JPS6062995A - 新規な含窒素多糖体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シュウトモナス属に属する微生物を利用して
生産される抗腫瘍活性を示す新規な含窒素多糖体および
その製造方法に関する。

近年、種々の微生物が生産する多楯類の抗肺鵠活性につ
いて数多く報告されており、それらのうちには工業的に
製品化さｎているものもみもれる。

本発明者は、抗腫ｊ４活性を示す多［類を生産する微生
物について検討した結果、海水凄微生物であるシュウト
モナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）に属する新菌株
を培養することにニジ得られる培養物中に優れた抗神瘍
活性を示し、且つ毒性の低し・含窒素多糖体を見出し、
本づｉ明をなｒに至った。

したがって、本発明の目的は、特定／、ｃ政生′１勿を
利用して生産される抗惜場活性を示−’！”！Ｊｒ　ｍ
　ｆｘ含窒素多楯体およびその製造方法を提供すること
ｅこある。

以Ｆ本発明の詳細な説明する。

本発明に係る含窒素多糖体（以−Ｆ　Ｍ　−２３１９物
質と称−ｆる）はＦ記にツバＪ−性質によってｔ時定さ
！Ｌる。

ｌ）形状 白色の粉末体であって、無味、無臭である。

２）均一性 超遠心分析で単一ピークを示−ｆとｉｓ＋′Ｃ、セルロ
ースアセテート膜を用（・た電気体！１１１１分析でも
アルシアンブルーに染まる単一）（ンドヲ示′１″仁と
から均一性は高いといえる。

３）分子量 セファロース２Ｂおよび４Ｂ力ラムクロマトグラフイ分
析による測定でｉ　ｏ’乃至ｉｏ’の平均分子量を有す
る。

４）融点 明確な融点を示さず、３００℃附近で分解して温度する
。

５）溶解性 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセトン、グロ
パノール、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、ヘキサン、ベ
ンゼン、エーテル、クロロホルムには不溶。

６）呈色反応 アンスロン反応　爾　性 モーリッシュ反応　陽　性 システィン硫酸反応　陽　性 フェノール硫酸反応　陽　注 鋼フォーリン反応　陰　性 カルバゾール反応　１−　性 以上の呈色反応からみて物質Ｍ−２３１９は主としてア
ミン糖、中性糖およびウロンｔＲ力為も成る楯質部分と
アミノ酸（又はペプチド）全含有していることが１！１
．ｌ’Ｊ’１ｌＬｌｌる。

７）旋光性 ０．２５％水溶液で〔α〕６８゜＝＋６０の比旋光度を
示す。

８）赤外線吸収 ＫＢｒ錠剤法による赤夕を線吸収スペクトルは添付の第
１図に示すとおりであって、第１図ｅこおいて３６００
〜３２００Ｇ：ＩｒＬ　のフロートな吸１又は水酸基（
ＯＨ）に基づくものであり、１６５０ｃＷＬ−”に多砿
体のｇ能基の吸収がみられる。

９ノ　紫外線吸収 水溶液の紫外線吸収スペクトルは添（すの第２図に示す
とおりであって、２５５ｎｒｎ附近に吸収極大がみられ
る。

１０）Ｍ−２３１９物質を槽成する糖゛ｈ部分の糖組成 本物１（７）４０ダに４　Ｎ　−ｋｌｃｔ　’ｆｃ添加
し１００℃で４時間加水分Ｍを行った後、常法により（
ただし、アミン糖の吸着による損失を防ぐためイオン交
換樹脂は用いなかった）アルディト−ｈアセテ−ト化を
行ったものをガスクロマトグンフィ分析に付したところ
、ガラクト−ス。

グルコサミンおよびガラクトサミンが検出された。

父本物質の５０ｍ９にプロピレンオキサイドとナトリウ
ムボロヒドリドを作用させてウロン酸のカルボキシル基
を還元した後、上述と同様な手順で加水分解して分析を
行ったところガラクトースの存在比が増加したことから
ガラクトロン酸の存在が推定される◇ なお、グルコサミンおよびガラクトサミンのイｒ在は、
本物質を加水分解した後アミノ酸自動分析機で分析する
ことによっても４ｇｍ　ｇし得る。

１υ　アミノ酸（又はペプチド）ｇ＋を分の購成Ｍ−２
３１’ｌｌ勿負を上述と同様にして常法によシ加水分解
したものについてアミノ酸自動分析機で分析した結果、
アラニンのみの伴在が認められた。なお、このアラニン
はＤ−アミノ酸オギシダーゼにより分解を受けることが
らＤ−アラニンと同定さ扛る。

囚に、アミノ酸自動分析機による分析結果から、本物質
中のグルコサミンごガラクトプーミン：アシニンの組成
比は１：２：１であった。また、カルバゾール法による
ウロン酸の１げ接定量分析の結果によると、本物質にお
けるガラクトース：ガラクトロン酸：グルコサミン：ガ
ラクトサミン：アラニンの組成比は１：１：１：２：ｌ
であると推定される。

次に本物＊ｙｔ−２３１９の製造方法について説明する
。

！シー２３１９物質の製造 本物質は、本発明によシ新たに分１帷されたシュウトモ
ナス租（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）に属する１株１Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｌＩｇｐ、　２３１９を培養ｆるこ
とにより生産される。ここで利用するＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｓｐ、　２３１９１ま香川県大用郡志度町大串
崎と同県小豆郡地蔵崎とを結ぶ線で大串崎よりＩＫ露の
海上で採取した海水（海面Ｆ５ｍ）よシ下記手順で分離
゛されたものＣあって、威工研菌寄第７２０７号（２ｇ
ルＭ　Ｐ　−７２０７）の受託番号で工業技術院微生物
工朶研死所に寄託されている。

参考として、上記菌の分離法をＦ記に示す。

上述のようにして採取した海水を滅菌海水で１／１０〜
１／１０５に稀釈したものを、ベグトン０．５ｗｔＸ−
１１母エキス０．１　ｗ　ｔ　９ｇおよびショ瑚３ｗ％
％を含有させた海水を滅菌処理して得られる液体培地に
０．１−宛移植した後、２７℃で２〜３週間培養を行い
、この培養により菌の生育がみられ且つ強く粘稠化され
た培地から白金線で上記と同様な組成の寒天平板培地（
寒天１．５　ｗ　ｔ　９に含有」に画線し、２７℃で１
〜２週間培養を行う。ついで寒天平板培地に生育した独
立コロニーを再び１呂ｄの液体培地に移植しで２〜３週
間培養を行った後、粘開化した培地から上記寒天平板培
地に画線する操作全３〜４回操返し行って上記ｓｐ、２
３１９を純粋分離する。

上述のようにして分離されたシュウトモナスｓｐ、　２
３１９の主要な菌学的性質を示すと次のとおりである。

乙さ先二二力乙μ穎ス共９（Ｑ豊ヱ預其ｊ（リ　形態学
的性質 ダラム染色陰性、短桿状で平均ｏ、　ｓ　ｘ　ｉ、　ｏ
〜１．３ｍμの大きさを有し、運動性あり。極鞭毛を有
し、胞子形成能が７．ｃい。二連鎖のものが多く、時に
は短い鎖全形成−ｊ−る。

（２）　各種培地における生育状態 ■　４天平板培地での生育良好、表面集落の性状につい
ては正円状乃至丘状召：形成し、乾燥状態の圧勝を有す
る微細顆粒状を呈し、固着性で不透明である。色素の生
成みろ！しず。

なお、培地は基本培地ｉｔ中ジョイη゛（ａｏｇおよび
寒天１５）を含有ｊ゛るものを用いた１、（リ　ショ糖
脅栄善培地での生育良好、濁りＩ２ｊ、はとんどみら扛
ず、両膜を形成し、生ｆｆ鏝沈を次金生ずる。培地の府
色なく、枯・調１隼が大きい。なお、培地は基本堵地１
を中シヨｔｌｔ’ｊ　３　。

ｇをよ有−ｆるものを用いた。

（リマツコンキイー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）培地および
ＣＶＴ培地での生１１はいずｊＬも良好、０１１者の培
地では紫レンガ色のコロニーを形成し、乳ｅＡ発酵のグ
ラム陰性菌の％徴を示す。又、後者の培地では赤色コロ
ニーを形成し、グラム陰性菌の特徴を示−ｆｏ （■　キングＡ培地およびキングＢ培地ではり）ずれも
生育良好、前者の培地では水溶性色素を産生じないが、
後者の培地では黄緑色の水溶性色素を産生ずる０ ■　ｐｇＡ培地では生育せず。

（リ　血液寒天培地では生育良好、潜血性を示さない。

上記各培地での生育ｅユいずれも好気培養したものであ
り（嫌気培養では生育せずジ、また、使用した培地は海
水を稿本培地として自製したものである。

（３）生理学的性質 ■　生育温度１１１α曲は５〜３７℃であって、４２℃
では生育しない。

■　生Ｎ可能なＮａＣ６＠　ＩＪＥ　Ｎｉｌ囲は１〜１
０９Ｇであって、ＮａＣＬが存在しｌ工いと生育し７エ
（＼。

■　ゼラチンの液化　１６性 ■　ゼラチンの分解　陰性 ■　デンプンの加水分解　陰性 （リ　キチンの加水分解　陰性 ■　カゼインの加水分解　陰性 ■　Ｔｗｅｅｎ　８０の分解　向性 ■　パープルミルク培地でアルカ１）イヒしてペプトン
化しないＯ ［相］　リドマスミルク培地ではアルカリイヒし、つい
で弱く脱色するが、ペプトン化し／ｊｌ、・１、ＱＯＦ
テスト　０型 ０　糖の分解性： 糖　酸生成　ガス生成 り一クルコース　十　− Ｄ−ガラクトース　− Ｄ−マンノース　− Ｄ−キシロース　− Ｌ−アラビノース　− υ−フラクトース　十　− ショ塘　十　− ２クトース　− デンプン　− クリセロール　十　− マニトール　＋　− イノシトール　− ズルシット　− マルトース　＋　− セロビオース　− サリシン　− イヌリン　− ０　硝酸塩の還元　陰性 ０　硫化水素の産生　陰性 ＩＪＩ　＋ｖｔｉｔ反応　ｌ破性 ［相］　ｖｐ反応　陰性 Ｏインドール　陰性 （坤　ＩＰＡ反応　］察註 ０　チトクロームオキシダーゼ反応　陰性［相］　カメ
ラーゼ反応　陽性 １０　クエン酸塩の利用　陽性 Ｏ酒石酸から酸の産生　陰性 （ハ）尿素分解能　両性 （ハ）アルギニンのアルカリ化　１犠１生（ハ）オルニ
チン脱炭酸能　噂性 宛φ　リジン脱炭酸能　聞性 Ｏプテリジンコンパウンド ０／１２９に対する感受性　陽性 （２，４−ジアミノ−６，７−シーイソプロビルプテリ
ジン（シグマ）を使用ン ・神　ノボビオシンに対する感受性　陰性ＩＯその他の
抗生物質および抗菌性物質に対する感受性： ペニシリン　− カナマイシン　＋ テトラサイクリン　」− クロラムフェニコール　＋ エリス四マイシン　士 コリスチン　− スルフイソキサゾール　士 リンコマイシン　− セファロリジン　十 本発明では上記菌株、シュウトモナスｓｐ、　ｐ３１９
を、天然海水９人工海水もしくは３％食塩水を基質とし
、これに窒素源としてのペプトン、肉エキス、カザミノ
酸等を添加したものを培地として用い、必要に応じ更に
グルコース、フラクトース。

シュクロース等の炭素源およびＦ’ｅＳＯ４１Ｍｇ５Ｏ
＋　＋ＣａＣ４１等の焦機塩等を適宜添加した培地中で
好気的条件下に培養することによシＭ−２３１９の物質
を生産する。

上記培養は珊地のｐＩｌ’に中性附近に保持して、２５
〜２７℃の温度で行うのが好ましい。培養期間は培地の
組成、培養温度に応じて変動するが、振とり培養では４
〜５日間程度、静置培養では２〜３週間程度行う。

上記培養により培養物に産生、蓄積される本物質は、撮
とり培養の揚台には培養液中に含まれるので、そｔｔを
分離、採取Ｊ−るに６培養物を遠心分離又ｔよｌ濾過に
よシ菌体を除いｆＦ：、後、ｐ液から分離して精製°ｆ
るとよく、また、静置培養の場合には培地表面上に生育
した菌体に固＜　４＝１沼しでいるので、この画線を集
め、１９にのフェノール水溶液に騒嘴させ一夜良く攪拌
した後、上記と同様にして遠心分配又は濾過により菌体
を除いて子ｌＩられる上澄液から分１’ｉｌ（して精製
する。本物質の分ｐＨ＃　、　（’ｌ戟には、ｉ１Ｍ常
行われている微生物の培養物かＥつの多糖体の単ｊすＷ
手法を適用し得る。丁なわら、アセトン、エタノール、
メタノール等の水５Ｊ溶性有殴溶媒を用いる分別沈澱法
により低分子物質を１余去し、得られる沈ｔ９物を水に
溶解したものにセチルトリメチルアンモニウムプロミド
のようなｉ’Ａ”、　４　Ｈ＆アンモニウム塩分加えて
生成ｒる沈＃を渠め、ついでこの沈澱物に塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム％１７のアルカリ水溶液を加えて溶解
し、ｔｎらｎる溶液にアセトン、エタノール、メタノー
ル等の水可（Ｂ　ｎ有機溶媒を２〜３４ｔｒＩＭ；添加
し、生成した沈ｌ″ｉ物を採取し、該沈ａ物全透４１ｒ
により脱塩した後凍結乾燥することにより、目的とする
Ｍ−２３１９の物質が得られる。

次に、上述のようにして得られる本物質（Ｍ−２３１９
）の有用性としての生理活性についで説明する。

Ｍ−２３１９物質ノｔ４　Ｊ（ｐ　、ｒ７ｒ、　ｇｎ）
　、ｉｌ￥１．性席性（父は亜Ｊ−性毒性９本物質のマ
ウスに対する急性毒性（又は亜、立性毒性）全試験した
結果は表１に示すとおりである。

表　１ （２）抗腫瘍活性 本物ア（Ｍ−２３１９についで抗帥瘍活ｒ１゛試験を行
った力青果をＦｉ己に示す。なお、洪ｄ氏′１勿７貿は
イ希［尼実施例でイθもれたものを用いた。

υ　ザルコーマ１８０腹水Ｉ匝１碍に対する活性Ｉ　Ｃ
Ｒ−ＣＩマウス（体取２０リノに移植後１週間経過した
ザルコーマ１８０ｊ復水１１れ弓原液の０．０５　ｍｅ
宛を７週令のＩ　ＣＲ系雌マウス（１群６匹すの腹腔内
に移植した。上記移植の翌１」より本物質２５、・ｎｙ
　／　Ｋｇを１日１回の割片で２０日間腹腔内に投与し
、生存日数’ｉ観察した。その結果本物質の投与群でｔ
、Ｊ、ｚ５ｍｙ／Ｋｇの投与腋で死亡したのは一匹に丁
ぎなかったのに対して対照としての非投与群−Ｃは上記
ｉ＄　４移ｉ後１４日目には全マウスが死亡した。なお
、本物質の投与群では上ｄ己１１市瘍移植〃１ら３５日
間の観察期間中上６己−匹以夕■の死亡はみられなかっ
た。

２）１４θｔｈ　−Ａ　：ｐｌ　！悟に対Ｊ−る活性あ
１うかしめマウスにおいて継代されていたＭｅｔｈ　−
Ａ　１ｉｉ）ｆ＋ｇａｌＪＩｆｉ２　（Ｉ　Ｘ　１０’
個月Ｃ本′吻負ヲ混汗し、ＢＡＣＩＩ／Ｃマウスの皮下
に移植し、それから１４日後のＩＩ！４！ＩＡ５ル縦を
測定した。その結果本物質を２．５　Ｉｎ９７　Ｋｆの
割合で上目己、Ｙ４１１１旭と混合して投与した場合投
与マウスの８６％に＋ｉ；＊　ｊ嶋増殖がみられなかっ
た。

以上の結果から本物質の抗腫瘍活性が認められる。

なお、本物＊を抗帽瘍剤として用いる場片の有効投与Ｊ
ｉｔは２．５　ｏＱ　／に１／日〜５０　Ｉｎ９　／　
Ｋｇ　７日の範囲でおる。

又、本物質を抗帽瘍剤に適用［るときは公知の手法によ
り錠剤、頂粒剤、赦剤、カブ七ル剤ｆＪ９ひに注射形態
の液剤等に製剤化し得る。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例 ペプトン０．５ｗｔ％、酵旬エキス０．１　ｗ　ｔ　５
’０おＬびシヨ、萌３ｗｔ％を添加、含、１さぜたン′
１σ水〃１［〕成る培地全試鱗管（１８Ｘ　１８　（ｌ
　ｍｍ　）　２　（１１１本にそ）Ｌぞれ１０ｔｒｄ！
、宛分注し、１２０℃で１５分同寸−トクレーブで滅菌
したものにシュウトモナスＩＩｐ、２３１９株（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−７２０７）を枇し、２７℃で２０日間靜置培ｙ
＃を行った。

培養終了後、各試験管内の培地衣層に生成しｌこ粘質物
を集めて１％フェノール水ｔｕ　ｅ、に繍渕させ、１日
攪拌を行った後、これにＶ濾過助剤としてノ・イフロス
ーパーセルを適箪加えガラス繊維ｐ紙（ワットマンＧＦ
Ｃ）を用いて吸引Ｖ濾過した。得られた？ｉＹ澄液にエ
タノールを３倍咀加えて糸状の沈澱□を生成させ、この
沈澱物をガラス棒にからめて採取して脱イオン水にｍｓ
’ｌした。

ついでこの溶液に５％セチルトリメチルアンモニウムプ
ロミドを添加しながらガラス棒で攪拌し、ガラス棒に堅
くまつわるように付着した沈＃を集めて４　Ｍ−ＮａＣ
Ｌ　水溶液に溶６解し、冷ｔ’ｔｒで２日間虜拌して完
全に溶解したことを確認してから、この溶液に３倍Ｍの
エタノールを加え、生成した沈（次を脱イオン水に溶解
した。イＧろれた溶液を流水中で２日間透析した後凍結
乾燥し−Ｃ白色の粉末を得た。収量は培地ｉｚ当り２５
０　ｍｙでめった。

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は本発明に係る含室累多糖体の赤外線吸収
スペクトルを示し、４２図は同じく紫外線吸収スペクト
ルを示Ｊ−０ ・撃ｎ〜鏝υ西゛印乳業株式会社 代沖人　宮　１１ｊ　広　豊

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記性質を有する含窒素多糖体； 融　点：明確な融点を示さず、３００℃附近で分解して
   褐変する、 分子量：セファロース２Ｂおよび４Ｂ力ラムクロマトグ
   ラフイ分析による測 定でｉ　ｏ’乃至ｌＯ＠の平均分子鼠を示す、 溶解性：水に溶解し、メタノール、エタノール、アセト
   ン、グロバノール。 ｎ−ブタノール、酢酸エチル、ヘ キサン、ベンゼン、エーテルｊｌｉ　Ｕにり００ホルム
   に不溶、 呈色反応：アンスロン反応、モーリッシュ反−ル硫酸反
   応、カルバゾール６ｆＥｌｉ！反応および塩酸加水分解
   後のニン ヒドリン反応並びにエルロンモル ガン反応についていずれも陽性を 示し、銅フォーリン反応について は陰性を示す、 旋光性：０．２５％水溶液についての比旋光度〔α）ｓ
   、は＋６０を示す、 赤外線吸収：ＫＢｒ＠剤法で添付図面の第１図の赤外線
   吸収スペクトルを示す、 紫外線吸収；水溶液について小付図面の第２図の紫外線
   吸収スペクトルを示す、 ａＵｓＢ分の構成糖ニガ２クトース、グルコサミン、ガ
   ラクトサミンおよびガラ クツロン酸、 アミノ酸の構成：アラニン。 ２、　シュウトモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ　）
   にＩｆ４する水もしくは３％食塩水を基質とする培地中
   で好気的条件Ｆに培榛し、培養物から特許請求の範囲第
   １項に記載の含窒素多糖体を採取することを特徴とする
   新規な含窒素多糖体の製造方法。 ３、培地がペプトン、肉エキスおよびカザミノ酸等の墾
   素源を含有する特許請求の範囲第２項に記載の製造方法
   。