JPS606190A - 新規細胞株 - Google Patents
新規細胞株Info
- Publication number
- JPS606190A JPS606190A JP58112875A JP11287583A JPS606190A JP S606190 A JPS606190 A JP S606190A JP 58112875 A JP58112875 A JP 58112875A JP 11287583 A JP11287583 A JP 11287583A JP S606190 A JPS606190 A JP S606190A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- cells
- serum
- free medium
- interferon
- Prior art date
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- Granted
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＩＩＩＬ ｆｆｊを含有しない培地では増殖
しないヒトリンパ芽球細胞を馴化して無血清培地に増殖
できるようにした新規ヒトリンパ芽球細胞、その調製法
、ならびに該細胞によるインターフェロンの製造法に関
する。
しないヒトリンパ芽球細胞を馴化して無血清培地に増殖
できるようにした新規ヒトリンパ芽球細胞、その調製法
、ならびに該細胞によるインターフェロンの製造法に関
する。
動物細胞は、通常血清添加培地によって増殖し、培地中
より血清を除去すると増殖はとまり、やがて死Ｉ戦Ｊる
。血清に代わるべき種々の物質、たとえばホルモン、増
殖因子を用いる無血清培地の開発が進められている。し
かし、これら無血清培地て生育した細胞を血清添加培地
に移して培養すると、無血ｌり培地に比べ速い増殖速度
を示し、また高い細胞密度を与える。
より血清を除去すると増殖はとまり、やがて死Ｉ戦Ｊる
。血清に代わるべき種々の物質、たとえばホルモン、増
殖因子を用いる無血清培地の開発が進められている。し
かし、これら無血清培地て生育した細胞を血清添加培地
に移して培養すると、無血ｌり培地に比べ速い増殖速度
を示し、また高い細胞密度を与える。
無血清培地においても血清添加培地と同程度の増殖速度
、細胞密度を与える細胞があれば有利に使用することが
できる。
、細胞密度を与える細胞があれば有利に使用することが
できる。
本発明者らは、動物細胞であるヒトリンパ芽球細胞、ず
なわもバーキットリンパ腫由来ナマルバ細胞株を順次低
血清濃度の培地に移しながら培養することにより、無血
清培地に増殖できる株が得られることを見い出した。
なわもバーキットリンパ腫由来ナマルバ細胞株を順次低
血清濃度の培地に移しながら培養することにより、無血
清培地に増殖できる株が得られることを見い出した。
この無血清培地馴化細胞は、再度血清添加培地で増殖さ
−Ｕても、無血清培地の生育と有意の差がない。Ｊ：た
この無血清培地馴化細胞は、電子顕微鏡による観察によ
り、親細胞とは細胞内構成成分が違）ことが確認された
。さらにこの無血清培地馴化♀１１胞は、ウィルス誘発
によるインターフェ１」ン生産能を保持するが、ビタミ
ン八による前処理によりインターフェロン生産能が消失
Ｊる。親１１■胞は、ビタミンへの前処理でも生産能を
発現するので、無血清培地馴化細胞はビタミンＡ感受性
であるといえる。
−Ｕても、無血清培地の生育と有意の差がない。Ｊ：た
この無血清培地馴化細胞は、電子顕微鏡による観察によ
り、親細胞とは細胞内構成成分が違）ことが確認された
。さらにこの無血清培地馴化♀１１胞は、ウィルス誘発
によるインターフェ１」ン生産能を保持するが、ビタミ
ン八による前処理によりインターフェロン生産能が消失
Ｊる。親１１■胞は、ビタミンへの前処理でも生産能を
発現するので、無血清培地馴化細胞はビタミンＡ感受性
であるといえる。
従来、動物細胞を馴化して低血清または無血清培地に増
殖した例はある。たとえば、Ｄｏｋｋｙ。
殖した例はある。たとえば、Ｄｏｋｋｙ。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ Ｖｅｌ、９． Ｉ）ｒｌ ９７−１０５．１９８
２では、ラット肝臓からの細胞株を馴化して１％まで血
清濃度を低下させた培地で生育てきる細胞株を得ている
。しかし、すべての細・胞が馴化できるわけではなく、
またＨ ａ Ｌ ；Ｉ細胞のように約８年間もかかっ−
Ｃ馴化できた細胞もある。
ｅｓ Ｖｅｌ、９． Ｉ）ｒｌ ９７−１０５．１９８
２では、ラット肝臓からの細胞株を馴化して１％まで血
清濃度を低下させた培地で生育てきる細胞株を得ている
。しかし、すべての細・胞が馴化できるわけではなく、
またＨ ａ Ｌ ；Ｉ細胞のように約８年間もかかっ−
Ｃ馴化できた細胞もある。
リンパ芽球細胞において馴化に、１：り無血清培地に増
・殖できるようになった例は知られておらず、とくに上
記のごとき性質をイｆｉる細胞は知られζいない。
・殖できるようになった例は知られておらず、とくに上
記のごとき性質をイｆｉる細胞は知られζいない。
以下本発明の詳細な説明場る。
本発明は、血清を含有し２ない培地では増Ｍ Ｌ−ない
ヒトリンパ芽球細胞を馴化し゛Ｃ無血清培地に増殖でき
るようにした新規ヒトリンパ芽球細胞に関する。
ヒトリンパ芽球細胞を馴化し゛Ｃ無血清培地に増殖でき
るようにした新規ヒトリンパ芽球細胞に関する。
１）馴化の方法
馴化をするための親株としては、ヒトリンパ芽球細胞で
、無血清培地に増殖できないものであれば、いずれの細
胞も用いることができる。々ｆ適な例としては、バーキ
ン１リンパ腫由来、リンパ芽球わ１胞ナマルバ株、ＡＴ
ＣＣＣＲＬ−１４３２があげられる。
、無血清培地に増殖できないものであれば、いずれの細
胞も用いることができる。々ｆ適な例としては、バーキ
ン１リンパ腫由来、リンパ芽球わ１胞ナマルバ株、ＡＴ
ＣＣＣＲＬ−１４３２があげられる。
馴化の方法は、単層培養の場合と、浮遊培養の場合とで
多少異なる。単層培養においては、細胞は培養器に付着
しているため、培地交換が容易であるが、トリプシン処
理をする際、無血清培地を用イル場合には、血清中に含
まれるトリプシンインヒビターに代わるインヒビター妊
を加える必要がある。馴化期間は、血清濃度の減少の割
合、種頽の変更によるが、１週間から数ケ月を要する。
多少異なる。単層培養においては、細胞は培養器に付着
しているため、培地交換が容易であるが、トリプシン処
理をする際、無血清培地を用イル場合には、血清中に含
まれるトリプシンインヒビターに代わるインヒビター妊
を加える必要がある。馴化期間は、血清濃度の減少の割
合、種頽の変更によるが、１週間から数ケ月を要する。
浮遊培養におい“Ｃは、細胞数として０．５〜ｓ Ｘ
１０５細胞／ｍｌ程度の維持が好ましい。ｐ Ｈ６，５
以下にならないにうに培地の交換が必要である。培地交
換は、細胞数が多い場合は希釈し、少ない場合は、遠心
分δ１］や」二／ｉ？除去によっ゛ζ濃縮することによ
り細胞濃度を合わ−１る。馴化期間は１週間〜数ケ月を
要−２る。
１０５細胞／ｍｌ程度の維持が好ましい。ｐ Ｈ６，５
以下にならないにうに培地の交換が必要である。培地交
換は、細胞数が多い場合は希釈し、少ない場合は、遠心
分δ１］や」二／ｉ？除去によっ゛ζ濃縮することによ
り細胞濃度を合わ−１る。馴化期間は１週間〜数ケ月を
要−２る。
ナマルバ細胞の浮遊培養を例にして、具体的に馴化法を
示−υば次のとおりである。
示−υば次のとおりである。
ナマルバ細胞株を血清を含む基礎培地にペニシリン、ス
トレプトマイシン、グルタミン、ヘペス緩山液などを添
加した培地に継代し”Ｃおき、これを親株細胞とする。
トレプトマイシン、グルタミン、ヘペス緩山液などを添
加した培地に継代し”Ｃおき、これを親株細胞とする。
親株細胞を遠心外削して集め、血清濃度を除々に減少さ
せながら、各血／ｎ ａＦｆ度の培地で２〜４０ごとに
培地を半分ずつ替えて約１〜２ケ月間培養し、最後に血
清を含まない無血清培地におし・て同様に約１〜２ケ月
間培養する。
せながら、各血／ｎ ａＦｆ度の培地で２〜４０ごとに
培地を半分ずつ替えて約１〜２ケ月間培養し、最後に血
清を含まない無血清培地におし・て同様に約１〜２ケ月
間培養する。
基礎培地としては、ＲＰＭＩ １．６４０（日水製薬社
！！り、ＭＥＭ （日永ＦＭ薬社製）、ダルへ・２コの
ＭＥＭ ＜日永製薬社製）、ハムＦ １０ 、ノ）ムＦ
１２ （フローラボ社製）などが用い゛られる。
！！り、ＭＥＭ （日永ＦＭ薬社製）、ダルへ・２コの
ＭＥＭ ＜日永製薬社製）、ハムＦ １０ 、ノ）ムＦ
１２ （フローラボ社製）などが用い゛られる。
ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン。
へペス緩術液の添加量は、それぞれ５〜１００Ｕ／ｍ１
．５〜１００μｇ／ｍｌ、Ｉ Ｏ＋１〜４００ｎｗ／ρ
および１〜３０Ｍである。
．５〜１００μｇ／ｍｌ、Ｉ Ｏ＋１〜４００ｎｗ／ρ
および１〜３０Ｍである。
無血１６培地としては、基礎１１）地にペニシリン。
ストレプトマイシン、グルタミン、ヘベス緩雨滝を加え
た培地に、さらに血清の代替物としてインシュリン、ト
ランスフェリン、つｌ」ガステロン（ＥＧＦ）、線維芽
細胞生長因子、 ？ｌｌｌ経成長促進因子、血小板由未
増殖因子などを加える。その他に、不飽和脂肪酸、エタ
ノールアミンなどを加えると効果的である場合がある。
た培地に、さらに血清の代替物としてインシュリン、ト
ランスフェリン、つｌ」ガステロン（ＥＧＦ）、線維芽
細胞生長因子、 ？ｌｌｌ経成長促進因子、血小板由未
増殖因子などを加える。その他に、不飽和脂肪酸、エタ
ノールアミンなどを加えると効果的である場合がある。
本実施例においては、蛋白質成分としＣは、最低限のト
ランスフェリン、インシブリンを添加した。また亜セレ
ン酸。
ランスフェリン、インシブリンを添加した。また亜セレ
ン酸。
ピルビン酸を有害重金属の無毒化、栄養腺の補充などの
目的に用いた。トランスフェリンは０．１〜１００ ｐ
ｇ／ｍ＋、 ６７ましくはＯ，Ｉ −］ Ｏｕ ｇ／
ｍｌ、インシュリンは０．３〜１００ ｉｔ ｇ ／ｍ
＋、々了ましくは１〜１０．ｃｚｇ／ｍ＋、亜セレン酸
は０．１１−１Ｏ０ｘ１０−７．＆了ましくけ０．５〜
ｌ０ＸＩＯＭ、ピルビン酸は０．１〜１００ｍＭ、好ま
しくは０．５〜２０ｍＭの濃度範囲で用いる。
目的に用いた。トランスフェリンは０．１〜１００ ｐ
ｇ／ｍ＋、 ６７ましくはＯ，Ｉ −］ Ｏｕ ｇ／
ｍｌ、インシュリンは０．３〜１００ ｉｔ ｇ ／ｍ
＋、々了ましくは１〜１０．ｃｚｇ／ｍ＋、亜セレン酸
は０．１１−１Ｏ０ｘ１０−７．＆了ましくけ０．５〜
ｌ０ＸＩＯＭ、ピルビン酸は０．１〜１００ｍＭ、好ま
しくは０．５〜２０ｍＭの濃度範囲で用いる。
かくジζ得られる本発明の無血清培地馴化細胞は、誘発
剤で誘発されることによりインターフェロンを？↓−産
するようになる。従って、本発明は該細胞によるインタ
ーフェロンの製造法も提供する。
剤で誘発されることによりインターフェロンを？↓−産
するようになる。従って、本発明は該細胞によるインタ
ーフェロンの製造法も提供する。
以下、イ〉・ターフェロンの製造法について酊述するや
培養し一ζ得られた細胞液を希釈するかもしくは該細胞
をｌｊ離しインターフェロン産生に好適な濃度で新鮮培
地にｆＩＡｉ’ シ誘発剤で処理する。誘発剤の処理に
先立ら、処理剤で処理して該細胞を単離回収し改めて新
鮮培地に再浮遊培養すると一層効県的ｉ： Ｊ、、る。
をｌｊ離しインターフェロン産生に好適な濃度で新鮮培
地にｆＩＡｉ’ シ誘発剤で処理する。誘発剤の処理に
先立ら、処理剤で処理して該細胞を単離回収し改めて新
鮮培地に再浮遊培養すると一層効県的ｉ： Ｊ、、る。
かくして培養液中にインターフェト１ンが産生し、一定
時間後にインターフェロン産生が一定値に達するので、
これを回 収する。
時間後にインターフェロン産生が一定値に達するので、
これを回 収する。
処理剤による処理方法についてのべると、リンパ芽球細
胞を用いる場合は公知の誘発剤で処理する２４時間〜４
８時間以前より、ソジウノ・ブヂレイト、ジメチルスル
ボキシド（以下Ｉ）ＭＳＯと略す）、ビタミンＡ、５−
ブロモデオキシウリジンなどの処理剤を単独、もしくは
それぞれの組合−ピで処理するとより好ましい結果が得
られる。細胞は、上記処理剤で処理した後、無菌的に回
収し、新鮮な培地にこ再浮遊させＮＤＶ にュー力、ス
ル・ディズーズ・ウィルス）、センダイウィルス（１０
〜ｔ ｏ ｏ ｏ ｔｔΔＵ／ｍｌ）などを用いて誘発
する。細胞濃度は１〜２０ＸＩＯら細胞／ｍｌの範囲で
あればよいが、打ましくは４〜７Ｘ１０Ｇ糸１胞／ｍｌ
が望ましい。
胞を用いる場合は公知の誘発剤で処理する２４時間〜４
８時間以前より、ソジウノ・ブヂレイト、ジメチルスル
ボキシド（以下Ｉ）ＭＳＯと略す）、ビタミンＡ、５−
ブロモデオキシウリジンなどの処理剤を単独、もしくは
それぞれの組合−ピで処理するとより好ましい結果が得
られる。細胞は、上記処理剤で処理した後、無菌的に回
収し、新鮮な培地にこ再浮遊させＮＤＶ にュー力、ス
ル・ディズーズ・ウィルス）、センダイウィルス（１０
〜ｔ ｏ ｏ ｏ ｔｔΔＵ／ｍｌ）などを用いて誘発
する。細胞濃度は１〜２０ＸＩＯら細胞／ｍｌの範囲で
あればよいが、打ましくは４〜７Ｘ１０Ｇ糸１胞／ｍｌ
が望ましい。
これらの誘発処理後、２８〜３７℃下で１８〜４８時間
培養して、インターフグロンを生産−ｕしめインターフ
ェロンの力価が最大値を示Ｊ時点附近（誘発後１５〜２
４時間）で細胞１． ｔｉ’ｌを隻め、インターフェロ
ンを回収する。
培養して、インターフグロンを生産−ｕしめインターフ
ェロンの力価が最大値を示Ｊ時点附近（誘発後１５〜２
４時間）で細胞１． ｔｉ’ｌを隻め、インターフェロ
ンを回収する。
インターフェロンの力価測定は、ヒト羊膜１１１［胞Ｗ
Ｉ Ｓ ＩＩ細胞およびＶＳＶ （ヴエスキプラー・
ストマティティス・ウィルス）を用いた色素取込み法に
より行う。
Ｉ Ｓ ＩＩ細胞およびＶＳＶ （ヴエスキプラー・
ストマティティス・ウィルス）を用いた色素取込み法に
より行う。
本発明で用いるインターフェロン産生用の培地としては
、ペニシリン、ストレプトマイシンルタミン、ヘペス緩
術液等を添加したＲ １１Ｍ Ｉ −１６４０培地及び
イーグルＭ ＩＦ．Ｍ培地が適しており、血清は種々の
血清が用いられ０．５〜２０％、々了ましくけ３〜１０
％が逍している。さらに、インターフェロンの精製分離
を容易ならしめるためには無血清培地も効果的である。
、ペニシリン、ストレプトマイシンルタミン、ヘペス緩
術液等を添加したＲ １１Ｍ Ｉ −１６４０培地及び
イーグルＭ ＩＦ．Ｍ培地が適しており、血清は種々の
血清が用いられ０．５〜２０％、々了ましくけ３〜１０
％が逍している。さらに、インターフェロンの精製分離
を容易ならしめるためには無血清培地も効果的である。
無血清培地としテハ、」二足の培地の血清の替わりにイ
ンシュリン０、３−’１ ０ ０１Ｚｇ／ｍｌ好ましく
は１〜１０Ｍｇ／ｍ１，トランス７ ｙ．リン０． １
〜１ ０，Ｏ ｐ ｇ ／ ｍｌ， ｊｉＴましくは
１ 〜１ ０ 、Ｌｌ ｇ／ｍ１． ！ｌｌｉセレン酸
０．１−１００ＸＩＯ Ｍ，々了ましくは０．５〜ｌ
Ｏ Ｘ Ｉ Ｏ−７Ｍ．ピルビン酸すトリウノ、０．１
〜ｌ Ｏ （１ｍＭ，々Ｔましくは（１． ５ − ２
０ ｍ Ｍを加え、場合により＋ｌｕ ｔｎシルブミ
ン０、１−２ ０ ０ １１ ｇ／ｍｌ、＆Ｔましく
Ｌｔ． １〜５０Ｍｇ／ｍｌが適している。さらに、種
々の，ｊ；ルモン類，ビタミン類などを加えーＣも良い
。
ンシュリン０、３−’１ ０ ０１Ｚｇ／ｍｌ好ましく
は１〜１０Ｍｇ／ｍ１，トランス７ ｙ．リン０． １
〜１ ０，Ｏ ｐ ｇ ／ ｍｌ， ｊｉＴましくは
１ 〜１ ０ 、Ｌｌ ｇ／ｍ１． ！ｌｌｉセレン酸
０．１−１００ＸＩＯ Ｍ，々了ましくは０．５〜ｌ
Ｏ Ｘ Ｉ Ｏ−７Ｍ．ピルビン酸すトリウノ、０．１
〜ｌ Ｏ （１ｍＭ，々Ｔましくは（１． ５ − ２
０ ｍ Ｍを加え、場合により＋ｌｕ ｔｎシルブミ
ン０、１−２ ０ ０ １１ ｇ／ｍｌ、＆Ｔましく
Ｌｔ． １〜５０Ｍｇ／ｍｌが適している。さらに、種
々の，ｊ；ルモン類，ビタミン類などを加えーＣも良い
。
本発明の細胞を用いるインターフェロン４゛序は、血ｌ
ｌＩｉ添加培地で培養しウィルス誘導した場合より、１
１１１清濃度が低い場合、さらに無血清培地を用いる場
合の力が高いという利点を有する。
ｌＩｉ添加培地で培養しウィルス誘導した場合より、１
１１１清濃度が低い場合、さらに無血清培地を用いる場
合の力が高いという利点を有する。
以Ｆ本発明の実施例を示す。
実施例１。
ｌ）無血清培地・＼の馴化
工０％仔牛脂児血ｌｉ￥を含有するＩ２ Ｐ Ｍ ｌ−
１ ６４０培地（「Ｊ水製薬社製）を基礎培地としペニ
シリン２５Ｕ／ｍ＋．ストレプ１゛７・イシン２５μ［
／ｎ＋１，グルタミン４００＋ｎｇ／ｌ！．１Ｍへペス
緩衝液（ｐＨ７．０）１ ０ｍＭ／ｍｌを添加した培地
（以下ＦＣＳと称する）に継代培養されていたバーキン
トリンパ腫由来、リンパ芽球細胞ナマルハ株（ΔＴ Ｃ
ＣＣＲＬ−１４３２）の細胞６ＸｌＯ”細胞／ｍｌを１
０％（Ｖｔｌ／Ｖ）イＹ牛血漬含自ＲＰＭ ｔ−１６４
０培地を基礎培地としペニシリン２５１ノ／ｍｌ、スト
レゾ１−マイノン２５μｇ／ｍｌ、グルタミン４ ［１
０ｍｇ／ ＩＩおよびＩＭへベス緩挿１液（ｐｌ＋７．
０） Ｉ （］ｍＭ／ｍｌを添加した培地（以下Ｎ Ｂ
Ｓ １．０と称する）ＩＯｍｌに接種し、３７°Ｃて
４５０間８４＋代培養した。継代は、２日毎に８Ｘ１０
５♀Ｉｌｌ ＩＩ包／ｍｌとなるように１１１１胞数を
あわ一υて行った。
１ ６４０培地（「Ｊ水製薬社製）を基礎培地としペニ
シリン２５Ｕ／ｍ＋．ストレプ１゛７・イシン２５μ［
／ｎ＋１，グルタミン４００＋ｎｇ／ｌ！．１Ｍへペス
緩衝液（ｐＨ７．０）１ ０ｍＭ／ｍｌを添加した培地
（以下ＦＣＳと称する）に継代培養されていたバーキン
トリンパ腫由来、リンパ芽球細胞ナマルハ株（ΔＴ Ｃ
ＣＣＲＬ−１４３２）の細胞６ＸｌＯ”細胞／ｍｌを１
０％（Ｖｔｌ／Ｖ）イＹ牛血漬含自ＲＰＭ ｔ−１６４
０培地を基礎培地としペニシリン２５１ノ／ｍｌ、スト
レゾ１−マイノン２５μｇ／ｍｌ、グルタミン４ ［１
０ｍｇ／ ＩＩおよびＩＭへベス緩挿１液（ｐｌ＋７．
０） Ｉ （］ｍＭ／ｍｌを添加した培地（以下Ｎ Ｂ
Ｓ １．０と称する）ＩＯｍｌに接種し、３７°Ｃて
４５０間８４＋代培養した。継代は、２日毎に８Ｘ１０
５♀Ｉｌｌ ＩＩ包／ｍｌとなるように１１１１胞数を
あわ一υて行った。
ｉυられた細胞を、血清濃１すを５％にする以外は」−
記と同し培地（以Ｆ Ｎ １３ Ｓ ５と称“する）で
４Ｓ目間培養した。継代も同様に行った。血清濃度を３
％（Ｎ１３Ｓ ３）、１５％（Ｎ１３Ｓ］、５）と順次
減らして」−記と同様に培臂し、１１１４代、馴化を行
った。
記と同し培地（以Ｆ Ｎ １３ Ｓ ５と称“する）で
４Ｓ目間培養した。継代も同様に行った。血清濃度を３
％（Ｎ１３Ｓ ３）、１５％（Ｎ１３Ｓ］、５）と順次
減らして」−記と同様に培臂し、１１１４代、馴化を行
った。
１．５％血清含介培地に馴化し、安定した生育が１Ｊら
れた１ｌｌ１１胞を、無血ｔｉ’ｌ培地に馴化した。
れた１ｌｌ１１胞を、無血ｔｉ’ｌ培地に馴化した。
無血清培地としては、ＲＩ）Ｍ ｌ−１６４０ｑ＋地に
ペニシリン２５ Ｕ ／ ｍｌ、ストレブトマイシン２
５μｇ／ｍ１． グルタミン４００ｍｇ／Ｉ！、ＩＭへ
ベス緩衝液（ｐ ＩＩ ７． ［１） Ｉ ＯｍＭ／ｍ
１． インンプリン３μｇ／ｍｌ ｌ・ランスフェリン
５μｇ／ｍ１．亜セレン酸］、２５ＸｌＯｍＭ／ｍｌピ
ルビン酸５川Ｍ／ｍｌを含む無血清培地（以下″１′ｒ
″Ｉ） Ｓ”と作事る）を用いた。
ペニシリン２５ Ｕ ／ ｍｌ、ストレブトマイシン２
５μｇ／ｍ１． グルタミン４００ｍｇ／Ｉ！、ＩＭへ
ベス緩衝液（ｐ ＩＩ ７． ［１） Ｉ ＯｍＭ／ｍ
１． インンプリン３μｇ／ｍｌ ｌ・ランスフェリン
５μｇ／ｍ１．亜セレン酸］、２５ＸｌＯｍＭ／ｍｌピ
ルビン酸５川Ｍ／ｍｌを含む無血清培地（以下″１′ｒ
″Ｉ） Ｓ”と作事る）を用いた。
無血清培地・＼の馴化は、１，５％血ｔ■含有培地で馴
化した細胞７Ｘ１０５／ｍｌを無血清培地に接種し、３
７℃で４５０間、ｔ＋４代培養することにより行った。
化した細胞７Ｘ１０５／ｍｌを無血清培地に接種し、３
７℃で４５０間、ｔ＋４代培養することにより行った。
継代は、２日イσに７ Ｘ ］ （＋ ５ ｔｍ胞／…
１とな乙ように細胞数をあわゼで行った。
１とな乙ように細胞数をあわゼで行った。
増殖が安定し、細胞の形態も親株同様に安定した♀１■
胞がｉ５られた。この馴化細胞の１株をＩくＴ−１株と
命名した。
胞がｉ５られた。この馴化細胞の１株をＩくＴ−１株と
命名した。
馴化の退行を第１表に示Ｊ０
第 １ 表
ｒｃｓ １０ ２２−２４−
Ｎｉ３Ｓｉ（ｌ Ｉ（ｌ ｌＸｌ０７２２−’２４４５
ＮＢ Ｓ ５ ５ ２３−２５４５ ＮＩ３３３ ：（７，９ｘｌＰ ２４−２８４５ＮＢＳ
１．５１．５ −−’ ２５−２８４５１ ＴＰＳ Ｏ
’６．２ＸＩ０６２８−３１４５実施例２゜ インターフェロン４ユ産 Ｋ Ｔ −１株４ Ｘ １０６＄１１１１／ ｍｌをＩ
ＴＰ Ｓ培地１０ｍ１に浮遊さゼ１％（Ｖ／Ｖ）ＤＭ
ＳＯおよびｌ ｍ Ｍソジウムブチレイトを加え、３７
℃で２４時間培養した。細胞を遠心分離（１，５０Ｏｒ
ｐｍ。
ＮＢ Ｓ ５ ５ ２３−２５４５ ＮＩ３３３ ：（７，９ｘｌＰ ２４−２８４５ＮＢＳ
１．５１．５ −−’ ２５−２８４５１ ＴＰＳ Ｏ
’６．２ＸＩ０６２８−３１４５実施例２゜ インターフェロン４ユ産 Ｋ Ｔ −１株４ Ｘ １０６＄１１１１／ ｍｌをＩ
ＴＰ Ｓ培地１０ｍ１に浮遊さゼ１％（Ｖ／Ｖ）ＤＭ
ＳＯおよびｌ ｍ Ｍソジウムブチレイトを加え、３７
℃で２４時間培養した。細胞を遠心分離（１，５０Ｏｒ
ｐｍ。
５分間）し−Ｃ集めドｒ １１ Ｓ培地１０ｍ１に浮遊
さ−Ｕ、むンダイウィルス５００ ＩＩΔＬＪ／ｍｌを
加え、３７℃で８時間培養後、２８゛Ｃに移し、１４時
間後のインターフェロン活性を調べた。インターフエ１
：Ｉン活性は前述の方法を用いた。ｌ １．（ｌ ＯＯ
ＬＪ／ｍｌ −のインターフェロン活性が認められた。
さ−Ｕ、むンダイウィルス５００ ＩＩΔＬＪ／ｍｌを
加え、３７℃で８時間培養後、２８゛Ｃに移し、１４時
間後のインターフェロン活性を調べた。インターフエ１
：Ｉン活性は前述の方法を用いた。ｌ １．（ｌ ＯＯ
ＬＪ／ｍｌ −のインターフェロン活性が認められた。
ソＪｈｌ！＋１列３゜
インターフ−ｉ ＋：Ｉン生産に対するビタミンΔ感受
性 ＮＢ５３馴化細胞４．５６ ×Ｉ （１” ｌ’ｌｌｌ
胞７’ｍｌ、Ｉ＜１’−用細胞４ｘｌ［ｌ”細胞／ｍｌ
を、′）Ｊ施例２？、ニコ。
性 ＮＢ５３馴化細胞４．５６ ×Ｉ （１” ｌ’ｌｌｌ
胞７’ｍｌ、Ｉ＜１’−用細胞４ｘｌ［ｌ”細胞／ｍｌ
を、′）Ｊ施例２？、ニコ。
いてｌ） Ｍ Ｓ ＯＪイよびソシウムフチレイトによ
る処理に代え−で１％Ｉ） Ｍ Ｓ Ｏ、Ｉ ｍ Ｍソ
ジウノ・ブ’ｆ Ｌ／イトおよび５ Ｘ Ｉ ０−ｓｙ
ｌじタミンＡ、まノ、一番ま１９も１） Ｍ Ｓ Ｏお
よび５ Ｘ Ｉ （］ Ｍ １．：ｌ”ｙ ミン△ｉ、
： Ｊ： Ｚ＋処理を行う以外は実施例２と同様へ行７
、た。結果を第２表に示１゜ ｆｆ１２表 インターフェロン活性ＬＪ／＋ｎｌ ＤＭＳ旧ソジウムブチレ・イｌ ５０．０００ １１．
０００Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ＋ビタミン／＼ ］ ２． ＯＯ
（１０この結果Ｋ １’−１株はビタミンΔ処理によ、
つてインターフェロン生産能を発現しないことか明らか
である 実施例４゜ Ｋ １” −１株０） ＋１１１ ／ｒｔ ？ａ度非依
存ｐＨ（′１−Ｎ株５ＸＩＯ″′細胞／ｍｌをドｒ”
Ｔ） Ｓ培地ならびに（ｒ牛胎児血清を１．５または１
０％加えた培地に接種し、３７゛Ｃで２０間培養した。
る処理に代え−で１％Ｉ） Ｍ Ｓ Ｏ、Ｉ ｍ Ｍソ
ジウノ・ブ’ｆ Ｌ／イトおよび５ Ｘ Ｉ ０−ｓｙ
ｌじタミンＡ、まノ、一番ま１９も１） Ｍ Ｓ Ｏお
よび５ Ｘ Ｉ （］ Ｍ １．：ｌ”ｙ ミン△ｉ、
： Ｊ： Ｚ＋処理を行う以外は実施例２と同様へ行７
、た。結果を第２表に示１゜ ｆｆ１２表 インターフェロン活性ＬＪ／＋ｎｌ ＤＭＳ旧ソジウムブチレ・イｌ ５０．０００ １１．
０００Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ＋ビタミン／＼ ］ ２． ＯＯ
（１０この結果Ｋ １’−１株はビタミンΔ処理によ、
つてインターフェロン生産能を発現しないことか明らか
である 実施例４゜ Ｋ １” −１株０） ＋１１１ ／ｒｔ ？ａ度非依
存ｐＨ（′１−Ｎ株５ＸＩＯ″′細胞／ｍｌをドｒ”
Ｔ） Ｓ培地ならびに（ｒ牛胎児血清を１．５または１
０％加えた培地に接種し、３７゛Ｃで２０間培養した。
培芥後、！細胞数を血球１１３９板を用いて算出した。
結果を第３表に示す。
第 ３ 表
この結果、ｊｆ１１１ＩＩ７濃度の差および血清添加培
地と無血清汀２地との間に自息の差は見らねない。
地と無血清汀２地との間に自息の差は見らねない。
実施例５゜
Ｋ 丁−１株の形態的特徴
Ｎ Ｂ ｓ １０ ！ＫＩＤ化細胞と１＜ ’］” −
］株細胞の電子顕微鏡月ｒＪによる比較を次のとおり行
った。
］株細胞の電子顕微鏡月ｒＪによる比較を次のとおり行
った。
各細胞（１，５００ｒ ｐ ＋ｒ＋の沈殿物として１ｍ
１）４−０．１Ｍす：’Ｍ１．１ｆＪｉｉ？＆ （ｐｌ
＋７．０） ］ ｍＩテ？９ＵＩＩ＋後、２％グルクー
ル’Ｊ’ ルテヒド１ ｍｌ−Ｃｊ’ｌｉｌ固定し、
３．（１＋１０ｒ ｐ ｒｎ ］ ０分間遠心分離して
ｉ＋＋胞を集め、ｆ’ＩＩＬＯ１Ｏ，１Ｍリンｈｅ 緩
１ｆｆｌｉ液 （ｐｌ＋７．０）１ｍｌで３回１３Ｌ、
／１＋ Ｌ、た。
１）４−０．１Ｍす：’Ｍ１．１ｆＪｉｉ？＆ （ｐｌ
＋７．０） ］ ｍＩテ？９ＵＩＩ＋後、２％グルクー
ル’Ｊ’ ルテヒド１ ｍｌ−Ｃｊ’ｌｉｌ固定し、
３．（１＋１０ｒ ｐ ｒｎ ］ ０分間遠心分離して
ｉ＋＋胞を集め、ｆ’ＩＩＬＯ１Ｏ，１Ｍリンｈｅ 緩
１ｆｆｌｉ液 （ｐｌ＋７．０）１ｍｌで３回１３Ｌ、
／１＋ Ｌ、た。
１％オスミウム酸１ｍｌを加え、室温で６０分間ｆｉｌ
ｌ装し、同条イ′１で遠心分離し、０．１ Ｍ ＩＪン
酸緩ｆｉｒ ｌｆ＆（ｐｔｌ ７．０ ） ］ ｍｌで
６１．浄した。（、ＨＪられた２１１１胞をトチ１エタ
ノール系列（４５％、７０％、９０％。
ｌ装し、同条イ′１で遠心分離し、０．１ Ｍ ＩＪン
酸緩ｆｉｒ ｌｆ＆（ｐｔｌ ７．０ ） ］ ｍｌで
６１．浄した。（、ＨＪられた２１１１胞をトチ１エタ
ノール系列（４５％、７０％、９０％。
１００％）を用いて脱水し、自然乾燥した後、超薄切片
とし、酢酸ウラン月１独染色し、Ｉ ００ Ｋ Ｖ下、
日本電子社製電子顕微鏡、Ｊ Ｉ巳ＯＬ −Ｉ Ｑ Ｏ
Ｃ透過型を用いて観察した。一方走査法用に、脱水乾燥
したｋｌｌｌ胞を塗抹法により金蒸着し、同電子顕倣鏡
で観察撞影した。
とし、酢酸ウラン月１独染色し、Ｉ ００ Ｋ Ｖ下、
日本電子社製電子顕微鏡、Ｊ Ｉ巳ＯＬ −Ｉ Ｑ Ｏ
Ｃ透過型を用いて観察した。一方走査法用に、脱水乾燥
したｋｌｌｌ胞を塗抹法により金蒸着し、同電子顕倣鏡
で観察撞影した。
走査電顕像より、両細胞の細胞表面お、１、び形聾には
差異はみられなかった。
差異はみられなかった。
透過法による切片像からは、Ｋ ｉ’ −１株は、細胞
質内に（トコンドリアが非常に発達しており、大きさは
０．２〜１．０１）（平均０．５１り、長さ２〜５μの
球状ないし糸状形を示し′Ｃいることがわかった。Ｋ
ｉ” −１株の方がミド：１ンドリアの数が多いことは
、Ｋ Ｔ−１株がエネルギー系を強化し′Ｃいることを
示している。
質内に（トコンドリアが非常に発達しており、大きさは
０．２〜１．０１）（平均０．５１り、長さ２〜５μの
球状ないし糸状形を示し′Ｃいることがわかった。Ｋ
ｉ” −１株の方がミド：１ンドリアの数が多いことは
、Ｋ Ｔ−１株がエネルギー系を強化し′Ｃいることを
示している。
Ｎ １３ Ｓ ］ ０馴化細胞には多数の脂肪滴の存在
が認められた点がＫＴ １株と大きく異なっていた。
が認められた点がＫＴ １株と大きく異なっていた。
実施例６゜
１＜ Ｔ−１株５ス１０５細胞／…１をＩ ｉ″ＰＳ培
地１イＹ牛血清１％、５％、１０％添加培地（Ｎ ）（
Ｓ １゜５、 Ｉ ［１）ならびに仔牛脂児血清１％、
５％、１０％添加培地（Ｆｅ２ Ｌ、５．Ｉ Ｏ）に接
種し、３７℃で２１」間培養した。培養後５０％の培養
液を同し培地に交換し、２００ ＩＩ△ＬＪ／、ｍｌの
ヒンダイウィルスを加え、３７°Ｃて２４時間培養した
。
地１イＹ牛血清１％、５％、１０％添加培地（Ｎ ）（
Ｓ １゜５、 Ｉ ［１）ならびに仔牛脂児血清１％、
５％、１０％添加培地（Ｆｅ２ Ｌ、５．Ｉ Ｏ）に接
種し、３７℃で２１」間培養した。培養後５０％の培養
液を同し培地に交換し、２００ ＩＩ△ＬＪ／、ｍｌの
ヒンダイウィルスを加え、３７°Ｃて２４時間培養した
。
インターフ、、 Ｉ′ｌン生産の結果をｆｆ！４表に示
ず。
ず。
第４表
、Ｉ’ｌ’ＰＳ ５，６８０
以−にの結果、Ｋ ′ｒ’−１株は、１１＋ｔ ？ｎ濃
度が低いほどインターフェロン化）γ能が高（、無１１
１１請培地（ｌ ＴＩ） Ｓ ’）で最も高いインター
フェロン生産能を示した。
度が低いほどインターフェロン化）γ能が高（、無１１
１１請培地（ｌ ＴＩ） Ｓ ’）で最も高いインター
フェロン生産能を示した。
特８′１出願人（１１４）Ｖ業技術院長用 １．１１
裕 部
裕 部
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１，１血Ｉｎを含有しない培地では増殖しなし）ヒト
１ノンパ封球細胞を馴化して無血清培地ζこ増り直−Ｃ
きるようにした新規ヒＩ・リンツマ芽球１１■胞。 （２）無血Ｉｎ培地が、基礎培地に−々ニジ１ノン、ス
トレゾ１−マイシン、クルタミン、ヘペスｋｍ ｔＩＴ
ｌｉ 液。 インシュリン、トランスソエリン、亜イ！レン酸および
ピルビン酸から選ばれノこ１種を含に＋音ｊｌＬ＋であ
ることを特徴とする特＝’１ｌｌＩ′Ｉ求の範囲第１Ｌ
３’ｊ記載のヒトリンパ芽Ｌｐ ２ｍ胞。 （３）基礎培地がＲＩ） Ｍ ＋−川用４０． イーク
′ルＭＥＭ、タルベソコウＭ Ｅ Ｍ 、ノ＼Ｊ、 ｌ
用Ｑ、Ｊぜコ；びハムＦ１２から途はれることを特徴と
する特許請求の範囲第２項記載のヒトリンノで刃球に１
１胞。 （４）無血清培地が旧）Ｍ ＋ −１［ｉ ４０ζこベ
ニシフノン、ストレプトマイシン、グルタミン、ヘペス
ｔｉｔ ｉｔｉ液、インシュリン、トランスフェリン、
亜セレン酸およびピルビン酸を加えた培１［！Ｉである
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のヒ１、リ
ンパ芽球細胞。 （５） ウィルス誘発によりインターフェロンを生産す
る能力を有することを特徴とする特１′１請求の範囲第
１項記載のヒトリンパ芽球細胞。 （６） ウィルス誘発によるインターフェロン生産能が
ビタλンへ感受性であることを特徴とする特許請求の範
囲第５項記載のヒトリンパ芽球細胞。 （７） 血清を含有しない培地では増殖しないリンパ芽
球細胞を、血清濃度を順次低下さゼた培地に培養し、最
終的に血ｌｎを含まない培地に培養することにより、該
リンパ芽球１１■胞を血清を含まない培地で増殖できる
ように馴化−１しめることを特徴とする無血清培地で増
殖できるリンパ芽球♀ＩＩ胞の１！ｌ製法。 （８）無血清培地が、基礎培地にペニソリン、スＩ・レ
ゾ１マイシン、グルタミン、′＼ベスｔｔ’Ａ ｆ＋Ｔ
ｊ ７ｆ１ 。 インクプリン、トランスフェリン、亜セレン酸４ゴ、１
、びピルビン酸から選ばれた１種を含む培地であること
を特徴とする特許請求の範囲第７項記載の調製法。 （９） 基礎培地がＲＰＭＩ−−１６４０，・Ｃ−グル
ＭＥＭ、 ダルベノコウＭＥＭ、ハノ、Ｆ］Ｏおよびハ
ムＦ１２から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲
ｍ８項記載の調製法。 ００）無血清培地がＲＩ） Ｍ Ｉ −１６４０にベニ
シリン、ストレプト”フィシン、グルタミン、へベヌＨ
（ｋｒ ｉ（ｆ、 、インシュリン、トランスフェリン
、亜セレン酸およびピルビン酸を加えた培地であること
を特徴とする特許請求の範囲第７項記載の調製法。 ０ＤＩＩＩＬ清を含有しない培地では増殖しないヒトリ
ンパ芽球細胞を馴化し゛ζ無血清培地に増殖できるよう
にしたヒトリンパ芽球細胞をウィルス誘発によりインタ
ーフェｉ」ンを生Ｄ１．１−る能力ををする細胞とし、
これを培地に培養し゛Ｃ１培養物中にインターフェロン
を蓄積ｌしめ、該培養物からインターフェロンを採取す
ることを特徴とするイターフェロンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58112875A JPS606190A (ja) | 1983-06-24 | 1983-06-24 | 新規細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58112875A JPS606190A (ja) | 1983-06-24 | 1983-06-24 | 新規細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS606190A true JPS606190A (ja) | 1985-01-12 |
| JPH0352956B2 JPH0352956B2 (ja) | 1991-08-13 |
Family
ID=14597713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58112875A Granted JPS606190A (ja) | 1983-06-24 | 1983-06-24 | 新規細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS606190A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63192381A (ja) * | 1987-02-05 | 1988-08-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 無血清培地で増殖継代可能な細胞およびその取得方法 |
| JPS6456689U (ja) * | 1987-10-03 | 1989-04-10 | ||
| JPH0833468A (ja) * | 1994-07-22 | 1996-02-06 | Noboru Akiyama | 茶用とうもろこし焙煎粒及びとうもろこし茶の製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57208987A (en) * | 1981-03-26 | 1982-12-22 | Univ California | Lymph cell system capable of fusing at high fusing degree |
-
1983
- 1983-06-24 JP JP58112875A patent/JPS606190A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57208987A (en) * | 1981-03-26 | 1982-12-22 | Univ California | Lymph cell system capable of fusing at high fusing degree |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63192381A (ja) * | 1987-02-05 | 1988-08-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 無血清培地で増殖継代可能な細胞およびその取得方法 |
| JPS6456689U (ja) * | 1987-10-03 | 1989-04-10 | ||
| JPH0833468A (ja) * | 1994-07-22 | 1996-02-06 | Noboru Akiyama | 茶用とうもろこし焙煎粒及びとうもろこし茶の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0352956B2 (ja) | 1991-08-13 |
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