JPH01503331A - モノカインの検査法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 モノカインの検査法 本発明は一般にモノカイン（Ｍｏｎｏｋｉｎｅ）の検査法に関する。さらに詳細 には、本発明は生物体液特に血液検体中の内生モノカインの検査法に関する。

モノカインはシトカイン（ｅｙｔｏｋｉｎｅ）として知られる細胞媒介物質（ｃ ｅｌｌ　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）のグループに属するものである。シトカインは実 際上は下記の２つにわけられる。

リンバカイン、すなわち、リンパ球によって分泌され、大食細胞または他のリン パ細胞を賦活化する可溶性媒介物質；および モノカイン、すなわち、単核大白血球または大食細胞によって分泌され、リンパ 球系の細胞または間葉起源の細胞に作用する媒介物質。

本発明が関わるモノカインは、特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　α）とインターロ イキン−１（ＩＬ−１β）とからなる、この２つの細胞媒介物質は実際にそれら の放出活動あるいは生物学的作用などの挙動において顕著な類似性があることが 知られている（（１）参考文献参照）。

抗ガンまたは抗ウイルス因子であることの他に、このＴＮＦαとＩＬ−１βは異 なるいくつかの病理学的状態において分泌されることが知られている。特に、Ｔ ＮＦαについていえば、炎症時において、また１敗血性ショックおよびすい臓シ ョック時に分泌される。より一般的にいえば、ＴＮＦαとＩＬ−１βの分泌は大 食細胞の賦活作用を示すものである。したがって、簡単で信頼性がありかつ迅速 な検査によってこのＴＮＦαまたはＩＬ−１βの分泌を追跡することができれば 病理症状における大食細胞の機能面についての非常に価値ある情報源となりうる 。

血液検体中のシトカインを免疫検査法によって検出することを試みた場合、いく つかの問題に遭遇する。すなわち、この検査法の感度はそれら媒介物質の存在量 が少ない場合、血漿中または血清中で直接当該媒介物質を検出するためには不十 分であることが多い、また、得られる検査値の性質から利用に非常に困難が伴な うという問題が生じる。なぜならば、数値が妥当であっても、得られる血清値ま たは血漿値は検体と検体との間、あるいは健康検体と病気検体との間でほとんど 変らないか、あるいは、有意義的変化が出ないからである。このことは特にリン バカイン（ＩＦＮ７（２）とＩＬ−２（３ａ−ｂ））についていえる。

ＴＮＦαについては、後述するように（実施例Ｖ：臨床アセスメント）、ＲＩＡ 免疫検査法が非常に感度が良いが、２０ｐｇ／ｍＱ以下の濃度の場合、２４時間 の検査培養時間を要しても血漿中のその直接検出は不可能である。実用上の必要 から培養時間を４時間に短縮しようとすれば、検出濃度限度は約１１００ｐ／ｍ Ｑに上昇してしまう。

わずか２時間の培養時間ですむＩＲＭＡ検査法はしかし血漿中のモノカインの存 在を直接検出するためには役に立たない。

血漿中の直接ＲＩＡ検査によって得られるＴＮＦαの濃度は健康な検体の場合で は平均５０ｐｇ／ｍＱのオーダであり、そしてほとんどの病理状態において２０ ０ｐｇ／　ｍ　Ｑを超すことはない、しかしながら、これら血漿中の直接ＲＩＡ 検査は利用にかなりの困難が伴なう。

実際に、場合によっては健康検体と病気検体との間でかなりの差がでるであろう が、１つの検体と別の検体とで得られる検査値の差は非常に小さい、しかも、検 査されるべき量は検査により満足すべき判定をするため、すなわち、検査ごとに 大きな変動が見い出しうるための検査の検出限界値よりかなり多い量（少なくと も４乃至５倍）でなければならないと一般に考えられる。このような２つの条件 に対応することは難しい。

従来、この問題の解決法としてシトカイン分泌（（２）ＩＦＮｙ、（３ａ−ｂ） ＩＬ−２，（４）ＴＮＦα、（５）ＩＬ−１）を刺激するための細胞培養の手段 に頼って血液検体中のシトカインを検査することがおこなわれてきすなわち、こ の従来方法では、有糸分裂を誘起する剤の添加によって刺激された培養基中への シトカインの分泌が検査される。たとえば、有糸分裂誘起剤の存在で培養された 末梢血液の単核大白血球の上澄みのモノカインを検査するのである。これにより 得られる検査値はＴＮＦαの場合１　ｍ　Ｑ当り１ナノグラムのオーダの値であ る（実施例Ｖ参照）、すなわち、検査の検出限界値よりもかなり大きい濃度であ り、特に正常検体と病気検体とが比較された場合には大きな差異が現れる。

しかしながら、この細胞培養に頼る方法が満足すべき解決法でないことは、特に ルーチンの臨床検査にこれを適用する観点から見れば明らかである。事実、この 培養では検査の信頼性に影響を及ぼすようなバラツキが生じてしまう、特に一方 では患者ごとにその再現性に変動が生じ、他方では同一患者でも検体ごとに再現 性が変動する。さらに、言うまでもないことであるが、培養内部組織（ｓ　ｉ　 ｃ）や殺菌条件のための準備が必要であり、さらにかなり長い検査時間が必要と される。

したがって、本発明の目的は信頼性に富みかつ得られる値が実用性があり、しか も簡単容易にルーチンの臨床診療に使用しうる血液検体中のモノカインの検査方 法、特に免疫学的検査方法を提供することである。

本発明の出発点はつぎのような事実の発見にある。すなわち、ＴＮＦαやＩＬ− １βのごときモノカインは他のシトカインよりもはるかに迅速に細胞培養基に分 泌され（第１図および第２図参照）、驚くべき新規な特徴として、モノカインの 検査のために末梢血液の単核細胞培養段階は回避可能であるということが見い出 されたのである。そして血漿が、血漿（または血清）と血球との分離段階の前に 有糸分裂誘起剤を使用して刺激された完全血液から得られたものであれば、直接 血漿を検査することによってモノカインの検査が可能であることが判明したので ある。

したがって、本発明は血液検体中のモノカイン、特にＴＮＦαまたはＩＬ−１β の検査方法に関し、本発明の方法の特徴はモノカインを直接血清中または血漿中 で検査し、この際に該血漿を血漿または血清分離前に前もって有糸分裂誘起剤に よって刺激された完全血液から得ることにある。

１つの特定の実施態様においては、検体血液は抗血液凝固物質たとえばＥＤＴＡ 上に取られそして次に有糸分裂誘起物質たとえばＰＨＡと接触せしめられ、その 状態で培養される。この操作の終了時に、血液は遠心分離によって清澄化され、 そして得られた血漿の中でモノカインの検出検査がなされる。

完全血液の刺激は４乃至４０℃で３０分乃至４８時間のインキュベーションを行 なうためには、特に、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉ ｎｉｎ＝　Ｐ　ＨＡ　）　０　、０２乃至５０μｇ／ｍｆｆ１またはリポ多糖類 （ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ＝ＬＰＳ）１０乃至２００μｇ／ｍｊ ｌを使用して実施することができる。

インキュベーション温度または時間を低下または短縮させた場合には有糸分裂誘 起剤の濃度をより高くしてやる必要がある。

実際には、たとえば、ＰＨＡを０．１乃至１０μｇ／＋ａｌｌまたはＬＰＳを１ ５乃至７５μｇ　／　ｍ　Ｄ使用して刺激し、２０乃至３７℃の温度で２乃至４ 時間インキュベートするのが適当である。

特に、完全血液をＰＨＡの５μｇ／■ΩとＬＰＳの２５μｇ　／　ｍΩ使用して 直接刺激し、インキュベーションを３７℃で２時間とすることができる。

これによって、ＲＩＡ検査の場合もＩＲＭＡ検査の場合にも、検体ごとに有意味 的変化のある。すなわち上記条件を満足する有用な数値である１０”ｐｇ／ｍＪ のオーダのＴＮＦαの血漿濃度値が得られる。

本発明による。培養段階に依存しない、完全血液の直接刺激によるモノカインの 検査方法はルーチン臨床診療への適用を非常に好都合ならしめる次のような一連 の利点を有する： 迅速である（完全血液の刺激のためのインキュベーションが２時間、ＩＲＭＡ免 疫的検査の場合、検査のためのインキュベーションが２時間以内、いずれの血漿 試料についても同様）； 簡単である。これは無菌条件あるいは培養下部組織を必要としないからである； 簡単な培養器があれば、血液試料を採取したその場所で実施可能である； 信頼性がある。これは培養に起因するすべてのバラツキがなくなり、患者ごとに 、また検体ごとに再現性が得られるからである。

さらに、後に詳述するように、検査キットに予め有糸分裂誘起剤を含有させた採 血管を準備しておくこともできる。そうしない場合でも、採血後２時間のタイム リミツトが刺激開始まで利用できる。したがって、培養器をサンプル採取の場所 から２時間の範囲内に置くことができる。

有糸分裂誘起剤としては上記したフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）やリポ多糖類 （ＬＰＳ）以外にも、たとえば。

ホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅａｃ ｅｔａｔｅ）　、カルシウムイオン透過担体（ｃａｌｃｉｕｍ　１ｏｎｏ−ｐｈ ｏｒｅ）、チモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）、ジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、 Ｗ　Ｇ　Ａ　（＝：ｖｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：麦芽アグル チニン）または他のレクチン類たとえばコンカナバリン（ｃｏｎｃａｎａ−ｖａ ｌｉｎ）などが使用できる。

１つのガイドラインとして以下にこれら種々の有糸分裂誘起剤の適当な使用濃度 範囲を示す：１）ＴＰＡ＝ＭＰＡ　（ホルボールミリステートアセテート’）（ ＭＷ＝６１７） １０−７乃至１０−”Ｍ。

２）カルシウムイオン透過担体（ＭＷ＝５２３）化合物Ａ２３１８７　（シグマ （Ｓｉｇｍａ））　：　５０乃至１００　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｑか、あるいはイオ ノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）　（カルビオケム（Ｃａ　ｌ−ｂｉｏｃｈｅ ｍ））　：　０　、５乃至２μＭ。

３）シモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）　Ａ　：３００ｔｔｇ／ｍＱ　乃至３　ｍ　ｇ 　／　ｍ　Ｑ　。

４）ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）　：１乃至２０μｇ　／　ｍ　Ｑ　。

５）ＷＧＡ　（麦芽アグルチニン）： １０乃至１００μｇ／ｍ（Ｌ ６）Ｃｏｎ　Ａ　（：ＩンカナバリンＡ）：２乃至１０μｇ　／　ｍ　Ｑ　。

抗血液凝集剤としてはＥＤＴＡのほかに、ヘパリンまたはクエン酸塩が本発明に おいて使用しうる。

本発明の検査法の１つの非限定的実施例においては。

検査放射線免疫検査法のごとき免疫による検査法として本発明は実施される。特 に、本発明の検査は置換免疫検査たとえばＲＩＡ検査または、特に、ＩＲＭＡ型 の２点免疫分析検査として実施しうる。

置換検査法は検査されるべき天然抗原と抗体のための標識をつけた抗原との間の 競合に基く検査法である１反応後、抗原−抗体複合体から遊離抗原が分離される ０通常、測定は結合した抗原について行なわれる。かかる条件下かつ一定濃度の 抗体の存在では、検査されるべき抗原の増加と共に測定される信号は減少する。

２点免疫分析検査法の場合では、抗原は下記のいずれかのものを使用して検査さ れる： ２つの互いに異なるエピトープ（ｅｐｉｔｏｐ６）に結合する２つの互いに異な り補完的な抗体か、または、１つのくりかえしエピトープに結合する２つの同種 の抗体。

第一の抗体は不溶性相（セルロース、プラスチック面。

マグノゲル（Ｍａｇｎｏｇｅｌ）など）上で固定化される。第二の吸収されない 抗体はトレーサまたは標識をつけている。

これをラベル抗体という。

反応後、遊離／結合複合体の分離が簡単な洗浄によりて実施されそして結合され ている複合体が測定される。このような条件下かつ過剰の抗体の存在では、検査 されるべき抗原の濃度の増加と共に測定される信号は減少する。

これら２つの検査方式において、トレーサまたはａｍは免疫学的反応を定量化す ることを可能にする。トレーサまたは標識は置換検査法の場合は抗原に結合し、 また、免疫分析法の場合では抗体に結合する。いずれにせよ。

標識の選択は所望される感度と分析実験室内に具備されている装置を考慮してお こなわれる。現在では下記の主な４つの型のトレーサが利用できる： ・・放射性同位元素；ヨウ素−１２５が感度と安定性を併せもつ最良例である。

置換検査法で使用されるのがＩＲＡ（放射線免疫検査）型、免疫分析法ではＩＲ ＭＡ（免疫放射分析検査）型である。

・・酵素：たとえば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはペ ルオキシダーゼ、！！置換検査法使用されるのがＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫収着 剤検査法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉ＋ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ ５ａｙ）　）型そして免疫分析法はＩ　ＨＭ　Ａ　（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏ ｍｅｔｒｉｅ　Ａｓ５ａｙ）型である。

本発明はさらに、高い特異性を有し、他のサイトカインと交差反応を示さない、 特別にＴＮＦαおよびＩＬ−１βの免疫検査のために有用な抗ＴＮＦα抗体と抗 ＩＬ−１β抗体とを発明の対象に包含するものである。

詳細には、うさぎ抗−ヒトＴＮＦαポリクローナル抗体またはうさぎ抗−ＩＬ− １βポリクロ一ナル抗体およびマウスのヒ臓細胞と５Ｐ２−０骨髄細胞腫細胞と の融合によってつくられたハイブリドーマから分泌された抗−ＴＮＦαモノクロ ーナル抗体である。

さらにまた、モノカインの免疫検査のための検査キットまたは試薬キットも本発 明の対象に包含される。このキットは、試薬の中でも、特に完全に校正されたバ ッチから取られたＰＨＡのごとき有糸分裂誘起剤の試料を含有する。

たとえば、このキットはＥＤＴＡとＰＨＡまたはＥＤＴＡのみを含有する、５乃 至１０ｍＱの血漿を吸引しうる真空吸引管のごとき真空下でサンプル採取するた めの管を包含している。ＥＤＴＡのみを含有する採取管の場合には、そのＥＤＴ Ａ含有採取管に採取された検体は次にＰＨＡを含有している管に移される。

有糸分裂誘起剤含有の検査キットを準備することは検査の信頼性に寄与する。な ぜならば、これら有糸分裂誘起剤は複合レクチンであり、バッチからバッチへ再 生産することが困難であり、有糸分裂誘起剤の組成にバラツキが生じ、その結果 として刺激作用に差異が生じる可能性があるからである。

本発明の他の目的として、血球分離前に有糸分裂誘起剤により完全血液を活性化 する段階も省略して、モノカイン、特にＴＮＦαを直接血漿検査により検出する 可能性が研究された。より一般的に言えば、生物学的液体、すなわち、血漿や血 清のみでなく例えば尿や腹膜浸出物も含めた生体液中の自生ＴＮＦαを直接的に 検査できる方法が研究されたのである。

この目的のために、まず免疫分析検査、特にＩ　ＲＭＡタイプのものを実施する 場合に最も感度の高いモノクロ−ナル抗体ペア（吸着ＭＡＢ／ラベルＭＡＢ）を 選択することを試みた。

実施例■に記載した実験から、特にＴＮＦαの検査のために非常に感度のあるモ ノクローナル抗体ペアでも、これを使用したＩＲＭＡ検査において、既知量の生 物学的液体に付加された外因性モノカインの値の検索を可能ならしめないことが 判明した。

この現象は生物学的液体中に存在する結合タンパク質が、特にＴＮＦαの場合、 モノカインの認識のためのエピトープを隠蔽してしまうためと思われる。

それにもかかわらず、本発明によって、つぎの発見がなされたのである。すなわ ち、免疫分析検査、特にＩＲＭＡ検査法において、下記の２つのものを併用する ことによって免疫分析検査でモノカイン、特にＴＮＦαの既知値の回収が最も良 く可能となることが見い出されたのである。

１）デコンプレキシングまたはアンカップリング剤、たとえば、ＥＤＴＡの作用 、たとえば、この剤をトレーサ（ラベルをつけられた非吸着抗体）と混合する。

２）数種のモノクローナル抗体を含有している、いわゆる、′オリゴクローナル 系の使用、この系はその感度に基づいて選択された吸着ＭＡＲ／ラベルＭＡＢベ アのほかにモノカイン特にＴＮＦαの検出に最も役たつ少なくとも１種の第２の 吸着ＭＡＢを含むものである。

これにより、吸着ＭＡＢ　が該第２の吸着ＭＡＲ（ｌａｃｕｎａ）である吸着Ｍ ＡＲ／ラベルＭＡＢペアを使用した。ＴＲＭＡ検査のごとき免疫分析検査におい てモノカインの、特にＴＮＦαの検出の最良の可能性が得られるのである。

したがって、モノカインの異なるエピトープを認識する少なくとも２種のモノク ローナル抗体を使用し、該抗体が固体相に吸着されていることを特徴とする。生 物学的液体中のモノカイン、特に、ＴＮＦαの免疫分析検査法たとえばＩＲＭＡ 検査の方法も本発明の対象である。

第１の吸着抗体は、極めて高い感度の検査、特に１０Ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑの低量 モノカインの検出を可能ならしめるような精度の高い検査を達成させるものを選 択し、そして第２の吸着抗体は、モノカイン（外来）の既知値を検査した時に最 高の回収度、特に１００％の回収度を与えるものを選択するのが適当である。

さらに、検査をＥＤＴＡのごときデコンブレキシング剤の存在で実施するのが有 利である。この場合、その剤は、たとえば、トレーサ（ラベルＭＡＢ）と−緒に 導入することができる。

さらにまた１本発明はモノカインの免疫分析タイプの検査のための検査キットも 発明の対象とするものであり。

そのキットは検査チューブの内壁または検査ビードの表面のごとき固体相に吸着 された。当該モノカインの複数の異なるエピトープを認識する少なくとも２種の 抗体を含有している。

このキットには、試薬の中でも、ＥＤＴＡのごときデコンブレキシング剤を含有 させておくのが有利である。

本発明のその他の特徴および利点は図面を参照した以下の記載から明らかとなろ う。

図面の簡単な説明 第１図はＰＨＡ（ＹＩＦＮの１２ｇ　／　ｍ　ＱおよびＩＬ−２とＴＮＦの１０ Ｐｇ　／　ｍ　１１　）で刺激された単核細胞培養基中でのＴＮＦα（ロ）、Ｉ Ｌ−２（Δ）およびＹＩＦＮ（・）の分泌の推移を示すグラフである。

このグラフから刺激された培養基中のＴＮＦαの分泌が迅速であることがわかる 。

第２図はＰＨＡ（１０Ｐｇ　／　ｍ　Ｑ　）で刺激された単核細胞の培養におけ るＴＮＦαとＩＬ−１βのＯ乃至６時間の間の分泌の推移を示すグラフである。

第３図はＴＮＦαについてのＲＩＡ校正曲線である。

第４図と第６図はモノクローナル抗体の各種ペア（吸着ＭＡＲ／ラベルＭＡＢ） を使用したＴＮＦαについてのＩＲＭＡ標準曲線である。

第５図はＴＮＦαのＲＩＡ検査の場合の半対数特異性曲線である。

第７図はＴＮＦαのＩＲＭＡ検査とＲＩＡ検査との間の相関関係を示すグラフで ある。

大豊叢上：皇蓋亙盈災隻！ この培養法はトリチウム化チミジンの融合の研究のため一般に使用されている方 法であり（ジエ、エクスプ。

メト、（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、１９７９，１４９，１０２９）。

今回これをＴＮＦαの分泌の研究に応用するために培養時間と最適ＰＨＡ投与量 の２つのパラメータについて変更を行なった。

この培養法の方法論は古典的なものであるが、これに対して２つの変更が加えら れた。

第１の変更事項はりューコプレプ、登録商’ＩＩ　（Ｌｅｕｃｏ−す肚’　）　 （ベクトンデイキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））の使用である 。この物質を使用すると血液の処理または前稀釈が不要となるので末梢血液の単 核細胞の分離が簡単になり時間が短縮される。

第２の変更事項は細胞ペレットで培養後にＤＮＡ検査が実施された点である。こ れは実際に培養基中でＲＩＡによって検出されたＴＮＦのレベルを同数の細胞に 関連させるために役立つ、使用したマイトジェン（ＰＨＡ）に試料ごとに可変の 効果を発揮させることができる。

１、　亙ｌ立見亘 “正常”検体の血液を真空吸引管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ　ｔｕｂｅ）でＥＤＴ Ａ上に吸引しそして室温に保持してリューコブレブ（ベクトンディキンソン）の ２相を含有する管内に６時間貯留する。そのあと９００ｇ　（２０℃７１５分） 遠心分離する。この分離のあと単核細胞が血漿と有機相との間に可視の白いリン グを形成する。この細胞層を無菌状態で吸引し５０　ｍ　Ｑ容量の円錐底つき管 に入れ、この中で細胞をＮａＮ、０．１％を含有するＰＢＳ緩衝液で連続２回洗 う（３００ｇ／４℃／１０分と４００　ｇ　／　４℃／１０分）、この細胞をグ ルタミン、抗生物質、自然血清５％を含有するＲＰＭＩ　１６４０培養基３ｍΩ と共に取り出す、細胞を数えて細胞濃度を１０’細胞／ｍＱに調整する。

２、　培　とマイトジェンによる前 培養は９６の培養区画をもつＮＵＮＣプレートの中で実施する。各区画に２００ μ２の細胞懸濁物を入れそしてこれに２２μａのブイトヘマグルチニンＰＨＡ　 （ウェルカム（Ｉｊｅｌｌｃｏｍａ）　）溶液を添加する。

この培養物を３７℃（５％ＣＯ２と９５％空気）でインキュベートする。

この９６ウ工ル培養皿を遠心分ｉｔ（９００ｇ／１０分／２０℃）した後、上澄 みを取り除きそして放射線免疫試験のために一２０℃で貯留する０区画部の底に 付着している細胞を蒸留Ｈ，Ｏの２００μＱで取り出し超音波で２秒間処理する 。細胞内容の１５０μ２アリコート試料をそのＤＮＡ濃度を調べるためバイゲン （Ｐａｉｇａｎ）とラバルカ（Ｌａｂａｒｃａ）の方法で検査する。

結果はすべてＤＮＡ単位濃度で示される。

３、　藍−果 ２つの予備研究を実施した。１つばカイネティックス（活動）の研究、いま１つ は投与一応答の研究である。

投与一応答効果を調べるため最終ＰＨＡ濃度を０．０２μｇ　／　ｍ　Ｑから５ ０μｇ　／　ｍ　Ｑまで変化させた。

カイネティックスは培養の４日間にわたって調べた。

ａ、ＰＨＡの投与一応答効果 γ−ＩＦＮはベル形応答曲線を示し、最大値はＰＨＡ投与量の１μｇ　／　ｍΩ と２μｇ　／　ｍ　ｎにある。

他方、ＴＮＦａは対照と比較して１μｇ　／　ｍ　Ｑ以下の投与量では刺激され ない、この値より上の投与量では進行は投与量に依存する。

また、ＩＬ−２は２乃至２０　ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑのごく狭い濃度範囲内で検知 可能な刺激を示す、最大値は５βｇｌｉにある。

結論：γ−ＩＦＮ、ＩＬ−２．ＴＮＦαの３つのパラメータの場合ではｌμｇ／ ｍＡと１０　μｇ　／　ｍ　ＱのＰＨＡ投与量が最適であると思われる。

ｂ、　カイネティックス １βｇ／ｍＱと１０μｇ／ｍＱ、の投与によるｙ−ｘＦＮの刺激は同様なカイネ ティックスを示し、培養を３日間まで延長するとそのあとの数時間で最大に到達 する。

ＩＬ−２はＰＨＡの投与量により異なる態様で分泌される。すなわち、ｌμｇ／ ｍＱでは、２８時間（２０時間と４４時間の間）でピークとなり、そのあと減少 しそして７６時間後に検査の検出限界以下のレベルとなる。

これとは対照的に、１０μｇ　／　ｍ　Ｑの場合では、分泌は５２時間まで漸増 し、そのあとはプラトーを示す。

これに対して、ＴＮＦａとＩＬ−１βは培養のきわめて初期（４時間以内）にか なりのレベルまで刺激され、第１図と第２図に見られるように、それ以降は到達 レベルが維持される。到達レベルはＰＨＡの投与量に依存する。

４、ＴＮＦａとＩＬ−１βの培 ａ、　培養時間 ＰＨＡの１つのパッチのＯｕｇ／ｍＱ、　１βｇ／ａｎ。

１０ｐｇ／ｍＱ、５０ｔｔｇ／ｍＱでそれぞれ刺激された培養のカイネティック スを調べたところ健康検査ではＴＮＦａおよびＩＬ−１βの分泌は主として培養 時間によりコントロールすることができることが判明した。

ＭＪＲ： 上記４つのＰＨＡ投与量の場合、培養物中のＴＮＦａとＩＬ−１βのレベルは培 養４時間目まで増加し、この時点以降はＴＮＦａについては培養９０時間以上そ のままのレベルにとどまり、ＩＬ−１βは増加を続けた。

Ｕ： ＴＮＦａとＩＬ−１βの検査のためにはＰＨＡを加えた培養基中での細胞の培養 は４時間以内とすべきである。それ以上培養時間を延長してもこの分子の分泌の 実質的変化は見られない。

ｂ、　使用されるべきＰＨＡ投与量 投与一応答実験をＰＨＡの投与量を種々変えて（２０ｎｇから５０μｇ　／　ｍ 　Ｑまで）７２時間培養することにより実施した。

藍見： ＰＨＡの５００ｎｇ／ｍＡまではＴＮＦａのレベルの変化は検出不能、なぜなら ば検査の検出限界以下であるからである。これに対して、５００ｎｇ／ｉ＊Ｑ以 上の投与量ではほとんど正比例的投薬量依存関係が存在する。このことはＰＨＡ ５０１Ｌｇ／ｍΩまで該当する。

亙且： ＰＨＡを大量投与するとＴＮＦａの分泌は最大となる。しかし、他のパラメータ （γ−ＩＦＮ、ＩＬ−２）は、多分ＰＨＡの毒作用の結果として減少する。

実際上、マイトジェンの１，５または１０μｇ／ｍＱの投与が細胞のＴＮＦα分 泌の滞在能力を検査するために適当である。

スｍニー直羞ヱ［グ逼Ｊｕ町数 上記した短時間培養の知識を基礎として、′培養”部分を短絡する新規な方法が 開発された。簡単にいえば、ＥＤＴＡ上に吸引された検体血液を直ちにＰＨＡと 接触させそしてそのまま培養するのである。この操作につづいて血液を遠心分離 して清澄化する。このあと得られた血漿中で直接にＴＮＦａを検査するのである 。

ＥＤＴＡ上に吸引された９の“正常”検体血液を直ちにＰＨＡのｏ、１または１ ０Ｍｇ／ｍＱで刺激すル、ツいで、たとえば、３７℃で４時間培養後、清澄化し そして得られた血漿の中をＴＮＦα検出のため検査する。

この単核細胞の培養において、ＴＮＦａも投薬量に依存した態様で刺激された。

すなわち、５３．８±１０．５Ｕ　／　ｍ　Ｑの対照（ＰＨＡはＯｕｇ／ｍＱ） の平均値に比較して、投与量１　μｇ　／　ｍ　Ｑの場合は５１２±２７３ｐｇ ／　ｍ　Ｑの平均血漿レベルが、そして１０Ｍｇ　／　ｍ　Ｑの場合は１９６６ ±８０４　ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑの平均血漿レベルが与４つの“正常”検体血液に ＰＨＡの５μｇ　／　ｍ　Ｑで直接刺激する実験を２０℃と３７℃の温度かつ１ ７８時間。

１時間、２時間、６時間および２２時間の培養時間を選択して実施した。

葺１じ １、　室温（２０”Ｃ）では刺激は常に３７℃の温度の場合より弱い。

２、４つの検体について、２時間培養後に最大血漿レベルに到達し、そのあとは プラトー状態で安定する。

遵」１ ＰＨＡの５μｇ　／　ｍ　Ｑを使用した直接刺激は温度３７℃で２時間培養した 場合に最良の結果を示す、この血液の直接刺激後の血漿分離は（ｌａｃｕｎａ） 時間の経過後に実直接刺激法は下記のような実質的利点を有する：１）　迅速で ある（２時間）。

２）　無菌条件および培養下部組織を必要としないから簡単である。

したがって簡単な培養器と遠心分離装置を具備していれば採血したその場所で使 用しうる。このあと試料を検査室に送り、抗血液凝集剤から抜き出した血液試料 について血漿の分離を行ない、生物学的パラメータのルーチンの血漿検査を実施 すればよい。

２匹のうさぎにＴＮＦａ（遺伝子組み換えヒトＴＮＦα）５０Ｍｇを含有する生 理食塩水０．５ｍΩ　とフレンド（ＦＲＥＵＮＤ）アジュバント０　、５　ｍ　 Ｑ　との懸濁物をパイツカイティス（ＶＡ　Ｉ　ＴＵＫＡ　Ｉ　Ｔ　Ｉ　Ｓ）法 （６）に従って注射した。

このあと、同量の抗体を使用して４回毎月補強注射を行なった。定期的に各うさ ぎの耳の末梢血管から抗血清の力価を試験するための採血を行なった。

２、ＴＮＦａの　化 グリーンウッド（ＧＲＥＥＮＷＯＯＤ）の方法（７）によってクロロアミンを使 用してＴＮＦａにヨウ素１２５でラベルをつける。０．０５Ｍ　リン酸塩緩衝液 ５μΩにＰＨ７，５で溶解した５μｇのＴＮＦａを、１ｔ′工の１　ｍｃｉ、同 じ０．５Ｍ緩衝液、ｐＨ７，５（７）５μｆｌ、および０．０５Ｍリン酸塩緩衝 液、ｐＨ７，５の１０μＱに溶解したクロロアミンＴ２０μｇと一緒に培養する 。

３０秒後２反応を同じ緩衝液１０μＱで稀釈したメタ重亜硫酸塩２０μｇの添加 によって停止させる。セファデックスＧ−５カラム（０，９Ｘ３０ｃｍ）のゲル 透過クロマトグラフィーにかけた後、最初の放射能ピークに対応する留分をセフ ァデックスＧ−１００カラム（０，９Ｘ６５ｃｍ）に通す、いずれのカラムにも 溶離剤としてはＮａＮ、０．０５％と生型アルブミン０．１％とを含有する０、 ０５％Ｍリン酸塩緩衝液を使用する。

３、　暮ｌ盪監狡正亘暮 培養は室温で、ＢＳＡｏ、５％とＮａＮ、０．０５％とを含有する０、０５Ｍリ ン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５の中で実施する。ラベルをつけない抗原の含有量を種 々増加させた（５，１０，２０，５０，１００，２００，５００ｐｇ）緩衝液０ ．１ｍΩまたは検査されるべき試料０．１ｍｆｌを１／１２５０００の稀釈度で 抗血清と混合する。−晩予備培養した後、約３００００ｃｐｍに相当するラベル 抗原と稀釈度１％のうさぎ血清とを含有している培養緩衝液０．１ｍ１２　を添 加する。ついで室温で２０乃至２４時間培養する。このあと、抗原に結合した抗 体を、トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）　０　、５％、ポリエチレングリコール６％、 微結晶質セルロース０．２％および羊の中でつくられた抗うさぎグロブリン血清 ０．５％　を含有する培養緩衝液１ｍｊｌを添加して沈殿させる。さらに２０分 培養後、その抗原−抗体複合体を２５００ｇで２０分間遠心分離して沈殿分離さ せる。上澄みをガンマ放射能カウンターで分析する。

第３図は下記のごとく室温で全部で２日間培養させ、遠心分離し計数した後で得 られたＲＩＡ校正曲線である。

・　血清＋標準または試料　８１日 ・　＋ＴＮＦ−″１工　：１日 ・　十免疫沈殿剤　：２０分。

沈澱物の放射能（抗体に結合したラベル抗原の放射能）は通常Ｂで支持される。

Ｔで支持される。すべての試験管について同一である全初期放射能も既知である 。また、遊離ラベル抗、［（Ｂｏという）の放射能を推計することもできる０通 常、Ｂｏ＝Ｔ−Ｂで計算すれば充分である。

４、　豊ＪＬ立 組換えβ−およびγ−ＩＦＮの０乃至５０００Ｕ／■Ωの濃度、また、組換え　 ＩＬ−１、ＩＬ−２およびγ−ＩＦＮの１１０００ｎ／ｍＱの量ではラベルＴ　 Ｎ　Ｆ　ａの抗血清への結合を阻止するようなものは生じ得ない、したがって、 第５図の直線りによって示されるように、ＴＮＦαの検査には何等の障害もない 。

さらに、第５図において１曲ＩＩＡＳ１は冷標準ＴＮＦについての置換曲線であ る。右側の曲線Ｓ、は外因性ＴＮＦを有する培養基の別の稀釈物についての置換 曲線である。

この２つの曲線の平行性は標準と本培養との間の免疫学的挙動の同一性を立証す るものであり、したがって、刺激を使用しうろことが証明される。

ＣＥＮ−Ｍｏｆｌ起源の２月令の２匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ種雌マウスを下 記手順で組換えＴＮＦで免疫化した。

−０日目に５０％フレンド完全アジュバント中１０μｇのＴＮＦの第１回旋膜内 注射； −２０日目に５０％フレンド不完全アジュバント中１０μｇのＴＮＦの第２回腹 膜内注射； −５０日目にＰＢＳ中１０μｇのＴＮＦの第３同腹膜内注射； −２匹の中の１匹のマウスには７５日目にそして２番目のマウスには４ケ月後に それぞれＰＢＳ中１０μｇのＴＮＦαを補強注射。

２、融合 最後の補強注射後３日目に２匹のマウスをそれぞれ殺した。ひ臓を取り出しモし てひ腫細胞を融合のため準備処理した。

細胞融合は変更されたコーラ−（ＫＨＯＬＥＲ）（Ｓｉｃ）とミルスティン（Ｍ ＩＬＳＴＥＩＮ）のプロトコールに従って実施された。

１番目のマウスでは９　Ｘ　１０’ひ腫細胞が１．６ＸＩＯ’５Ｐ２−０骨髄腫 細胞と融合された。２番目のマウスでｌ！４．８ｘｌｏ”ひ腫細胞が１０’　５ Ｐ２−０骨髄腫細胞と融合された。融合誘起剤としてはポリエチレングリコール ４０００が使用された。融合後、細胞は下記物質で補完されたＤＭＥＭ培養液中 に２．５　Ｘ　１０’細胞／　ｍ　Ｑの濃度で再懸濁された： うま血清　１０％。

胎児うし血清　１０％。

豚インシュリン　４μｇ／Ｑ、 ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナ トリウム、ハイポキサンチン／チミジンおよびアミノプテリンのＧＩＢＣＯ溶液 　２％。

この懸濁液は２０枚の９６区画培養プレートに０．２ｍ　Ｑ　／区画の割合で分 配された。

３、　バイブ１ドーマのスクリーニング融合の１０日後に培養プレートの培養液 を取り出しそしてアミノプテリンまたはインシュリンのない同じ培養液で置換し た。これらの培養プレートを反転顕微鏡を使用して各区画をハイブリドーマの成 長の有無を調べて選別した。ハイブリドーマが存在する区画の培養液中にＴＮＦ に対する特異性抗体が存在するものを次のようにして選別した： 当該培養の５０ｍΩ（ｓ　ｉ　ｃ）を区画部から取り出しそして溶血管の中でＰ ＢＳ緩衝液０　、２　ｍ　Ｑ中４０，０００ａｍｐ（ｓｉｃ）のＴＮＦ−”Ｊを 加えて一晩培養する。

ついで各管にセルロースにカップリングしたシｅｌｌｃｏｍｅｄｏｎｋｅｙ抗マ ウス試薬の０　、１　ｍ　Ｑを１５分間で添加する。

さらに、４０００ｃｐｍ　（ｓｉｃ）で１０分間遠心分離する前にトウイーン２ ０を　０．１％含有する水２ｍＱを添加する。遠心分離後の上澄みを取りそして γ−カウンターで放射能を調べる。

４、　モノクローナル抗体の産生 検査陽性の培養ウェル内の細胞を順次２４ウエルプレートおよびペトリ皿に移し た。

マウス１匹当り５　Ｘ　１０’　の細胞を、１０日前にブリスタン０．５ｍＡの 注射を受けていた複数のＢ　Ａ　Ｌ　Ｓ　／　ｃマウスに腹膜注射した。１０乃 至１５日後、マウスは腹水液を産生じた。これらの腹水液を集めて精製した。

腹水液中のモノクローナル抗体をファルマシアタンパク質Ａ−セファロース親和 性カラムに通して精製した。

６、査 １００本のナンクマキシソーブ（Ｎｕｎｃ　ｍａｘｉｓｏｒｂ）管をモノクロー ナル抗体各２０　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｑを含有する溶液の２００μΩでコーティン グした。コーティング４８時間後に抗体溶液を除去しそして管をＢＳＡ　Ｏ，５ ％含有リン酸塩緩衝液で４時間飽和させた。このあと管をトウイーン２０ｔ−０ ，１％含有している水２ｍｊ２で２回洗った。

これらの管を吸引乾燥して乾燥剤を入れた密封容器の中に貯蔵した。

モノクローナル抗体各２５μｇをクロラミンＴ法を使用してＮａ”’Ｉでラベル をつけた。

ヨウ素１２５で４Ｌｌ化した各モノクローナル抗体をマキシソーブ管に吸着され た各抗体と共に免疫放射線分析検査に使用した。

ＢＳＡｏ、５％含有のＰＨ７リン酸塩緩衝液０．１ｍＱ中の０．００５または５ ナノグラム／−ΩのＴＮＦ標準試料をＰＨ６リン酸塩緩衝液５０ｔｔＱ中２００ ，０００ｃｐｍの！２ｓエラベルモノクローナル抗体を加えて培養した。

培養は具なるモノクローナル抗体でコーティングした管内で２時間実施された。

ついで、その混合物を取り出しそして管をトウイーン２０を０．５％含有してい る水で２回洗い、γ−カウンターでカウント測定した。与えられたＴＮＦα濃度 に対して最良の信号を与えるモノクローナル抗体ペアを後の使用のために選択し た。

Ｂａ１ｂ／ｃ種マウスのひ臓細胞を５Ｐ２−０骨髄腫細胞と融合した。少なくと も１種のクローン（ハイブリドーマ）を含む区画の１３８０の上澄みをＴＮＦα 認識抗体の有無を調べるべく分析した。

抗ＴＮＦα特異性抗体を分泌する１９のハイブリドーマが選択された。それらハ イブリドーマはっぎのものである：　３Ｃ５，ＩＢ５．ＩＤ６，３８５．ＩＢ２ ．４Ｂ３．５Ｇ１．２Ｃ４，５Ａ３，２Ｂ３，６Ａ３，４Ｄ１゜２Ａ５，３Ｇ３ ，３Ｅ６，３Ｄ３．ＩＦ９，２Ｈ７，１０Ａ２゜ 表１はヨウ素１２５でラベルをつけたＴＮＦαと上記クローンの中の５種、すな わち、３Ｄ３．ＩＦ９，２Ｈ７，３Ｅ６，１０Ａ２　（これらは最初に入手され たものである）との結合特性を示したものである。

第一」−一表 一抗−一体−１２″Ｉ−ＴＮＦの　八％（＊）３Ｄ３　６１ １Ｆ９　６０ ２Ｈ７５９ １０Ａ２　１５ ３Ｅ６　１　１ （本）２４ウエル培養プレートの上澄による”’Ｉ−ＴＮＦの場合。

２）　射線　析 上記５つのハイブリドーマの培養物を成長させ、そして細胞をＢ　ａ　ｌ　ｂ　 ／　ｃ種マウスに注射し、これにより腹水液を得た。タンパク質Ａカラムにかけ てこの腹水液から抗体を精製分離した。精製した抗体をマキシソーブ管に塗布し そしてＮａ”Ｊでラベルをつけた。各塗布抗体と各ラベル抗体とのすべての組み 合わせについて３つの標準を使用して免疫放射線分析検査の方法でテストを実施 した。

得られた結果を下記表２に示す、記載の数値は結合されたＴＮＦ−１工のｃｐｍ 値である。

１−」二二民 ラベル　標準 ＭＡＢ　ｎｇ／ｍ　Ｑ ３Ｄ３　０　３６６　３７９　４３８　４７９０．５　１０５５　１３９５　１ ７２８　１１７２ＩＦ９　０　７５２　−　−　１２７６０．５　１３３０　− 　１３６０ 第２表は吸着抗体２Ｈ７とラベル抗体３Ｄ３とのペアかいずれのＴＮＦ濃度に対 しても最良の信号を与えることを示している。この結論は第３図に示されるよう に、より広範な標準を使用して実施された第２の実験によって確証された。

第３図（ｓ　ｉ　ｃ）は下記の室温で全２時間の培養によるＩＲＭＡ標準曲線を 示す： 吸着抗体１＋標準または試料＋ヨウ素１２５ラベル抗体２を一緒に２時間培養。

３つの曲線は吸着２Ｈ７／ラベル３Ｄ３のペアの曲線（ム）と、吸着ＩＦ９／ラ ベル３Ｄ３のペアの曲線（・）と、吸着３Ｄ３／ラベルＩＦ９のペアの曲線（＋ ）とである。

第２表から抗体３Ｄ３が標識化された形の自分自身との結合に顕著な応答を示す ことがわかる。このパラドックスはＴＮＦが単量体の形と二または三量体の形の 開方で存在しているという事実によって説明できるであろう。

後の２つの場合、吸着抗体とラベル抗体とに対して同じエピトープが得られるで あろう。

３）　ＩＲＭＡの特　性 交差反応を生じる能力のある下記６種のポテンシャル試薬を使用して検査の特異 性を調べた：ＴＮＦβ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インタ ーフェロンα、インターフェロンγおよびインターフェロンβ。

実験はＴＮＦα標準を交差反応試薬標準で置換し、濃度を漸増させながら実施さ れた。使用濃度範囲は次の通ＴＮＦａ　：Ｏ乃至５０ｎｇ／ｍＱ ＴＮＦβ　：０乃至１０００　ｎ　ｇ　／　ｍ　ＱＩＬ−１：Ｏ乃至１１０００ ｎ／ｍＱ ＩＬ−２：Ｏ乃至５０００　Ｕ　／　ｍ　ＱＩＦＮ（Ｅ　：Ｏ乃至１１０００ｎ ／ｒｒ＋１１ＦＮｙ　：Ｏ乃至５０００　Ｕ　／　ｍ　ＱＩＦＮβ　：Ｏ乃至５ ０００Ｕ／ｍｕ 交差反応に関してはポテンシャルであるこれら６種の試薬のいずれもＴＮＦαの 力価に影響をおよぼす干渉を起こさなかった。したがって、検査は与えられた試 薬濃度の場合において完全にＴＮＦα特異性であるといえる。

それ故、提案されたＴＮＦαのＩＲＭＡ検査法はＴＮＦβ、インターロイキン− １、インターロイキン−２、インターフェロンα、インターフェロンγおよびイ ンターフェロンβに関して特異性を有する。

吸着モノクローナル抗体２Ｈ７とラベル抗体３Ｄ３のペアが下記実験のために選 択された。

ＩＲＭＡ検査を複数の異なるシリーズの臨床試料でＲＩＡと比較した。

第１のシリーズは賦活化されたあるいはＰＨＡを加えた正常単核細胞の複数の上 澄み試料からなる。これら試料についてのＲＩＡとＩＲＭＡによるＴＮＦα力価 の比較結果をつぎの第３表に示す。

第２のシリーズは完全血液を０．１　または１０μｇのＰＨＡで直接刺激した後 の正常供与体の複数の血清試料よりなる。これらの試料による比較結果は第４表 に示されている。

表■中の数値はＴＮＦαのｐｇ／ｍＱである。

ＡはＰＨＡによる刺激をしない実験、 Ｂは１μｇ　／　ｍ　ＱのＰＨＡで刺激した実験、Ｃは１ｏμｇ／ｍＱのＰＨＡ で刺激した実験を意味する。

これらすべてのＩＲＭＡ実駿は室温、２時間の一段階で実施された。

第一」エニ４ 次の第５表は第３シリーズの２０の血清についてのＲＩＡとＩＲＭＡとの比較結 果を示す、このシリーズの血清は刺激されない健康検体血清である。（ＩＲＭＡ 検査によるＴＮＦαは２Ｈ７／３Ｄ３のペアを使用しては検出不可能であった。

第６表はさらに別のシリーズの２０の血清検査の結果を示すものである。この場 合には、血清はすい臓炎患者から試料採取されたものであり、刺激はされなかっ た。

第−ｊニー民 血清　ＲＩ　Ａ　Ｉ　ＨＭＡ ＴＮＦＬ島ｌ恒ｎ）−一二ｒＮ旦副」江ｈ」ユ！−」Ｌ−表 血清　ＲＩ　Ａ　Ｉ　ＲＭＡ ＴＮＦ　α（／ｍｆｌ　ＴＮＦ　ａｃ　／ｍｆ１結論として、ＰＨＡで刺激され た血液試料中またはＰＨＡで刺激された単核大白血球の上澄み中の血清ＴＮＦα の力価はそれら検査法の感度の観点からＲＩＡとＩＲＭＡで満足できる大きな値 を与える。これに対して、刺激を与えなかった場合には、観察される数値レベル は検査の検出限界に対して低過ぎる。

追加の抗体が第２の融合で得られた。

得られた抗ＴＮＦモノクローナル抗体の１９組のペアをＩＲＭＡ試験におけるそ れらの感度に関して試験した。

試験結果は下記方法で表■に記載されている：各抗体に０から１］までの指数を 与える。この指数は２つのモノクローナル抗体のＴＮＦａの存在で信号を与えろ る能力を表す。

各ヨウ素１２５で標識化したモノクローナル抗体が各吸着モノクローナル抗体と 共につぎのようにして試験する。すなわち、０．５００ｐｇ／ｍＡと５０００ｐ ｇ／ｍｆｉのＴＮＦα標準がモノクローナル抗体を塗布した管の中で２００．Ｏ ＯＯｃｐｍ　を放射するヨウ素１２５１１識化ＭＡＢと共に２時間培養される。

洗浄後、ガンマ計数器で管を測定する。そしてそれぞれのＭＡＢペアに下記の基 準で１つの指数を与える： 指数０：　ＴＮＦａの０乃至５００　ｐ　ｇ　／　ｍ　ｆｔにおいて５００ｃｐ ｍより低い値を与えＴＮＦａの０乃至５０００ｐｇ／ｍＱにおいて５０００ｃｐ ｍより低い値を与えるペア。

指数１：　ＴＮＦａの０乃至５００　ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑにおいて５００ｃｐｍ より高く、１１０００ｃｐより低い値を与え、ＴＮＦａの０乃至５ｏ００ｐｇ／ ｍＱにおいて５００Ｑｃｐｍより高く１０．０００ｃｐｍより低い値を与えるペ ア。

指数２：　ＴＮＦａの０乃至５００　ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑにおいて１１０００ｃ ｐより高く、２０００ｃｐｍより低い値を与えＴＮＦａの０乃至５０００ｐｇ／ 　ｍ　Ｑにおいて１０．ＯＯＯｃｐｍ　より高く２０、ＯＯＯｃｐｍよ（ｓ　ｉ 　ｃ）　り低い値を与えるペア。

指数３　：ＴＮＦａのＯ乃至５００　ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑにおいて２０００ｃｐ ｍより高＜、３０００ｃｐｍより低い値を与え、ＴＮＦａの０乃至５０００ｐ　 ｇ　／　ｍ　Ｑにおいて２０．ＯＯＯｃｐｍ　より高＜３０．ＯＯＯｃｐｍ　よ り低い値を与えるペア。

指数４　：ＴＮＦ（Ｅの０乃至５００ｐｇ／ｍＱにおいて３０００ｃｐｍより高 く、４０００ｃｐｍより低い値を与え、ＴＮＦａの０乃至５０００ｐｇ／ｍｕに おいて３０，０００ｃｐｍ　より高＜４０．ＯＯＯｃｐｍ　より低い値を与える 指数５　：ＴＮＦ（！の０乃至５００ｐｇ／ｍＡにおいて４０００ｃｐｍより高 く、５０００ｃｐｍより低い値を与え、ＴＮＦａの０乃至５０ｏＯｐ　ｇ　／　 ｍ　ｎにおいて４０．ＯＯＯｃｐｍ　より高＜５０＊ＯＯＯｃｐｍ　より低い値 を与えるペア。

指数７　：ＴＮＦａの０乃至５００ｐｇ／ｍＡにおいて６０００ｃｐｍより高く 、７０００ｃｐｍより低い値を与え、ＴＮＦａのＯ乃至５０００ｐｇ／ｍ！にお いて６０，０００ｃｐｍ　より高＜７０ｅＯＯＯｃｐｍ　より低い値？与えるペ ア。

指数１１　：ＴＮＦａのＯ乃至５００ｐｇ／ｍｕにおいて１０、ＯＯＯｃｐｍ　 より高＜、１１．０００ｃｐｍより低い値を与え、ＴＮＦａのＯ乃至５０００　 ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　ニおいて　１ｏ０．ＯＯｏｅｐｍより高＜１１０．ＯＯＯ ｃｐｍ　より低い値を与えるペア。

笈−Ｊ−一表 ＩＲＭＡのためのＭＡＲペアの　択 ラベルＭＡＲ 吸着　３１２１０３１１３１４５２５２３４２３ＭＡＢ　ＤＦＨＡ　ＣＢＤＢＢ ＢＣＣＡＢＡＤＡＣ３Ｄ３　０２０　０　１２０００１２０００００００１Ｆ９ 　１００　０　０００１００００００００００２Ｈ７４２２０１２２２１０２１ １０１１０２１０Ａ２　２００　０　０２０１００２０００００２１３Ｃ５４０ ００１３３４３１２０００３０２３１Ｂ５　５２０　０　３０１１００００３０ １００１ＬＤ６　０２０　０　３００１００１０００００００３Ｂ５　０２０　 ０　３０００００００００００００１Ｂ２　０００　０　７０００００００００ ００８０４Ｂ３　５００　０　３００２００００２０００００５Ｃ１４１００３ ０１１０００１２０１００１２Ｃ４２００００２００００２０５０００２０５Ａ ３　１２０　０　０２０００１２１００００００２Ｂ３　００２　０１１０１０ ００００００００００３Ｃ３１２（Ｉ　Ｑ　２０００００００００００２０第７ 表から、５より大きい指数を有する７組のペアを選択してさらに広範な研究のた めに使用した。これらのうち５組のペアは第６図に示すように、より広い範囲の 標準を使用して試験された。第６図は下記のごとく室温で全２４時間培養した後 でそれら５組の抗体ペアにより得られたＩＲＭＡ標準曲線な示す。

−吸着抗体１＋標準または試料＋Ｎ　ａｉ２ｓエラベル抗体を一緒に２４時間培 養。

下記第８表のデータが第６図に再現されている。

第６図から最も感度の高い抗体ベアが吸着２Ｂ３＋ラベル３Ｃ５のペアであるこ とがわかる。

この点から研究を２段階で進めた。

第１段階：抗体２Ｂ３／３Ｃ５ペアを使用した培養基内でのＴＮＦａの検査のた めに敏感なＩ　ＲＭＡの開発。

第２段階：生物学的液体内に存在する自生的ＴＮＦαのＩＲＭＡ検査までの進展 、この研究の進展にはアンカップリング剤の使用と固体相に吸着された追加の吸 着ＭＡＢの添加（“オリゴクローナル”混合物）が必要であった。

吸着２Ｂ３＋Ｎａ”’Ｉラベル３Ｃ５゜１．２　塵−一稟： 第６図の２８３／３Ｃ５標準曲線はＴＮＦａの１０ｐｇ／ｍｌのオーダの感度を 示している。

１．３　竺−ｊ！　ｉ： ２Ｂ３／３Ｃ５ペアの特異性を交差反応を起しうる下記６種の試薬について試験 した。

、ＴＮＦａ　（１０００ｎｇ／ｍｌまで）ＩＬ−１β（１０００ｎｇ／ｍｌまで ）ＩＬ−２（１０００単位／　ｍ　ｌまで）Ｉ　Ｆ　Ｎ　ａ　（１，００ｎ　ｇ 　／　ｍ　ｌまで）ＩＦＮ？　（５０００単位／　ｍ　ｌまで）ＩＦＮβ　（５ ０ｏＯ単位／　ｍ　ｌまで）。

これら６種の交差反応試薬のいずれもＴＮＦａの検査に干渉しなかった。

１．４　回収試験： 培養物に添加されるヒト組換えＴＮＦ（ｈｒ−ＴＮＦａ）の回収率は９０％以上 である。

１．５　稀釈試験： 培養基中のＴＮＦα豊富培養物の稀釈度が第９表に示されている。第９表に示さ れている結果は１７１６までの範囲の稀釈度におｔ）て回収率が９０％であるこ とを示している。

星−主一人 培養液の稀釈試験 稀釈度　計算＊　（ｐｇ／ｍｌ）　測定値　％１．６　尺上人旦互■且鳳五： ＲＩＡによってまたは２Ｂ３／３Ｃ５ＩＲＭＡによって検査された臨床試料の値 の間に相関関係が成立した。

臨床試料は２２個体の異る検体から採取されたＰＢＬの１０９の培養上澄みであ り、それぞれ０，０．２，１．５または１０Ｐｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されてい た。

２２の試料検体の内訳は下記のとおり：正常　１１検体；　喉頭ガン　４検体； 糖尿病　４検体； リュウマチ様多発関節炎　３検体 ＲＩＡとＩＲＭＡとの間の相関関係は第７図に示されている。相関係数は０．９ ７であり、これは２つの試験の間でよく一致する。

２、生　学・　内のＴＮＦａのＩＲＭＡによる　査２Ｂ３／３Ｃ５ＩＲＭＡは培 養上澄み内のＴＮＦａの検査においてすばらしい結果を示す、この検査法を特定 の患者（敗血症発作または移植拒絶反応の患者）の体液内に存在するＴＮＦａの 検査まで拡張適用することが切望されたのである。

２．１　瓜遺恵夏旦腹に腹 正常検体の血清または敗血症発作をもつ検体の血清に既知量のｈｒ−ＴＮＦａを 添加しそしてこれら血清中のＴＮＦａを後から２Ｂ３／３Ｃ５ＩＲＭＡで滴定し た。

下記結果が得られた： ・正常血清中の回収率　４０乃至５０％・発作患者血清中の回収率　１ｏ乃至２ ０％この悪い回収試験結果は血清中にＴＮＦａと結合するタンパク質のような物 質が存在することを示唆するものである。この物質が工ＲＭＡ検査に干渉しそし てこの物質は敗血症発作をもつ患者の血清により多く存在してν）ることが推定 される。

２．２　上記血清　゛をト除するためのいくつかの星立に監 アンカップリング剤の添加または不活性化処理によって血清中のＴＮＦのｌＲＡ Ｍ検査の妨害物を排除することが試みられた。

それらの各種試行処理が第１０表に記録されている。

すなわち、第１０表は２Ｂ３／３Ｃ５ＩＲＭＡ感度曲線（標準点は０，１００　 および５０００）におよぼすそれら処理の作用ならびに敗血症発作をもつ患者の 血清に添加されたｈｒ−ＴＮＦａの回収率におよぼすそれらの効果を示すもので ある。試験の感度に影響するような処理（たとえば５００ｍＭのＤＴＴ添加）は 不採用とされた。また、回収率を向上させるけれども、付加的工程（試料の５６ ℃までの予熱あるいはＰＥＧによる沈殿）を要する処理も不採用とされた。

回収率が１９％でなく、９６％となるＥＤＴＡの添加が採用された。

第　１０　表 血清干渉に対する各種処理の 処理の種類： Ａ　／ナシ Ｂ　／　ＤＤＴ　５０ｍＭ　３７℃　１ｏ分（ＤＤＴ＝ジチオトレイトール） Ｃ／　ＥＤＴＡ　１０ｍＭ Ｄ　／　ＥＤＴＡ　１０ｍＭ　＋ＣＡＣ１２２０ｍＭＥ　／ＮＡＳＣＮ　１０ｍ Ｍ Ｆ　／　ＮＡＳＣＮ　３００ｍＭ Ｇ／ＰＥ０９％と遠心分離 Ｈ／ＰＥ０　１２．２％と遠心分離 Ｉ　／ＰＥ０　１５％と遠心分離 Ｍ／ＰＨ１３ Ｎ　／　ＣＯＮ　Ａ　１００　Ｇ／ｍｌ○　／　ＣＯＮ　Ａ　５００　Ｇ／ｍｌ Ｐ　／　ＣＯＮ　Ａ　１０００　Ｇ／ｍｌＱ　／ＰＢ、１００　Ｌ （ＰＢ＝リン酸塩緩衝液） Ｒ／　ＰＢ、２００　Ｌ。

全カウント数＝１９３０００゜ 下記第１１表からも明らかなごとく、多数の試料においてＥＤＴＡの効果が確認 された。

一般的に言えば、ＥＤＴＡを使用すると敗血症発作をもつ検体の血清中あるいは 正常検体の血清中で５０％の代わりに８０％の平均回収率が達成可能となる。

これは顕著な向上であるが、まだ、十分とはいえない。

１　ＪＬ ＥＤＴＡ添加または未添加の各種 生物学的試料中での回置１−−−− 試料　ＥＤＴＡ　０％　ＥＤＴＡ　１０％正常血漿　６０％　８６％ 正常血清１　３８％　８３％ 正常血清２　３０％　８８％ 発作１６％　７２％ 発作２１７％　５１％ ２．３　他の　体ペアの試 血清と２Ｂ３／３Ｃ５ＩＲＭＡとの干渉が第６図の抗体の他のペアの場合にもあ るか否かが調べられた。

第１２表には下記のＩＲＭＡペアを使用した場合の敗血症発作をもつ患者の３つ の血清と２つの正常血清中のｈ　ｒ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ　５０００ｐｇ／ｍｌの回収 試験の結果が示されている。

ＩＢ５／３Ｄ３；　４Ｂ３／３Ｄ３； ＩＢ２／３Ｃ５；　６Ａ３／３Ｃ５゜ 試験結果を見ると干渉血清物質がすべてのペアと関与活動するものではないとい える。

干渉は２Ａ５／３Ｃ５ペアの場合に最大であり、２Ｂ３／３Ｃ５ペアと４Ｂ３／ ３Ｄ３ベアでは同等、そしてＩＢ２／３Ｃ５ペアの場合は少ない。

これに対して、ＩＢ５／３Ｄ３と６Ａ３／３Ｃ５のペアは１００％以上の回収率 を示している。

６Ａ３／３Ｃ５のペアが２Ｂ３／３Ｃ５のペアと同じトレーサを使用しているに もかかわらず回収の点から見ると挙動が互いに相違しているという事実は干渉が トレーサと関連していないことを示唆している。

複数の吸着抗体が別々のエピトープを認識する、すなわち干渉物質の結合場所に 多少近いエピトープを認識する（抗体２Ｂ３．４Ｂ３．２Ａ５．ＩＢ２）か、あ るいはその場所から遠いエピトープを認識する（抗体６Ａ３特表平１−５０３３ ３１　（１５） と１Ｂ５）のはこのためである。

１Ｂ５／３Ｄ３のペアと６Ａ３／３Ｃ５のペアはそのまま使用するのには感度が 十分でないから、固体組上に抗体ＩＢ５と２Ｂ３を一緒に、あるいはまた、抗体 ６Ａ３と２Ｂ３とを一緒に吸着させ、それぞれの利点（ＩＢ５と６Ａ３はすぐれ た回収率、２Ｂ３はすぐれた感度）を組み合わせる可能性が考えられた。

区 ２．４　第１ゴクローナル　のＩ　ＲＭＡ第１３表はオリゴクローナルペアＩＢ Ｓ＋２Ｂ３／３Ｃ５および６Ａ３＋２Ｂ３／３Ｃ５を使用した回収試験の結果を ２Ｂ３／３Ｃ５のみを使用した場合と比較して示す、この試験はＥＤＴＡの存在 で実施された８表から。

２種のオリゴクローナルＩＲＭＡが敗血症発作の患者の血清または正常人の血清 で１００％以上の回収率を有し、他方、比較例ペアの場合では回収率は正常血清 で１００％より低く１発作患者血清では８０％より高い（ｓｉｃ）ことがわかる 。さらに、オリゴクローナルペアは感度も満足すべきものである。

第１３表　各　オリゴクローナルＩ　ＲＭＡｕ支五１久に艮 １：　ＩＢ２＋２Ｂ３／３Ｃ５ ２：　６Ａ３＋２Ｂ３／３Ｃ５ ３：　２Ｂ３＋３Ｃ５のみ。

２、　敗血症発作患者血清＋５００　ｐｇ／ｍ１３、ＣＲＰ＋５００　ｐｇ／ｍ １ ４、　正常ヒト血清 ５、　敗血症発作患者血清 ６、　緩衝液＋５００ｐｇ／ｍｌ 第１３表つづき：各種オリゴクローナルＩ　ＨＭＡの回収試験 カウント総数　１６９６７１　１７０００９　１６９９９１標準曲線 Ｏｐｇ／ｍｌ　７９３　６５４　６６４２０　Ｐ　ｇ／　ｍ　ｌ　１０７１　１ １３０　１２３０５０　ｐ　ｇ／ｍ　ｌ　１６１９　１６３６　２２７２１００ 　ｐｇ／ｍ　ｌ　２５３１　２６０９　３２７３２００　ｐｇ／　ｍ　ｌ　４０ ９０　４６８３　５５８０５００　Ｐ　ｇ／　ｍ　ｌ　８４０５　１０９１２　 １２７５６１０００　ｐ　ｇ／　ｍ　ｌ　１６１５３　２００１０　２３７７３ ２０００　ｐ　ｇ／　ｍ　１　３０７９３　３８１８５　４４５４０５０００　 ｐ　ｇ／　ｍ　ｌ　６３４０５　７４９３０　９０６７２正常ヒト血清　１２１ ．＄　１０７．３　９６．７敗血症発作血清　１１０．６　１０３．４　７９． ＩＣＲＰ　１２０．１　１０８．１　８５．９２．５　オリゴクローナルＩＲＭ Ａ法による生物学的液体内の内果性ＴＮＦ検査 第１４表は正常者または敗血症発作患者の血清中または血漿中または腹膜浸出液 中のＴＮＦαの検査のデータを示すものである。これから、２つのオリゴクロー ナルＩＲＭＡ検査では正常検体内のＴＮＦを検出せず、発作患者検体では血清と 血漿の両方あるいは腹膜浸出液中でＴＮＦαを検出することがわかる。

２Ｂ３／３Ｃ５モノクローナルＩＲＭＡによるＴＮＦα検査値は低い。

第１４表：オリゴクローナルＩＲＭＡ法による生物学的液体中での天然ＴＮＦ検 査 １：　６Ａ３＋２Ｂ３／３Ｃ５ ２：　ＩＢＳ＋２Ｂ３／３Ｃ５ ３：　２Ｂ３＋３Ｃ５ カウント総数　１６２５３９　１６２４６２　１６２３３７基準曲線 Ｏｐｇ／ｍｌ　６３１　６０７　６５５２０　ｐｇ／ｍｌ　１０７３　８２１　 １２２３５０　ｐｇ／ｍｌ　１５２３　１３５４　１７６１１００　Ｐ　ｇ／ｍ ｌ　２５６１　２１１８　２７５１２００ｐｇ／鳳１　４３５７　３４０２　４ ９６６５００　ｐ　ｇ／＋ｓｌ　９５５５　７４３７　１１７０９１０００　Ｐ 　ｇ　／ｍｌ　１８５９５　１４０８８　２２８９９２０００　Ｐ　ｇ　／＋ｓ ｌ　３４１４６　２６４８６　４２７１３５０００　ｐ　ｇ　／ｍｌ　６８０９ ２　５５６０２　８４４５３第１４表＝（つづき） ８、　敗血症発作１期 乾燥管内（２０１ｐｇ／ｍｌ）　１４１　１１９　８８９、　敗血症発作２期 乾燥管内（４５０ｐ　ｇ／ｍｌ）　１０３４　８８０１０、敗血症発作３期 乾燥管内（７１ｐｇ／ｍｌ）　３．４　１１　０．６１１、浸出液プール　１　 ３３　２６　１４１２、浸出液プール　２　３３　２９　１２１３、敗血症発作 ４期 乾燥管内（＋５０ｐｇ／ｍｌ）　０　０　０１８、正常ヒト血清＋５００ｐｇ／ ｍｌ　５０４　５６８　３７５１９、敗血症発作、（ジｘ’／ト）＋５００ｐｇ ／ｍｌ　５４４　６２７　３６６２０、緩衝液＋５００ｐｇ／社　４５２　４５ ４　４３４結　論 ＭＡＲ２Ｂ３／３Ｃ５のペアは培養物において高感度でＩＲＭＡ検査においてＴ ＮＦαを検出する。

同じ抗体ペアを使用した生物学的液体内でのＴＮＦαの検出検査は正常検体の血 清中および敗血症発作をもつ検体の血清中の干渉物質によって妨害される。後者 の場合、その程度は大きい。

干渉物質は吸着抗体↓こよって認識されたエピトープに近い領域のＴＮＦαに結 合するものと考えられる。

他の抗体ペアはこの欠点を有していない、しかしながら、明らかに感度が低く、 したがって、そのままでは生物学的液体内ＴＮＦα検査のためには使用不可能で ある。

ＩＲＭＡ検査においてＥＤＴＡを添加すると干渉物質の作用を減少させることが できるが、しかし完全ではない。

固体相に吸着された２つの異なる抗体（一方は十分な検出感度を有するものそし て他方は干渉物質に不感応なもの）を−緒に使用しかつ検査をＥＤＴＡの存在で 実施することにより、各種病理学的状態において干渉されることなく生物学的液 体内でＴＮＦαを検出しうる敏感なＩＲＭＡを得ることができる。

末五Ｍ−亘　ＩＬ−１β　変法の開 １）ム皮生 ヒト組換えＩＬ−１βを抗原として使用した。

免疫化はパイツカイティス（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ）の方法によってうさぎに 複数回背骨に沿って皮肉注射をすることによって実施した。注射液は生理的液体 ５０ｍ１に抗［５０μｇを溶解した懸濁物及び完全フレンドアジュバント０．５ ｍｌからなるものであった・ 同じ方法かつ同じ量の抗原を使用して月１回、合計１２回の補強注射を行なった 。血液試料を定期的に耳の末梢血管から採取した。免疫化の終りに、うさぎを全 放血により殺した。

以上により採取された別々の血液試料について力価と感度を調べた。はぼ同じ感 度と充分な力価を示した複数の採取血液試料を混合し３７℃、２０℃および４℃ の温度で反応速度論的実験に供した。

ブール工は１ケ月目と３ケ月目に採取された血液試料よりなり、プール■は４ケ 月目、５ケ月目、６ケ月目および７ケ月目に採取された血液試料よりなる。

２）　応　論的　験　果 抗体と抗原の結合が最もよく起こる温度は４℃であることが判明した。２４時間 後には約２０％の結合が達成され、９６時間後には２８％に達する。また、２つ のプールの挙動には並行性がみられた。したがって、これらの異なる採血試料が 混合された。

古典的なりロラミンＴ法によるＩＬ−１のラベルづけ（クロラミンＴ２０μｇ− ３０”−メタ重亜硫酸塩２０μｇ）は満足すべき結果をもたらさない。

実際には、セファデックスＧ７５ゲルでの過した後、２つの溶離ビークが得られ る。

この２つのビークについて抗体との結合性および感度を試験した。その結果、ピ ークエ　（大きい方）はよく抗体と結合するが、ラベルをつけてない抗原の２０ ０ｎｇによる結合抑制率はわずか±１５％にすぎないことがわかった。これに対 して、ビーク■は同様に抗体に結合するが、上記と同量の抗原による抑制率は± ７０％であった。

そこで、クロラミンＴの量を１０倍減らしかつメタ重亜硫酸塩の添加を取り止め ることによる標識化の改良を試みた。第２表に見られるように、感度にわずかな 改良（８０％抑制率）がなされたが、標識効率は増加されなかった。実際にはビ ークエは減少したが、ビーク■は増加しなかった。

さらに次の方法で標識化の改良を試みた：１−　ヨウ素１２５の量を２倍にする ；２−　ラクトペルオキシダーゼでラベルをつける；３−　ヨードゲンでラベル をつける。

最初の２つの方法はビークエを減少させるが、ビーク■はキットをつくることを 可能にするほどには増加されない、他方、ヨードゲンでラベルをつける方法はか なり満足すべき結果をもたらした。したがって、この標識化方法が採用された。

この方法は次のようにして実施される。

−　ヨードゲン（入手ソース：　Ｐｅａｒｃｅ）の各２μｇアリコートを５０μ ｍのクロロホルムに溶解して貯蔵するニ ー　ラベルづけ直前に窒素雰囲気下でクロロホルムを蒸発追放しそして管の中に 順次下記のものを添加する： ０．５モ／ｌ、’ＰＯ，，ｐＨ７，５１５ｕｌ。

”’Ｉ　（１ｍＣｉ）　１０μ１ｗ ０．０５モルＰＯ４、ＰＨ７，５の２５μｍに溶解したＩＬ−１β　５βｇ。

この混合物を頻繁に振とうしながら１０分間反応させそしてＮａＩの０．２５モ ル溶液５００μｌを添加して反応を停止させる。

この方法でも、しかし、まだ問題が残る。すなわち、０．０５モルＰＯ，緩衝液 に溶解されたＩＬ−１は安定性に欠け、何度も解凍できない。

このため、各３０μｍのアリコートごとに凍結または凍結乾燥して貯蔵すること が試みられた。

凍結乾燥後、製品は完全に品質低下することが観察され、これに対して、１回だ けの解凍では保存性が向上されるように思われる。

しかしながら、その結果は顕著ではなく、他の緩衝液（トリス−ＭＣＩ緩衝液） を研究する必要があった・ トリス−ＭＣＩ緩衝液は非常に適当であることがわかった（１００ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７，８゜０．０２ｍＭ　（ｓ　ｉ　ｃ）　）　。

標準物または試料の１００μｍを１／８０００の初期稀釈度で抗血清の１００μ ｍと接触させそして４℃で少なくとも２０時間接触状態で放置する。ついで、６ ０，０００　ＱｐｍでラベルをっけたＩＬ−１溶液１００μｍを添加して室温で ４時間反応させるか、３０，０００　ｃｐｍでラベルをつけたＩＬ−１溶液１０ ０μｌを添加して４℃で２００時間反応せる。

２・礼−五−ｉ ポリクローナルうさぎ血清はＩＦＮγ、ＩＬ−２あるいはＴＮＦαおよびＴＮＦ βと交差反応し本検査法の感度は１０ｐｇ／管である。

４、コメント 標準物、抗血清、標識化物の凍結乾燥試験の結果はすべて満足すべきものである 。

正常値とサンプリング法 正常人の血清の１００検体において得られた平均値は４２８±６１ｐｇ／ｍｌで ある。

さらに、凝集時間と血清におよぼす解凍の影響を調べた。いずれも検査結果に影 響を与えていなかった。

さらに３３正常検体を使用し、各種サンプリング法を、ＥＤＴＡにつき、クエン 酸塩につき、またヘパリンにつき調べた。得られた結果はすべて同様であった（ ＥＤＴＡ＝３４４±９３ｐｇ／ｍｌ；クエン酸塩３２７±１２１　ｐｇ／ｍｌ　 ；ヘパリン＝３５２ｐｇ／ｍｌ）。

豊生叉監且！ （１）　ジェー、サクラトバラネイチャー（Ｊ、　５ＡＫＬＡ−ＴＶＡＬＡ　Ｎ ａｔｕｒｅ）　Ｖｏｌ、　３２２−８月７日１９８６−ｐ、５４７〜５４９ （２）　レウマトイドアルトリティスにおけるマクロファージ活性のメカニズム 、ＩＦＮγの役割。

（“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ 　ｉｎＲ）ＩＥＬＩＭムＴＯＩＤ　ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ、　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　 ｏｆ　ＩＦＮｙ″）エムジ−リドレイ等ＣＭ、Ｇ、　ＲＩＤＬＥＹ　ｅｔ　ａｌ 、）化学及び実験免疫学（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔ ａｌ　ｉ＋ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　１９８６　Ｖｏ　ｌ　、６３Ｐ、５８７〜５ ９３ （３）土　ビー、コック、ダグリュー。レグナツト。

ジェー、タリン、ラブ、イムツル、（Ｂ。

ＫＯＧＫ、Ｗ、ＲＥＧＮＡＴ、Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｌａｂ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）（１９８４）、１３゜１７１．１７８ 互　カーデナス、マーシャル、ジャーナル　オブイムノロジカルメソッド（ＣＡ ＲＤＥＮＡＳ。

ＭＡＲ５）ＩＡＬＬ、Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ）、　８９　（１９８６）　１８１−１８９（４）　ダナダーカ 　−ザランセット、１１月２３日（ＤＡＮＡＤＥＲＫＡ　−Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅ ｔ、　Ｎｏｖｅ＋＋＋ｂｅｒ　２３）。

１８７５、　ｐ、１１９０　カチェクチン／テユーモアネクロシス　ファクター （ＣＡＣＨＥＣＴＩＮ／ＴＵＭＯＵＲＮＥＣＲＯ５ＩＳ　ＦＡＣＴＯＲ） （５）オッペンへイン等　ブロバティーズオブＩＬ−１フェデエレーションプロ シーディングス（ＯＰＰＥＮＨＥＩＭ　ａｔ　ａｌ、ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏ ｆ　Ｉ　Ｌ−ＩＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）　Ｖｏｌ、４ １．　Ｎｏ、２゜２月１９８２゜ （６）パイツカイティス等−ジェ、タリン、エンドクリノル、メタブ、）　（Ｖ ＡＩＴＵＫＡＩＴＩＳ　ａｔ　ａｌ、　−Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、）　３３　、　９８８−　９９１　：　１９７１ （７）　グリーンウッド、バイオヶム、ジェー、　（ＧＲＥＥＮ−ＷＯＯＤ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　）　８　：１１４−１２０゜（８）　コーラ−オブ（ｓｉ ｃ）　ミルスティン　ネエイチャー（ＫＯＨＬＥＲｏｆ　（ｓｉｃ）　ＭＩＬＳ ＴＥＩＮ　Ｎａｔｕｒｅ）Ｖｏｌ、２５６．　１９７５゜ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ば） ＩＲＭＡ／ＲＩＡ　２目関ゲラフ ＴＮＦα ＦＩＧ、６ 手続補正書 （１）別紙のとおり、印書せる明細書の翻訳文および請求の範囲の翻訳文１通を 提出いたします。

（２）別紙のとおり、正式図面の翻訳文１通を提出いたします。

国際調査報告 ｌｌｌｍ７〜−一−ＴｈｌＬ　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１０Ｃ１４３０−一一一〜− 一−ｋＰＣＴ／ＥＰ　８８１００４３０国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．血漿または血清と血球とを分離する前に有糸分裂誘起剤で刺激された完全血 液から得た血清または血漿中でモノカインを検査する、血液試料中のモノカイン 、特にＴＮＦαまたはＩＬ−１βの検査方法。
2. ２．血液をＥＤＴＡ、ヘパリンまたはクエン酸塩のごとき抗血液凝集物質上に吸 引し、ついで有糸分裂誘起剤と接触させて培養し、そしてこのあと清澄化、特に 遠心分離によって清澄化し、これによって得られた血漿中でモノカインの検出を 実施する、請求項１記載の検査方法。
3. ３．有糸分裂誘起剤がフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはリポ多糖類（ＬＰ Ｓ）である請求項１または２記載の検査方法。
4. ４．完全血液の直接刺激をＰＨＡの０．０２乃至５０μｇ／ｍｌまたはＬＰＳの １０乃至２００μｇ／ｍｌを使用し、４乃至４０℃の温度で３０分乃至４８時間 培養することにより実施する請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
5. ５．完全血液の刺激を濃度１乃至１０μｇ／ｍｌのＰＨＡまたは濃度１５乃至７ ５μｇ／ｍｌのＬＰＳを使用して実施する前記請求項のいずれかに記載の検査方 法。
6. ６．完全血液の刺激を５μｇ／ｍｌのＰＨＡまたは濃度２５μｇ／ｍｌのＬＰＳ を使用して３７℃で２時間培養することにより実施する前記請求項のいずれかに 記載の検査方法。
7. ７．他のシトカインと交差反応をしないうさぎのポリクローナル抗ＴＮＦαまた は抗ＩＬ−１β抗血清を使用して置換検査、特に、ＲＩＡ型の置換検査を行なう 、前記請求項のいずれかに記載のＴＮＦαまたはＩＬ−１βの免疫検査方法。
8. ８．当該モノカインの異なるエピトープを認識する、固体相上に吸着された少な くとも２種のモノクローナル抗体を使用する、生物学的液体内のモノカイン、特 にＴＮＦαのＩＲＭＡ検査のごとき免疫分析タイプの免疫検査方法。
9. ９．当該モノカインの既知値を検出しながら第１の吸着抗体を非常に高い検査感 度を得るべく選択し、そして第２の吸着抗体を最大回収率を得るべく選択する、 請求項８記載の免疫検査方法。
10. １０．検査をＥＤＴＡのごときデコンプレッキシング剤の存在で実施する、請求 項８または９記載の免疫検査方法。
11. １１．他のシトカインと交差反応をしない、モノカインに指向されたモノクロー ナル抗体を使用して特にＩＲＭＡ型の免疫分析検査を行なう、前記請求項のいず れかに記載のモノカインの免疫検査方法。
12. １２．マウスひ臓細胞とＳＰ２−Ｏ骨髄腫細胞との融合によってつくられたハイ ブリッドマスから分泌される抗体である、前記請求項のいずれかに記載の特に免 疫検査法のために有用なモノクローナル抗体。
13. １３．試薬の中でも特に有糸分裂誘起剤を含有している、前記請求項のいずれか に記載のモノカインの免疫検査のためのキット。
14. １４．検査されるべき血液試料を真空吸引するための管の中に有糸分裂誘起剤が 存在しており、該管にはさらに抗血液凝集剤が含有されている、請求項１０記載 の検査キット。
15. １５．検査管の内壁または検査ビーズの外面のごとき固体相上に吸着された、当 該モノカインの異なるエピトープを認識する少なくとも２種のモノクローナル抗 体を含有している、請求項８乃至１４のいずれかに記載の、モノカイン特にＴＮ Ｆαの免疫分析検査のためのキット。
16. １６．試薬の中でも特にＥＤＴＡのごときデコンプレッキシング剤がトレーサと 混合されて含有されている、請求項８乃至１５のいずれかに記載の、モノカイン 特にＴＮＦαの免疫分析検査のためのキット。