JPS6065000A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の目的 産業上の利用分野 この発明は、新規なモノクローナル抗体に関するもので
ある。さらに詳＋１８には、抗α−インターフェロン・
モノクローナル抗体、ＦＡｌｌ、ＦＡ工２、ＦＡＡｓ２
よびＦＡ工４に関するものであり、そｎらのモノクロー
ナｌし抗体１１ａ−インターフェロン（以下、ＩＦＮ−
ａと略称する。）の酵素免疫定址法のための試薬および
ＩＦＮ−ａのアフィニティー・カラムクロマトグラフィ
ーのための免疫吸Ｎ剤として有用である。 従来の技術 ハイブリドーマから得られたぢ劇ＦＮ−α°モノクロー
ナｌし抗体とじては、例えば特表昭５７−５００６９２
号公報および特開昭５７−１９７２２４号公報記載のＮ
Ｋ２１ｉ体およびＴＩシリーズ抗体が知られているが、
これらの抗体は免疫定量用試薬、免役１汲Ｔｔｉ薊等と
して使用する上で必ずしも満足ざｎるものでになかった
。 発明が解決しようとする問題点 この発明者等は上記の公知の抗体と免疫グロゾリン°サ
ブクラスｆアイソタイプ）が異なるか、工Ｆ　Ｎ　−ａ
（Ｄｙ４なった抗原決定基を認識するか、亜 ＩＦＮ−αの４群との結合能力が異なる抗ＩＦＮ−〇・
モノクローナル抗体を得て、上記従来技？−１，Ｔの不
満足な点を解消すべく柚１ｉｆｔ究ケ行なった。 発明の構成 間ｂ１点全解決するための手段 抗工ＦＮ−ａ、モノクローナル抗体、ＦＡｌｌ、ＦＡ工
２、ＦＡＡｓ２よびＦＡ工４は新規なマウヌーハイブリ
ドーマｔｍｕｒｉｎｅ　ｈｙ’ｂｒ／ｄｏｍａｌＦＡ工
１、ＦＡＩ２、ＦＡ工ろおよびＦＡＩ４ヶそれぞれ培地
またはマウスの腹刀く中で培養すぶことによ久製造され
る。 ここで用いるマウス・ハイグリドーマＦＡ工１、ＦＡ工
２、ＦＡＡｓ２よびＦＡ工４は一般的６ては、ＴＦＮ−
αで１θ作したマウスの肺臓細胞とマウスの骨髄肺細胞
とを常法、例えばケーラーおよびミＪＶヌタイｙｔＫ６
ｈｌｅｒ　ａｎｃｌ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎｌ　の細胞Ｍ１
合技術の基本方法しネイチア、第２５６巻第４９５頁１
９７５年）参ｊ１α〕により細ｊ狗醐（台して製造する
ことができるが、ｆｌｌ細には、下記失施例を参照され
たい。 筐た、上記ハイグリドーマを培養する培地としては、ハ
イブリドーマの培養に通した培地であればよく、そのよ
うな例としては、例えばダルベツコ氏父法イーグル氏最
小必須培地［）ｕｌｂｅｃｃ○′５１ｎＯαｊ−ｆｉｅ
ｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｊ
−ａ工ｎ１ｅｄｉｕｍ、以下Ｄ−１ｖｌ　Ｆ　Ｍと略称
する】にウシ胎児血清、Ｌ−グＪレタミン、２−メルカ
プトエタノールおよび抗生物質（例えば、ペニシリンＧ
１ストレプトマイシン、ゲンタミシン等Ｊを含有せしめ
た培地か挙けら九る。 この発明のハイプリドーマの培養ニ、通常、培地を用い
る時にに６７°Ｃで２−４日間、ｌたマウスのＩ）！ｉ
＋控内て培養する時にば７−２０日間程度で行なわ几る
。 このようにして製造され７ｔモノクローナル抗体は培養
物貰たけマウスの腹水から、蛋白質の単離、精製に一般
的に用いられる常法により分離、精製することができる
。 そのような方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫
安塩析、ＤＥＡＥ−セ）ｖロースを用いるカラム・クロ
マｌ−グラフィー、ゲＪＶ　［−例えば、セファロース
４Ｂ１セフアデツクス（ｍ標、７７　ＪＶマシア・ファ
イン・ケミカルズＡＥ社製）等〕を凍結乾燥、結晶化等
が挙けられる。 このようにして得られた技工ＦＮ−ａ・モノクローナル
抗体ば、リンパ芽球またに白血球服生工ＦＮ−ａと結合
する能力を有し、工ＦＮ−αの精製に用いる免疫吸着剤
および工Ｆ　Ｎ　−ａの免疫定量用の試薬として有用で
ある。 この発明の技工ＦＮ−ＣＩ・モノクローナル抗体をＩＦ
Ｎ−ＣＩの精製に使用するにぽ、丑ず、抗■ＦＮ−α・
モノクローナｌし抗体、ＦＡＩ１、ＦＡＩ２、Ｆｐ、ｘ
３＋ＥたばＦＡＩ４を活性化された多糖類〔例えば、シ
アン化臭素−活性化セフ７０−ヌ４Ｂ（商標、ファルマ
シア・ファヘン・ケミカルズ社製）等〕と常法によシ反
応させ、該ＦＡ１１、ＦＡＩ２、ＦＡＩ３捷たばＦＡＩ
４結合多糖類を゛調製し、これを用いて、カラム式ｌた
はバッチ式でＩＦＮ−ａｆ常法に従い精製すればよい。 サラに、技工ＦＮ−ａ・モノクローナル抗体、ＦＡＩ１
、ＦＡＩ２、ＦＡＩ：３およびＦＡＩ４は例えば酵素免
疫足首１法Ｉ　ＥＩＡ　ｌ、放剖能免疫定量汰Ｉ　ＲＩ
Ａ　ｌにおける試薬として使用できるが、該体を用いる
免疫定量法に常法によシ行うことができ、酵素免疫定量
法とじてに、マイクロタイター・プレートを用いるワン
・ヌテノプ・サンドイッチ酵素免疫定量法がそのような
例として挙げられる。 この酵素免疫定量法の具体例に下記実施例８に示す通り
であるが、一般的ＶＣＩＣ、工ＦＮ−ａの互いに異なっ
た抗原決足基を認識する２椋類の抗ＩＦＮ−ａ・モノク
ローナｌし抗体を用いて行ない、１ず、マイクロクイタ
ー・プレートの穴

【ウェル１をあらかじめ、工ＦＮ−Ｑ
に力して親和力の％ｉい（■ＦＮ−Ｑ（７）通常の浴出
密謀で浴出さｎない）１棹類の抗体（例えば、Ｆ’Ａ工
４）でｊ６作させておき、次いで、この穴にＩ　Ｆ　Ｎ
　−ａ　ｆ含むＭ、検体および酸素標識した別僚の抗体
【例えは、ＦＡＩ１　】の溶液を入れ、約１〜６時間ｆ
ｊＤ値後洗浄し、ｌ！＋４’紮基り（浴液ｒ加えて６０
分程度酵素反応を行なう。酸素反応終了後、比色広告常
法Ｖてより、被検体中の工Ｆ　Ｎ　−ａ　’／）Ｈ＜’
ｌ：定量することにより行うことができる。 実施例 次にこの発明を実施例によ′り説明する。実施例におい
て、ＩＦＮ−ａＣＱ活゛洗は常法、例えは次の方法によ
ってｙ、１ｉｌＪ足された。 ＩＦＮ−αのバイオアッセイ ＩＦＮ−ａ（１）活性はフィンター＋　Ｆｉ、ｎｔｅｒ
　ｌの方法〔インターフェロンズ・アンド・インターフ
ェロン・インデュサー【工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ　ａｎ
ｄ工ｎ−ｔｅｒｆｅｒｏｎ　１ｎｄｕｃｅｒｓｌ第２版
（１９７６年）、（出版元：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｎｏ
ｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎσＰｕｂ−１１ｓｈｉｎｇＣｏ、
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）参照〕と同様にしてヒト羊膜由来
ＦＴＪＪ胞に対するンンドビス・ウィルス（Ｓｉｎｄ’
ｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害に
より測定し１こ。すべてのＴ、　Ｆ　Ｎ−αツＪ価は国
際標準品ＧＯ２３−９０１−５２７（共給九：Ｎａｔｉ
ｏ、ｎａｌ　工ｎＲＬｊ−ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａ１工ｅｒ
ｇｙ　ａｎｄ工ｎｆｅｃｔｊ−ｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ
、Ｂｅｔｈｅ８ｃｌａ、ＵＳＡ）によ久表わされている
。 実施例１ （ａ）　免疫化した牌１藏、１ｉｌｌｌ胞の調製：ＢＡ
’ＬＢ／Ｃ系マウヌにヒトリンパ芽球様細胞ナバｌレバ
株産生Ｉ　Ｆ　Ｌ！”−〇（投与量：　２．６Ｘ１０６
国際車位）と百８１咳・ジフテリア・破傷風３か混合ワ
クチン（阪大ｊフイｄｆ製、Ｊシ与豫、２ＸＩＱ　死第
数）との混曾物を生ｊ、！■食塩水に溶解して腹腔内」
り与した。（第り回免疫）。４０日経過後、該マウスに
工ＦＮ−ａ（投与量：２．６Ｘ１［Ｊ　国際単位）を生
理食塩７Ｋに溶解して腹腔内投与した（第２回免疫）。 第２回免疫から２１日経過後、工ＦＮ−１α（投与量：
２．６Ｘ１（Ｊ６国際単位）を生理食塩水に溶解１−で
、該マウスの静脈内に投与した（第３回免疫）。−拾４
回免疫から１照夜経過後、ＩＦＮ−σ（投与量：１．３
Ｘ’）、Ｑ６国際単位）を生理食塩水に溶解して、該マ
ウスの静脈内［投与した（最終免疫）。最終免疫から２
日経過後、肺臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に
供した。 （１））　マウス・ハイブリドーマＦＡ工１の調製：上
記で調製した免疫化したマウスの牌ｊ藏細胞とマウス骨
ｆｓ！ｆｌ挿ｉｉ”ｌｆｌ胞Ｐ　３　Ｘ　６３　Ａｐ８
　Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１　）（佐賀医大渡辺教授よシ分譲され
たもの）と會ケーラーとミルスタイｙ　（Ｋｇｈｌｅｒ
　ａｎｄ　Ｍｌｌｓｔｅｉｎ）の方、去〔ネイチャー第
２５６巻第４９５頁ミ＃（１９７５年）参照〕により融
合させた。すなわち、免疫化し１ｃマウヌの牌１艮細胞
をとり出しくＤ−ＭＥＭ）にｌヒ濁した。懸濁液中の赤
血球１ｌ−１：０．８３％壇化アンモニウム緩衝液（９
谷量）と０．１７Ｍトリヌー塩酸緩衝叡（ｐＨ７，６５
）（１容量）との混液で４”Ｃ１５分間処理することに
よ−り破壊し、遠心分離（１，５００ｒｐｍ　Ｘ５分間
）により除去する。股臓細胞の懸濁締と１５％ウシ胎児
血消を添刀口したＤ−ＭＥＭで培養したマウス骨髄１１
ｉ１！細胞Ｐ、３：Ｘ　６３　Ａ、８　ｕｌの培養物を
それそｎ同じ培地で洗浄した。マウス骨髄腫細胞ＰろＸ
＝６３　Ａ、８Ｕ１（４Ｘ１（Ｊ７細胞数）の懸濁液を
牌ルヤ細胞（２Ｘ１０”＋１１１を胞数）のｉ゛託濁敢
に加えた。この混合物を５０Ｍ１のプラスチック製試験
管中で十分に混合した。培地を遠心分離して除去し、残
漬全水浴（３７”Ｃｙ中で７ＪＱ温した。これに、ろ７
−Ｇに加温ＬＪｊ　４５％（Ｗ／■）ポリエチレングリ
コ−１し溶τ夜（シグマ社製、平均分子力”（：４００
０）’（＋？１分間を要して攪拌下栓々に加えた。 ′５７°Ｃ１７分間酢置した後、反応液に５分間を要し
てＤ−ＭＥＭ（３７℃、１５ゴ）を滴下することによシ
（細胞融台反１谷）停止させた。大量のＤ−ＭＥＭを反
応液に加えた後、反応液？遠心分離（１，（Ｊ　ＯＯｒ
ｐｍ　Ｘ　１０分）して上Ｂ？ｂ　’ｉ”除去した。残
渣に１５％ウシ胎児血清全添加したＤ−ＬＭＫＭを加え
、次いで軽く混和した後、２４穴プラスチツク製プレー
ト（Ｎｕｎｃ　Ｎ１４８３）に１穴当たり肺臓細胞が１
×１０６個となるように１　ｒｙｌずつ分注した。習日
、ＨＡＴ培地（１５％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＩｔ
ｌｌＶＣアミノプテリン４Ｘ１０−７Ｍ、ナミシン１．
６Ｘ’！　Ｏ’　Ｍ、ヒポキサンチン１×１０−４　Ｍ
になるように添刀口し１と、もの）を刀１」えた。２週
間培養中、２〜３日ごとに培地の半量を吸引除去し、上
記ＨＡＴ培地を加えた。次いで、各穴の培地の半量をＨ
Ｔ培地（１５％ウシ胎児而清を含むＤ−ＭＥＭ＋ＶＣ＋
ミジ７１．６Ｘ１０　Ｍ。 ヒボキサンチンｌＸ１０−４　ＭＫなるように添加し１
ζもの）と交換した。さらにその２日後から２〜６日ご
とに培地の半量全１５％ウシ胎児血１ｆｆｆ含むＤ−Ｍ
ＥＭと交換した。 融合の３週間後、はとんど全ての穴の中に、雑種細胞の
増殖が見られたので培養上清の抗インターフェロン活性
を常法（例えばモーゼルらの方法、ジャーナル・オプ・
ゼネラｌし・ピロロジー第５６全混和後、担体としてマ
ウヌ血清ヤ扉え、次いで、この混液にマウス免疫グロブ
リンに刻する抗体を茄えて４°Ｃで一夜放置した。次い
で、遠心分離（３，０００ｒｐｍ　Ｘ１０分）して上澄
液を得た。 上澄液中の残存ａ−インターフェベン活性をＦＬ細胞と
シンドビス・ウイルヌを用いる細胞変性効果阻止法によ
り測定した。上記の測定の結果から、一つの穴の雑種細
胞の培養上清はヒ）　ＩＪンパ芽球様細胞ナマルバ株産
生部分精ｐａ−インターフェロンに対する抗体を有する
ことが明らかになった。 この雑種細胞に常法の限界希釈法によりクローン化し、
マウス・ハイブリドーマ（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｙｂｒｉ−
ｄｏｒｒ＋ａ）　ＦＡ　Ｉ　１　’ｌｚ得た。 英施例２ （ａ）　免疫化された牌１ｊｆ２細胞の調製：ＢＡＬＥ
／Ｃ系マウスに工ＦＮ−ａ（投与量：２、ｏｘｉｏ６国
際単位）と百日咳・ジフテリア・破傷風６種混合ワクチ
ン（阪大微研製。投与量：２×１０９死菌数）との混合
物全生理食塩Ｘに溶解して腹腔内投与した（第１回免疫
）。第１回免役から２０日経過後、該マウスに上記と同
じ工ＦＮ−〇と百日咳・ジフテリア・破傷風６種混合ワ
クチンとの混合物を生理食塩水に溶解して腹腔内投与し
た（第２面免疫）。第２回免役から１２日経過後、該マ
ウスに上記と同じ工ＦＮ−αと百８＋亥・ジフテリフ′
・破傷風６棚温合ワクナンとの混合物を生理食塩７Ｋに
溶解して腹腔内投与した（第６回免疫）。第６回免疫か
ら６０日経過後、該マウスにＩ　Ｆ　Ｎ−ａ　（２，６
Ｘ　１０６国際単位）のみを含む生理食塩水を静脈内投
与した（第４回免疫）。 第４回免疫後、−日後にさらにＩＦＮ−ａ（ｉ、３×１
０６国際単位）を含む生理食塩水を静脈内投与しｆｃ（
最終免疫）。最終免疫から６日経過後、該マウスから免
疫化された肺臓細胞を取り出し、これを細胞融合に供し
た。 （ｂ）　マウス・ハイブリドーマＦＡ工２．６および４
の調製： マウス・ハイプリドーマＦＡ工２、ＦＡＡｓ２よびＦ　
Ａ、工４を、上記で調製した牌細胞とマウス骨髄腫細胞
Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８　Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１）とから実施例１　
（ｂ）と同様にして調製し、クローン化した。 このようにして調製したマウス・ハイプリドー−ｑ　（
ｍｕｒｉｎｅ　ｈｙ’ｂｒｌｄｏｍａ）ＦＡ工４にフラ
ン７のパスツール研究所コレクシオン・ナショナル・ド
ウ・りｌレチュール・ドウ・ミクはオ！レガニヌム（工
ＮＳＴ工ＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲＣ０ＬＬＥＣＴＩＯＮ
　ＮＡ↑工０−ＮＡＬＥ　ＤＥ　ＣＵＬＴＵＲＥＳ　Ｄ
Ｅ　Ｍ工ＣＲＯＯＲＧＡＮ工ＳＭＥＳ）にマウス・ハイ
ブリドーマＦＡ工Ｉ　Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。 Ｎｏ、Ｉ　−２３８（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｙｂｒ、ｉｄｏ
ｍａ　ＦＡ工１ｃｒ、ｃ、Ｍ、Ｎｏ、　ｌ−２３８）と
して寄託されている。 実施例３　（モノクローナル抗体の製造）マウス・ハイ
ブリドーマＦＡ工１　（ｔ７ｖｌｑＦＡ工４）ｆ：５％
ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、２Ｘ１［Ｊ−５
Ｍ２−メルカプトエタノールＵ／ｙｇｌペニシリン（）
、Ｑ．１”Ｗ／ｍｌストレプトマイシンおよび８０μ／
ｌ　／肩１ゲンタミシン含有Ｄ−ＭＥＭ中で６７℃で５
％二酸化炭素雰囲気中７２〜９６時間培養した。培養物
全遠心分ｌＩＢ　（　１．０　０　（Ｊ　ｒｐｍ−　×
１０分）後、上澄液に硫酸アンモニウム全５０％最終ａ
Ｐｉとなるように徐々に加えた。混合物を水冷下６０分
間攪拌した後６０分間放置し、遠心分離（　１　０，０
００ｒｐｍ　Ｘｌ　０分）後、得られた球漬を少量の１
０ｍＭ５ん酸緩前液（　ｐＨ８．０　）に溶解し、ｉ’
　［１　ｍ　Ｍシん酸緩前液Ｖｃ′Ａｔ，て透析した。 次いで、透析物を夾雑蛋白質を除去するため１３ｍＭり
ん酸緩前液で平衡化した少量のＤＥＡＥ−セファロース
のカラムクロマトグラフィーに付した。未吸着の通過液
を集め、１０ｍＭ，９ん酸緩前液（　ＤＨ　８．０　）
に対して透析し、１　［］ｍＭｐん酸緩前液（　ｐＨ８
．ＣＩ　）で平衡化したＤＥＡＦ−子ルローヌのカラム
クロマトグラフィーに付した。モノクローナル抗体の溶
出は１ＱｍＭシん酸緩前液（ｐＨ８．０）と１５ＱｍＭ
ｊ３化ナト’）ラムに含む１　［ＪｍＭりん酸緩前液（
　ｐＨ８．０　）の間で連続濃度勾配法により連税的に
行なった。溶出された免疫グロブリンＧ分画を限外ｐ過
膜、ダイヤフィルター（Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）　Ｇ　−
　［］　５　Ｔ　（商標、バイオエンジニアリング株式
会社製）で濃縮し、０．１Ｍシん酸Ｍ前液（　ｐｎ　８
．０’）に対して透析した。ウシ血清工ｙＧ’ｉ除くた
めに、透析物をうさぎ抗つシ血清工ｙＧーセファ０ーヌ
４Ｂのカラムに４回通過させた。通過液をダイヤフィル
ター〇−０５’ｒで濃縮し、０．１Ｍりん酸緩前液（　
Ｉ）Ｈ　８．０　）に対して透析し、次いでＱ，ＩＭり
ん酸緩前液（　ｐＨ８．０　）で平衡化したプロティン
Ａ−セファロース４Ｂのカラムクロマトグラフィーに付
した。カラムラ大量の０．１Ｍりん酸緩前液（　ｐＨ　
８．０　）および０．１Ｍクエン酸緩衝液（　ｐａ　６
．０　）で溶出して、精製した抗α−インターフェロン
・モノクローナｌし抗体ｐＡ■１（ＪたばＦＡ工４）の
溶腋全得た。 抗α−インターフェロン・モノクローナル抗体、ＦＡＡ
ｌ１（またばＦ’Ａ工４）の理化学的性質は次の通りで
ある。 ＦＡＡｌ １ａ）　分子量：（ＳＤＳ−ポリアクリフレアミドゲル
電気泳動法） ○　非還元状態：（２−メルカプトエタノール非存在下
） １５０，００．（Ｊ〜２００，０００ ０　還元状態：（２−メルカプトエタノール在下） 重鎖：６０，０００ 軽鎖：２８，０００ （ｂ）　紫外’ｆｆＡ吸収スペクトラム（７Ｊ（）：λ
ｍａｘ＝　２　７　８ｎｍ （Ｃ）赤外線吸収ヌペクトラム（ヌジョール）：第１図
に示す通シ。 ＡＩ４ （ａ）　分子ｆｍ：（ＳＤＳ−ポリアクリフレアミドゲ
ル電気泳動法） ○　非還元状態−（２−メルカプトエタノーＩし非存在
下） １５０、ＯＤＤ〜２００，０００ ０　還元状態＝（２−メルカプトエタノ−ｌし存在下） 重鎮：６０，ＯＤＤ 軽鎖：２８，０００ （ｂ）　紫外線吸収スペクトラＪＶ（水）：λｍａＸ＝
２７３ｎｍ （ｃ）　赤外線吸収ヌベクトラム（ヌジョール）：第２
図（（示す通９。 実施例４　（モノクローナル抗体の製造）テトラメチＩ
Ｖペンタデカン（０．５ｄ）ｆマウスに腹腔内投与する
。投与後７〜６０日後に、りん酸緩衝化生理食塩水（ｐ
Ｈ７．２）で十分に洗浄したマウス・ハイブリドーマＦ
Ａ工１（またばＦＡ工２またばＦＡ工６またはＦＡ工４
）（投与量＝５〜１　０Ｘ１　０’細胞数）を該マウス
の腹腔内に投与した。投与後７〜２０日目に、該マウス
から腹水を採取し、腹水１容量にシん酸緩衝化生理食塩
水（ｐＨ７．２）１容量と硫酸アンモニウム飽和溶液２
容量を茄えた。混合物を水冷上攪拌し、３０分間放置し
た。遠心分離（　１　、０．０　０　０　ｒｐｍＸｌ　
０分）後、残渣ｉ１［ＪｍＭＪん酸緩前液（　ｐＨ　８
．０　）に対して十分に透析し、次いで、１３ｍＭりん
酸緩前液（　ｐｎ　８．０　）［よシ平衡化され７’（
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セｌレロースのカラム・クロマトグラ
フィーに付した。カラムをｉＱｍＭりん酸緩前液（ｐＨ
　８．０　）と１５０ｍＭｉｌ化ナトリウム含！１０ｍ
’Ｍりん酸緩＃液（ｐＨ８．０）の曲で連続ａ度勾配法
によυ連続的に溶出して、技工ＦＮ−〇・モノクローナ
７し抗体、ＦＡ工１（またはＦＡ工２またばＦＡ工６ま
たばＦＡ工４）を含有する画分全得た。 実施例５　（免疫グロブリン・クラスの同定）抗α−イ
ンターフェロン・モノクロ−ナノＶ抗体ＦＡ１１、ＦＡ
工２、ＦＡ工ろおよびＦＡ工４の免疫グロブリン・クラ
スの同定にオフタロニー・二重免疫拡散法により行なわ
れた。結果は表１に示す通りである。 表　１ 実施例６　（アフィニティー・クロマトグラフィー）Ｍ
ｍされた抗α−インターフェロン・モノクローナル抗体
ＦＡ工１（またｉｄＦＡ工４　）　５”Ｗｉ　ｃＮＢｒ
活性化セファ０ーヌ４１ｉ４Ｌ　ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社製）１ゴに結合させたものを免疫吸着
剤（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ）として用いた。ＩＦ
Ｎ−〇を抗ａーインターフェロン・モノクローナル抗体
、ｐＡｒｌ．（−、４たけＦＡ工４）−結合セファロー
ヌ４　Ｂ　（　０．５Ｍｌ）カラムに吸着キせた。りん
酸緩衝化生卵食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄後、吸着され
た工Ｆ　Ｎ　−　ａを次の，客用浴深で溶出を試みた。 （ａ）３Ｍチオンアン酸カリウム刀（溶液；（ｂ）　０
．５Ｍ塩化ナトリウム含有Ｑ．ＩＭグリシン−塩酸緩衝
液（　ｐＨ　２．３　） （Ｃ）　９１ＶＩエタンジオールおよび０．３＋ｖｕ３
化ナトリウム含有Ｑ，１Ｍクエン酸綬衝？ｏ　（　１）
Ｈ　２．０　）（ｄ）４０％１−プロパツール；または
（ｅ）　０．５Ｍｔｌ化ナトサナトリウム含有２ノ−！
レアミン７Ｋｉ容液（ｐＨ１０．５） 工ＦＮ−αを含有する画分を、２．５％ウシ胎児血清ア
ルブミンを含有するりん酸緩衝化生理食塩水（１）Ｈ７
，２）　０．２５容量含有試験官中に集める。 シん酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，２）に対して透析し
た後、各画分の１ＦＮ−αの含量を定ｉした。 結果を次表２に示す。 表　２ 米　溶出操作せず 寒　国、ｉｎ位 実施例７　（モノクローナｌし抗体によシ認識されたヒ
トリンパ芽球様細胞ナマルバ株産 生工ＦＮ−ａの亜群の同定） リンパ芽球様細胞産生ＩＦＮ−ａをシん酸緩衝化生理食
塩水（ｐｕ７．２）で平衡化したＦＡ１１４合セフ１０
−ス４Ｂ’カラムにかけると、工ＦＮ−〇の約１１％が
ＦＡ工１−結合セファロ−７４Ｂに吸着されず、カラム
を通過した。この画分をＦＡ工１に）工ＦＮ−Ｑとする
。次に、このＦＡ１１←）工ｐｍ−ａおよびリンパ芽球
様細胞産生工ＦＮ−ａと技工ＦＮ−ａ・モノクローナル
抗体、ＦＡ工１、ＦＡ工２、ＦＡＩ３およびＦＡ工４そ
の反応性を次のようにして調べた。すなわち、リンパ芽
球産生工ＦＮ−ｄ（８，６００国際単位）またはＦＡ１
１←）工ＦＮ−ａ（５，４００国際単位）をマウヌ・ハ
イブリドーマＦＡ工１、ＦＡ工２、ＦＡＩ３およびＦＡ
工４の培養物の上澄液６００μβと３７°Ｃで１２０分
間加温した後、第２抗体しウサギ抗マウヌ卑疫グロブリ
ンＧ（重鎖十軽鎖）〕と共沈ささ後、ＩＦＮ−αの残存
活性を測定した。結果を次表５に示す。 表　６ ＦＡｌｌ　１，７００　５．４００　ｉＦＡ工２　１，
４００　５．４００ ＦＡＩ３　ｉ・７００６・２００１ ＦＡ工４　９００．８００ 上記表から明らかなように、技工Ｆ　Ｎ　−ａ・モノク
ローナル抗体ＦＡ工１、ＦＡ工２、ＦＡＡｓ２よびＦＡ
工４は第２抗体と共沈させた後、リンパ芽球様細胞産生
工ＦＮ−ａの７５〜８５％を中和した。 他方、抗ＩＦＮ−α・モノクローナル抗体ＦＡＩ４のみ
がＦＡ工１←）ＩＦＮ−ａの大部分を中和することかで
き、技工Ｆ　Ｎ　−ａ・モノクローナル抗体ＦＡ工１、
ＦＡＩ２およびＦＡＴ３はＦＡ工１←〕工ＦＮ−αを全
く中和できなかった。この結果は、技工ＦＮ−〇・モノ
クローナｌし抗体ＦＡ工１、ＦＡ工２およびＦＡＡｓ２
リンパ芽球様細胞産生ｒＦＮ−αの同じかまたけ非常に
密接な関係にあり亜群を認識するが、ＦＡ工４は異なっ
た亜群を忍識することをならび［ＦＡ工４がＦＡｌｌ、
ＦＡ工２およびＦＡＡｓ２認識する抗原決定基とゴ異な
る抗原決定基全認識することを示唆してい乙。 起施例８　（ワン・ヌテノプ・サンドイッチ酵系免疫定
量法） 西洋ワサビ・ベルオギシダーゼ（タイプＳ’！、シグマ
社ｎ）ｋ抗ＩＦＮ−α・モノクローナル抗体、ＦＡ工１
に結合させる方法はナカネおよびカワオイ（ｕａｋａｎ
ｅ　ａｎｄ　＋（ａｗａｏｌ）［ジャーナル・オプ・ヒ
ストケミストリー・アンド・サイトケミストリー第２２
巻第１０８４〜１０９１頁（１９７４年）＃照〕の方法
にｌｆｇじて行なった。これを用いて工ＦＮ−ａのワン
・ヌテンプ・サンドインチ酵素免疫定量を次のようにし
て行なった。 技工ＦＮ−〇・モノクローナル抗体、ＦＡ工４を１５ｍ
Ｍ伏酸緩衝（α中に５．０μ！、　／ｍｌの濃度に溶解
したものを２・２穴平底型ポリスチレン製マイクロタイ
ター・プレート［２００μｌ入れて室温で一時間静置し
た。そのプレ、ｉ［ｌ、１％ウシｉ清アｌレブミンを含
む１１ｍＭ５ん酸緩衝化生理食＋ＭｙＫ　（ｐＨ７，２
）で洗浄した。このようにして抗体全感作したプレート
の穴に１００μｌの被検体および上記で調製したペルオ
キシダーｙ標識抗ＩＦＮ−ａ−モノクローナＩＶ抗体、
ＦＡ工１の５％ウシ血清を含む１［１ｍＭシん酸緩衝化
生理食塩水（ｐＨ７，２）溶液１００ＩＬｎを添加した
。室温で６時間静置後、プＶ−）ｆＯ，１％ウシ血肩ア
ルブミ７−０．５％ＴＷｅｅｎ　２１：Ｎｒ含む１　［
］ｍＭ５ん酸緩衝化生理食塩７Ｘで３面洗浄した。次い
で、酵素基質液（０，１Ｍクエン酸−りん酸緩前液（ｐ
Ｈ５，４）に過酸化水素ｔｏ、ｏｉ％、Ｏ−フ二二レン
ジアミン・２塩酸塙全２．５ダ／ｍｅ浴解した液）２０
０μβづつをプレートのそれぞれの穴にＭＳ７Ｊｉｌし
た。室温にて３０分間静置し、酵素反応を行なった後、
４．５Ｎ硫酸１００μｌを添刀口して反応を停止した。 各穴の残存液の４９０ｎｍにおける吸光度；＜ｙＲ−５
９０Ｆマイクロ−エライザ・ミニリーダー（ｍｉｃｒｏ
−ＥＬ工ＳＡ　ｍｆｎｊ−ｒｅａｄｅｒ）（商標、ダイ
ナチック社製）で測定した。′被検体中のａ−インター
フェロンの量に同時に行なった検量用ＩＦＮ−ａの４９
０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線上からめた。 発明の効果 この発明の技工ＪＩ″Ｎ−Ｑ・モノクローナｌし抗体に
、上述のごとく、工ＦＮ−Ｑ免疫吸着剤および免疫定量
用試薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明で得られる抗ａ−インターフェロン・
モノクローナｌし抗体、ＦＡｌｌの赤外線吸収スペクト
ラムを、第２図に抗ａ−インターフェロン・モノクロー
ナｌし抗体、ＦＡ工４の赤外線吸収スペクトラムをそれ
ぞれ示す。 特許出願人藤沢薬品工業株式会社 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　６１９８′Ｒ−９月１２日［相］イギリス（ＧＢ）
［株］８３２４３４１＠発　明　者　服　部　清　宝塚
市逆瀬台３−３１７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記性質を有するＦＡ工１、ＦＡ工２、ＦＡＩ３
   およびＦＡＩ４からなる群から選ばれる抗ａ−インター
   フェロン・モノクローナｌし抗体：■　モノクローナル
   抗体ＦＡ工１の性質：（ａＪ　分子量＝（測定法：　５
   ＤＳ−ポリアクリｌレアミドゲル電気泳動法］ １５０．０［ＪＯ〜２００，０ＤＤ （ｂ）　’！外線吸収ヌベクトラム： λｍａｘ＝２７８ｎｍ （Ｑ）　赤外線吸収ヌペクトラム： 第１図に示す通り。 （Ｃ１）　免疫グロプリ：／・クラヌ：マウスエｙＧ□ ■　モノクローナル抗体ＦＡＩ４の性質：（ａ）　分子
   量：（測定法：５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法） １５０．０００〜２００，０００ （ｂ）　紫外線吸収スペクトラム： λｍａｘ＝２７３ｎｍ （Ｑ）　赤外線吸収スペクトラム： 第２図に示す通り。 （ｄ）　免疫グロブリン・クラヌ：ζ マウスエｇＧよ ■　モノクローナル抗体ＦＡＩ２の性質：（ａ）　免疫
   グロブリン・クラス： マウス■ｇＧ２ａ ■　モノクローナル抗体ＦＡ工５の性質：（ａ）　免疫
   グロブリン・クラス： マウスエｙＧ工 （２）マウス・ハイプリドーマＦＡ工１、ＦＡＩ２、Ｆ
   Ａ工ろおよびＦＡ工４からなる和・から選ばれたマウス
   ・ハイブリドーマ・クローン。 （３）　マウス・ハイプリドーマＦＡＩＩ、ＦＡＩ２、
   ｐＡ工３ＦたばＦＡＩ４を培地に培養するかまたにマウ
   スの腹腔内で培養し、得られる培養物カラ抗α−インタ
   ーフェロン・モノクローナｌし抗体ＦＡ工１、ＦＡ工２
   、ＦＡＡｓ２ｇたはＦＡ工４を分離すること？特徴とす
   る抗ｄ−イ”ｊター７エロン・モノクロ−ｆ−）しａ体
   ｙ　Ａｘ　ＩＦＡ工２、ＦＡＡｓ２たばＦＡ工４の製造
   法。 （４）　抗α−インターフェロン・七ツクローナル抗体
   ＦＡ工１、ＦＡ工２、ＦＡＡｓ２よびＦ訂４からなる群
   から選ばｎた抗体の一涼または二種以上を使用すること
   を特徴とする免疫定量法。 （５）免疫定量法が酵素免疫足置法である特許請求の範
   囲第４項記載の免疫定量法。 （６）　免疫定量法がマイクロタイター・プレート全使
   用する醇索免疫定量法である特許請求の範囲第４項記載
   の免疫定量法。 （７）　抗ａ−１ンターフェロン・モノクローナル抗体
   ＦＡ工１、ＦＡ＝２またはＦＡＩ３と抗インターフェロ
   ン・モノクローナルａ体ＦＡ工４とを抗体として使用し
   、マイクロタイター・プレートを使用するワン・ステッ
   プ・サンドインチＢ素免投足に法でおる特許請求の範囲
   第４項記載の免疫定量法。 −（８）　ｍα−インターフェロン・モノクローナル抗
   体ＦＡ工１．ＦＡ工２、ＦＡＩξたばＦ訂４を結合した
   多糖類にょシ、ａ−インターフェロンヲ精製することを
   特徴とするα−インターフェロンの精製法。