JPS6062984A - 耐熱性β−ガラクトシダ−ゼ遺伝子を有する新規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダ−ゼの製造法 - Google Patents
耐熱性β−ガラクトシダ−ゼ遺伝子を有する新規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダ−ゼの製造法Info
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- JPS6062984A JPS6062984A JP17107783A JP17107783A JPS6062984A JP S6062984 A JPS6062984 A JP S6062984A JP 17107783 A JP17107783 A JP 17107783A JP 17107783 A JP17107783 A JP 17107783A JP S6062984 A JPS6062984 A JP S6062984A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は耐熱性β−ガラクトンダーゼ遺伝子を有する新
規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造法に
関する。
規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造法に
関する。
β−ガラクトシダーゼは乳糖をガラクトースとグルコー
スに加水分解する作用を有する酵素で、低乳糖牛乳の製
造に用いられたり、チーズ製造の際、副産物として大量
に生成する乳清（Ｗｈｅｙ）中の乳糖から利用価値の高
いガラクトース、又はグルコースを製造するために用い
られる等食品加工に広く利用されている。食品加工に用
いられる酵素としては加工中の微生物汚染を防ぐ観点か
ら高温使用に耐え得る耐熱性酵素が望ましい。そこで本
発明者らは、耐熱性β−ガラクトシダーゼを製造する方
法について鋭意研究した結果、好熱菌パシルス・ステア
ロサーモフィラスから得た耐熱性β−ガラクトシダーゼ
の遺伝情報を担うＤＮＡをベクターを介して大腸菌に導
入させることに成功するとともに。
スに加水分解する作用を有する酵素で、低乳糖牛乳の製
造に用いられたり、チーズ製造の際、副産物として大量
に生成する乳清（Ｗｈｅｙ）中の乳糖から利用価値の高
いガラクトース、又はグルコースを製造するために用い
られる等食品加工に広く利用されている。食品加工に用
いられる酵素としては加工中の微生物汚染を防ぐ観点か
ら高温使用に耐え得る耐熱性酵素が望ましい。そこで本
発明者らは、耐熱性β−ガラクトシダーゼを製造する方
法について鋭意研究した結果、好熱菌パシルス・ステア
ロサーモフィラスから得た耐熱性β−ガラクトシダーゼ
の遺伝情報を担うＤＮＡをベクターを介して大腸菌に導
入させることに成功するとともに。
この大腸菌を培養して得られた菌体がら耐熱性β−ガラ
クトシダーゼを工業的有利に取得することに成功し、本
発明を完成するに至った。
クトシダーゼを工業的有利に取得することに成功し、本
発明を完成するに至った。
以下に本発明の詳細な説明する。
耐熱性β−ガラクトシダーヅの遺伝情報を担う１） Ｎ
Ａ （以下、染色体１） Ｎ Ａと称する）のバシル
ス°ステアロサーモフィラスがらの単ＲＩＭ製は常法に
従って行うことができる。例えばＢｉｏｃｂｉｍ、 Ｂ
ｉｏｐｂｙｓ、 Ａｃｔａ、 ７２．６１９−６２９
（１９６３）に記載のフェノール法により行うことがで
きる。
Ａ （以下、染色体１） Ｎ Ａと称する）のバシル
ス°ステアロサーモフィラスがらの単ＲＩＭ製は常法に
従って行うことができる。例えばＢｉｏｃｂｉｍ、 Ｂ
ｉｏｐｂｙｓ、 Ａｃｔａ、 ７２．６１９−６２９
（１９６３）に記載のフェノール法により行うことがで
きる。
この染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組込みは染色体
ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを制限酵素で切断して染色
体ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡ断片を調製したのち
１両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより
行うことができる。ここで用いられるベクター１） Ｎ
Ａとよびその誘導体（例えばｐＨＲ３２２，Ｉ）ＡＣ
ＹＣ１７７等）やλファージ等があげられ、とりわけｐ
ＨＲ３２２゜ｐＡＣＹＣ１７７が好適に用いられる。ま
た制限酵素としてはＢａｍＨ１，ＢｇＬＩＪ、 Ｅｃｏ
Ｒｌ、 Ｐｓｔ ｌ、 Ｍｌｕ ｌ。
ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを制限酵素で切断して染色
体ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡ断片を調製したのち
１両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより
行うことができる。ここで用いられるベクター１） Ｎ
Ａとよびその誘導体（例えばｐＨＲ３２２，Ｉ）ＡＣ
ＹＣ１７７等）やλファージ等があげられ、とりわけｐ
ＨＲ３２２゜ｐＡＣＹＣ１７７が好適に用いられる。ま
た制限酵素としてはＢａｍＨ１，ＢｇＬＩＪ、 Ｅｃｏ
Ｒｌ、 Ｐｓｔ ｌ、 Ｍｌｕ ｌ。
ＳａＬ ｌ 、 Ｘｂｏ １等があげられる。さらに］
） Ｎ ＡリガーゼとしてはＴ ４フアージ由来のＤ
Ｎ Ａリガーゼが好適に用いられる。
） Ｎ ＡリガーゼとしてはＴ ４フアージ由来のＤ
Ｎ Ａリガーゼが好適に用いられる。
上記方法で得られた組換え体ＤＮＡの大腸菌への導入は
Ｐｒｏｃ、 ＮａｔムＡｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、
Ａ、、 ６９゜２１１０−２１１４ （１９７２）に記
載のカルシウムイオン処理により行うことができる。組
換え体ＤＮＡ（すなわち、耐熱性β−ガラクトシダーゼ
の遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組込んだベクターＤＮＡ
）を有する菌株の選択方法は、当該組換え体ＤＮＡを調
製するのに際して使用した制限酵素やベクターＤＮＡの
種類によっても異なるが９例えば、制限酵素としてＸｈ
ｏ ｌを用い、ベクターＤＮＡとしてｐＡｃＹｃ１７７
を用いた場合には。
Ｐｒｏｃ、 ＮａｔムＡｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、
Ａ、、 ６９゜２１１０−２１１４ （１９７２）に記
載のカルシウムイオン処理により行うことができる。組
換え体ＤＮＡ（すなわち、耐熱性β−ガラクトシダーゼ
の遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組込んだベクターＤＮＡ
）を有する菌株の選択方法は、当該組換え体ＤＮＡを調
製するのに際して使用した制限酵素やベクターＤＮＡの
種類によっても異なるが９例えば、制限酵素としてＸｈ
ｏ ｌを用い、ベクターＤＮＡとしてｐＡｃＹｃ１７７
を用いた場合には。
次のようにして行うことができる。すなわち菌株をトリ
プトン・イースト・エクストラクト培地（以下Ｔ Ｙ
Ｅ寒天培地という）に培養し、アンピシリン耐性でカナ
マイシン感受性の菌株を第一次選択する。次いでこの菌
株を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（以下Ｘｇａｔという）とアンピ
シリンを含むＴ Ｙ Ｅ寒天培地に培養し、青色を呈す
るコロニーを選択し、最終的にはβ−ガラクトシダーゼ
活性の有無を確認する。
プトン・イースト・エクストラクト培地（以下Ｔ Ｙ
Ｅ寒天培地という）に培養し、アンピシリン耐性でカナ
マイシン感受性の菌株を第一次選択する。次いでこの菌
株を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（以下Ｘｇａｔという）とアンピ
シリンを含むＴ Ｙ Ｅ寒天培地に培養し、青色を呈す
るコロニーを選択し、最終的にはβ−ガラクトシダーゼ
活性の有無を確認する。
次いで、」二記方法で得られた組換え体ＤＮＡ含有菌株
より組換え体１）ＮＡを単離する。組換え休１） Ｎ
Ａの単離は常法に従って行うことができる。例えばＮｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ｖｏＬ
−７，ｐｌ）１５１３−Ｊ５２３ （１９７９）に記載
のアルカリ抽出法により行うことができる。この様にし
て得られた組換え休］） Ｎ Ａを大腸菌に導入すれば
１組換え体ＤＮＡを含有する大腸菌を調製することがで
きる。組換え体ＤＮＡを含有する大腸菌はアンピシリン
とＸｇａｌを含むＴＹＥ寒天培地に出現する青色コロニ
ーとして取得することができる。
より組換え体１）ＮＡを単離する。組換え休１） Ｎ
Ａの単離は常法に従って行うことができる。例えばＮｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ｖｏＬ
−７，ｐｌ）１５１３−Ｊ５２３ （１９７９）に記載
のアルカリ抽出法により行うことができる。この様にし
て得られた組換え休］） Ｎ Ａを大腸菌に導入すれば
１組換え体ＤＮＡを含有する大腸菌を調製することがで
きる。組換え体ＤＮＡを含有する大腸菌はアンピシリン
とＸｇａｌを含むＴＹＥ寒天培地に出現する青色コロニ
ーとして取得することができる。
このようにして得られた組換え体ＤＮＡを含有する大腸
菌は、それらの代表的菌株として次の２株が工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。
菌は、それらの代表的菌株として次の２株が工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。
エシェリヒア・コ９２９４−４３（ｐＨ０１）〔徽工研
菌寄第７２３２号〕 エシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐｌＩＧ ２ ）
〔微工研菌寄第７２３３号〕 本発明による耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造は、上
記のようにして得られた新規な遺伝子組換大腸菌を常法
により培養し、集菌したのち、常法により菌体を破砕し
、無細胞抽出液をとることにより行われる。かくして得
られた耐熱性β−ガラクトシダーゼの精製は、熱処理お
よび通常のタンパク質の精製法１例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル沢過等の方法により行われるが、
特に熱処理が有効である。この熱処理による精製法はパ
シルス・ステアロサーモフィラスやサーマス・サーモフ
ィラスから耐熱性β−ガラクトシダーゼを取得するのに
従来行われている方法とは異なり、新規かつ有効な方法
である。
菌寄第７２３２号〕 エシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐｌＩＧ ２ ）
〔微工研菌寄第７２３３号〕 本発明による耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造は、上
記のようにして得られた新規な遺伝子組換大腸菌を常法
により培養し、集菌したのち、常法により菌体を破砕し
、無細胞抽出液をとることにより行われる。かくして得
られた耐熱性β−ガラクトシダーゼの精製は、熱処理お
よび通常のタンパク質の精製法１例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル沢過等の方法により行われるが、
特に熱処理が有効である。この熱処理による精製法はパ
シルス・ステアロサーモフィラスやサーマス・サーモフ
ィラスから耐熱性β−ガラクトシダーゼを取得するのに
従来行われている方法とは異なり、新規かつ有効な方法
である。
即ち、好熱菌の生産する蛋白質は全て熱安定性が良いの
で、細胞抽出液を熱処理しても全・蛋白質が徐々に変性
するのみで、特にβ−ガラクトシダーゼのみが精製され
ることはない。
で、細胞抽出液を熱処理しても全・蛋白質が徐々に変性
するのみで、特にβ−ガラクトシダーゼのみが精製され
ることはない。
これに対し、常温菌の大腸菌に好熱菌の遺伝子を組込ん
だ本発明の新規微生物が産生ずるβ−ガラクトシダーゼ
は熱安定性の点で１元の大腸菌の蛋白質とは大差があり
、約７０℃３０分程度の加熱処理で大腸菌の蛋白質は大
部分変性して沈殿となるが、β−ガラクトシダーゼはほ
とんど変性せず熱処理液中に溶解している。
だ本発明の新規微生物が産生ずるβ−ガラクトシダーゼ
は熱安定性の点で１元の大腸菌の蛋白質とは大差があり
、約７０℃３０分程度の加熱処理で大腸菌の蛋白質は大
部分変性して沈殿となるが、β−ガラクトシダーゼはほ
とんど変性せず熱処理液中に溶解している。
この熱処理液を遠心分離するだけで、上清に純度の上昇
したβ−ガラクトシダーゼが得られる。
したβ−ガラクトシダーゼが得られる。
この熱処理による簡便かつ効率の良いβ−ガラクトシダ
ーゼの分離精製法は本発明の遺伝子組換技術により初め
て可能になった新規技術である。
ーゼの分離精製法は本発明の遺伝子組換技術により初め
て可能になった新規技術である。
以下に本発明の実施例を掲げる。
実施例１゜
本実施例は、ＤＮＡ供与体としてバシルス・ステアロサ
ーモフィラスＩＡＭＩ１００ＩをベクターＤＮＡとして
ｐＡＣＹＣ１７７を、制限酵素としてＸｈｏ ｌを、宿
主大腸菌として、エシェリヒア・コリ２９４ （ＡＴＣ
Ｃ３１４４６）のニトロソグアニジン変異処理により得
たβ−ガラクトシダー、ゼ欠損株〔以下゛′エシェリヒ
ア・コリ２９４−４３ （ｒｋ−ｍｋ ）”という〕を
用いて行った例である。
ーモフィラスＩＡＭＩ１００ＩをベクターＤＮＡとして
ｐＡＣＹＣ１７７を、制限酵素としてＸｈｏ ｌを、宿
主大腸菌として、エシェリヒア・コリ２９４ （ＡＴＣ
Ｃ３１４４６）のニトロソグアニジン変異処理により得
たβ−ガラクトシダー、ゼ欠損株〔以下゛′エシェリヒ
ア・コリ２９４−４３ （ｒｋ−ｍｋ ）”という〕を
用いて行った例である。
（１）耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を担う染
色体ＤＮＡの調製と切断 バシルス・ステアロサーモフィラスＪＡＭ１１００１を
乳糖０．２チを含む’ｒ Ｙ Ｅ培地（トリプトン１％
、酵母エキス０．５％、 ＮａＣｚＯ，５％、ｐ！１７
．０）４を中、６０℃で６時間振とう培養した。菌体を
集洗菌後、２００−の１ ｍ９／ｌｎε リゾチーム入
りの２０ ｍＭ’Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５） 、
５ ｍＭＩ（ＤＴＡ緩衝液に懸濁し、１５℃、１５分
間放置する。２０％ＳＤＳ溶液を５−加えて、溶菌させ
、この溶菌液に２０５ｍ／のフェノール（使用直前に２
０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｔ（ｐｌＩ８．０）で飽和して
おいたもの）を加え、おだやかに攪はん後、遠心分離す
る。（７，ＯＯＱ ｒｐｍ。
色体ＤＮＡの調製と切断 バシルス・ステアロサーモフィラスＪＡＭ１１００１を
乳糖０．２チを含む’ｒ Ｙ Ｅ培地（トリプトン１％
、酵母エキス０．５％、 ＮａＣｚＯ，５％、ｐ！１７
．０）４を中、６０℃で６時間振とう培養した。菌体を
集洗菌後、２００−の１ ｍ９／ｌｎε リゾチーム入
りの２０ ｍＭ’Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５） 、
５ ｍＭＩ（ＤＴＡ緩衝液に懸濁し、１５℃、１５分
間放置する。２０％ＳＤＳ溶液を５−加えて、溶菌させ
、この溶菌液に２０５ｍ／のフェノール（使用直前に２
０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｔ（ｐｌＩ８．０）で飽和して
おいたもの）を加え、おだやかに攪はん後、遠心分離す
る。（７，ＯＯＱ ｒｐｍ。
１０分）水層（上層）をとり、さらにフェノール抽出を
数回くり返して得られた水層に、２倍容量の９５チエタ
ノールを加え、生じた白色沈殿をガラス棒にまきつけ回
収する。このＤＮＡを０．１ｘＳＳＣ溶液１００＋ｊニ
溶解り、２００πｅのエタノールを加え再度エタノール
沈殿を行う。生じた沈殿を」１記と同様に回収し、４５
−の０．ｌＸ５ＳＣ溶液に溶解後、５ｍ７！の１０ Ｘ
８ＳＣを加える。（終濃度１ｘＳ８Ｃとなるように）
得られたＩ） Ｎ Ａ溶液’５０ｍｅをエチジウムブロ
マイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけ。
数回くり返して得られた水層に、２倍容量の９５チエタ
ノールを加え、生じた白色沈殿をガラス棒にまきつけ回
収する。このＤＮＡを０．１ｘＳＳＣ溶液１００＋ｊニ
溶解り、２００πｅのエタノールを加え再度エタノール
沈殿を行う。生じた沈殿を」１記と同様に回収し、４５
−の０．ｌＸ５ＳＣ溶液に溶解後、５ｍ７！の１０ Ｘ
８ＳＣを加える。（終濃度１ｘＳ８Ｃとなるように）
得られたＩ） Ｎ Ａ溶液’５０ｍｅをエチジウムブロ
マイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけ。
染色体１） Ｎ Ａ ７５０μＶを得た。染色体ＤＮＡ
を切断するため、１０ ｐｆｆのＩ）ＮＡに対し１０
ｕ （７）Ｘｈｏ １を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−１４
（１（ＩＡ１７．４）、 ５０ｍＭＮａＣ１１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２の反応液５０ｐｔ中で、３７℃にて３時間反
応を行わせ、６５℃で１０分間加熱して。
を切断するため、１０ ｐｆｆのＩ）ＮＡに対し１０
ｕ （７）Ｘｈｏ １を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−１４
（１（ＩＡ１７．４）、 ５０ｍＭＮａＣ１１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２の反応液５０ｐｔ中で、３７℃にて３時間反
応を行わせ、６５℃で１０分間加熱して。
）（ｈｏ ｌを失活させ、ＤＮＡをエタノール沈殿させ
た後、２５１Ｌｔの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＴ（
７，５）１ｍＭＥＤＴＡ （以下ＴＥ緩衝液と称Ｔ）に
とかす。
た後、２５１Ｌｔの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＴ（
７，５）１ｍＭＥＤＴＡ （以下ＴＥ緩衝液と称Ｔ）に
とかす。
（２）ベクターＤＮＡの調製と切断
アンピシリン耐性及びカナマイシン耐性を有するｐＡｃ
Ｙｃ １７７プラスミドのＤＮＡを下記のようにして調
製した。
Ｙｃ １７７プラスミドのＤＮＡを下記のようにして調
製した。
ｐＡｃＹｃ１７７をプラスミドとして持つエシェリヒア
−コリＣ６００（ｒｋ−・ｍｋ−） ［Ａ、 Ｃ，Ｙ、
Ｃｈａｎｇ。
−コリＣ６００（ｒｋ−・ｍｋ−） ［Ａ、 Ｃ，Ｙ、
Ｃｈａｎｇ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｈａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３４
１１４１−１１５６ （Ｈ）７８）−］をＭ９培地（Ｎ
ａ２ＨＰＯ４５，８Ｗ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ４３ｆ／ｌ。
１１４１−１１５６ （Ｈ）７８）−］をＭ９培地（Ｎ
ａ２ＨＰＯ４５，８Ｗ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ４３ｆ／ｌ。
ＮａＣｔ５ｊμ、 ＮＨ４Ｃｌ １ ｆ／ｌ、 Ｃａ
ｃｚ２１１ｍ９／Ｌ、 Ｍｇ ８０４９５ ｍ９／ｌ、
１７’ｅ Ｃ／−３１，６ｍ９／ｌ、カサミノ酸５７
μ、グルコース４ ｆ／Ｌ ） １５０ ｍｅ中で ３
７℃で培養液の５ＱＱｎｒｎの吸光度が０．６〜１．０
になるまで培養後。
ｃｚ２１１ｍ９／Ｌ、 Ｍｇ ８０４９５ ｍ９／ｌ、
１７’ｅ Ｃ／−３１，６ｍ９／ｌ、カサミノ酸５７
μ、グルコース４ ｆ／Ｌ ） １５０ ｍｅ中で ３
７℃で培養液の５ＱＱｎｒｎの吸光度が０．６〜１．０
になるまで培養後。
２００μ秒賃のクロラムフェニコールを添加して一夜培
養を続けた。菌体な集注菌後、２ｍｑ／ｍ１（Ｄリゾｆ
−ムを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐｌ（８，０）
。
養を続けた。菌体な集注菌後、２ｍｑ／ｍ１（Ｄリゾｆ
−ムを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐｌ（８，０）
。
５０ｍＭグーｔレコ−ス、１０ｍＭＥＤＴＡ１５ｍｇに
懸濁し。
懸濁し。
０℃で３０分間放置後、０．２ＮＮａ０１１．１％５Ｄ
Ｓ（ラウリル硫酸ブ゛トリウム）３０−を加え溶菌させ
、０℃で５分間放置した。次いで３Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ４，８） ２２．５ ｍｌ加え、０℃で１時間放置
後、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、 ２０分）して上清
を得た。上清に２．５倍量のエタノールを加えＤＮＡを
沈殿させた後、５ｍｇの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐ
）１７．５）に溶かした。このＤＮＡ溶液をエチジウム
ブ（Ｊマイト−塩化セシウム平衡密度勾配遠心ニカけ、
ｌ］ＡｃＹｃ１７７プラスミド１）ＮＡ１００μｆを得
た。ベクター１）Ｎ−Ａを切断するためｐＡＣＹＣ１７
７１／７りに文ＪＬ、５１１のＸｂｏ ｌを力１１えｒ
１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｉｌｃｔ（ｐＨ７，４）、 ５０
ｍＭＮａＣｔ、１０ｍＭＭｇ（２２の反応液２０μを中
で、３７℃、２時間反応を行わせ。
Ｓ（ラウリル硫酸ブ゛トリウム）３０−を加え溶菌させ
、０℃で５分間放置した。次いで３Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ４，８） ２２．５ ｍｌ加え、０℃で１時間放置
後、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、 ２０分）して上清
を得た。上清に２．５倍量のエタノールを加えＤＮＡを
沈殿させた後、５ｍｇの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐ
）１７．５）に溶かした。このＤＮＡ溶液をエチジウム
ブ（Ｊマイト−塩化セシウム平衡密度勾配遠心ニカけ、
ｌ］ＡｃＹｃ１７７プラスミド１）ＮＡ１００μｆを得
た。ベクター１）Ｎ−Ａを切断するためｐＡＣＹＣ１７
７１／７りに文ＪＬ、５１１のＸｂｏ ｌを力１１えｒ
１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｉｌｃｔ（ｐＨ７，４）、 ５０
ｍＭＮａＣｔ、１０ｍＭＭｇ（２２の反応液２０μを中
で、３７℃、２時間反応を行わせ。
６５℃で１０分間加熱し、１）ＮＡをエタノール沈殿さ
せた後、２０ｐＬの’ｌｌ’Ｅ緩衝液にとかす。
せた後、２０ｐＬの’ｌｌ’Ｅ緩衝液にとかす。
（３） 染色体ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの挿入
（１）で得た染色体１）ＮＡＩＯμ２と （２）で得た
ベクターＤＮＡ０．５７ｊりを混合しｅ ６６ｍＭＴｒ
ｉｓ −Ｈｅ（ｐＨ７，５）、 １０ｒｎＭＭｇＣ／−
ｚ、１０ｍＭジチオスレイト−＃ 、１ ｍＭ Ａ Ｔ
Ｐの反応液５０ｐｔ中で０．２０のＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼにより４℃、１６時間反応させた後、６５℃、１０
分間加熱し、ＤＮＡ溶液とした。
ベクターＤＮＡ０．５７ｊりを混合しｅ ６６ｍＭＴｒ
ｉｓ −Ｈｅ（ｐＨ７，５）、 １０ｒｎＭＭｇＣ／−
ｚ、１０ｍＭジチオスレイト−＃ 、１ ｍＭ Ａ Ｔ
Ｐの反応液５０ｐｔ中で０．２０のＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼにより４℃、１６時間反応させた後、６５℃、１０
分間加熱し、ＤＮＡ溶液とした。
（４）組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換
エシェリヒア・コリ２９４−４３をＬ培地（トリプトン
１チ、酵母エキス０．５ ％ｔ Ｎａ（Ｊｏ、５１−グ
ルコース０．１チ、 ｐ）■７．０ ） ５０７！中３
７℃で培養液の５ＱＱ ｎｍの吸光度が０．６〜１，０
になるまで振とう培養し、集菌する。１２．５ｍｇの０
．１ Ｍ ＭｇＣｌ２で洗浄後、１２．５ ｍｌ ０Ｊ
Ｊ） ０．１ Ｍ Ｃａ Ｃ１２に懸濁し、０℃。
１チ、酵母エキス０．５ ％ｔ Ｎａ（Ｊｏ、５１−グ
ルコース０．１チ、 ｐ）■７．０ ） ５０７！中３
７℃で培養液の５ＱＱ ｎｍの吸光度が０．６〜１，０
になるまで振とう培養し、集菌する。１２．５ｍｇの０
．１ Ｍ ＭｇＣｌ２で洗浄後、１２．５ ｍｌ ０Ｊ
Ｊ） ０．１ Ｍ Ｃａ Ｃ１２に懸濁し、０℃。
２０分間放置する。遠心集菌後、２．！５ｍｌの１５％
グリセリンｓ ｏ、Ｉ Ｍ Ｃａ Ｃｔ、に懸濁する。
グリセリンｓ ｏ、Ｉ Ｍ Ｃａ Ｃｔ、に懸濁する。
この懸濁液０．２−に（３）で得たＤＮＡ溶液１０μｔ
を加え。
を加え。
０℃で１時間放置後４２℃で３分間処理する。
この懸濁液をＬ・培地″にて１０倍に希釈し、３７℃で
３０〜９０分間涼持後、アンピシリン（５０ｐｆ７旬）
を含むＴＹＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一夜培養し
、アンピシリン耐性となった大腸菌を得る。
３０〜９０分間涼持後、アンピシリン（５０ｐｆ７旬）
を含むＴＹＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一夜培養し
、アンピシリン耐性となった大腸菌を得る。
（５） 耐熱性β−ガラクトシダーゼ産生能を有する大
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン耐性の大腸菌の
うちカナマイシン（５μｆ／ｍｅ）を含むＴＹＥ寒天培
地で生育できないものを選び。
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン耐性の大腸菌の
うちカナマイシン（５μｆ／ｍｅ）を含むＴＹＥ寒天培
地で生育できないものを選び。
Ｘｇａｌ （４ｏ μｆ／ｍｇ）とアンビシリｙ （５
０ｐｔ／ｍｅ）を含むＴＹＥ寒天培地に植菌し、３７℃
で培養する。
０ｐｔ／ｍｅ）を含むＴＹＥ寒天培地に植菌し、３７℃
で培養する。
β−ガラクトシダーゼ産生能を有する大腸菌のコロニー
は青色を呈する。かくして得られた新規な大腸菌はエシ
ェリヒア・コ９２９４−４３（ｐｓＩＧｌ）と名付け、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。〔微工研
菌寄第７２３２号： １Ｍ５ｃｌｉｅｒｉｃｈａ ｃｏ
ｌｉ ２９４−４３ （ｐＨ０１）−）（６）大腸菌の
保持する組換え体ＤＮＡの解析（５）で得られた形質転
換株をアンピシリン（５０μケ賃）を含むＭ９培地１５
０ｍｇ中で３７℃で培養し、（２）と同様にしてプラス
ミドＤ Ｎ Ａ １００μ２を得た。このプラスミドＤ
ＮＡを用いて。
は青色を呈する。かくして得られた新規な大腸菌はエシ
ェリヒア・コ９２９４−４３（ｐｓＩＧｌ）と名付け、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。〔微工研
菌寄第７２３２号： １Ｍ５ｃｌｉｅｒｉｃｈａ ｃｏ
ｌｉ ２９４−４３ （ｐＨ０１）−）（６）大腸菌の
保持する組換え体ＤＮＡの解析（５）で得られた形質転
換株をアンピシリン（５０μケ賃）を含むＭ９培地１５
０ｍｇ中で３７℃で培養し、（２）と同様にしてプラス
ミドＤ Ｎ Ａ １００μ２を得た。このプラスミドＤ
ＮＡを用いて。
エシェリヒア・コリ２９４−４３を（４）と同様の方法
で形質転換したところ、得られた形質転換株は全てアン
ピシリン耐性でβ−ガラクトシダーゼ産生能を有してい
た。このことはプラスミドＤＮＡ上にβ−ガラクトシダ
ーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ断片が組込まれていること
を示している。
で形質転換したところ、得られた形質転換株は全てアン
ピシリン耐性でβ−ガラクトシダーゼ産生能を有してい
た。このことはプラスミドＤＮＡ上にβ−ガラクトシダ
ーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ断片が組込まれていること
を示している。
またこのプラスミドＤＮＡを（２）と同様の方法で制限
酵素Ｘｈｏｌで切断し、耐熱性β−ガラクトシダーゼの
遺伝情報を担うＤＮＡ断片の大きさを１％アガロースゲ
ル電気泳動法礁二より測定したところ６メガダルトン（
Ｍｄ）であった。
酵素Ｘｈｏｌで切断し、耐熱性β−ガラクトシダーゼの
遺伝情報を担うＤＮＡ断片の大きさを１％アガロースゲ
ル電気泳動法礁二より測定したところ６メガダルトン（
Ｍｄ）であった。
（７）大腸菌の産生するβ−ガラクトシダーゼの耐熱性
エシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐｍｌＧｌ ）を
Ｌ培地１５０−中で、３７℃、６時間振とう培養し。
Ｌ培地１５０−中で、３７℃、６時間振とう培養し。
集菌後、Ｚ緩衝液（０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＩｔ７．
ｏ）。
ｏ）。
１０ｍＭＫＣｔ、 １ｍＭＭｇ５Ｏ＋、５０ｍＭ ２−
メルカプトエタノール〕３−に懸濁する。超音波処理に
より無細胞抽出液゛を調製した。
メルカプトエタノール〕３−に懸濁する。超音波処理に
より無細胞抽出液゛を調製した。
この無細胞抽出液の７０℃、３０分間の熱処理前後のβ
−ガラクトシダーゼ活性を基質としてＯ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下０ＮＰＧと称す
）を用いて下記のようにして測定した。０．８ｍν駕の
０ＮＰＧを含むＺ緩衝液２ゴと酵素液０．４ ｍｌを混
合し。
−ガラクトシダーゼ活性を基質としてＯ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下０ＮＰＧと称す
）を用いて下記のようにして測定した。０．８ｍν駕の
０ＮＰＧを含むＺ緩衝液２ゴと酵素液０．４ ｍｌを混
合し。
６５℃で一定時間放置後Ｉ ＭＮａ２ ｃｏ３１ ｔｎ
εを加え水冷し１反応により生じたソルトニトロフェノ
ールの量を４２０ｎｍの吸光度により測定した。
εを加え水冷し１反応により生じたソルトニトロフェノ
ールの量を４２０ｎｍの吸光度により測定した。
１分間に１μモルのオルトニトロフェノールを遊離する
酵素量を１０とした。
酵素量を１０とした。
対照として野生株であるエシェリヒア°コリ２９４ （
Ａ’ｌ’ＣＣ３１４４６）を乳糖０．２％を含むＴＹＥ
寒天培地で培養し、上記と同様にして得た無細胞抽出液
を用いた。
Ａ’ｌ’ＣＣ３１４４６）を乳糖０．２％を含むＴＹＥ
寒天培地で培養し、上記と同様にして得た無細胞抽出液
を用いた。
その結果はｆ８１表の通りである。
第１表
７０℃、３０分間の熱処理後も８０チの活性−残存して
おり、比活性は４．５倍に上昇してＩ／Ｘることか示さ
れた。
おり、比活性は４．５倍に上昇してＩ／Ｘることか示さ
れた。
実施例２゜
本実施例はＤＮＡ供与体としてプラスミドｐＩＩＧｌを
制限酵素、としてＰＧｌを、 ベクターＤＮＡとしてｐ
ＢＲ３２２を、宿主大腸菌としてエシェリヒア・コリ２
９４−４３を用いて行った例である。
制限酵素、としてＰＧｌを、 ベクターＤＮＡとしてｐ
ＢＲ３２２を、宿主大腸菌としてエシェリヒア・コリ２
９４−４３を用いて行った例である。
（１）プラスミドｐｌ（Ｇｌの切断
実施例１の（６）で得たプラスミドＤＮＡ １μｆ（二
対し、５ｕのｐｓＬ ｌを加え、２ＱｍＭＴｒｉｓ−１
１Ｃｔ（ｐＨ７，５）、 １０ｍＭＭｇ（Ｅ４ｚ、 ５
６ｍＭ （ＮＨ４）２８０４．０．１ｍＶ−牛血清アル
ブミンの反応液２０μを中で３７℃、３時間反応を行わ
せ、６５℃、１０分間加熱し、エタノール沈殿後、２０
μｔのＴｌｌ緩衝液にとかす。
対し、５ｕのｐｓＬ ｌを加え、２ＱｍＭＴｒｉｓ−１
１Ｃｔ（ｐＨ７，５）、 １０ｍＭＭｇ（Ｅ４ｚ、 ５
６ｍＭ （ＮＨ４）２８０４．０．１ｍＶ−牛血清アル
ブミンの反応液２０μを中で３７℃、３時間反応を行わ
せ、６５℃、１０分間加熱し、エタノール沈殿後、２０
μｔのＴｌｌ緩衝液にとかす。
（２）ベクター１） Ｎ Ａの調製と切断アンビシ９ン
耐性及びテトラサイクリン耐性を有するｐ Ｂ Ｉ＜
３２２プラスミドのＤＮＡをｐＢＲ３２２をプラスミド
として持つエシエリヒア−−７すＣ６００（ｒｌｃ−ｍ
ｋ−）を用いて実施例１の（２）に記した方法で調製し
た。その結果ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ１１１１ｇ
を得た。ベクターＤＮＡを切断するためｐＢＲ３２２ｉ
ｐｆ ＋ニ一対し＋ ５ｕノＰｓｔ１を加え、２０ｍ
Ａ４’ｌ”ｒｉｓ−）ＩＣｔ（ｐ＋１７．５ ）、 １
０ｍＭＭｇＣ／−２゜５０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４．０
．１ｍｙ７，１牛血清アルブミンノ反応液２０μを中で
：３７℃、 ３時間反応を行わせた後６５℃、１０分間
加熱し、エタノール沈殿後。
耐性及びテトラサイクリン耐性を有するｐ Ｂ Ｉ＜
３２２プラスミドのＤＮＡをｐＢＲ３２２をプラスミド
として持つエシエリヒア−−７すＣ６００（ｒｌｃ−ｍ
ｋ−）を用いて実施例１の（２）に記した方法で調製し
た。その結果ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ１１１１ｇ
を得た。ベクターＤＮＡを切断するためｐＢＲ３２２ｉ
ｐｆ ＋ニ一対し＋ ５ｕノＰｓｔ１を加え、２０ｍ
Ａ４’ｌ”ｒｉｓ−）ＩＣｔ（ｐ＋１７．５ ）、 １
０ｍＭＭｇＣ／−２゜５０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４．０
．１ｍｙ７，１牛血清アルブミンノ反応液２０μを中で
：３７℃、 ３時間反応を行わせた後６５℃、１０分間
加熱し、エタノール沈殿後。
２０μｔの゛Ｉ’Ｅ緩衝液にとかす。
（３） ＤＮＡ断片の結合
（１）で得たＤＮＡ０．５μ２と（２）で得たベクター
Ｄ Ｎ Ａ ９．５ ｐｆを混合し、６６ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｃｔ（ｐＨ７，５）。
Ｄ Ｎ Ａ ９．５ ｐｆを混合し、６６ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｃｔ（ｐＨ７，５）。
１０ｆｎＭＭｇ（Ｊ２． １０ｍＭ９ チオスレイト−
／ｌ／、 １ｍＭＡＴＰの反応液５ＱμＡ中で、０．２
ｕのＴ４’−ＤＮＡリガーゼにより４℃、１６時間反応
させた後、６５℃。
／ｌ／、 １ｍＭＡＴＰの反応液５ＱμＡ中で、０．２
ｕのＴ４’−ＤＮＡリガーゼにより４℃、１６時間反応
させた後、６５℃。
１０分間加熱し、ＤＮＡ溶液とした。
（４）組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換
実施例１の（４）と同様にして、上記の如くして調製し
たＤＮＡ溶液をエシェリヒア・コリ２９４−４３に導入
し、テトラサイクリン（５μ２／ｍ７りとＸｇａｌ （
４０ｐｆ／ｍｅ）を含むＴＹＥ寒天培地でコロニーが青
色を呈するものを選択した。かくして得られた新規な大
腸菌をエシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐ）ｌＧ２
）と名付け、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
した。〔微工研菌寄第７２３３号： ｈｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ２９４−４３（ｐＨ０２） 、 ） （５）大腸菌の保持する組換え休］） Ｎ Ａの解析（
４）で得られた形質転換株をテトラサイクリン（５μｆ
／ｌｄ）を含むＭ９培地１５〇−中で３７℃で培養し、
（２）と同様にしてプラスミド］ＪＮＡ３００μｆを得
た。 このプラスミドＤＮＡを（２）と同様の方法で制
限酵素ＰｓＬ ｌで切断し、 耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝情報を担うＤＮＡ断片の大きさを１係アガロー
スゲル電気泳動法により測定したところ２Ｍｄであった
。
たＤＮＡ溶液をエシェリヒア・コリ２９４−４３に導入
し、テトラサイクリン（５μ２／ｍ７りとＸｇａｌ （
４０ｐｆ／ｍｅ）を含むＴＹＥ寒天培地でコロニーが青
色を呈するものを選択した。かくして得られた新規な大
腸菌をエシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐ）ｌＧ２
）と名付け、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
した。〔微工研菌寄第７２３３号： ｈｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ２９４−４３（ｐＨ０２） 、 ） （５）大腸菌の保持する組換え休］） Ｎ Ａの解析（
４）で得られた形質転換株をテトラサイクリン（５μｆ
／ｌｄ）を含むＭ９培地１５〇−中で３７℃で培養し、
（２）と同様にしてプラスミド］ＪＮＡ３００μｆを得
た。 このプラスミドＤＮＡを（２）と同様の方法で制
限酵素ＰｓＬ ｌで切断し、 耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝情報を担うＤＮＡ断片の大きさを１係アガロー
スゲル電気泳動法により測定したところ２Ｍｄであった
。
（６）大腸菌の産生するβ−ガラクトシダーゼエシェリ
ヒア・コリ２９４−４３ （ｐＨ０２）から実施例】の
（７）と同様にして調製した無細胞抽出液のβ−ガラク
トシダーゼ活性を測定したところ１２．１ ｕ／ｍｅ
（０，５３ｕ／ｍｙ蛋白）であり、７０℃。
ヒア・コリ２９４−４３ （ｐＨ０２）から実施例】の
（７）と同様にして調製した無細胞抽出液のβ−ガラク
トシダーゼ活性を測定したところ１２．１ ｕ／ｍｅ
（０，５３ｕ／ｍｙ蛋白）であり、７０℃。
：３０分間の熱処理後の活性はｇ、７ ｕ／ｍＡ （２
，４”／’９蛋白）であった。
，４”／’９蛋白）であった。
なお、」−記実施１及び２で創製した新規大腸菌エシェ
リヒア・コリ２９４−４３ （ｐ）Ｉｏ １ ）及びエ
シェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐｌ（０２）の菌学
的性質はいづれもアンピシリン耐性及び耐熱性β−ガラ
クトシダーゼ生産性を示す以外は普通の大腸菌の性質と
ほぼ同一である。
リヒア・コリ２９４−４３ （ｐ）Ｉｏ １ ）及びエ
シェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐｌ（０２）の菌学
的性質はいづれもアンピシリン耐性及び耐熱性β−ガラ
クトシダーゼ生産性を示す以外は普通の大腸菌の性質と
ほぼ同一である。
特許用Ｎ１人
わかもと製薬株式会社
Claims (3)
- （１） バシルス°ステアロザーモフィラスかう取得し
た耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ
断片を大腸菌用ベクターＤＮＡに組込んだ新規組換え体
ＤＮＡ０ - （２） バシルス・ステアロサーモフィラスから取得し
た耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ
断片を大腸菌用ベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮ
Ａを導入させた新規な大腸菌。 - （３） パシルス・ステアロサーモフィラスから取得し
た耐熱性β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ
断片を大腸菌用ベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮ
Ａを導入させた大腸菌を培養し、その培養菌体に蓄積し
た耐熱性β−ガラクトシダーゼを採取することを特徴と
する耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17107783A JPS6062984A (ja) | 1983-09-19 | 1983-09-19 | 耐熱性β−ガラクトシダ−ゼ遺伝子を有する新規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17107783A JPS6062984A (ja) | 1983-09-19 | 1983-09-19 | 耐熱性β−ガラクトシダ−ゼ遺伝子を有する新規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6062984A true JPS6062984A (ja) | 1985-04-11 |
Family
ID=15916584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17107783A Pending JPS6062984A (ja) | 1983-09-19 | 1983-09-19 | 耐熱性β−ガラクトシダ−ゼ遺伝子を有する新規な大腸菌及び耐熱性β−ガラクトシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6062984A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54163889A (en) * | 1978-06-07 | 1979-12-26 | Nat Res Dev | Enzyme and utilization thereof |
| JPS5756495A (en) * | 1980-09-24 | 1982-04-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Novel dna-introduction vector and recombinant dna |
-
1983
- 1983-09-19 JP JP17107783A patent/JPS6062984A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54163889A (en) * | 1978-06-07 | 1979-12-26 | Nat Res Dev | Enzyme and utilization thereof |
| JPS5756495A (en) * | 1980-09-24 | 1982-04-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Novel dna-introduction vector and recombinant dna |
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