下部より高
濃度に存在することが２花柱の５ｎ切片の抽出物の５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動から明らかとなった。

３２ＫＩＰｉ蛋白質の最高濃度は花柱の上部に見られ、
そこは花粉管阻害が起こる区分でもある。同様にリコペ
ルシコン・ベルビアナムにおいて、ｈおよびｈ遺伝子蛋
白質は柱頭と花柱の頂部を含む第１区分および次の花柱
区分（２鰭区分）に比較的高濃度に存在した。これら成
分の見かけ濃度は花柱区分が子房に近くなるに従い低下
し、子房自身では検知されなかった。

ニコチアナ・アラーク３２にバンドに相当するバンドは
、ニコチアナ・タハカム、ニコヂアナ・ツルベストリス
、ニコチアナ・グラウカ、もしくはペチュニア・ハイブ
リダの花柱抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動では認められなかった一之、＠３２に花柱ハンドに相
当するハンドは花弁。

葉、子房等９ニコチアナ・アラータの他の組織の抽出物
中には認められなかった。　従って、この３２にバンド
は他の種々はニコチアナ・アラータの他の組織に共通の
蛋白質ではない。

３２ＫＳ２−遺伝子蛋白質の生物学的活性がＷｉｌｌｉ
ａｍｓら（１９８２）により報告されたインビトロ花粉
管増殖分析により示された。ｈ−遺伝子蛋白質は抽出緩
衝液にＥＤＴＡや他の２価イオン結合試薬を含まないと
き、２５μｇ／　ｍ７！で花粉管増殖を７０％阻害した
。これらの結果は）−遺伝子蛋白質の生物学的有効濃度
は花粉管増殖を阻害するよう作用し得ることを示した。

前述の実験はニコチアナ・アラータのｈ−遺伝子蛋白質
、およびリコペルシコン・ベルビアナムのｂおよびｈを
用いて極めて詳細に行ったが１発達発現の時期、物理的
性質９自家不和合性遺伝子型との相関および免疫的性質
の［（Ｕ性は、ここで述べた他の五−遺伝子蛋白質が種
々の植物種から同定された事を示している。という事が
１　当業者にとっては明らかであろう。ここで示された
発見と研究の結果、自家不和合性種の）−遺伝子蛋白質
は今、同定され、単離され、精製され、そして植物育種
に用いるための性格づけが成された。種間に亘剣Σ−遺
伝子蛋白質の基本的構造の類似性を顕す、その重要な性
質を次に述べる。

異型　物のＳ−゛　云−白　の　１的六〜一応性プルナ
ス・アビウムの五−蛋白質に対する抗血清をウサギから
調製し、　Ｍａｕ　ら（１９８２）に従い精製した。　
ニコチアナ・アラータ、プルナス・アビウムおよびリコ
ペルシコン・ベルビアナムノ花柱抽出物をＰｒａｋｅｒ
と５ｐｅｃｋ　（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　８０　：　８
４９のヨード化技術により１２５Ｉで標識した。標識さ
れた抽出物を前出の文献に詳述されている手順により免
疫沈澱さセた。

抗プルナス・アビウム盈−蛋白質血清は第１Ｉ図に示す
ようにプルナス・アビウムの五−蛋白質（３７Ｋ）に加
えてニコチアナ・アラータの３２Ｋ　釘−蛋白質および
リコペルシコン・ベルビアナムの約２８に五−蛋白質（
植物源が２つの）一対立遺伝子を有するので２本のバン
ドがある）を沈澱させた。

本質的に同じ手法により１種々の抗血清がｈｈおよび油
遺伝子型の１２５■−標識ニコチアナ・アラータ花柱抽
出物と免疫沈澱を生した。結果を第１２図に示す。各組
の列ＡおよびＢは遺伝子型５ｚＳｚ（Ａ）とＳ、Ｓ、（
Ｂ）を示す。番号を付けた各列の組はウサギ抗血清と以
下のものとの免疫沈澱を示ｔ　：　（１１１Ｊコペルシ
コン・ベルビアナムＳ＋Ｓｚの未分画花柱抽出物；（２
）ニコチアナ・アラータ虹りの未分画花柱抽出物：（３
）ブラシカ・カンペストリスｂの部分精製）−糖蛋白質
（Ｋ、ｌ１ｉｎａｔａにより調製され供給されたもの、
　Ｎ１５ｈｉｏと１ｌｉｎａｔａ　（１９８２）参照）
ｉ（４１プルナス・アビウム５３５４の精製Σ−糖蛋白
質。分子指標の位置を左端に示す。矢印はニコチアナ・
アラータの３２に＆−蛋白質の位置を示す。

５、−１７Ｈ蛋白質は抗−ブラシカ血清で処理したｂの
明らかな例外を除き、各側において異質の抗血清により
免疫沈澱した。しかし、第１２図に示すように、ニコチ
アナ・アラータのｈ−蛋白質は抗ブラシカ血清により免
疫沈澱した。

第１３図にはブラシカ・カンペストリスの部分精製五−
蛋白質（Ｋ、１ｌｉｎａｔａにより供給された）に対す
る抗血清を用いた免疫沈澱分析の結果を示す。この血清
は第１３図の対応する列に矢印で示されるように、ニコ
チアナ・アラータ、プルナス・アビウム、およびリコペ
ルシコン・ベルビアナムの花柱抽出物中の五−蛋白質を
免疫沈澱させ得た。第１３図の分子量指標は左側に示す
。

花柱Ｉ出物の抗原　性質ニコチアナ・アラークＳ＋Ｓｚおよびｂｂ両者の全花柱
抽出物に対する抗血清はウエスタンブロノＩ・分析によ
り、４種のニコチアナ・アラータの遺伝子型の花柱抽出
物の蛋白質と結合した。そして唯一の差は分子１ｔ３０
に領域に生じる結合パターンであった。抗血清結合のパ
ターンは特定のハントの）−遺伝子型との相関がわかる
ものである（第１４図）。正常ウサギ血清は調べた抽出
物のいずれとも結合しなかった。多くの高分子量蛋白質
もまた抗血清と反応したが、これらはすべての遺伝子型
の花柱抽出物に共通であった。

同−棟内での異なった遺伝子型の五−蛋白質問。

異種間のΣ−蛋白質問、および配偶体不和合性にコチア
ナ、リコベルシコン）と胞子体不和合性（ブラシカ）を
有する種間での免疫交叉反応の結果はこれらの五−蛋白
質は少なくとも１つの同類の構造を有する共通成分を有
する事を示す。分子量およびｐｒの見かけ上の相違にも
かかわらず。

ここに示された証拠は五−遺伝子蛋白質は機能的類似性
を有すると共に、構造上も認識できる群であるという驚
くべき事実が明らかになった。

Ｓ−遺伝子　白′とこれらの蛋白　に対する抗体傅侠朋 Σ−遺伝子蛋白質とそれらに対する抗体を利用すること
により種々の新しい植物育種の方策が可能となる。自家
不和合性、異系交配作物では自殖種生成が困難であるこ
とは同型接合優秀系の造成と維持を極めて困難にしてい
る。この難点は抗Σ−蛋白質血清を用いることにより打
破できる。即ち、適当な時期に抗血清を柱頭につけると
正常では自家不和合性の植物を一時的に自家不和合性に
変える事ができる。逆に、３Ｌ−蛋白質を適当な方法１
例えば柱頭表面に散布するか覆うことにより正常では自
家不和合性の植物を一時的に自家不和合性に変える事が
でき、それによって自家授粉を防ぐ。　（自家不和合性
植物は正常では自家授粉（Ｓｆ）植物の花粉を拒絶する
だろう）。

五−遺伝子蛋白質を利用する技術により新しい異種間混
成物が造りだせる。例えば他方の栽培トマト品種を関連
する野性種からの病原菌耐性、耐乾燥性などの遺伝的形
質により改良できる。雌親として用いられる自家授粉栽
培品種をできれば近接した自家不和合性種のΣ−遺伝子
蛋白質を植物の柱頭につけることにより一時的に自家不
和合性に変える。そのような表現型の修飾を５ｆＳｆ　
（Ｓ、）の記号で表す。′印で表される望ましい性質を
持った自家不和合性親株による授粉は１つの自家不和合
性対立遺伝子と望ましい性質を有するＦ１子孫を生ずる
だろう。

そのようなＦｌ子孫は抗り一血清を用いるなどにより盈
−蛋白質を失活させる処理をしなければ自家授粉できな
いし２種子をつくらないだろう。

しかし、そのようなＦ１植物はブラシカのように栄養細
胞部分のみを収穫する作物であればそれ自身で有用であ
ろう。さらに、このＦ１植物は元の５ｆＳｆ親株と戻し
交雑するための雄親として用いることができる。５ｆＳ
ｆ親株と繰り返し戻し交雑し。

１遺伝子について選抜することにより、そのような遺伝
子を持つ５ｆＳｆ”栽培種をつくることができる。

既述の方策は混成種を生成する事に拡張できる。

その１つの計画として、４種類の親株を用いる。

種類１と３を適当な）−遺伝子蛋白質との処理により一
時的に自家不和合性にする。例えば２種類ｌと種類２と
の交雑では１種類工を鉦−遺伝子蛋白質と処理し、自家
不和合性にするが９種類２とは和合性である。もし望む
なら１種Ｍｌと３は五−遺伝子蛋白質処理により一時的
に表現型では異なったものになるであろうが９両者は事
実上回しである事がわかるだろう。種類２と４は当然自
家不和合性であろう。しかし、ある例では何らかの有効
な適当な遺伝子操作により、目的に応した自家不和合性
対立遺伝子を導入する事が望まれる。

下の交雑において。

種類１×種類２　種類３×種頻４亜（Ｓ、）　ＸＳ、鉦“および　且旦（Ｓ２）　Ｘ　５
１５１８Ｆ１子孫は夫々ｓｒｓ、”およびｕ針′であろ
う。前と同様、そのような植物は自家不和合性である。

しかし、この２つのＦ１型は交雑和合性であり。

両型の種子の混合物は、お互い授粉でき１作物を生成す
る種子をつける植物を生しるだろう。　（１剣計：　２
５１５２：　ｌ；１旺）さらに盈−遺伝子蛋白質および抗体は、植物養育者があ
る植物栽培種の保持する自家不和合性対立遺伝子を決定
する事にもまた使用される。今まで、そのような決定は
労力と時間がかかる交雑実験を要した。インビトロ花粉
管増殖分析は花粉試料の五−遺伝子型を同定するために
各既知の−Ｓ一対立遺伝子の精製五−遺伝子蛋白質と組
み合わせて使う事ができる。また特異的Σ−遺伝子蛋白
質の抗体を反応抽出物中の対応する蛋白質を同定するの
に使う事ができる。対立遺伝子に特異的な抗体は種々の
対立遺伝子の五−遺伝子蛋白質を互いに区別するのに望
ましい。ある植物種に対して。

試験材料は、−多一一遺伝子蛋白質の組、インビトロ花
粉管増殖の平板および花粉管増殖を促進する緩衝液の入
った培地から成るキットの形で生産される。定量的ある
いは定性的に）−遺伝子蛋白質を免疫的に測定する試験
キットは、）−遺伝子蛋白質のその抗体との結合を同定
するための道具と共に植物種に適当な抗体の組から成る
だろう。そのような道具は抗原抗体複合体の螢光により
あるいは抗体・酵素複合体の活性により検知し得る螢光
−色素結合抗体または酵素結合体より成り、後者の分析
系は文献で一般的に知られている酵素連関免疫吸着分析
（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）である。他の免疫分析検知法は適当
な当業者のよく知っている操作原理に従って用いられる
だろう。野外試験や日常の実験室での分析にはＥＬＩＳ
Ａが好ましい。

当業者によれば、ここに記述した発明および具体的に述
べた単離・同定法は、それ以外にもその変形や改変が可
能であることが明らかであろう。

この発明はその精神と範囲内に含まれるすべてのそのよ
うな変形と改変を包含することはいうまでもない。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ和合性および不和合性の
授粉における花粉管の成長の状態を示す顕微鏡写真；第
３図は遺伝子型がＳ＋ｈ、ｈＳｓおよび五＆の成熟リコ
ペルシコン・ベルビアナム、および遺伝子型が５ｚＳｚ
、　５ｚＳｓ、　ＳｚＳ：＋および５ＩＳ３のニコチア
ナ・アラータの花柱ずべての抽出物の部分的２次元ゲル
電気泳動；第４図は遺伝子型が虹与。鉦ＳＩ　５ｚＳｚ、Ｓ＋Ｓｓ、５３Ｓ４およびｂシρリ
コベルシコン・ベルビアナムの花柱の抽出物の２次元ゲ
ル電気泳動；第５図はここで述べる部分的２次元ゲル電
気泳動法の説明図；第６図はさまざまな発達過程におけ
る自家不和合性のニコチアナ・アラータの遺伝子型の全
花柱抽出物のソディウム・ドデシル号ルフェートーポリ
アクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；第７図
はニコチアナ・アラータ花柱抽出物のＤＥＡＥ−セファ
ロースクロマトグラフィー；第８図はＤＥＡＥ−セファ
ロースクロマトグラフィー後のｂ−糖蛋白質のバイオゲ
ルＰ１５０クロマトグラフィー；第９図はＤＥＡＥ−セ
ファロースクロマトグラフィー後のｂ−糖蛋白質画分の
ＣｏｎＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフ
ィー；第１０図はＣｏｎＡ−セファロースクロマトグラ
フィー後の５ｔ−Ｉ％＋蛋白質のバイオゲルＰ１５０ク
ロマトグラフィー；第１１図は遺伝子型がｈｂおよびｂ
ｈのニコチアナ・アラータの花柱の抽出物の免疫沈澱；
第１２図はニコチアナ・アラータ、プルナス・アビウム
およびリコベルシコン・ベルビアナムの花柱のブラシカ
・カンペストリス（Ｓ７）から部分精製した五−遺伝子
型に関係する享唐蛋白質により引き起こした抗血清との
免疫沈澱による免疫交叉反応；第１３図はニコチアナ・
アラータ。プルナス・アビウムおよびリコペルシコン・ベルビアナ
ムからの花柱の抽出物の精製したプルナス・アビウムの
糖蛋白質に対する精製したウサギの抗血清による免疫沈
澱；第１４図はＳ＋Ｓｉ、　５２Ｓ３−５ＺＳ２および
ｈｈ遺遺伝梨型花柱抽出物の遺伝子５１５３にニコチア
ナ・アラ−タフの未分画花柱に対する抗血清を用いたウ
ェスタンプロットである。以」二代理人　弁理士　山木秀策図面の浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　４ｐ−■ 箸　稈？ＦＩＧ、ＩＯｋｈ４’−。才尤・′７°ＩＬ−プ又５ＦＩＯ，ｌｌ１　２　３　４・１巾外・ン　ＡＢ　ＡＢ　ＡＢＡＢＦＩＯ，Ｉ２２触　・ブ）２／か　Ｓニコイ′ｉ″す・　７１ノ１ス　リコずル・ゴーＪ／′
アラ・−々　アビ°つＺ−・び′しｔ−；７ｆｔ。ＦＩＧ、　１３４ＫＦＩＧ、　１４＄真　５１５３ ―　贅 −３：？第１頁の続き０発　明　者　ロスリン　ホガート　オーストラリ”ロ
ーンガツタ０発　明　者　マリリン　ニー、アン　オーストラリー
ダーリン　ズ　アベニュー０発　明　者　エリザベス　ジー、ウ　オーストラリ；
イリアムズ　ム、ヤング　ニｒ　ビクトリア　３７８７　サッサフラス、クーロード
、ロット　Ｍ γ　ビクトリア　３４２９　サンバリイ、ヒギン４７ど　ビクトリア　３１３２　ノース　ミツチャストリー
ト２４手続補正書（自発）特許庁長官殿１、事件の表示　昭和５９年特許願第１０８２５１号２
、発明の名称自家不和合性糖蛋白質３、補正をする有事件との関係　特許出願人住所　アメリカ合衆国　コロラド　８０３０１−２２４
４ボールダー、ミソチェル　レーン　３３７５名称　ア
グリジェネティクス　リザーチアソシェイッ　リミテッ
ド代表者　ゾール　ジェイ、ハンセン国籍　アメリカ合衆国４、代理人　〒５３０住所　大阪府大阪市北区西天満４丁目３番１７号５、補
正により増加する発明の数：０６、補正の対象願書の出願人の代表省の欄、願書のイＰ先１７１主張の
出願番号の欄、明細書の図面の簡Ｌ’４な説明の欄１図
面、および委任状。７、補正の内容（１）明細書第５４頁下から６〜４行の［第１図および
第２図はそれぞれ和合性および不和合性の授粉における
花粉管の成長の杖態を示す顕微鏡写真；」を［第１図お
よび第２図の写真はそれぞれ和合性および不和合性の授
粉後の花粉管の形態を示す生物形態図、第１図および第
２図の該写真の左側の図はそれぞれ上記写真を模式的に
表した模式図；」に訂正しまず。（２）訂正願書、トレーシングペーパーに製果で描いた
正式図面（内容に変更なし）、および委任状（訳文添イ
づ）を別紙のとおり差し出しまず。

Claims

【特許請求の範囲】１、自家不和合性植物の実質的に純粋な形の五−遺伝子
蛋白質。２、前記自家不和合性植物が配偶子自家不和合性を示す
特許請求の範囲第１項に記載の−Ｓ−−遺伝子蛋白質。３、前記自家不和合性植物が胞子体自家不和合性を示す
特許請求の範囲第１項に記載のΣ−遺伝子蛋白質。４、前記自家不和合性植物がソラナシー科の一員である
特許請求の範囲第２項に記載の−Ｓ−−遺伝子蛋白質。５、前記自家不和合性植物がニコチアナ属の一員である
特許請求の範囲第４項に記載の）−遺伝子蛋白質。６、前記自家不和合性植物がリコペルシコン属の一員で
ある特許請求の範囲第４項に記載のΣ−遺伝子蛋白質。７、前記自家不和合性植物がクルシフニラ科の一員であ
る特許請求の範囲第３項に記載のΣ−遺伝子蛋白質。８、前記自家不和合性植物がブランカ属の一員である特
許請求の範囲第７項に記載の旦−遺伝子蛋白質。９、ニコチアナ・アラータの５−　遺伝子蛋白質。ニコチアナ・アラータのｈ−遺伝子蛋白質、ニコチアナ
・アラータのシ、〜遺伝子蛋白質、リコペルシコン・ベ
ルビアナムの五−遺伝子蛋白質、リコベルシコン・ベル
ビアナムのｈ−遺伝子蛋白質。リコペルシコン・ベルビアナムのｈ−遺伝子蛋白質、ブ
ラシカ・オレラシーのｂ−遺伝子蛋白質。ブラシカ・カンペストリスのｈ−遺伝子蛋白質。もしくはプルナス・アビウムの盈−遺伝子蛋白質のいず
れかに対する抗体と免疫的に交叉反応する。自家不和合性植物から精製された蛋白質。１０、前記蛋白質が旦−遺伝子蛋白質である特許請求の
範囲第９項に記載の蛋白質。Ｉｌ、植物の自家不和合性表現型を修飾する方法であっ
て、旦−遺伝子蛋白質の生物学的に活性な量を授粉前の
該植物の花柱に適用する工程を包含する方法。１２、前記五−遺伝子蛋白質が修飾される植物の自家不
和合性遺伝子型と異なる自家不和合性遺伝子型を有する
植物に由来する特許請求の範囲第１１項に記載の方法。１３、修飾される前記植物が遺伝形質的に自家授粉であ
る特許請求の範囲第１１項に記載の方法。１４、）−遺伝子蛋白質の生物学的に活性な量を、花粉
または発芽花粉管が該）−遺伝子蛋白質と接触する基質
に適用する工程を包含する方法であって、花粉または増
殖花粉量が該旦−遺伝子蛋白質との接触により該適用）
−遺伝子蛋白質と同し自家不和合性遺伝子型の花粉がら
生じる花粉管の増殖が阻害されるインビトロまたはイン
ビボの花粉管増殖阻害方法。１５、前記基質が植物花柱である特許請求の範囲第１４
項に記載の方法。１６、前記基質が花粉管増殖平板である特許請求の範囲
第１４項に記載の方法。１７１８）緩衝溶液で凍結摩砕花柱を抽出工程。（ｂｌ塩濃度勾配で溶出する陰イオン交換体のイオン交
換クロマトグラフィーによる抽出物を分画する工程。（Ｃｌクロマトグラフ用支持マトリックスにＣｏｎ　Ａ
を架橋結合させ水溶液中のα−グリコシドで？容出させ
るアフィニティークロマトグラフィーにより、工程（ｂ
ｌからのΣ−遺伝子蛋白質含有画分を分画する工程。および（ｄ＋工程ＦＣ＋に由来するクロマトグラフィー画分に
含まれ４５−遺伝子蛋白質を保存し、それにより五−遺
伝子蛋白質が実質的に純粋な形で得られる工程を包含する実質的に純粋な形で）−遺伝子蛋白質を調製
する方法。