JPS6060550A - トランスアミナ−ゼ活性の測定法 - Google Patents
トランスアミナ−ゼ活性の測定法Info
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- JPS6060550A JPS6060550A JP58169046A JP16904683A JPS6060550A JP S6060550 A JPS6060550 A JP S6060550A JP 58169046 A JP58169046 A JP 58169046A JP 16904683 A JP16904683 A JP 16904683A JP S6060550 A JPS6060550 A JP S6060550A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/52—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving transaminase
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生体試料中のトランスアミナーゼ（グルタミ
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ：ＧＯＴと略記す
る及びグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ：Ｇ
ＯＴと略記する）の活性を測定する方法に関するもので
ある。
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ：ＧＯＴと略記す
る及びグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ：Ｇ
ＯＴと略記する）の活性を測定する方法に関するもので
ある。
本発明を用いれば、同一反応セル中で同一試料中のＧＯ
Ｔ及びＧＰＴを試料を入れ替えることなく測定すること
ができる為、試料の測定を迅速に、精度よく行うことが
できる。
Ｔ及びＧＰＴを試料を入れ替えることなく測定すること
ができる為、試料の測定を迅速に、精度よく行うことが
できる。
トランスアミナーゼは、アミノ酸のアミノ基転移を触媒
する酵素で、その内ＧＯＴは心筋、肝、骨格筋、腎に多
量に含まれ、ＧＰＴは肝、腎に多量に含まれている。従
ってＧＯＴ、ＧＰＴの測定は急性ウィルス性肝炎、慢性
肝炎、肝硬変、肝腫瘍、急性アルコール性肝炎等の肝疾
患、胆のう、胆管炎、胆石症等の肝外閉塞性黄痘、心筋
梗塞、進行性筋ジストロフィー、感染性疾患等の診断に
有用な役割を果しており、ＧＯＴ、ＧＰＴを簡便に精度
よく迅速に測定することは臨床的に意義が大きい。
する酵素で、その内ＧＯＴは心筋、肝、骨格筋、腎に多
量に含まれ、ＧＰＴは肝、腎に多量に含まれている。従
ってＧＯＴ、ＧＰＴの測定は急性ウィルス性肝炎、慢性
肝炎、肝硬変、肝腫瘍、急性アルコール性肝炎等の肝疾
患、胆のう、胆管炎、胆石症等の肝外閉塞性黄痘、心筋
梗塞、進行性筋ジストロフィー、感染性疾患等の診断に
有用な役割を果しており、ＧＯＴ、ＧＰＴを簡便に精度
よく迅速に測定することは臨床的に意義が大きい。
先行技術
従来、ＧＯＴの測定方法としては基質のアスパラギン酸
とα−ケトグルタル酸に試料を加え、生成したオキザロ
酢酸を、リンゴ酸脱水素酵素と補酵素Ｎ Ａ Ｄ Ｈの
存在下で共役させ、このときのＮＡＤＨの３４０顎の吸
光度の減少を初速度法で測定するカルメン法と、上記の
様に生成したオキザロ酢酸を２，４−ジニトロフェニル
ヒドラジント反応させヒドラゾンを生成させ、これをア
ルカリ性にしてキノイドを作り発色させるライトマン−
フランクル法がある。しかし、カルメン法では使用する
試薬が不安定で、また恒温セルを付属させた特殊な分元
元度計が必要である等の問題がある。
とα−ケトグルタル酸に試料を加え、生成したオキザロ
酢酸を、リンゴ酸脱水素酵素と補酵素Ｎ Ａ Ｄ Ｈの
存在下で共役させ、このときのＮＡＤＨの３４０顎の吸
光度の減少を初速度法で測定するカルメン法と、上記の
様に生成したオキザロ酢酸を２，４−ジニトロフェニル
ヒドラジント反応させヒドラゾンを生成させ、これをア
ルカリ性にしてキノイドを作り発色させるライトマン−
フランクル法がある。しかし、カルメン法では使用する
試薬が不安定で、また恒温セルを付属させた特殊な分元
元度計が必要である等の問題がある。
一方、ライトマン−フランケル法では基質のα−ケトグ
ルタル酸も発色して生成物の発色を妨害するために基質
量を極度に減じる必要があり、検量線が変曲することや
測定可能範囲が狭い等の欠点がある。
ルタル酸も発色して生成物の発色を妨害するために基質
量を極度に減じる必要があり、検量線が変曲することや
測定可能範囲が狭い等の欠点がある。
またＧＰＴの測定方法には、基質のアラニンとα−ケト
グルタル酸に試料を加え、生成したピルビン酸を乳酸脱
水素酵素と前記Ｎ Ａ、 Ｄ Ｈの存在下で共役させ該
ＮＡＤＨの減少を測定するカルメン法と、上記の様に生
成したピルビン酸に２，４−ジニトロフェニルヒドラジ
ンを作用させて発色させるライトマン−フランクル法が
ある。しかしこれらの方法にも上記ＧＯＴの測定方法と
同様の欠点がある。
グルタル酸に試料を加え、生成したピルビン酸を乳酸脱
水素酵素と前記Ｎ Ａ、 Ｄ Ｈの存在下で共役させ該
ＮＡＤＨの減少を測定するカルメン法と、上記の様に生
成したピルビン酸に２，４−ジニトロフェニルヒドラジ
ンを作用させて発色させるライトマン−フランクル法が
ある。しかしこれらの方法にも上記ＧＯＴの測定方法と
同様の欠点がある。
これらの欠点を解決する目的で最近、ピルビン酸オキシ
ダーゼ＜ｐｏｐと略記する）を利用してＧＰＴ、ＧＯＴ
を分析する方法が開発されているうたとえばＧＰＴの測
定方法としては、基質のアラニンとα−ケトグルタル酸
に試料を加えピルビン酸を生成する反応と、生成したピ
ルビン酸をＰＯＰと所要基質の存在下に酸化するピルビ
ン酸酸化反応とを共役させ、ピルビン酸酸化反応に伴う
過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定量するもの
がある。
ダーゼ＜ｐｏｐと略記する）を利用してＧＰＴ、ＧＯＴ
を分析する方法が開発されているうたとえばＧＰＴの測
定方法としては、基質のアラニンとα−ケトグルタル酸
に試料を加えピルビン酸を生成する反応と、生成したピ
ルビン酸をＰＯＰと所要基質の存在下に酸化するピルビ
ン酸酸化反応とを共役させ、ピルビン酸酸化反応に伴う
過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定量するもの
がある。
またＧＯＴの測定方法としては、基質のアスパラギン酸
とα−ケトグルタル酸に試料を加えオキザロ酢酸を生成
する反応と、生成したオキザロ酢酸ヲオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼ（ＯＡＣ，！：略記する）の存在下にピ
ルビン酸を生成する反応とを共役させピルビン酸を生成
させる。次にこの生成したピルビン酸をＰＯＰと所要基
質の存在下にピルビン酸酸化反応を行わせ、ピルビン酸
酸化反応に伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比
色定量する。しかしながら上記ＰＯＰを利用する測定法
は、高価な酵素の使い捨て、測定時間が長いこと、ＰＯ
Ｐ自身が溶液中では不安定であるため測定時の再現性が
悪い等の問題点がある。
とα−ケトグルタル酸に試料を加えオキザロ酢酸を生成
する反応と、生成したオキザロ酢酸ヲオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼ（ＯＡＣ，！：略記する）の存在下にピ
ルビン酸を生成する反応とを共役させピルビン酸を生成
させる。次にこの生成したピルビン酸をＰＯＰと所要基
質の存在下にピルビン酸酸化反応を行わせ、ピルビン酸
酸化反応に伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比
色定量する。しかしながら上記ＰＯＰを利用する測定法
は、高価な酵素の使い捨て、測定時間が長いこと、ＰＯ
Ｐ自身が溶液中では不安定であるため測定時の再現性が
悪い等の問題点がある。
そこでＰＯＰを固定化し、これを酸化電位測定用電極に
装着した酵素電極を使用してＧＰＴ、ＧＯＴを測定しよ
うとする研究も盛んに行なわれている。（特開昭５５−
１１１７８６号、同５６−１２４３９６号各公報、Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ 。
装着した酵素電極を使用してＧＰＴ、ＧＯＴを測定しよ
うとする研究も盛んに行なわれている。（特開昭５５−
１１１７８６号、同５６−１２４３９６号各公報、Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ 。
１１８（１９８０）６５−７１等参照）しかし、これら
上記の固定化法では、固定化ＰＯＰの活性ならびに安定
性は十分とはいえず、またＰＯＰのみの固定化ではＧＯ
Ｔ測定時にＯＡＣ酵素を添加しなければならない欠点が
あるため、ＧＯＴ及びＧＰＴ測定用の高活性で安定性の
優れるＰＯＰおよびＯＡＣ固定化酵素を用いるＧ ＯＴ
及びＧＰＴを測定する方法の提供が切望されていたＯ 発明の概要 本発明者らは、この要望に応えるべく鋭意検討を行った
結果、ＰＯＰ及びＯＡＣの酵素活性及びその安定性に優
れ、基質拡散性がよく、洗浄しやすい固定化酵素膜を酸
化電位測定用の電極に装着して酵素センサーとして利用
することにより、従来の測定方法の欠点を解消し、生体
試料中の微量のトランスアミナーゼを簡便な方法で、迅
速に精度良く、定量範囲も広く測定し得ることを見出し
本発明を完成した。
上記の固定化法では、固定化ＰＯＰの活性ならびに安定
性は十分とはいえず、またＰＯＰのみの固定化ではＧＯ
Ｔ測定時にＯＡＣ酵素を添加しなければならない欠点が
あるため、ＧＯＴ及びＧＰＴ測定用の高活性で安定性の
優れるＰＯＰおよびＯＡＣ固定化酵素を用いるＧ ＯＴ
及びＧＰＴを測定する方法の提供が切望されていたＯ 発明の概要 本発明者らは、この要望に応えるべく鋭意検討を行った
結果、ＰＯＰ及びＯＡＣの酵素活性及びその安定性に優
れ、基質拡散性がよく、洗浄しやすい固定化酵素膜を酸
化電位測定用の電極に装着して酵素センサーとして利用
することにより、従来の測定方法の欠点を解消し、生体
試料中の微量のトランスアミナーゼを簡便な方法で、迅
速に精度良く、定量範囲も広く測定し得ることを見出し
本発明を完成した。
即ち、本発明は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）お
よびオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＣ）を担体
上に固定した固定化酵素膜を装着した酵素電極を有する
セルにピルビン酸測定用緩衝溶液、試料液およびグルタ
ミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）測定
用基質溶液またはグルタミン酸ピルビン酸トランスアミ
ナーゼ（ＧＰＴ）測定用基質溶液を供給し該酵素電極の
出力によりＧＯＴ活性まだはＧＰＴ活性を測定し、次い
でこのセルに上記測定に用いなかったＧＰＴ測定用基質
溶液まだばＧＯＴ測定用基質溶液を供給してＧＰＴ活性
およびＧＯＴ活性の合計活性を測定するトランスアミナ
ーゼ活性の測定法を提供するものである。
よびオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＣ）を担体
上に固定した固定化酵素膜を装着した酵素電極を有する
セルにピルビン酸測定用緩衝溶液、試料液およびグルタ
ミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）測定
用基質溶液またはグルタミン酸ピルビン酸トランスアミ
ナーゼ（ＧＰＴ）測定用基質溶液を供給し該酵素電極の
出力によりＧＯＴ活性まだはＧＰＴ活性を測定し、次い
でこのセルに上記測定に用いなかったＧＰＴ測定用基質
溶液まだばＧＯＴ測定用基質溶液を供給してＧＰＴ活性
およびＧＯＴ活性の合計活性を測定するトランスアミナ
ーゼ活性の測定法を提供するものである。
３、発明の詳細な説明
本発明に用いられる固定化酵素膜は、多孔性高分子膜担
体を用いて製造できる。多孔性高分子担体としては、公
知の塩化ビニル樹脂担体、アセチルセルロース、ポリカ
ーボネート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン
、テフロン等を用いることができる。この中でも塩化ビ
ニル樹脂担体が特に好ましく用いられ、該担体は、特開
昭５５−３９７１９号公報記載のものを用いることがで
きる。
体を用いて製造できる。多孔性高分子担体としては、公
知の塩化ビニル樹脂担体、アセチルセルロース、ポリカ
ーボネート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン
、テフロン等を用いることができる。この中でも塩化ビ
ニル樹脂担体が特に好ましく用いられ、該担体は、特開
昭５５−３９７１９号公報記載のものを用いることがで
きる。
特に好ましくは、塩化ビニル樹脂担体は以下の様にして
製造される。
製造される。
先ス塩化ビニル樹脂をジメチルボルムアミドなどの溶媒
（４）に溶解し、これを所望の担体形状に形成した後溶
媒（Ｂ）への浸漬処理を行なう。
（４）に溶解し、これを所望の担体形状に形成した後溶
媒（Ｂ）への浸漬処理を行なう。
本発明の上記塩化ビニル樹脂（ＰＶＲ）としては、ポリ
塩化ビニル（ＰＶＣ）、塩化ビニル共重合体、これらと
他の樹脂とのブレンド物があり、塩化ビニル共重合体と
しては、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニリ
デン、エチレン、アクリル酸、アクリロニトリルなどと
の二元または三元以上の共重合体がある。
塩化ビニル（ＰＶＣ）、塩化ビニル共重合体、これらと
他の樹脂とのブレンド物があり、塩化ビニル共重合体と
しては、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニリ
デン、エチレン、アクリル酸、アクリロニトリルなどと
の二元または三元以上の共重合体がある。
溶媒（４）は、ＰＶＲを溶解できる溶剤であって、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＲ） 、ジメチルアセトアミド
（ＤＭＡ ）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ−ＭＰ）、ヘ
キサメチルホス７オアミド（ＨＩｖＩＰＡ）、テトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）、アセトンとベンゼンの混合溶媒
などがある。ＰＶＲ溶液の濃度としては１〜３０重量％
のものが用いられる。
チルホルムアミド（ＤＭＲ） 、ジメチルアセトアミド
（ＤＭＡ ）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ−ＭＰ）、ヘ
キサメチルホス７オアミド（ＨＩｖＩＰＡ）、テトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）、アセトンとベンゼンの混合溶媒
などがある。ＰＶＲ溶液の濃度としては１〜３０重量％
のものが用いられる。
酵素等の固定膜が優れた吸着活性を発揮して機能するた
めにはＰＶＲの重合度が約１０００において６〜１２重
量％が好ましい。
めにはＰＶＲの重合度が約１０００において６〜１２重
量％が好ましい。
次に、か＜ｔ、−ｃ得たＰＶＲ溶液を所望の担体形状に
形成した後、ＰＶＲの貧溶媒であり且つ溶媒（４）の良
溶媒となる溶媒（）３）と接触させて担体層を形成する
。この際、溶媒（Ｂ）との接触はＰＶＲ溶液層か白化す
る前に行なうことが好ましい。ここで白化する前とは、
ＰＶＲと溶媒（４）の溶液が目視できる白濁を生じて不
透明となるまでの期間である。
形成した後、ＰＶＲの貧溶媒であり且つ溶媒（４）の良
溶媒となる溶媒（）３）と接触させて担体層を形成する
。この際、溶媒（Ｂ）との接触はＰＶＲ溶液層か白化す
る前に行なうことが好ましい。ここで白化する前とは、
ＰＶＲと溶媒（４）の溶液が目視できる白濁を生じて不
透明となるまでの期間である。
溶媒（Ｂ）としては水、アルコール系溶媒、エーテル系
溶媒などがある。
溶媒などがある。
アルコール系溶媒としては、メチルアルコール、エチル
アルコール、ｎ−プロピルアルコール、１ｓｏ−７’口
ビルアルコール、ｎ−７”ｆルアルコール、５ｅｅ−メ
チルアルコール、ｔｅｒｔ −メチルアルコールナトＦ
） −価フルコール類、エチレンクリコール、ジエチレ
ングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類、エ
チレングリコールモノメチルエーテル、エチレンクリコ
ールモノエチルエーテルなどのグリコールモノエーテル
類などが用いられる。浸漬する溶媒としてはこれらアル
コール系溶媒単独また（はアルコール系溶媒を５０重量
％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合溶媒であって
もよい。
アルコール、ｎ−プロピルアルコール、１ｓｏ−７’口
ビルアルコール、ｎ−７”ｆルアルコール、５ｅｅ−メ
チルアルコール、ｔｅｒｔ −メチルアルコールナトＦ
） −価フルコール類、エチレンクリコール、ジエチレ
ングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類、エ
チレングリコールモノメチルエーテル、エチレンクリコ
ールモノエチルエーテルなどのグリコールモノエーテル
類などが用いられる。浸漬する溶媒としてはこれらアル
コール系溶媒単独また（はアルコール系溶媒を５０重量
％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合溶媒であって
もよい。
殊ニ、メチルアルコール、エチルアルコールを用いた場
合には、固定化酵素活性の大きい固定化物が得られ好ま
しい。
合には、固定化酵素活性の大きい固定化物が得られ好ま
しい。
なお、ＰＶＲと溶媒囚の溶液には、担体の膨潤の度合の
調整すなわち担体の含水率の調節、孔径の調整等のため
に、ポリエチレングリコール等のＰＶＲに対し非溶媒性
の化合物を添加することができる。
調整すなわち担体の含水率の調節、孔径の調整等のため
に、ポリエチレングリコール等のＰＶＲに対し非溶媒性
の化合物を添加することができる。
担体形状としては膜状、管状、試験管状、ビーズ状等種
々の形状をとることができる。酵素電極等の用途には特
に膜状が好ましい。膜状担体はＰＶＲ溶液を流延し、そ
の後溶媒ＣＢ）に浸漬して形成する。
々の形状をとることができる。酵素電極等の用途には特
に膜状が好ましい。膜状担体はＰＶＲ溶液を流延し、そ
の後溶媒ＣＢ）に浸漬して形成する。
この際、担体の強度を向上させる為不織布等の補強材を
用いてもよい。
用いてもよい。
なお担体の形成後、担体を水中に浸漬して溶媒（ト）を
水と置換することが好ましい。
水と置換することが好ましい。
次に上記担体を酵素ＰＯＰ及びＯＡＣを含有する溶液と
接触させる。この時好ましくはこれらの酵素と共に補酵
素フラビンアデニンジヌクレオチド（Ｆ’ＡＤと略記す
る）、補酵素チアミンピロホスフェート（ＴＰＰと略記
する）およびＭｇ２＋イオン及び／又はＭｎ ２＋イオ
ンを含む溶液に浸漬して本発明に用いられる固定化酵素
を得る。
接触させる。この時好ましくはこれらの酵素と共に補酵
素フラビンアデニンジヌクレオチド（Ｆ’ＡＤと略記す
る）、補酵素チアミンピロホスフェート（ＴＰＰと略記
する）およびＭｇ２＋イオン及び／又はＭｎ ２＋イオ
ンを含む溶液に浸漬して本発明に用いられる固定化酵素
を得る。
この場合、上記酵素を含む溶液は、ＰＯＰとＯＡＣの合
計の濃度は１００〜１ｏｏｏη／ｄ１１好ましくはｚｏ
ｏ−ａ ｏ ｏｍｇ／ａｓであり、ｐｏｐとＯＡＣと
の重量組成比が５０１５ｏ〜９９／１、好ましくは７０
／３０〜９８／２、特に好ましくは ８５／１５〜９７
／３の間にあり、かつ該浴液のｐＨが６〜８．５、好ま
しくは６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液である。
計の濃度は１００〜１ｏｏｏη／ｄ１１好ましくはｚｏ
ｏ−ａ ｏ ｏｍｇ／ａｓであり、ｐｏｐとＯＡＣと
の重量組成比が５０１５ｏ〜９９／１、好ましくは７０
／３０〜９８／２、特に好ましくは ８５／１５〜９７
／３の間にあり、かつ該浴液のｐＨが６〜８．５、好ま
しくは６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液である。
本発明に使用する上記緩衝溶液は、Ｇｏｏｄら（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ５．４６７（１９６６））によ
る公知の緩衝剤を用いることができる。たとえばＮ置換
型双極性アミノ酸としては、Ｎ−（２−アセトアミド）
−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミ
ド）イミノジ酢酸、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホンＬ Ｎ、Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ、Ｎ−ビ
ス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−４リス（ヒドロキシ
メチル）メチル−３−アミノプロパンスルボッ酸、Ｎ−
）リス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン
スルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグ
リシン等がある。また脂肪族アミンとしては、２．２−
ビス（ヒドロキシメチル） −２，２’、２’−ニトリ
ロトリエタノール、１．３−ビス〔トリス（ヒドロキシ
メチル）メチルアミンクプロパン、グリシンアミド等が
ある。またトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等
を用いることができる。
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ５．４６７（１９６６））によ
る公知の緩衝剤を用いることができる。たとえばＮ置換
型双極性アミノ酸としては、Ｎ−（２−アセトアミド）
−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミ
ド）イミノジ酢酸、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホンＬ Ｎ、Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ、Ｎ−ビ
ス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−４リス（ヒドロキシ
メチル）メチル−３−アミノプロパンスルボッ酸、Ｎ−
）リス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン
スルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグ
リシン等がある。また脂肪族アミンとしては、２．２−
ビス（ヒドロキシメチル） −２，２’、２’−ニトリ
ロトリエタノール、１．３−ビス〔トリス（ヒドロキシ
メチル）メチルアミンクプロパン、グリシンアミド等が
ある。またトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等
を用いることができる。
マタ、Ｍｇ２＋イオンおよびＭｎ２＋イオンはＭｇＣ＆
およびＭｎＣｔｚの形態で使用することが好ましい・本
発明に用いられる固定化酵素は、昭和５７年１２月１日
出願の特許の明細書に記載した常温硬化、性ブロックト
イソシアネート化合物の水溶液に接触させて該化合物で
被覆することもできる。
およびＭｎＣｔｚの形態で使用することが好ましい・本
発明に用いられる固定化酵素は、昭和５７年１２月１日
出願の特許の明細書に記載した常温硬化、性ブロックト
イソシアネート化合物の水溶液に接触させて該化合物で
被覆することもできる。
上記の様にして得られた固定化酵素膜を公知の多孔性の
高分子膜、例えばアセチルセルロース膜、ポリカーボネ
ート膜、ナイロン膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン
膜、テフロン膜等と貼り合せ、固定化酵素膜が試料液に
接する様に公知の例えば過酸化水素電極等に装着し酵素
電極を製作し、使用する。
高分子膜、例えばアセチルセルロース膜、ポリカーボネ
ート膜、ナイロン膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン
膜、テフロン膜等と貼り合せ、固定化酵素膜が試料液に
接する様に公知の例えば過酸化水素電極等に装着し酵素
電極を製作し、使用する。
第１図は、この酵素電極を用いた本発明の一例を示すト
ランスアミナーゼ活性分析装置の系統図である。
ランスアミナーゼ活性分析装置の系統図である。
以下、第１図を用いて本発明のトランスアミナーゼ活性
を測定する方法によるＧＯＴ及びＧＰＴ測定方法を説明
する。
を測定する方法によるＧＯＴ及びＧＰＴ測定方法を説明
する。
、Ｊ１図に於て先にＧＯＴ活性を測定する場合は測定セ
ル３にピルビン酸測定用緩衝溶液（ＦＡＤ、ＴＰＰ及び
Ｍｇ ２＋及び／又はＭｎ２＋イオン等を含む）１５と
少なくともアスパラギン酸とα−ケトグルタル酸を含有
するＧＯＴ測定用基質溶液１４を各々ポンプ１１．１ｏ
にて注入する。次に試料を注射器１又はサンプラー２に
より測定セル３に注入する。セル３中にてアスパラギン
酸、α−ケトグルタル酸及び生体試料中のＧＯＴとの反
応により生成したオキザロ酢酸は、上述の固定化酵素ル
゛ｘ４中のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼに、しりピ
ルビン酸となり、次いで固定化酵素膜４中のピルビン酸
オキシダーゼと反応する。この際、発生する過酸化水素
量又は減少する酸素量を過酸化水素１１℃極又は酸素電
極５にて検出し記録計７また（ｒまデジタルマルチメー
タ８により読み取る。
ル３にピルビン酸測定用緩衝溶液（ＦＡＤ、ＴＰＰ及び
Ｍｇ ２＋及び／又はＭｎ２＋イオン等を含む）１５と
少なくともアスパラギン酸とα−ケトグルタル酸を含有
するＧＯＴ測定用基質溶液１４を各々ポンプ１１．１ｏ
にて注入する。次に試料を注射器１又はサンプラー２に
より測定セル３に注入する。セル３中にてアスパラギン
酸、α−ケトグルタル酸及び生体試料中のＧＯＴとの反
応により生成したオキザロ酢酸は、上述の固定化酵素ル
゛ｘ４中のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼに、しりピ
ルビン酸となり、次いで固定化酵素膜４中のピルビン酸
オキシダーゼと反応する。この際、発生する過酸化水素
量又は減少する酸素量を過酸化水素１１℃極又は酸素電
極５にて検出し記録計７また（ｒまデジタルマルチメー
タ８により読み取る。
引！続き少なくともアラニンとα−ケトグルタル酸を含
有するＧＰＴ測定用基質溶液１６をポンプ９にて測定セ
ル３に注入する。この際発生する過酸化水素量又は減少
する酸素量は前記ＧＯＴとオキザロ酢酸デカルボキシラ
ーゼ反応より生成するピルビン酸と新たに７ラニンとα
−ケトグルタル酸を注入したことにょるＧＰＴ反応より
生成するピルビン酸が同時に固定化酵素膜４中のビルビ
ン酸オキシダーゼと反応して生じたものであり、上記同
様、発生する過酸化水素量又は減少する酸素量を過酸化
水素電極又は酸素電極５にて検出し記録計７またはデジ
タルマルチメータ８により読み取る。従って最初にＧ
ＯＴ反応による出力のみを測定し、次にＧＯＴ反応およ
びＧＰＴ反応の二成分反応の出力を測定し、先に測定の
ＧＯＴ反応による出力を補正することによりＧＰＴ反応
による出力をめることができる。測定終了後、ポンプ１
３によりセル内の液は廃棄される。
有するＧＰＴ測定用基質溶液１６をポンプ９にて測定セ
ル３に注入する。この際発生する過酸化水素量又は減少
する酸素量は前記ＧＯＴとオキザロ酢酸デカルボキシラ
ーゼ反応より生成するピルビン酸と新たに７ラニンとα
−ケトグルタル酸を注入したことにょるＧＰＴ反応より
生成するピルビン酸が同時に固定化酵素膜４中のビルビ
ン酸オキシダーゼと反応して生じたものであり、上記同
様、発生する過酸化水素量又は減少する酸素量を過酸化
水素電極又は酸素電極５にて検出し記録計７またはデジ
タルマルチメータ８により読み取る。従って最初にＧ
ＯＴ反応による出力のみを測定し、次にＧＯＴ反応およ
びＧＰＴ反応の二成分反応の出力を測定し、先に測定の
ＧＯＴ反応による出力を補正することによりＧＰＴ反応
による出力をめることができる。測定終了後、ポンプ１
３によりセル内の液は廃棄される。
この様にして既知のＧＯＴ活性値およびＧ、Ｐ Ｔ活性
値を有する試料を用いて測定すると、第２図に示す該酵
素電極出力の反応曲線が得られ、ＧＯＴ活性値およびＧ
ＰＴ活性値と電流値変化速度との間には第３図に示す良
好な直線関係が認められた。
値を有する試料を用いて測定すると、第２図に示す該酵
素電極出力の反応曲線が得られ、ＧＯＴ活性値およびＧ
ＰＴ活性値と電流値変化速度との間には第３図に示す良
好な直線関係が認められた。
またＧＯＴ活性の測定に於て、ピルビン酸緩衝沼液１５
を測定セル３に供給した後、試料を注入し、次にＧＯＴ
測定用基質溶液１４を測定セル３に注入しても同様に測
定できる。
を測定セル３に供給した後、試料を注入し、次にＧＯＴ
測定用基質溶液１４を測定セル３に注入しても同様に測
定できる。
一方、ＧＰＴ活性を最初に測定し、次に二成分活性を測
定する場合は、少なくともアスパラギン酸とα−ケトグ
ルタル酸を含有するＧＯＴ測定用基質溶液から少なくと
もアラニンとα−ケトグルタル酸を含有するＧＰＴ測定
用基質溶液に変え、ざらにＧＰＴ測定用基質溶液１６を
少なくともアスパラギン酸とα−ケトグルタル酸を含有
スるＧＯＴ測定用基質溶液とすることにより前記同様に
測定することができる。
定する場合は、少なくともアスパラギン酸とα−ケトグ
ルタル酸を含有するＧＯＴ測定用基質溶液から少なくと
もアラニンとα−ケトグルタル酸を含有するＧＰＴ測定
用基質溶液に変え、ざらにＧＰＴ測定用基質溶液１６を
少なくともアスパラギン酸とα−ケトグルタル酸を含有
スるＧＯＴ測定用基質溶液とすることにより前記同様に
測定することができる。
以上詳述した通り、本発明のトランスアミナーゼ活性を
測定する方法を用いることによって、生体試料中の微量
のＧＯＴ及びＧＰＴを簡便な方法で、迅速に精度良く、
定量範囲も広く測定することができる。
測定する方法を用いることによって、生体試料中の微量
のＧＯＴ及びＧＰＴを簡便な方法で、迅速に精度良く、
定量範囲も広く測定することができる。
第１図は、本発明の測定方法を用いるトランスアミナー
ゼ活性分析装置の系統図の−し１ｊである。 第２図は、本発明の測定方法を用いて得られた酵素電極
の出力特性図である。 第３図は、本発明の測定方法を用いて測定して得たＧＯ
Ｔ活性値およびＧＰＴ活性値と電流値変化速度との相関
図である。 １・・・試料注入器、２・・・試料注入用サンプラー、
３・・・反応及び検出セル、４・・・固定化酵素瞑、５
・・・酸素電極または過酸化水素電極、６・・・増幅器
、７・・・レコーダー、８・・・テシタルマルチメータ
ー、９、】０．１１．１２．１３・・・ポンプ、１４．
１６・・・基質溶液槽、１５・・・ピルビン酸測定用緩
衝液槽、１７・−・廃液槽。 特許出願人 三菱油化株式会社 代理人 弁理士 古 川 秀 利 代理人 弁理士 長 谷 正 久 第１図 第２図
ゼ活性分析装置の系統図の−し１ｊである。 第２図は、本発明の測定方法を用いて得られた酵素電極
の出力特性図である。 第３図は、本発明の測定方法を用いて測定して得たＧＯ
Ｔ活性値およびＧＰＴ活性値と電流値変化速度との相関
図である。 １・・・試料注入器、２・・・試料注入用サンプラー、
３・・・反応及び検出セル、４・・・固定化酵素瞑、５
・・・酸素電極または過酸化水素電極、６・・・増幅器
、７・・・レコーダー、８・・・テシタルマルチメータ
ー、９、】０．１１．１２．１３・・・ポンプ、１４．
１６・・・基質溶液槽、１５・・・ピルビン酸測定用緩
衝液槽、１７・−・廃液槽。 特許出願人 三菱油化株式会社 代理人 弁理士 古 川 秀 利 代理人 弁理士 長 谷 正 久 第１図 第２図
Claims (1)
- （１） ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｐ＞およびオキ
ザロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＣ）を担体上に固定
化した固定化酵素膜を装着した酵素電極を有するセルに
ピルビン酸測定用緩衝溶液、試料液およびグルタミン酸
オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）測定用基質
溶液まだはグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
（ＧＰＴ）測定用基質溶液を供給し該酵素電極の出力に
よりＧＯＴ活性またはＧＰＴ活性を測定し、次いでこの
セルに上記測定に用いなかったＧＰＴ測定用基質溶液ま
たはＧＯＴ測定用基質溶液を供給してＧＰＴ活性および
ＧＯＴ活性の合計活性を測定するトランスアミナーゼ活
性の測定法０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58169046A JPS6060550A (ja) | 1983-09-13 | 1983-09-13 | トランスアミナ−ゼ活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58169046A JPS6060550A (ja) | 1983-09-13 | 1983-09-13 | トランスアミナ−ゼ活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6060550A true JPS6060550A (ja) | 1985-04-08 |
Family
ID=15879314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58169046A Pending JPS6060550A (ja) | 1983-09-13 | 1983-09-13 | トランスアミナ−ゼ活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6060550A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7539103B2 (en) | 1998-07-29 | 2009-05-26 | Lg Electronics Inc. | Method for real time recording/playback of data to/from and optical recording medium and method for managing files thereof |
-
1983
- 1983-09-13 JP JP58169046A patent/JPS6060550A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7539103B2 (en) | 1998-07-29 | 2009-05-26 | Lg Electronics Inc. | Method for real time recording/playback of data to/from and optical recording medium and method for managing files thereof |
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