JPS6058076A - Ｄνａ塩基配列及びそのｄνａ塩基配列を含む組換え体プラスミドの創製法 - Google Patents

Ｄνａ塩基配列及びそのｄνａ塩基配列を含む組換え体プラスミドの創製法

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JPS6058076A
JPS6058076A JP58166665A JP16666583A JPS6058076A JP S6058076 A JPS6058076 A JP S6058076A JP 58166665 A JP58166665 A JP 58166665A JP 16666583 A JP16666583 A JP 16666583A JP S6058076 A JPS6058076 A JP S6058076A
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富岡　登
Masaru Honjo
勝 本城
Kazuaki Manabe
真鍋　員明
Hiroaki Shimada
浩章 島田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はたんばく質分泌能を高めるＤＮＡ塩基配列とそ
のＤＮＡ塩基配列を含む組換え体プラスミドに関する。
ある種の微生物（細菌、酵母等）はべりプラズム中にあ
るいは菌体外にたんば〈質を分泌する。
特にバチルス属細菌は菌体外に多量のたんばく質を分泌
する。このような微生物のたんばく質分泌促進に関与す
る遺伝情報を遺伝子工学の手法を用い宿主ベクター系に
組み込み、高い分泌能を有する宿主ベクター系を創作す
ることは微生物によるたんばく質生産の観点からみて大
きな意義がある。
すなわちそのような宿主ベクター系が得られると、それ
によって遺伝子を発現させ、たんばく質を菌体外すなわ
ち培養液中に多量に分泌させて、培養ろ液から簡単な工
程で回収できるからである。
本発明者等はかかる観点から、本発明の方法によシバチ
ルス属細菌のたんばく質分泌能を高めるＤＮＡ塩基配列
のクローニングを行ない、菌体外にたんばく質、特にプ
ロテアーゼを顕著に分泌させるＤＮＡ塩基配列を得、そ
の塩基配列を決定し、一群の本発明を完成するに至った
。
本発明の方法とは、クローニングの過程で目的とするＤ
ＮＡ塩基配列を含む組換え体ＤＮＡを導入している微生
物を選択する場合に、分泌された４酵素たんばく質に着
目し、その量を、特には菌体外でのそのたんばく質の酵
素活性を測定してたんばく質分泌能の著しく向上した株
を選ぶ方法で極めて能率良く目的を達成している微生物
を得ることが出来る方法である。
本発明に云うたんばく質分泌能を高めるＤＮＡ塩基配列
とは特許請求の範囲第１項において、当業者の常識に従
がい、５′末端から３′末端への方向に従ってその塩基
の配列の順序を特定しているものである。そうしてその
誘導配列とは後に規定するが、これらの配列を有するＤ
ＮＡ断片を、適当なベクターＤＮＡあるいは宿主菌染色
体ＤＮＡに組み込むことによって種々の高い分泌能を有
するバチルス属細菌分泌ベクター系の創作が可能となる
。
以下本発明の詳細な説明する。
特許請求の範囲第１項に示したたんばく質分泌能を高め
るＤＮＡ塩基配列（以下本発明のＤＮＡ塩基配列という
）は、たんばく質分泌能を有する微生物の染色体ＤＮＡ
からクローニングによって又は合成によって得られるが
、本発明の実施例によって示したように種々のたんばく
質を著量に分泌する能力を有するバチルス属細菌、例え
ばバチルス・アミロリキファシエンス（Ｂ、ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆ−ａｃｉｅｎｓ　）　ＡＴＣ！０２３８４
２等、バチルス・サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　
）　ＡＴＯＣｅ６０５１等、又はバチルス奢りケニホル
ミス（Ｂ、、目ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）　ＡＴＣｊ
Ｃ２１４１５等が染色体ＤＮＡ源として特に適している
。
また、本発明のＤＮＡ塩基配列の誘導配列とは、本発明
の目的であるたんばく質分泌能を損うことなく塩基置換
、削除、挿入、転位されたＤＮＡ塩基配列をいう。
以下に１例としてバチルス属細菌から本発明のＤＮＡ塩
基配列を得る場合について説明する。まず、バチルス属
細菌の菌体から常法によりＤＮＡを調製し、そのＤＮＡ
を制限酵素により又は物理的勇断力によシ断片化する。
この場合当然のことながら制限酵素を用いる場合は、分
泌促進に関与する塩基配列を切断しないようその酵素を
選び又はその塩基配列を切断してしまう場合でも部分分
解の条件でなければならない。
次に断片化した染色体ＤＮＡをベクターとして用いるプ
ラスミドＤＮＡ又はファージＤＮＡに連結する。連結に
用いる酵素には例えばＴ４ＤＮＡＩＪガーゼがあシ、連
結するＤＮＡ断片の形態によっては必要に応じてリンカ
−を使用すると良い。この連結ができた／・イブリッド
Ｄ　Ｎ　Ａをバチルス属細菌に導入する方法は通常行わ
れているいかなる方法でもよい。例えば、プロトプラス
トを用いる方法あるいはコンピテント細胞を用いる方法
によると効率よくハイブリッドＤＮＡをバチルス属細菌
細胞内に導入することができる。抗生物質耐性等の遺伝
的マーカーを有するプラスミドをベクター−として用い
れば形質転換したバチルス属細菌の選択がその遺伝的マ
ーカーを利用して容易に行なえるので手法として極めて
有利である。ベクターとしてはプラスミドｐＴＰ４　、
　ｐＴＰ５　、　ｐＵＢｌｌｏ。
ファージＰ１１．φ１０５１φ１等が適している。
ｐＵＢｌ　１０を用いるとカナマイシン耐性で形質転換
体の選別が行なえるので、カナマイシンを含む寒天培地
上でプラスミドが導入できたバチルス属細菌を能率良く
選別することができる。
こうして得られた数多くの形質転換したバチルス属細菌
には、種々の分子量を有するバチルス属細菌染色体ＤＮ
Ａを含む組換え体プラスばドＤ、ＮＡが存在する。プラ
スミドをベクターとして用いて形質転換を行った場合、
得られた形質転換体のうちたんばく質分泌能が高まって
いるものを選び出し、その形質転換体を培養して菌体を
集め、その菌体よシ通常の方法でプラスミドＤＮＡを抽
出すれば、抽出された組換え体プラスミドＤＮＡには本
発明のＤＮＡ塩基配列が含まれている。たんばく質分泌
能が高まった形質転換体を選別するにはそれぞれの形質
転換体を培養し、培養液中に分泌されたたんば〈質が宿
主菌に比べ増大しているか否かを調べる方法でも良いが
、酵素活性を有する分泌たんばく質に着目し菌体外に分
泌されるその酵素たんばくの酵素活性の増大を調べる方
法を用いると選別が容易となる。このような酵素には例
えばアミラーゼ、プロテアーゼ、ペニシリナーゼ、セル
ラーゼ、アルカリ性フォスファターゼ等がある。これら
の酵素の中でも特にプロテアーゼは、カゼインを含む寒
天グレートに示されるハローの大きさを測定することに
よシ、あるいはカゼインを基質とした酵素反応によシ酵
素活性を極めて容易に測定することが出来る。
たんばく質分泌能の増大がみられる形質転換体が得られ
れば、その細胞よシブラスミドＤＮＡを抽出し、抽出で
きたプラスミドを再び宿主として用いたバチルス属細菌
に導入し、その組換え体プラスミドにたんばく質分泌能
を高める性質が存在することを確かめることが出来る。
分泌たんばく質としてプロテアーゼを選んだ場合、菌体
外プロテアーゼ活性の増大を指標として目的の形質転換
体を得、その細胞よシ組換え体プラスミドＤＮＡを抽出
し、抽出できた組換え体プラスミドＤＮＡを用いて形質
転換を行う。その結果得られた形質転換体の全てに菌体
外プロテアーゼ活性増大の性質が見られた場合、抽出さ
れた組換え体プラスミドＤＮＡにはたんばく質分泌を高
めるＤＮＡ塩基配列が存在するのである。この組換え体
プラスミドＤＮＡの制限酵素切断地図を作成して、目的
の組換え体プラスミドを特徴づけ、またその切断地図を
基に挿入されているバチルス属細菌染色体ＤＮＡ塩基配
列を例えばマクサム−ギルバート（Ｍａｘａ＋ｎ−Ｇ１
１ｂｅｒｔ　）法（Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ−８
Ｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、ｖｏｌ、７４　、　ｐ５６０　、　（１９
７７）　）によシ決定するへ本発明のＤＮＡ塩某西−Ｊ
ｌｌは、クローニング六れたＤ　Ｎ　Ａの全部としであ
るいは一部として得られる。バチルス属の変異株あるい
は種まだは属の異なる微生物からたんばく質分泌能を高
めるＤＮＡのクローニングを試みた場合、本発明のＤＮ
Ａ塩基配列について塩基置換、削除、挿入、転位等の変
異の入った誘導配列であるＤＮＡ断片が得られることも
勿論のことあシうる。
さらに本発明のＤＮＡ塩基配列は、微生物、特にバチル
ス属細菌の染色体ＤＮＡに又はベクターに組み込んで微
生物に導入することにより、たんばく質分泌能の極めて
高い微生物を育種することが出来るので、本発明のＤＮ
Ａ塩基配列は微生物工業において極めて広い応用範囲を
有する。
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、
これにより本発明は制限されるものではない。
実施例 アミラーゼ、プロテアーゼ等のたんばく質分泌能が高い
バチルス属細菌バチルス・アミロリキファシエンス（Ｂ
、ａｍ　１ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　７株（体を
集め、？−−ｒ−（Ｍａｒｍｕｒ　）の方法（Ｊ、Ｍｏ
ｌ　、ＢｉａＬ土、　ｐ２０８　、１９６１　）で染色
体ＤＮＡを調製した。
この染色体ＤＮＡ５０μ２に制限酵素ＥｃｏＲ工を４０
０ｇの反応液（１００ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣｔ、　ｐ
Ｈ７，５、７ｍ　ＭＭｙＯｔ２．５０１ｎＭＮａＯ４，
７１ｎ　Ｍ　２−メルカプトエタノール、０．０１　％
　ウシ血清アルブミン、２０ユニツト。
宝酒造株式会社製）中で３時間３７℃で作用させた。フ
ェノールで除たんばくして後分解物をエタノールで沈殿
させて回収した。
一方バチルス属細菌で増殖可能なプラスミドであるｐＵ
Ｂｌｌｏ　ＤＮＡ　５０μ２についても同様の方法を用
いてＫｃｏＲＩ完全分解物を得、得られた直鎖状ＤＮＡ
Ｋつキハクテリアアルカリホスファターゼ（以下ＢＡＰ
）を３００　ｐｔの反応液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ　、　ｐＨ８，４、８ユニツトのウォージントン（Ｗ
ｏｒ−１ｈｉｎｇｔｏｎ　）社製ＢＡＰ）中で４時間６
５℃で作用させ、フェノールで除タンパクした後分解し
たＤＮＡをエタノールで沈殿させて回収した。
この様にして得られたｐＵＢｊｌ　ＯＤ　Ｎ　Ａ　（Ｅ
ｃｏＲＩ切断、ＢＡＰ処理）０５μｍと上記染色体ＤＮ
ＡＥｃｏＲＩ分解物１μ２を００６ユニツトのＴ、ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）を用い２０μｔの反応液（６
６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ２、ｐＨ７，６、６，６ｍＭ　
ＭｙＣ１２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ）中で１５℃、４時間インキ−ベートして結合させ、
チャン（Ｃｈａｎｇ　）等の方法（Ｍｏｌ　、Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、１６８　、１１１　、１９７８）に従いグ
ロテアーゼ分泌能の低いバチルス属細菌バチルス・サブ
チリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ｌＡ２８９（ａｒ
ｏ　１９０６　ｍｅｔ　Ｂ５　ｓａｃ　Ａ３２１　ａｍ
ｙ　Ｅ　）株（オハイオ大学バチルス　ジエネティソク
　ストックセンター保存株）に導入した。
バチルス属細菌バチルス・サブチリス（ｎ、５ｕ−ｂｔ
ｉｌｉｓ　）　ｌＡ２８９に組換えプラスミドが導入さ
れカナマイ７ノ耐性（Ｋｒｒｌｒ）となった約７．５０
０個の形質転換体を、カゼインを０６チきむ寒天培地上
に植え継ぎし、３７℃で１８時間培養した後それらの形
質転換体のうちグロテアーゼ分泌能の高い株をコロニー
の周囲に大型ノ・ローを形成する性質によシ選別した。
得られたグロテアーゼ分泌能の高まった株のうち１株を
選びカナマイシンを含む培地で培養し、その菌体からバ
ーノボイム（Ｂｉｒｎｏｂｏｉｍ　）等の方法（ｎｕｃ
ｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ。
７　、１５１３　、１９７９　）で組換え体プラスミド
ＤＮＡを抽出し、制限酵素切断地図を作成してプラスミ
ドｐＮＰ７１８と命名した。（第１図参照）プラスミド
ｐＮＰ７１８を前述のチャン（ｃｈａｎｇ　）等の方法
でグロテアーゼ分泌能の低いバチルス属細菌バチルス・
サブチリス（且、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｉ　Ａ２０　
（ｄｎａ　Ｃｉ　ＩｖＡｌ　ｍｅｔＢ５　）株（オノー
イオ大学バチルス　ストックセンター保存株）に導入し
たところ、得られたカナマイシン耐性の形質転換体の全
てが高いグロテアーゼ分泌能を示した。宿主トシテ用い
たバチルス−サブチリス（且、ト虫土す−１ｓ）ＩＡ２
０株及びｐＮＰ７１Ｂを保持するノミチルスφサプチリ
ヌ（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｉ　Ａ　２０株をそれ
ぞれＢＹ培地（肉エキス０．５％、ポリペプトン７．２
）を用いそれぞれ３７℃で１０時間振盪培養し、得られ
た培養ろ液のグロテアーゼ活性の測定を行いこれらの菌
株で菌体外プロテアーゼ活性を比較した結果が表１であ
る。グロテアーゼ活性は中性グロテアーゼ活性及びアル
カリ性グロテアーセ活性ノ両方ヲ萩原らの方法（Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、ｖｏｌ　。
４５　、１８５　、　（１９５Ｂ）　）によシ測定し相
対値で表した。
表１ プラスミドｐＮＰ７１８にはＣ１ａ■切断部位が４ケ所
ある。そこで我々はｐＮＰ７１８　ＣｔａＩ部分分解物
を得た後、Ｔ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼを用いる方法で
こｈ＋ｉ枯介１７、たんば〈質の分泌能を高める遺伝子
を含むさらに小型の組換えプラスミドを創作したのでそ
れにつき述べる。ｐＮＰ７１８のａｔａ工部分分解物を
再結合して作成したプラスミドＤＮＡ　（混合物）は前
述のチャン（ｃｈａｎｇ　）等の方法でバチルス属細菌
バチルス・サブチリス（よ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）ＩＡ
２８９に導入し、得られた形質転換体のいくっかよシブ
ラスミドＤＮＡを前述のバーノボイム（Ｂｉｒｎｏｂｏ
ｉｍ　）等の方法で抽出したところｐＮＰ７１８由来の
ｃ　ｌ　ａ　Ｉ　１，７５ｋｂ　７ラグメ／トが挿入さ
れているプラスミドｐＮｐ１８１を得た。（第２図参照
）アーゼ分泌能を前述のカゼインを含む寒天培地上のハ
ローの大きさで調べた結果プラスミドｐＮＰ１８１にプ
ロテアーゼ分泌能を高める能力があることを確認した。
プラスミドｐＮＰ１８１をプロテアーゼ分泌能の低い前
述のバチルス属細菌バチルス・サブチリス（Ｂ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）　ＬＡ２０株に導入し、得られた形質転
換体のプロテアーゼ分泌能の増大を調べた結果が表２で
ある。グロテアーゼ活性の測定は表１の場合と同じ方法
を用いた。
表２ この組換えプラスミドｐＮＰ１８１に中性プロテアゼ、
アルカリ性グロテアーゼ及び他のたんばく質の分泌を高
める能力があることは、形質転換体を培養した培養液中
の分泌たんばく質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で
調べることによっても確認することができた。
Ｃ１ａ工１．７５ｋｂのＤＮＡ塩基配列を決定する目的
で、まずｃｔａＩ　１．７５ｋｂを含むＫｃｏＲ丁４．
０ｋｂ７ラグメントをプラスミドｐＮＰ７１８から切シ
出し得られた７ラグメントを大腸菌ベクターｐＢＲ３２
２のＢｃ。
Ｒ工部位にＴ、ＤＮＡＩＪガーゼを用いて結合し組換え
プラスミドｐＮＰ６２６　（第３図参照）を作成した。
プラスミドｐＮＰ６２６　Ｄ　Ｎ　Ａを大腸菌で増殖さ
せ、クロラムフェニコールでプラスミドのコピー数を増
幅させた後菌体からプラスミドＤＮＡとして抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡのｃｔａＩ１．７５ｋｂ　フ
ラグメントを材料とし、制限酵素Ｈｉｎｆｌ　。
Ｓａｕ　３　Ａ　、　Ｈｐａｌ　、　Ｔａｑ　ｌで切断
してさらに小さなりＮＡ断片を得、それらの小さなりＮ
Ａフラグメントにつきマクサム−ギルバー）　（Ｍａｘ
ａｍ−Ｇｉ　−Ｉｂｅｒｔ）法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ’、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４５６０１９７
７　）によってＤＮＡ塩基配列を決定した。
得られたＣ１ａＴ１，７５ｋｂ　７ラグメントのＤＮＡ
塩基配列の片方の鎖は特許請求の範囲第１項に記載の通
りである。そしてこのＤＮＡ塩基配列には第４図に示す
通りのＲＮＡ合成開始部位に特徴的な配列（−６５領域
、ＴＡＴ　Ａボックス）及びＲＮＡ合それに続くＴに富
む配列）が存在している。これら開始部位、終了部位及
びこれらの部位にはさま始部位の、ＲＮＡ合成終了部位
の、およびこれらの部位にはさまれた各部位のそれぞれ
の塩基配列、あるいはそれらの部位の塩基配列を含んで
組み合わされている塩基配列をいうのである。そして組
換え体プラスミドｐＮＰ７１８　、　ｐＮＰ１８１及び
ｐＮＰ６２６のそれぞれには特許請求の範囲第１項記載
のＤＮＡ塩基配列が存在するので前記の形質を発現させ
ておシ、この故に我々はこれらの組換え体プラスミドを
特許請求の範囲第４項に記載の組換え体プラスミドとし
て特許を請求するのである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のプラスばドｐＮＰ７１Ｂの制限酵素切
断地図を、第２図は同じ＜　ｐＮＰ１８１がｐＮＰ７１
８たものであり第３図は本発明の組換えプラスミドｐＮ
Ｐ６２６の制限酵素切断地図をそれぞれ示す。また第４
図は本発明のＤＮＡ塩基配列に含まれるＲＮＡ合成開始
部位同終了部位の存在を示す塩基配列図である。 特許出願人 工業技術院長 ＃　１　図 察　２　目

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）片方の鎖が次の順序であるだんばく質分泌能を高
    めるＤＮＡ塩基配列及び誘導配列。 ＡＴＣＧＡ　ＴＡＯＧＣ！　ＴＴＣ！Ｔ　ＣＣＡＧＡＧ
    ＡＧＡＧＯＴＴＧＡＧ　ＧＡ　ＣＡＴ　ＡＧＴＣＡＡＡ
    ＧＡＡ　ＣＴＧＯＣＴＴＴＡＡ　ＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴ
    　ＯＧ　ＧＡｃ　ＡＧＧＣＧ　ＣＴＧＯＴＣＧＧＴＴ　
    ＡＴＧＡＡ　ＡＡＯＧＡ　ＴＴＡＴＴＡＯＡＴＧ　ＡＴ
    Ｇ　ＣＴ　ＣＧＧＧＯＴ（１！ＧＴ　ＣＡＡＡＧＣＣＡ
    ＴＴＧ　ＡＡＴＧＣ！　ＡＡＣ！ＡＡＣＴＧＧＧ　ＡＯ
    ＴＧＴ　ＧＡＣＧＡ　ＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡ　ＧＡＡＯ
    Ｔ　ＧＧＡＣＡ　ＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧ　Ａ
    ＡＴＧＴ　ＴＡＣＴＴＡＣＡＧＧ　ＣＧＡＴＣＧＡＡＴ
    Ｇ　ＧＴＧ　ＣＣＧＧＯＡＧ　ＣＴＴＡＴ　ＣＧＴＧＡ
    　ＡＴＴＧＡＧＧＣ！ＧＣ！　ＴＴＴＡＡ　ＧｃｃＧＡ
    　ＣＣｆ１．Ｃ，ＣＴＧＡＧＧ　ＧＯＧＡＴ　ＧＡＴＧ
    Ａ　ＡＣＯＧＧＣ！ＴＴＴＧ　ＣＴＣ！Ｔ（！　ＴＧＡ
    Ａｃ　ＡＧＡＯＴＧＡＣＡＯ’ＧＧＡＴＧ　Ｃ０ＧＴＣ
    ＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴ　ＧＴＯＡＣ！　ＡＴｃＡＡ　Ａ
    ＡＴＣＡＴＴＴＴＴ　ＧＡＴＧＣＣ！ＧＧＴＯＴＧＣ！
    ＴＴＡＡＴＧＡ　ＧＣＣＧＣＴＴＧＡＣ！　ＣＣ＋Ｃ０
    ＧＣＧＧＣＧ　ＴＣＡＧＡ　ＴＧＡＴＴ　ＧＣＧＣＴＧ
    ＯＧＧＴ　ＧＡＧＧＡ　ＴＧＣ！ＧＧ　ＣＧＯＧＣＡＡ
    ＧＯＴ　ＣＴＴＴＴ　０ＡＣＧＣＣ！ＧＡｃＡＧＣＣ！
    ＧＣＧＣ！ＡＡＧ　ＧＡＧＯＡ　ＧＡＣ！ＧＧＧＯＧＴ
    ｃ　０ＴＣＣＡ　ＧＯＡＴＧ　ＣＣＣＧＣＡＧＣＣＴ　
    ０ＴＴＴＴ　ＧＣＧＧＡ　ＣＧＣＴＧＴＣＡＡＡ　ＡＴ
    ＡＴＣ！　ＴＧＣＧＴ　ＧＡＡＴＣＧＴＧＧＧ　ＡＧＯ
    ＡＧ　ＧＣＧｃＡ　ＧＧＡＴＴＧＣＧＴＡ　ＴＧＧＯＧ
    　０ＧＧＣＧ　ＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴ　ＧＧ
    ＡＴＡ　０ＡＣＡＴＡＡＡＧＣ！　ＡＴＧＣＧ　ＧＣＧ
    Ｇｃ　ＣＴＣＣＴＴ（、ＴＧＡ　ＧＡＴＡＡ　Ｃ！ＡＴ
    Ｔｃ　ＧＴＴＡＴＡＣＡＴＧ　Ａ’ＧＴＡＴ　ＡＧＧＯ
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    （１ＩＣＯＴＧＡ由来であることを特徴とする特許請求
    の範囲第株であることを特徴とする特許請求の範囲第２
    項に記載のたんばく質分壓能を高めるＤＮＡ塩基配列お
    よびその誘導配列。 （４）特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ塩基配列ま
    たはその誘導配列の全部または一部を含むことを特徴と
    する組換え体プラスミド。 （５）組換え体プラスミドを構成するベクタ一部分が、
    バチルス属細菌で増殖可能なプラスミド又はファージで
    あることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の組換
    え体プラスミド。 （６）ベクタ一部分がｐＵＢｌ　１０又はその誘導体で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の組
    換え体プラスミド。 （７）微生物の菌体外に分泌されたたんばく質の量を指
    標として選択することを特徴とする特許請求の範囲第４
    項に記載の組換え体プラスミドを得る方法。 （８）たんばく質が酵素たんばく質であり、指標がその
    酵素活性であることを特徴とする特許請求の範囲第７項
    記載の方法。 （９）酵素たんばく質がプロテアーゼであることを特徴
    とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。 （１０）特許請求の範囲第４項に記載の組換え体プラス
    ミドを微生物に導入してその微生物のたんばく質分泌能
    を高めることを特徴とする微生物育種法（１１）特許請
    求の範囲第１０項記載の微生物がバチルス属細菌である
    ことを特徴とする微生物育種法
JP58166665A 1983-09-12 1983-09-12 Ｄνａ塩基配列及びそのｄνａ塩基配列を含む組換え体プラスミドの創製法 Expired - Lifetime JPH0659224B2 (ja)

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JPS6091980A (ja) * 1983-07-06 1985-05-23 ジェネックス・コーポレイション プロテア−ゼ酵素の発現のための徴生物を製造する方法

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