JPS606193A - 固定化微生物膜の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化微生物膜の製造法に関する。

更にｙ）′、Ｌ　＜は、）ｌ］０Ｄ７ｉＩｊｌ定装置の
酸素センサー検出部のＢＯＤセンサー要素などとして有
効に用いられる固定化微生物膜の製造法に関する。

固定化微生物膜を得る方法として、従来から次のような
方法が知られているが、それぞれ欠点があり、いずれも
十分に満足される方法とけいえない。

（１）セラミック１次などへの物理的吸着。この方法は
、吸着さＪｔだ微生物が脱離し易いという欠点がある。

（２）ポリビニルアルコールなどの水溶液中１ｔｃ　６
１　生物を混入させた後、キャスｉ・、風乾して成膜す
る方法。この膜の場合には、炭素源、窒素源、゛無機物
などの透過性に乏しいという欠点がみられる。

（３）コラーゲン・フィブリル液と微生物とを混合後、
キャスト、風乾した後、更にグルタルアルデヒド水溶液
中（Ｃ浸漬、風乾して膜を得る方法。この方法では、２
段階の操作を必要としている。

（４）ポリアクリルアミド、アルギン酸、カラゲナン、
寒天などを使用し、ゲル中ｒ固定化する方法。

この場合、膜状にすると脆くなり、寸た例えばポリアク
リルアミドを例にとると、重合に際しては重合開始剤、
重合促進剤、架橋剤などモノマー以　外の成分を必要と
する。

本発明は、かかる従来技術の欠点などをふまえて、ｎｏ
Ｄｉ！Ｉｌｌ定装置の酸未センザー検出部の１３０Ｄセ
ンサー要素などに有効に用いられる固定化ｒ、ｉ生物膜
の製造法を提供するものであり、１？ＩＩ定化微生物膜
の製造は、微生物を混入さ４ゼた水溶性モノマー水溶液
中に多孔質高分子１１ぐを浸清し、該高分子膜に微生物
および水溶性モノマーを含浸ざセた後、水溶液中から引
き上げた未乾操含浸７１”ｊをプラズマ照射し、てモノ
マーを重合さぜ、それによって微生物を高分子膜に固定
せしめることによって行われる。

（微生物としては、対数増殖期もしく　（ｑｔ定常期に
ある微生物が用いられ、具体的には、例えばシュー　）
−モナス・フルオレッセンス、バチルス°ズブチリス、
シュードモナス・エルギノーザなどの細菌、アスペルギ
ルス・ニガー、リゾプス・ホルモセンシスなどの糸状菌
、ストレプトミセス・グリセウスなどの放線菌、ザツカ
ロミセス・セレビツセ、トリコスポロン・クタノイムな
どの酵母菌、かびなどが挙げらｉする。

水溶性モノマーとしては、例えばアクリルアミド、メタ
クリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンス
ルボン酸、メタクリル酸−２−ヒト［１キシＪ、チルエ
ステルなどが挙げられる。これらの水溶性モノマー４１
１、一般に約５〜８０重＠％程度の１・！＆度の水溶液
に調製され、その際必要に応じて、更に少量のＮ、ＩＪ
’−メチレンビスアクリルアミドなどの架橋剤がそこに
添加される。そして、このような水溶液１　ｍｌ当り約
０．１〜１０η２？程度の微生物がそこに混入される。

かかる水溶液中ｔ／ｃ多孔質高分子膜が浸漬され、この
ｆＪｊ４に微生物および水溶性モノマーが含浸される。

高分子膜とじ一〇は、酢酸セルロース（トリ酢酸セルロ
ースを含む）、ポリウレタン、目ζリスルホン、ポリア
クリロニトリル、ポリプロピレン、ｙ４′：り環化ビニ
ル、ポリアミド、ポリイミド、ポリカーボネートなどの
多孔質膜、一般にＣ才多孔度が約５％以」二で最大孔径
が約０，８〜１．２μｍを右する多孔質膜が用いられる
。浸漬の、約１０〜４０℃の温度で約１〜１２０分間程
度行われる。

このようにして、微生物および水溶性モノマーを含浸さ
せた多孔質膜は、水溶液中から引き上げられ、乾燥しな
いうちに、ガラス板などの基板に搭載した状態で、プラ
ズマ照射することによりモノマーを重合させる。

プラズマ重合は、例えば第１図にその概略が示されるよ
うな装置を用いて行われる。Ｂち、真空ポンプ１、リー
クバルブ２およびメインバルブ３に接続され、真空計４
を備えたプラズマ反応器５内に多孔質高分子膜６を収容
し、反応器内を約０．００１〜ＩＱ　Ｔｏｒｒの圧力に
なる迄高真空状態とした後、高周波発生装置１’Ｚ　（
１３，５６Ｍ　Ｈ２）　？およびマツチンダニニット８
よりなる高周波′市源を用いて、有効電力約５０〜２０
０ｗ、時間約５〜６００秒間の条件下で、発振コイル９
からプラズマ照射することにより行われる。なお、反応
器としては、キューブ型およびペルジャー型のいずれを
も用いることができ、また放電電極としてはコイル状の
もの以外に外部もしくは内部平行電極板を用いることも
できる。

多孔質高分子膜として未乾燥状態のものが用いられるの
は、モノマーの歌合に水が関与しているためである。ま
た、プラズマ重合は、一般に２０℃前後で行われること
が適当であり、このためプラズマ反応器に冷却装置を取
り付け、膜を冷却した状態で重合することが望ましい。

照射終了後、膜は約４〜３０℃の温度で約１時間乃至３
日間程度放置し、後重合させる。これらの処理により、
モノマーは膜の多孔質面で重合し、同時に微生物が膜に
固定化されることになる。

このように、本発明によれば、モノマーを用いて微生物
を高分子膜に固定化させるに際し、重合開始剤、重合促
進剤などを用いることなく、短時間のプラズマ照射のみ
によってそれを行なうことができる。しかも、例えば酵
母菌をグルタルアルデヒドで高分子膜に化学結合させよ
うとすると、膜材はアルデヒド基に対して結合性を有す
る基、例えばアミ７基などを有していなければならず、
膜材の種類の選択に制限が課せられることになるが、本
発明方法によればそのような制限はない。

得られた固定化微生物ｆｖ、ｉｌ２、例えばＢＯＤ測定
装置の酸素センサー検出部のＢＯＤセンサー要妬などと
して用いることができる。この膜をＢＯＤセンサーに用
いたＢＯＤ測定装置に、酸素消費紀を酸素電極で測定す
ると、被測定物溶液の濃度の増加と共に出力電圧は直線
的な低下を示し、しかもその出力電圧の測定値となるベ
ース電圧および平衡電圧は約２週間程度はぼ安定した値
を示すので、固定化微生物膜は有効にＢＯＤセンーリー
として機能する。

次に、実施例について本発明を説明する。

実施例１ 酵母菌Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｃｕｔａｎｅｕｍ　
（ＩＡＭ　１２２０６　）を、ｐｕ６．０の液体培地に
て、培養器（三洋′市機製Ｍｌ−１５（１型）中で３０
℃、４８時間好気的に培養した。培地組成ｄ１、麦芽エ
キス０．３％、酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．
３％、グルコース１％および緩衝液９８．１％よりなる
。培養状態は、可視および紫外吸収光度計（島津製作所
製ＵＶ　−１９０）を用い、６３０　ｎｍの吸収の吸光
度を測定することにより観察した。培養時間が約２５時
間ケ経過すると、その吸光度は約１．２となり、その後
は一定の値で経過する。

＃ｆ養後の酵母菌は、遠心分離機（国産遠心機製Ｈ−２
００型）を用い、８０００　ｏで集菌された。この酵母
菌を、１０５℃で２４時間乾燥した後、その２ｒｎｙｋ
アクリルアミド水溶液１ｍｅ中に混入した。

このアクリルアミド”水溶液ｕ：　、アクリルアミドモ
ノマー２ｏ重、１％、Ｎ、　Ｎ／−メチレンビスアクリ
ルアミド架橋剤０．３重量％および逆浸透水７９．７重
量％よりなる組成を有している。

次いで、この酵母菌を含有する水溶液中に、多孔質ホ゛
リウレタン膜を室温で５分間浸漬した。用いられた多孔
質ボリウレクンＩＩφＵ１、ホ”リエチレンアジペート
、４．４°−ジフェニルシイノンアネートおよびハイド
ロギノンジエチロールエーテル主鎧延長剤を用いて重合
したポリコニスプル型ポリウレタンヲ、ジメチルホルム
アミド中にｉｏ重量憾の諾度で溶解し、ガラス板上で成
膜、水溶液中でゲル化および多孔質化させた後乾燥した
ものであり、湿潤時の厚さは０．１４＋ｎｊｎ、最大孔
径は電子顕微鏡（日立−明石製ＭＳＮ　−７型）による
観察でｌ、Ｑ　ｌ１ｍである。

浸漬された多孔質ポリウレタン膜は、水溶液中からす１
き上げられ、十分に乾燥されないうちにガラス板上に搭
載し、第１図に示されたプラズマ照射装置を用い、０．
１　Ｔｏｒｒの頁空状態で６０秒間プラズマ照射を行な
った。○−リング部分１ｏによってプラズマ反応器を分
割し、高分子膜を反応器から取り出した後２５℃で２４
時間放１１イし、アクリルアミドの後重合を行ｊ（つた
。

このようにして、アクリルアミド超刀漠の多孔；６面で
ｉ重合しかつ架橋ざｈると同時Ｖこ酵１′：ｆ菌もＪｌ
−ηｆ固定化されるが、固定化の確１沼−次のよう１（
シて行われた。この高分子ｊ俟を、ｐＨ７，Ｑのリン酸
緩衝液中に２４時間浸漬し、酵母菌の脱＋ｔｉｌｅの有
力ＩＩを可視および紫外吸光光度、計を用いて、６３（
）　ｒｌ、ｍの波長Ｃｙｌｉｌｌ定した。そのＸ−ｊ果
、酵母菌の脱〆Ｆ現象１：ｌ　ｉｊ召められなかった。

実施例２ 実施例１で製造された酵母菌固定化多孔質ポリウレタン
１侯を用い、ＢＯＤ測定装ｒｆｉを製作した。

ＢＯＤ　（生物学的酸素要求量）は、排水中の汚染物で
ある有機物質の濃度指標を示すものであり、その値の測
定には少くとも５日間を要し、また測定した人の個人的
な誤差も入りつる煩雑を工程を必要とし、従ってｔ＃カ
便にして迅速なｉｑ＋ｕ定を１１■能とする装着°の開
発が望まれていた。

第２図は、ＢＯＤ測定装置を示す概略図であり、その装
ｆｔｆｆ１本体にけ溶存酸素分析用（ベックマン社１！
４０２６０型）ｌｉ′ｆＫ：使用し、電極からの出力ｍ
圧はレコーダー（横河′１１を機ｖ：１０６６型）１２
を用いて記録した。酵イυ菌を固定化したポリウレタン
膜１３シ）二、スターク−１４上に楢ψさねかつ（Ｗ押
子１５を備えた容硼ＩＱＯ＋ｖｊ！のビーカー１６中の
ｐＨ７，０リン酸緩衝液１７中に半分浸漬される酸素電
極１８の浸漬側端面であるテトラフルオロエチレン樹脂
製置ＩＪ１４の下ｊ？（ｓｌｌこ密着するように取すイ
４けら〕する。ぞして、ビーカーは、温度３０℃の恒温
槽１９中で一定ン昌度に保持される。出力電圧Ｕ、この
状態でベース電圧が５．７５　ｍｙで安定イヒし、た。

この状態で、グル：１−ス（関東化学１７！品）をそれ
ぞれ５０　、１００　、１ｆｉＯまたけ２００　ｐｎ　
＋ｎ含翁する］）Ｈ７，０のリン１−ｉ’ｌ　ｋｍ　’
ＦＪＪ　ｆ（１，、ＬＯｏ　１．７１！づツ叶・、川（
ｉ　＠　（／こビーカー中に入れ、ぐ−こに前記電柚（
を浸漬し、その出力′電圧を測定し７こ。

ｒｉ’ｉ’　ｉｉＪ：菌の存在下０１次の分厚ｒ反応が
１了われ、グルコース＋０２−→Ｃｏ２−１　）１２０
＋ΔＥこｔしに用いら、１１−７、；１暫素消費）１１
．全１′Ｈ（２素電極で油１寓し、ぞ）’Ｌ　’に？出
力′載１］：、のｉ４下として劃′、ｔすると、グルコ
ース濃度Ｏｐｐｍのときの出力’７ｉ’ｊ圧（ベース′
Ｉｆｉ　Ｉｊモ）５．７５　ｍＶから察度２００　ｐｐ
ｍのときの出力？４Ｔ、　Ｉ’ｌ’：　１２　ｎ＃迄、
濃度の増加と共に出力可ｎ：、　＋佳直鞄的に低下する
ことが判った。なｊ５、このγ１ｊ１１宇ｆ１１日且、
各６）ｐ１度における平衡電圧についてのン則定結果で
ある。

この結果から、ポリウレタン膜中に固定化された酵１Ｊ
菌は、ゲルコースを咋化し、その際溶存酸素を消費して
おり、全体としてＢ（’）］）センザーとじて機能する
ことが判った。捷た、ベース電圧およ゛び５０　ｐｐｍ
グルコース平衡−ｆｌｊ、圧についての安定性を測定し
た結果、いずれも約２凋間にわたって安定であることが
確認された。

４　図面のＩ’ｉ？ｊ弔ンｊ説明 第」図にし、本発明で用いられるプラズマτノ【合装置
の一態様を示づ一概略図である。ｆだ、第２図は、本発
明に係る固定ｆ１）微生物Ｈつを酸素センザー検出部の
Ｂｏｂ）・ｉ！ンサー７り素どして用いたＢＯＤ測定装
置の−ｒ用様の概略図である。

（省゛号の１１）ａ明） Ｉ・・・・・・・・・・・・真空ポンプ４・・・・・・
・・・・・・プラズマ反応器６・・・・・・・・・・・
・多孔質高分子膜７・・・・・・・・・・・・）％ＭＪ
波発牛装置８・・・・・・・・・・・マツチングユニッ
ト９・・・・・・・・・・・・ｆｌ　４辰コイル１１・
・・・・・・・・・・・溶存師素分析汀１１２・・・・
・・・・・・・・出力可、圧レコーダー１３・・・・・
・・・・・・・微生物固定化膜１８・・・・・・・・・
・・・酸素電極代理人 弁ｊ）７１士　吉　ＩＪＪ　俊　夫

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物を混入さゼた水溶性モノマー水溶液中に多孔
   質高分子ｊ摸を浸漬し、該高分子膜に微生物および水溶
   性モノマーを含浸さぜた後、水溶液中から引き上げた未
   乾燥含浸膜をプラズマ照射してモノマーを重合させ、そ
   れによって微生物を高分子膜に固定せしめることを特徴
   とする固定化微生物膜の製造法。 ２、　ＢＯＤ測定装置の酸素センサー検出部のＥＯＤセ
   ンサー要素に用いられる特許請求の範囲第１項記載の固
   定化微生物膜の製造法。