JPS6056254A - ポ−ラログラフ分析用選択透過膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の屈する技術分野〕 本発明はいわゆる酵素電極を用いてクルコース等の特定
の物質を分析する際に、酵素膜と組み合わせて該酵素膜
中の酵素が前記特定物質に反応して生成された反応生成
物たとえば過酸化水素を選択的に透過させてポーラログ
ラフ電極に伝達させるだめの選択透過膜に関する。

〔従来技術とその問題点〕

前記のような酵素電極とくに酵素反応により生成される
過酸化水素をポーラログラフ電極により検出して酵素と
反応する特定物質を分析ないし定量するものはいわゆる
クラークの〕墨酸化水素酵素電極として知られており、
従来は分析や測定か非常に困難であった血液中のグルコ
ースやコレステロールの定量を可能にするものとして近
年医療用分析などに重用されつつある。この独断分析技
術の第１の核心は、分析すべき特定物質たとえばクルコ
ースのみに動く酵素だとえげグルコースオニ１シダーゼ
を「Ｉ子素膜中に固定化して、ポーラログラフ電極によ
り検出可能な特定の反応生成物質たとえば過酸化水素や
グルコン酸を生成することにあるが、かかる検出可能な
反応生成物質が生成されたとしても、ふつうは分析すべ
き被検液中には特定物質のほかに多数の他成分が含まれ
ているので、これらの他成分がポーラログラフ電極に作
用して測定結果を誤まらせないようにしなければならな
い。かかる測ボ上の妨害成分を除去ないし排除するだめ
の手段として、被検液と酵素膜との間に多孔性膜を介在
させ、神検液中の高分子量物質が酵素膜に到達しないよ
うにすることが行なわれているが、被検液中に分析すべ
き特定物質と同程度の分子量をもつ妨害成分が含まれて
いる場合にはかかる多孔性膜だ目では問題を解決できな
い。この種妨害成分としては血液中のクルコース量の分
析に際しての尿酸を挙げることができ、また清酒中のア
ルコール分の分析に当っても清酒中に存在し、いわゆる
「こぐ」として知られている種々の成分がアルコール分
の分析に当っての妨害成分となシ５る。

このため技術の第２の核心として、かかる妨害成分がポ
ーラログラフ′電極に達するのを阻止する手段、逆にい
えはポーラログラフ電極により検出すべき反応生成物質
のみを選択的に通すような手段が必要となり、これが本
発明の対象となる選択透過膜である。従来かがる選択透
過性を得る手段には大別して二通りの手段があり、その
−っは酵素膜中に酵素を固定化すると同時に該固定化酵
素膜自体に選択透過機能を賦与することである。がかる
機能を持たせるには、元来選択看過性を有する物質を膜
材料として用いることによシ原理−１二は可能であるが
、実際面では折角固定化したはずの酵素が膜から脱離し
やすくなったり、それに至らないまでも選択透過性能上
のばらつきが大きくて、多くの努力にかかわらず性能の
管理が容易でない。

また、二つ目の手段として例えば特公昭５２−５５６９
１号公報に開示されているように、２枚の高分子材料膜
の間に酸素を固定化し、該２枚の膜の内の被検液側の膜
を多孔性膜として高分子量物質を１泪止するとともに、
ポーラログラフ電極側の他の膜を特定反応生成物質を選
択的に透過する物質からなる均質な選択透過膜とする手
段がある。

この２番目の手段は実用化されており、この稗均質な選
択透過膜を用いた酵素電極は正確な測定結果が得られる
までの平衡速度が大であるという長所を備える反面、選
択透過膜として２ミクロン以下の極薄膜を生成させる必
要があって、成膜作業に高度の熟練を要する難点がらり
、かつ固定化酵素層ほかと組み合わせる際の工程が複雑
で性能上の管理も困難であった。

〔発明の目的〕

本発明は従来技術がもつ上述のような問題点を解決して
、製造工程が簡単で酵素電極への組み立て時に取シ扱い
がしやすい機械的に安定なポーラログラフの分析用選択
透過膜を提供することを目的とする。

〔発明の要点〕

上述の目的達成のため、本発明においては選択透過膜を
固定化酵素膜と分けて形成するが、従来の均質な選択透
過膜のかわりに特定の反応生成物質に対して選択透過性
を有する物質を比較的厚さの大きな多孔性の基拐膜の上
に被着して選択透過膜を形成する。かかる基材膜として
は微細孔を有する多孔性のポリカーボネート膜やポリエ
ステル膜が好適であり、その膜１’％とじては５ミクロ
ンリーヒ、望ましくは７〜１０ミクロンのものが用いら
れ、従来の２ミクロン以下の選択透過膜よりｌ”Ｉｌ取
（ルいに便利な機械強度をイ３するものが選ばれる。微
細孔の孔径は１〜１２ミクロン程度でよい結果が得られ
る。被着される物質としては、選択透過すべき反応生成
物質によっても異なるが、アセチルセルローズ、アルブ
ミン、アクリルアミドゲルを用いることができ、とくに
過酸化水素に対する選択透過性がこれら物質によって得
られる。かかる物質の基材膜への被着は、後述のように
該選択透過性物質を揮発性の溶剤に溶解して基材膜上に
流延などの手段により適用した上で溶剤を蒸発させるこ
とによシ簡単にできるので、選択透過膜の形成にとくに
熟練した技能を要することがなく、シかも得られる選択
透過膜は従来よシ格段に機械強度が−あって酵素電極へ
の組み立て時にも取扱いが容易なものが得られる。

〔発明の実施例〕

以下図面を参照しながら本発明の詳細な説明する。

第１図は本発明による選択透過膜が用いられるポーラロ
グラフ分析用のロｉ素笛、極１の構造例を示すもので、
本発明による選択透過膜を含む積層膜１０が図の下方に
図示のように該酵素１Ｂ、極１内に組み込まれ、被検液
が矢印Ｐの方向がら該Ｍ層膜の図の下面に接触される。

酵素電極１は筒状の絶縁物例えばグラスチックやガラス
からなるケース２をもち、該ケースの図の上方の開口は
蓋３により密封されている。差８とその延長された柱状
部８ａを貫通してリード７が埋め込まれており、柱状部
８ａの下端面に取シ付けられた白金等からなるポーラロ
グラフ電極６に電気接続されている。ケース２０図の下
方の開１」をふさぐように、前述の積層膜１０が環状の
ホルダ４とｏす／グ５とにより密封的に取り付けられて
おシ、該積層膜１００図の上面は前述のポーラログラフ
電極６にごく近接して配てれる。このように上下開口を
密封されたケース２の内面と蓋８の柱状部３ａの外面と
の間の環状の空間には電解液９が導入される。この電解
液９としては、公知のように水等の溶媒に炭酸塩等の塩
類を溶解して緩衝剤を加えた緩衝溶液が用いられる。こ
の電解液９内に浸漬σれる電極としては、前述のポーラ
ログラフ電極６のほかに基準電極８があり、そのリード
８ａが各３を貫通して酵素電極１の外に導出されている
。

前述のように積Ｒ４膜１０の下面が被検液に接触される
と、接栓液中の分析すべき特定の物質たとえばアルコー
ルが積Ｍｌ摸１０中に含有される酵素としてのアルコー
ルオキシダーゼと反応して３Ｎｅ化水素を生じ、積層膜
】０に近接するポーラログラフ電極６がこれを検知して
、ふつうは基準電極８を陰極、ポーラログラフ電極６を
陽極としてリード７゜８ａ間に起電力が生じ、ポーラロ
グラム出力信号として測定装置（図示せず）により読み
取られる。

第２図は積層膜ｌＯの細部を断面図で示すもので、本発
明による選択透過膜１１と、酸素膜１２と、多孔性膜１
３とからなる３層構成になっている。選択透過膜１１は
構成的に示された多数の微細孔１１Ｃを有する基材膜１
１ａとその上に被着された選択透過性物質１１ｂとから
なる。これら層膜の厚烙は例えば選択透過膜１１が７〜
１０ミクロン、酵素膜１２が１ミクロン、多孔性膜１３
が５ミクロンである。この内争孔性膜１３が被検液と接
触して、被検液中の分析をすべき特定物質たとえばクル
コースやヱチルアルコールの分子のみを酵素膜１２に導
き、これよシ分子量の大な被検液中の他成分が酵素膜１
２にまで達しないようにフィルタ作用を行なう。このた
め、多孔性膜１８も多数の微細孔を有するポリカーボネ
ートなどの多孔性グラスチック材料で構成される。

酵素膜１２分析をすべき特定物質にのみ作用する酵素、
例えばグルコース分析の場合はグルコースオキシターセ
を種々の公知の手段を用いてプラスチックや接着剤中に
固定化した膜ないしは層として構成され、この中でＭ＋
＋述の多孔性膜１３を透過して来た特定物質と酵素が反
応してポーラログラフ電極６により検出される反応生成
物質たとえば過酸化水素や醋酸の分子が生成される。こ
のほか、前述の説明からも容易に理解されるように、併
検液中に特定物質と同８！１現の分子量を有する物質た
とえば尿酸が含まれている場合には、かかる含有物質は
容易に多孔性膜１３を透過し、さらに選択透過膜１１に
達しうるが、本発明による選択透過膜１１によってその
ポーラログラフ１に極側の面に達するのが阻止され、前
述の特定反応生成物質ないしは分子のみがポーラログラ
フ電極に達してこれによって検出される。

つぎに本発明による選択透過膜１１の調製例を説明する
。まず、基材膜１１ａとして適度の孔径の多数の微細孔
ないしはボアを持ち、５ｏｍ’ｍ程度の外径を有する円
形のプラスチック膜たとえば多孔性のポリカーボネート
膜をアセトンなどの溶剤中に浸漬しておいて、以後に被
着される選択透過性物質がよくなじむように準備する。

微細孔の孔径としては数ミクロンから十数ミクロン程度
がよく、必ずしも孔径がよく揃ったものが必要ではなく
、例えば１〜１２ミクロン程度の孔径であって、孔径が
この程度に分布したものであってもよい。例えば米国の
ジエネラルヱレクトリック社製の商品名「ヌクレボアフ
ィルタ」と称されるフィルタ８料が基材膜に適した孔径
の微細孔を備える。またこの程度の孔径の微細孔を有す
るものであれば、無機のセラミック材料からなる薄い多
孔性のウエノ１であってもよい。基材膜の厚さとしては
取扱いが容易な程度の機械強度をもち、かつ可及的薄い
ものがよ＜、最低５ミクロノの厚さが取扱い上必要で、
好ましくは７〜１０ミクロンの間がよい。これより基材
膜の厚さがあまり大になると、分析時に平衡時間が長く
なるので実用上思わしくない。

つぎに溶剤としてのアセトン１００！ｊに選択透過性材
料としてのアセチルセルロース５！ｊを加え、マグネソ
クスターラ等を用いて２４時間程度よく攪拌して、溶剤
中にアセチルセルロースをできるだけ均一に溶解ないし
分散させる。つぎに、前述のようにアセトン中に浸漬し
て準備されていた基材膜をアセトンから取り出して、そ
の表面に上述のアセチルセルロース溶液Ｏ涌を室温下で
流延する。その後、このサンプルを２０度Ｃの乾燥窒素
カスふん囲気中で数分程度乾燥して・アセチルセルロー
スの薄膜を基材膜上に形成略せる。これにより、アセチ
ルセルロースは基材膜の一表面を完全に覆うとともに、
その一部が微細孔内に充填される。なお、アセチルセル
ロースの被着は基材膜の片面のみでなく両面に行なって
もよい。以上により、本発明による選択透過膜の調製が
完了する。

以上のようにして調整された本発明による選択透過膜の
試験結果を第８図に示す。同図に示されたポーラログラ
ムは選択透過膜の性能を純粋に試験するために、第１図
に示すような電極配置において積層膜１０のかわりに選
択透過膜１１のみを取り付けたとき得られた結果である
。図において横軸は分で表わされた時間、縦軸はポーラ
ログラフ電極からの出力信号値を表わす。図の時点Ａに
おいて、ポーラログラフ電極が検出すべき過酸化水素を
１．２ｐ、ｐ、ｍ含有する水溶液に選択透過膜の反型極
側表面を接触させた。図のＢで示すポーラログラムはこ
の過酸化水素に対するポーラログラフ電極の反応を示す
もので、これから過酸化水素が上述のように調整された
選択透過膜中をよく透過してポーラログラフ電極に達し
て所定の出力信号が発生てれたことがわかる。なお、こ
の反応曲紳から平衡時間は約３０秒でろって実用上差し
支えない程度であることがわかる。ついで、Ｃの時点で
は過酸化水素水の選択透過膜への接触が断たれたので、
電極からの信号はＤのポーラログラムに見られるように
平衡時間にして３０秒以内に最初の値に戻った。さらに
Ｅの時点においては、選択透過膜に対する妨害成分をか
なり多量に含んでいる清酒に選択透過膜を接触させた。

これに引続くポーラログラムＦに示されるように、電極
からは目立った信号は発生せず、選択透過膜が清酒中の
妨害成分をよく阻止していることがこれかられかる。な
お、清酒中には当然エチルアルコールが含まれているが
、上記の試験はアルコールオキシダーゼを含む酸素膜と
組合わせない状態で行なったので、アルコールに対する
ポーラログラムは現われていない。

以上説明したような本発明による選択透過膜は、第２図
に示すような酸素膜１２と多孔性膜１８とに組合わせて
実用に供される。かかる３層構成の積層膜１０を調製す
るには、まず前のような多孔性ポリカーボネートのよう
な多孔性膜１３の表面に、特定物質に適合した酵素、例
えばクルスコースオキシダーゼやアルコールオキシター
ゼと、不活性たん白、例えば牛血清アルブミンとの混合
物に架橋試薬として例えばゲルタールアルデヒドを加え
たものを塗着、乾燥して酵素層ないしは酵素膜を形成す
る。ついで、前述のように調製した本発明による選択透
過膜を載置し軽く酵素層に押し付ければ、酵素層が接着
の役目を果して３層構成の積層膜１１が形成される。酵
素電極１への取付けは、従来の積層膜の場合と同様でよ
い。なお、基拐膜の片面にのみ選択透明性物質が塗着さ
れる場合には、ふつう該塗着面はポーラログラフ電極側
に配される。

以上によシ本発明の詳細な説明を終えるが、本発明の要
旨はこのような実施例になんら限定されるものでなく、
分析すべき特定物質に応じて基材膜や選択透過性物質の
種類、形状、用法を選び、あるいは選択透過膜の調製手
段を本発明の要旨内で適宜選定しうろことはもちろんで
ある。

〔発明の効果〕

以上説明のとおシ、本発明においてはｒ１′ｆ素膜と組
み合わせてポーラログラフ電極によシ検出されるべき反
応生成物質をのみ透過し、分析に対する妨害成分となり
うる物質を阻止する選択透過膜を、微細孔を有する多孔
性の基材膜と、該基材膜の表面に被着した選択透１１ｆ
＾性を有する物質とにより梠成したので、従来の選択透
過膜に格段に機械強度に優れ、かつ品質の揃った選択透
過膜を提供することができる。また、選択透過膜自身の
調整やこれを酵素膜等と組み合わせて積層膜を調整する
際に、本発明によればとくに優れた技能が要求されるこ
とがなくなるので、品質管理が容易になりかつ量産に適
する。すなわち、従来の調整方法によれば水等の液体の
平扛１な表面上に２ミクロン以下、好ましくは１ミクロ
７程度の厚での極薄膜を形成し、これを適当な４４４体
によりすくい上げてその上で積層膜を形成した後に、和
体を取り除くといったようないわば職人的な技能にたよ
る必要がなくなる。まだ、本発明による選択透過膜を用
いたポーラロクラフ分析装置は、血液中のグルコースや
コレステロール等の健康管理用や医療時の臨床化学分析
用に広範な用途を開拓しつつあり、本発明はかかる分野
に性能の揃った信頼性の高い分析装置を提供できる点に
大きな意義を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による選択透過膜が用いられる酵素電極
の構造を示す断面図、第２図は本発明による選択透過膜
１１と酵素膜１２と多孔性膜１８とを積層した積層膜ｌ
Ｏの構Ａムを示す部分断面図、第８図は本発明による選
択透過膜の選択性の試験結果を示すポーラログラムであ
る。図において、１：酵素電極、６：ポーラログラフ電
極、１ｏ：積層膜・ｉＭ選択透過膜・ｌｌａ　：基材膜
、１１ｂ＝選択透過性物質、１１ｃ：基材膜、１１ａ中
の微細孔、１２：酵素膜、でを】る。 夷 ニ 第１因　第２因 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）分析すべき特定物質と反応する酵素を含む酵素膜と
   組み合わされ、該酵素膜により生成された特定の反応生
   成物質を選択的に透過させてポーラログラフ電極に伝達
   させる選択透過膜であって、微細孔を有する多孔性の基
   材膜の表面に前記の特定反応生成物質に対して選択透過
   性を有する物質を被着してなることを特徴とするポーラ
   ログラフ分析用選択透過膜。 ２、特許請求の範囲第１項記載の選択透過膜において、
   基材膜の厚さが５ミクロン以上であることを特徴とする
   ポーラログラフ分析用選択透過膜。 ３）特許請求の範囲第２項記載の選択透過膜において基
   材膜の厚さが７〜１０ミクロンの間であることを特徴と
   するポーラログラフ分析用選択透過膜。 ４）特許請求の範囲第１項記載の選択透過膜において、
   基材膜が１〜１２ミクロンの間の径の微細孔を有するこ
   とを特徴とするポーラログラフ分析用選択透過膜。 ５）特許請求の範囲第１項記載の選択透過膜において、
   特定反応生成物質が過酸化水素に対して選択透過性を有
   する物質としてアセチルセルローズが基材膜に被着され
   たことを特徴とするポーラログラフ分析用選択透過膜。 ６）特許請求の範囲第１項記載の選択透過膜において・
   基材膜のポーラログラフ電極側に特定反応生成物に対し
   て選択透過性のある物質が被着されたことを特徴とする
   ポーラログラフ分析用選択透過膜０